4.2 Funktionsuntersuchungen an TrpB2o
4.2.3 Erstellung von Deletionsstämmen in T. kodakaraensis
Die Deletion von Genen ist eine aussagekräftige und direkte Methode, um die Funktion von Enzymen in vivo zu Untersuchen. T. kodakaraensis ist einer der wenigen hyperthermophilen
Mikroorganismen, für den ein System zur gezielten Deletion von Genen entwickelt wurde. Es beruht das auf dem Prinzip der homologen Rekombination (Sato et al., 2005).
Das System, mit dem Deletionsmutanten erstellt werden können, nutzt den Uracil-auxotrophen Stamm KU216, bei das pyrF Gen vollständig deletiert wurde (Sato et al., 2005).
Dieses für die Uracil-Biosynthese essentielle Gen codiert für die Orotidin-5'-phosphat Decarboxylase, weshalb KU216 nur in Anwesenheit von Uracil im Medium wachsen kann.
Um Deletionsmutanten zu erstellen, wird ein Konstrukt in einem beliebigen Plasmid hergestellt, welches pyrF, flankiert von stromaufwärts und stromabwärts gelegenen, homologen Bereiche des zu deletierenden Gens (jeweils ca. 1 kb), enthält. Mit diesem Plasmid wird der Stamm KU216 transformiert und auf Klone, die nach einem doppelten crossover anstelle des Zielgens das pyrF Gen enthalten, selektiert. Die Selektion erfolgt auf Minimalmedium ½ SME -AA ohne Uracil, in dem die 20 natürlichen Aminosäuren als einzige Kohlenstoffquelle enthalten sind (2.13). Durch das Weglassen einzelner Aminosäuren kann getestet werden, ob das Produkt eines deletierten Gens für die Biosynthese dieser Aminosäure essentiell ist.
Um die physiologische Funktion von TrpB2o zu untersuchen, wurden ΔtrpB2o und als Referenz ΔtrpB1 Stämme von T. kodakaraensis hergestellt und bezüglich ihres Tryptophan-abhängigen Wachstumsverhaltens und ihrer Metabolomzusammensetzung analysiert. Um die korrekte Expression der restlichen Gene des trp Operons von ΔtrpB1 zu verifizieren, wurde die Doppelmutante ΔtrpB1 ΔhisD::trpB1 hergestellt. Bei dieser wurde trpB1 an anderer Stelle außerhalb des trp Operons im Genom des ΔtrpB1 Stammes eingefügt, wodurch bei korrekter Herstellung der restlichen Enzyme der Tryptophan Biosynthese Tryptophan-Prototrophie zu erwarten war.
Die Herstellung der Deletionsmutanten erfolgte in Kooperation mit Ingrid Waege (Waege, 2009) und Winfried Hausner (Lehrstuhl für Mikrobiologie, Universität Regensburg). Die DNA Sequenzen der erstellten Konstrukte finden sich in Anhang 6.5.
4.2.4.1 Erzeugung von T.kodakaraensis KU216 ΔtrpB2o
Für die Herstellung von T.kodakaraensis KU216 ΔtrpB2o wurde ein Teil des trpB2o Gens (gene identifier tk1442) aus dem Genom entfernt, und durch den Selektionsmarker pyrF ersetzt. Dabei wurde die Länge des zu deletierenden Bereichs von trpB2o möglichst ähnlich zu pyrF gewählt, um Schleifenbildung während der homologen Rekombination zu vermeiden.
