Da im IL-10 defizienten Modell nicht alle Tiere eine Darmentzündung entwickelten und die Interpretation der Statistik der telemetrisch erhobenen Parameter durch die geringe Anzahl erkrankter Tiere schwierig war, erfolgte die Belastungsbeurteilung zusätzlich im Modell der akuten DSS-Kolitis. Dieses Modell zeichnet sich v.a. durch seine gute Reproduzierbarkeit und einfache Handhabung aus (CHASSAING et al.
2014). Ein weiterer wesentlicher Vorteil im Vergleich zu den genetischen Kolitismodellen ist die geringe interindividuelle Variabilität in der Ausprägung der Darmentzündung (WIRTZ et al. 2017). Je nach DSS-Konzentration und Empfänglich-keit des Tierstamms wird die Darmentzündung nach etwa drei bis fünf Tagen beobachtet (CHASSAING et al. 2014; RANDHAWA et al. 2014). Nach Absetzen der DSS-Behandlung kommt es zu einer langsamen epithelialen Regeneration.
In der vorliegenden Arbeit erfolgte die Kolitis-Induktion in B6 WT Mäusen durch eine fünftägige Applikation von 1,5 % DSS im Trinkwasser. Um den Verlauf der akuten Kolitis sowie die anschließende Regeneration des Darmepithels exakt zu protokollieren, wurde jede Maus täglich gewogen, klinisch untersucht und die Kotkonsistenz beurteilt. Die telemetrischen Messungen fanden an drei aufeinanderfolgenden Tagen vor DSS-Gabe zur Erhebung der basalen Werte sowie an den zehn folgenden Tagen unter DSS-Gabe statt.
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In Übereinstimmung mit den Beschreibungen der Fachliteratur wiesen die Befunde der klinischen Untersuchung, der Gewichtsverlauf und die telemetrisch erfassten Daten der mit DSS behandelten Tiere ab dem fünften bzw. sechsten Tag nach der Kolitis-Induktion deutliche Veränderungen auf. Passend dazu konnte auch ab Tag 5 bei allen Mäusen der DSS-Gruppe weich-klebriger und teilweise blutiger Kot beobachtet werden.
Im Gegensatz zu den Beobachtungen in der postoperativen Phase und während der Stressversuche konnten in diesem Modell im Rahmen der klinischen Untersuchung Veränderungen des äußeren Erscheinungsbildes bei den mit DSS behandelten Mäusen festgestellt werden. Einige dieser Mäuse fielen durch eine gekrümmte Körperhaltung, struppiges Fell, unvollständig geöffnete Augen sowie ein reduziertes Spontanverhalten auf. Erste Veränderungen zeigten sich hierbei bereits an Tag 3 nach DSS-Gabe. An den Tagen 5 bis 12 war der klinische Score im Vergleich zu den unauffälligen Kontrolltieren signifikant erhöht. Der Verlauf des Körpergewichts zeigte hingegen erst ab dem sechsten Tag einen deutlichen Einbruch. Eine maximale Reduktion des Körpergewichts von 6,2 +/- 1,1 % wurde in der DSS-Gruppe an Tag 8 gemessen. Im Anschluss folgte eine kontinuierliche Gewichtszunahme, wobei das Gewicht an Tag 11 wieder dem Ausgangsgewicht entsprach.
Passend zum Gewichtsverlauf zeigte sich auch ein deutlicher Einbruch in den telemetrisch erhobenen Parametern Temperatur, HRV und Aktivität in der Nacht von Tag 5 auf Tag 6. Diese Parameter blieben in den folgenden vier Tagen im Vergleich zu den Kontrolltieren signifikant erniedrigt. Ab Tag 8 bzw. Tag 9 konnte wieder ein kontinuierlicher Anstieg beobachtet werden. Die Werte für die Herzfrequenz der DSS-Gruppe zeigten hingegen nur an Tag 7 eine Erhöhung, an Tag 10 waren diese im Vergleich zu den unbehandelten Kontrolltieren sogar statistisch signifikant niedriger. Die histologische Auswertung der Darmpräparate der mit DSS behandelten Tiere zeigte an Tag 7 einen deutlich höheren Score als an Tag 14 nach Beginn der DSS-Gabe. Entgegen den Ergebnissen aus den Stressversuchen konnte im Modell der chronischen Kolitis keine signifikante Erhöhung der CORT-Konzentration im Blut gemessen werden.
Die unbehandelten Kontrolltiere zeigten weder im Rahmen der klinischen Untersuchung noch im Gewichtsverlauf Auffälligkeiten. Auch die histologische Untersuchung des Darms war unauffällig. Bei der Analyse der telemetrisch gemessenen Parameter traten lediglich geringe Tagesschwankungen auf.
Insgesamt bestätigten die vorliegenden Ergebnisse der Untersuchungen im Modell der akuten Kolitis die Wirksamkeit der DSS-Lösung zur Induktion einer Darmentzündung. Durchfälle und mangelnde Nahrungsaufnahme durch die mit der akuten Kolitis einhergehenden Schmerzen führen zu einem Gewichtsverlust. Auch die erhöhte Herzfrequenz sowie die verringerte HRV deuten auf eine Sympathikus-aktivierung durch Schmerzen hin. Wie schon in der postoperativen Phase gezeigt,
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erwies sich auch im Modell der akuten Kolitis die HRV als deutlich sensiblerer Parameter. Während die Herzfrequenz der mit DSS behandelten Tiere nur an Tag 7 erhöht war, konnte eine signifikant erniedrigte HRV sogar über vier Tage gemessen werden. An diesen Tagen waren ebenso die Temperatur und die Aktivität statistisch signifikant verringert. Die niedrigsten Werte der Temperatur, HRV und Aktivität konnten an Tag 6 bzw. 7 gemessen werden und zeigten sich somit ein bis zwei Tage früher als das Minimum im Gewichtsverlauf an Tag 8. Im weiteren Verlauf war ein kontinuierlicher Anstieg der Werte dieser telemetrisch erhobenen Parameter zu beobachten, was auf eine langsame Regeneration des Darmepithels nach Absetzen der DSS-Behandlung hindeutet. Bestätigt wurde diese Vermutung durch die histologische Untersuchung der Därme an Tag 14, welche zeigte, dass zu diesem Zeitpunkt bereits eine Regeneration des Darmepithels stattgefunden hatte.
Von Tag 5 auf Tag 6 war ein deutlicher Einbruch in allen telemetrisch gemessenen Parametern der mit DSS behandelten Mäuse zu erkennen. Dieser Einbruch könnte mit der Probennahme, die an Tag 5 stattfand, in Zusammenhang stehen. Bei der Probennahme wurden die Mäuse mittels Nackengriff fixiert und es erfolgte eine Blutentnahme aus der V. facialis. Im Anschluss an die Blutentnahme wurden die Tiere zur Gewinnung der Sammelkotprobe für eine Dauer von zwei Stunden einzeln in einen mit Labsand gefüllten Käfig verbracht. Die Manipulationen, das Verbringen in eine neue Umgebung und die Trennung vom Sozialpartner stellen einen erheblichen Stressfaktor für die Mäuse dar (TABATA et al. 1998; BALCOMBE et al.
2004). Außerdem scheint insbesondere die Blutentnahme aus der V. facialis belastend und mit Schmerzen für das Tier verbunden zu sein (TEILMANN et al.
2014; TSAI et al. 2015). Da dieser Einbruch bei den Kontrolltieren nicht bzw. nur minimal zu erkennen war, kann davon ausgegangen werden, dass die Probennahme alleine nicht zu einer Belastung führte. In Kombination mit der DSS-Gabe könnte sie allerdings einen kumulativen Effekt darstellen und in einer höheren Gesamtbelastung für das Tier resultieren.
Die Tatsache, dass eine Kombination oder Wiederholung verschiedener experimenteller Eingriffe innerhalb eines kurzen Zeitraumes durch kumulative Effekte der Einzelbelastungen eine höhere Gesamtbelastung für das Tier darstellt, wurde in mehreren Studien bewiesen (BAUMANS et al. 1994; TABATA et al. 1998;
FROHLICH et al. 2018). So werden beispielsweise Mäuse durch wiederholte Blutentnahmen deutlich stärker belastet als durch eine einmalige Blutentnahme. Dies zeigte sich in der Studie von Frohlich et al. (2018) durch stärkere Gewichtsverluste, ausgeprägte histologische Gewebeschäden sowie durch eine erhöhte Mortalität.