Da trpB2o deutlich größer als pyrF ist (1,3 kb und 0,6 kb), blieb ein Teil von trpB2o (0,7 kb) im Genom erhalten. Deletiert wurde der N-terminale Bereich des Genprodukts bis einschließlich Aminosäure 266, wobei das den Cofaktor PLP bindende Lysin 110 entfernt wurde, was zum vollständigen Verlust der Aktivität führt. Um die homologe Rekombination über doppelten crossover zu ermöglichen, wurden an das pyrF Gen an beiden Enden die unmittelbar stromaufwärts bzw. stromabwärts gelegenen Sequenzbereiche (jeweils 1 kb) des
zu entfernenden trpB2o Anteils fusioniert. Sie entsprechen dem 3’-terminalen Bereich von tk1441 (Genprodukt unbekannter Funktion) bzw. dem 3’-terminalen Bereich von tktrpB2o plus dem 5’-terminalen Bereich von. tk1443 (Aspartatsemialdehyd-Dehydrogenase) (Abbildung 61).
Abbildung 61: Strategie zur Herstellung von T. kodakaraensis ΔtrpB2o über homologe Rekombination.
Durch den doppelten crossover über die flankierenden Regionen wird der 5’-terminale Bereich von trpB2o durch pyrF (inklusive seines konstitutiven Promoters) ersetzt. Dieses Rekombinationsereignis führt zu einer Uracil Prototrophie des auxotrophen KU 216 Stammes, auf die selektiert werden kann.
Das Zusammenfügen der Komponenten erfolgte über OE-PCR (3.3.9.2) und das Produkt anschließend über blunt end Klonierung in den Vektor pJet 1.2 (2.2.3) ligiert (Abbildung 62).
Abbildung 62: Herstellung des Konstrukts pJet 1.2. ΔtrpB2o.
Durch PCR auf gDNA von T. kodakaraensis wurden über die Primerpaare 1/6 (Fragment A), 2/5 (Fragment B) und 3/4 (Fragment C) überlappende Fragmente amplifiziert. Diese wurden über OE-PCR zusammengefügt (3.3.9.2). Zuerst wurden die Fragmente A und B über die Außenprimer 1 und 5 zum Fragment AB zusammengefügt. Dieses wurde anschließend über die Außenprimer 1 und 4 mit Fragment C fusioniert, um das fertige Konstrukt zu bilden welches in den Vektor pJet 1.2. ligiert (3.3.9.2) wurde. Die Primersequenzen finden sich in Kapitel 2.3.4. und die durch DNA-Sequenzierung überprüfte Nukleotidabfolge des klonierten Konstrukts in Anhang 6.5.
Die Transformation von T. kodakaraensis Zellen mit dem Plasmid, die Selektion positver Klone über Uracil-Prototrophie und die Verifizierung der Integrationsstelle über PCR Analyse und Southern Blot wurden von Ingrid Waege durchgeführt (Waege, 2009).
4.2.4.2 Erzeugung von T.kodakaraensis KU216 ΔtrpB1
Der Deletionsstamm T.kodakaraensis KU216 ΔtrpB1 wurde in analoger Weise wie in Kapitel 4.2.4.1 für ΔtrpB2o beschrieben durchgeführt. Dabei wurden ca. 800 bp am 5’-terminalen Ende des 1,2 kb großen trpB1 Gens durch pyrF ersetzt, d. h. es blieben 0,4 kb von trpB1
erhalten. Wiederum wurden an das pyrF Gen flankierende Bereiche von jeweils 1 kb angefügt, stromaufwärts der 3’-terminale Bereich von trpF und stromabwärts der 3’-terminale Bereich von trpB1 plus eines 5’-terminalen Anteils von trpA (Abbildung 63).
Abbildung 63 Strategie zur Herstellung von T. kodakaraensis ΔtrpB1 über homologe Rekombination.
Durch den doppelten crossover über die flankierenden Regionen wird der 5’-terminale Bereich von trpB1 durch pyrF (inklusive seines konstitutiv aktiven Promoters) ersetzt. Dieses Rekombinationsereignis führt zu einer Uracil Prototrophie des auxotrophen KU 216 Stammes, auf die selektiert werden kann.
Das Zusammenfügen der Komponenten erfolgte über OE-PCR (3.3.9.2) und das Produkt wurde anschließend über blunt end Klonierung in den Vektor pJet 1.2 (2.2.3) ligiert (Abbildung 64).