Zusammengefasst wurde deutlich, dass die im Modell der akuten Kolitis beobachteten Veränderungen in der klinischen Untersuchung und im Gewichts-verlauf, welche auf das Einsetzen der Darmentzündung hindeuten, mit den
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Veränderungen in den telemetrisch gemessenen Parametern korrelieren und somit mit beiden Methoden zeitgleich diagnostiziert werden konnten. Auch die Regenerationsphase nach Absetzen der DSS-Behandlung konnte durch die telemetrischen Daten gut dargestellt werden.
Im Gegensatz zu den Untersuchungen in den anderen Belastungsmodellen konnten im Versuchsverlauf der DSS-induzierten Kolitis erstmals Veränderungen im äußeren Erscheinungsbild der Mäuse beobachtet werden. Diese waren allerdings nicht bei allen Tieren vorhanden, wodurch die berechneten mittleren Scorewerte im Rahmen der klinischen Untersuchung nur Maximalwerte von 2 erreichten. Diese wären in Bezug auf die Belastungsbeurteilung als gering zu interpretieren. Auch der Gewichtsverlust repräsentiert mit einem Maximum von etwa 6 % eher eine geringe Belastung. Die telemetrisch erhobenen Werte zeigten jedoch für die Aktivität einen Einbruch von über 50 % und eine um etwa 30 % verringerte HRV. Veränderungen in diesem Ausmaß deuten auf eine höhere Belastung hin (ARRAS et al. 2007; HÄGER et al. 2018). Anhand der telemetrischen Befunde wäre die Belastung der Tiere im Modell der akuten Kolitis daher als mittelgradig einzustufen.
Die Probennahme allein scheint keinen nachhaltigen Effekt auf die Tiere zu haben. In Kombination mit der DSS-Behandlung könnte sie allerdings zu einer Kumulation der Belastung geführt haben.
Im Modell der akuten Kolitis konnte zu keinem Zeitpunkt ein DSS-induzierter Anstieg der CORT-Konzentration bestimmt werden. Die Analyse der endokrinen Stress-antwort war daher in diesem Modell nicht geeignet um die Belastung der Mäuse durch die akute Darmentzündung aufzuzeigen.
Vergleichend zu den anderen untersuchten Belastungsmodellen erwies sich die Telemetrie auch im Modell der akuten Kolitis als geeignete Methode zur Darstellung der Belastung und somit zur Beurteilung des Wohlbefindens der Mäuse. In diesem Zusammenhang muss auch noch einmal der Vorteil der störungsfreien Messung hervorgehoben werden. Da einige klinische Veränderungen oder Verhaltensweisen der Tiere nur durch einen Experimentator erkannt werden können, sollte die Telemetrie nicht als einzige Methode zur Belastungsbeurteilung, sondern lediglich als Ergänzung zur klinischen Untersuchung eingesetzt werden (DEACON 2006c).
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Miriam Heider
Telemetrische Überwachung zur Belastungsbeurteilung in Mausmodellen für Stress und chronisch entzündliche Darmerkrankungen
Das Wohlergehen von Versuchstieren hat in den letzten Jahrzenten kontinuierlich sowohl in der Gesellschaft als auch in der tierexperimentellen Forschung einen deutlich höheren Stellenwert erlangt. Dies spiegelt sich auch in der Gesetzgebung wider: Laut der EU-Richtlinie 2010/63 ist im Tierversuchsantrag die zu erwartende Belastung der Versuchstiere prospektiv einzuschätzen. Außerdem muss während der Versuchsdurchführung der tatsächliche Schweregrad für jedes einzelne Tier erfasst und dokumentiert werden. Die Belastungsbeurteilung bei Versuchstieren umfasst die Einschätzung und das Erkennen von Schmerzen, Leiden, Schäden sowie Stress und muss unter Berücksichtigung aller beeinflussenden Faktoren individuell erfolgen.
Für viele etablierte Tiermodelle und tierexperimentelle Eingriffe bestehen bis heute Unklarheiten darüber, inwieweit sie das Wohlbefinden der einzelnen Versuchstiere beeinträchtigen. Aufgrund fehlender verbaler Kommunikationsmöglichkeiten von Tieren muss die Belastungseinschätzung anhand von Beobachtungen und physiologisch messbaren Parametern erfolgen. Dabei stellt die Maus, die weltweit am häufigsten in der Forschung eingesetzte Spezies, eine besondere Heraus-forderung dar. Schließlich gehört es zum natürlichen Schutzmechanismus dieser Tiere, vorhandene Schmerzen zu verbergen. Auch wenn in den letzten Jahren erhebliche Fortschritte auf diesem Gebiet gemacht wurden, stehen derzeit kaum objektive, einheitliche und reproduzierbare Messmethoden zur Belastungsbeurteilung von Mäusen zur Verfügung.
Das Ziel dieser Dissertation war es daher, mit Hilfe der Telemetrie belastungs-bedingte Veränderungen physiologischer Parameter von Labormäusen zu erfassen und auf wissenschaftlicher Basis zu beurteilen, um so anhand der gewonnenen Daten die Belastung der Tiere einschätzen zu können. Als Belastungsmodelle dienten hierbei die chirurgische Implantation eines Transmitters, das experimentelle Restraint-Stress-Modell sowie zwei gut etablierte Tiermodelle für CED: das Modell der Interleukin-10 defizienten Maus und das Modell der akuten DSS-induzierten Kolitis.
Die in den verschiedenen Versuchen telemetrisch erhobenen Daten (Temperatur, Herzfrequenz, Herzfrequenzvariabilität und Aktivität) wurden anschließend mit den Befunden der klinischen Untersuchung und mit den Daten von biochemischen Stressmarkern verglichen. Dabei galt es insbesondere heraus zu finden, ob mit Hilfe der Telemetrie auch gering- bis mittelgradige Schmerz- und Belastungszustände objektiv erfasst werden können und daher Vorteile gegenüber dem klinischen
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Scoring bestehen. Des Weiteren wurde der Einfluss von Stress auf die Pathogenese der chronisch entzündlichen Darmerkrankung untersucht.
Für die telemetrische Überwachung von Labormäusen ist zunächst eine chirurgische Implantation eines Transmitters erforderlich. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit konnten bestätigen, dass dieses invasive Verfahren belastend und zunächst mit postoperativen Schmerzen für die Tiere verbunden ist. Allerdings wurde auch deutlich, dass die Tiere sich schnell an den in der Peritonealhöhle liegenden Transmitter gewöhnen. Nach einer Erholungszeit von mindestens zwei Wochen kann die Telemetrie deshalb für Langzeitmessungen an wachen und sich frei in ihrer gewohnten Umgebung bewegenden Mäusen verwendet werden, ohne eine zusätzliche Belastung darzustellen.
In allen untersuchten Belastungsmodellen stellte sich die Telemetrie gegenüber der klinischen Untersuchung als deutlich sensitivere Methode zur Detektion von Schmerz und Belastung dar. Insbesondere die Aktivität und Herzfrequenzvariabilität erwiesen sich als äußerst zuverlässige Indikatoren zur Beurteilung des Wohlbefindens.
Anhand dieser Parameter war es möglich selbst gering- bis mittelgradige Schmerz- und Belastungszustände der Mäuse zu erkennen.
Die klinische Untersuchung war hingegen selten aussagekräftig. So konnten in den Kolitismodellen erst bei Auftreten von Durchfall einhergehend mit starkem Gewichtsverlust Veränderungen im äußeren Erscheinungsbild festgestellt werden.
In den Stressversuchen fand eine schnelle Gewöhnung der Tiere an die sich wiederholende Stressexposition statt. Somit war das verwendete Restraint-Stress-Protokoll nicht geeignet, dauerhaft einen eindeutig stressinduzierten Phänotyp zu erzeugen. Ebenso konnte mit diesem experimentellen Stressprotokoll kein direkter Einfluss von Stress auf die Entwicklung und den Verlauf der chronischen Kolitis festgestellt werden.
Weiterhin konnte gezeigt werden, dass der genetische Hintergrund der Mauslinie einen bedeutenden Einfluss auf die experimentellen Forschungsergebnisse nimmt.