Abbildung 64: Herstellung des Konstrukts pJet 1.2. ΔtrpB1.
Durch PCR auf gDNA von T. kodakaraensis wurden über die Primerpaare 1/6 (Fragment A), 2/5 (Fragment B) und 3/4 (Fragment C) überlappende Fragmente amplifiziert. Diese wurden über OE-PCR zusammengefügt (3.3.9.2). Zuerst wurden die Fragmente A und B über die Außenprimer 1 und 5 zum Fragment AB zusammengefügt. Dieses wurde anschließend über die Außenprimer 1 und 4 mit Fragment C fusioniert, um das fertige Konstrukt zu bilden welches in den Vektor pJet 1.2. ligiert (3.3.9.2) wurde. Die Primersequenzen finden sich in Kapitel 2.3.4. und die durch DNA-Sequenzierung überprüfte Nukleotidabfolge des klonierten Konstrukts in Anhang 6.5.
Die Transformation von T. kodakaraensis Zellen mit dem Plasmid, die Selektion positver Klone über Uracil-Prototrophie und die Verifizierung der Integrationsstelle über PCR Analyse wurden von Ingrid Waege durchgeführt (Waege, 2009).
4.2.4.3 Erzeugung von T.kodakaraensis KU216 ΔtrpB1 ΔhisD::trpB1
Im Deletionsstamm T.kodakaraensis KU216 ΔtrpB1 steht durch Einfügen des konstitutiven pyrF Promoters auch das stromabwärts liegende trpA Gen unter Kontrolle dieses Promoters (Abbildung 65).
Abbildung 65: Organisation des trp Operons in T.kodakaraensis KU216 ΔtrpB1.
Der gelbe Pfeil symbolisiert den zellulären Promoter des trp Operons, der rote Pfeil den über den Selektionsmarker eingefügten, konstitutiven pyrF Promoter. TrpA steht unter Kontrolle des pyrF Promoters.
Es konnte nicht ausgeschlossen werden, dass die beobachtete Tryptophan-Auxotrophie von KU216 ΔtrpB1 (Abbildung 69) lediglich auf nicht ausreichenden Expression von trpA zurückzuführen ist.
Deshalb wurde ein Komplementationsstamm erstellt, der auf dem KU216 ΔtrpB1 Stamm basiert und zusätzlich einen Austausch des für die L-Histidinol Dehydrogenase codierenden Gens hisD durch trpB1 aufweist (Abbildung 66). Dadurch erfolgt die zelluläre Expression von trpB1 unter Kontrolle des pyrF Promoters.
Abbildung 66: Strategie zur Herstellung des Komplementationsstamms T. kodakaraensis ΔhisD::trpB1 über homologe Rekombination.
Durch den doppelten crossover über die flankierenden Regionen wird hisD durch trpB1 ersetzt. Dies führt zu Histidin-Auxotrophie und im Falle der korrekten Expression des nicht Operon-ständigen trpA zu Tryptophan-Prototrophie.
Falls der Phänotyp des KU216 ΔtrpB1 Stamms von Tryptophan-Auxotrophie zu Prototrophie dadurch revertiert wird, ist dies ein Beleg dafür, dass das trpA Gen unter Kontrolle der pyrF Promoters im diesem Stamm in ausreichendem Maß transkribiert wird.
Das Zusammenfügen der Komponenten erfolgte über OE-PCR (3.3.9.2) und das Produkt wurde anschließend über blunt end Klonierung in den Vektor pJet 1.2 (2.2.3) ligiert (Abbildung 67).
Abbildung 67: Herstellung des Konstrukts pJet 1.2. ΔhisD::trpB1.
Durch PCR auf gDNA von T. kodakaraensis wurden über die Primerpaare 1/3 (Fragment A), 2/5 (Fragment B), 4/7 (Fragment C) und 6/8 (Fragment D) überlappende Fragmente amplifiziert. Diese wurden über OE-PCR zusammengefügt (3.3.9.2). Zuerst wurden die Fragmente A und B (Außenprimer 1/5) bzw. C und D (Außenprimer 4/8) fusioniert. Fragment AB und CD wurden schließlich über die Außenprimer 1/8 verknüpft, um das fertige Konstrukt zu bilden welches in den Vektor pJet 1.2. ligiert (3.3.9.2) wurde. Die Primersequenzen finden sich in Kapitel 2.3.4. und die durch DNA-Sequenzierung überprüfte Nukleotidabfolge des klonierten Konstrukts in Anhang 6.5.
Die Transformation von T. kodakaraensis mit pJet 1.2 ΔhisD::trpB1 wurde mittels eines Hitzeschrittes nach Waege (2009) wie in Kapitel 3.2.10 beschrieben ausgeführt. Da der Ausgangsstamm KU216 ΔtrpB1 vollständig Tryptophan auxotroph und Uracil prototroph ist (4.2.4), wurde die Selektion mit ½ SME-AA (ohne Uracil, ohne Tryptophan) Medium durchgeführt. Der Austausch von hisD durch trpB1 sollte den Zellen das Wachstum ohne Tryptophan ermöglichen, was der Fall war.
Um sicherzustellen, dass die Integration von trpB1 bei positiven Transformanten an der richtigen Stelle im Genom stattgefunden hat, wurde genomische DNA der Stämme KU216 und KU216 ΔtrpB1 ΔhisD::trpB1 einer PCR-Analyse im Bereich der Integrationsstelle unterzogen (Abbildung 68).
Abbildung 68: Verifizierung des Stammes ΔtrpB1 ΔhisD::trpB1 über PCR Analyse.
A Lage der Primerpaare zur Überprüfung der genomischen Situation im Ausgangsstamm KU216 (oben) und KU216 ΔtrpB1 ΔhisD::trpB1 (unten). B PCR Analyse genomischer DNA von T.
kodakaraensis KU216 (links) und KU216 ΔtrpB1 ΔhisD::trpB1 (rechts). Die erwartete Produktlängen und die Namen der Primerpaare sind neben dem Gel rechts gezeigt, ihre Sequenzen finden sich in Kapitel 2.3.4.
Dazu wurden Primerpaare verwendet, die die einzelnen Sequenzbereiche, die Teil der genomischen Veränderung sind, abdecken (Abbildung 68 A). Durch Primerpaar 1, welches abseits der Integrationsstelle bindet, lässt sich die Integrität der isolierten genomischen DNAs nachweisen. Die Primerpaare 2 und 3 führen zur Amplifizierung der flankierenden Bereiche der deletierten hisD Region, jedoch nur, falls sich an entsprechender Position nun trpB1 befindet. Mit Primerpaar 4 hingegen soll die Abwesenheit des zu von hisD in der Doppelmutante verifiziert werden. Abbildung 68 B zeigt das Ergebnis der PCR-Analyse. Die Kontroll-PCR mit Primerpaar 1 lieferte für beide Stämme das erwartete Amplifikationsprodukt. Ebenfalls wie erwartet lieferte das gegen hisD gerichtete Primerpaar 4 im Ausgangsstamm KU216 ein 1000 bp großes Produkt, welches in den untersuchten Transformanten fehlt. Die stromaufwärts und stromabwärts gelegenen Integrationsstellen, also die Bereiche, an denen die homologe Rekombination erfolgt ist, konnten wie geplant nur in KU216 ΔhisD::trpB1 amplifiziert werden (Primerpaare 2 und 3, Produktlänge jeweils 1500 bp). Bei diesen Primerpaaren bindet jeweils ein Primer innerhalb des eingefügten trpB1 und der andere an einer Position, die vom doppelten crossover unverändert bleibt. Somit konnte die geplante genomische Organisation in KU216 ΔhisD::trpB1 bestätigt werden.