Schon unter basalen Bedingungen wurden mit Hilfe der Telemetrie signifikante Unterschiede in allen erfassten physiologischen Parametern zwischen den B6 und den C3 Mäusen detektiert. Die Untersuchungen in der postoperativen Phase sowie unter experimentellem Stress zeigten außerdem, dass die B6 Mäuse deutlich schmerz- und stressempfindlicher waren als die C3 Mäuse. Sie reagierten in beiden Modellen sensibler und benötigten eine längere Erholungsphase. Diese Ergebnisse verdeutlichen die Problematik einer Übertragung auf andere Inzuchtstämme.
Zusammenfassend zeigten die Ergebnisse dieser Doktorarbeit, dass die Telemetrie eine objektive und reproduzierbare Erfassung belastungsrelevanter Parameter von Labormäusen erlaubt. Da die Tiere zur Erhebung der physiologischen Parameter nicht manipuliert werden müssen, liefert sie robuste und zuverlässige Daten und leistet somit einen wertvollen Beitrag zum Refinement und zur Reduction gemäß des 3R Prinzips.
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Miriam Heider
Severity assessment in mouse models of stress and inflammatory bowel disease by telemetric monitoring
The wellbeing of laboratory animals has gained increasing interest during the last decade in society as well as in the animal research sector itself. This development is also reflected in current legislation: According to EU Directive 2010/63, applications for experimental procedures require an assessment of expected severity imposed on animals. Furthermore, while studies are carried out, mandatory monitoring of the actual severity level for each individual animal requires constant assessment and documentation, including the evaluation of pain, suffering, physical damage as well as psychological stress and needs to be evaluated on an individual basis.
For many well-established animal models and procedures, uncertainty remains in the actual extent of stress experienced by the animal. Due to missing verbal communication, severity assessment takes place through observations and the measurement of physiological parameters. This is particularly challenging in the most widely used laboratory animal - the mouse, because of its natural behaviour of hiding pain. Despite considerable progress in the field, methods for severity assessment in terms of objectivity, standardization and reproducibility are still scarce.
The aim of this thesis was to develop a method to assess stress-induced changes of physiological parameters in laboratory mice through the use of telemetry in order to predict the levels of imposed severity. In order to analyze severity the following mouse models were used: surgical transmitter implantation, restraint stress and two well-established murine models of inflammatory bowel disease (the IL-10 deficient mouse and the DSS-induced colitis).
Acquired telemetry data (temperature, heart rate, heart rate variability and activity) were compared to clinical findings from physical examination and analysis of biochemical markers of stress. Special focus was laid on whether telemetry was able to objectively detect mild to moderate pain and stress levels and if this method has advantages over clinical assessment. Furthermore, the impact of stress on the pathogenesis of chronic inflammatory bowel disease was assessed.
Telemetric surveillance requires laboratory mice to undergo prior surgical implantation of transmitters. The findings of this work confirm that this invasive procedure causes stress and immediate postoperative pain. However, the animals adapted rapidly to the implanted transmitter in the peritoneal cavity. After a recovery period of at least two weeks, telemetric data can be collected continuously from awake and freely moving mice, without further stress induction through the presence of a transmitter.
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In all examined experimental models, telemetry was found to be a much more sensitive method for pain and severity assessment than clinical examination. Here, activity and heart rate variability were particularly relevant indicators for welfare assessment. According to these parameters, it was possible to detect even mild to moderate pain and stress levels in mice.
In contrast, clinical examination was rarely conclusive. In the colitis models, for instance, changes in clinical appearance only occurred when diarrhea and severe weight decrease were present as well.
In the restraint stress model, rapid habituation to repeated stress exposure was observed and thus, the used experimental protocol was found unsuitable to produce a long-term stress-induced phenotype. This experimental stress-induction model was also unable to provide insight on the impact of stress on the development and progression of chronic colitis as well.
Furthermore, this study showed that the genetic background of mouse strains has great impact on experimental results.
Telemetry was able to detect significant differences between B6 and C3 mice in all measured physiological parameters already under baseline conditions.
Data from the postoperative phase and the induced stress experiments showed that B6 mice were significantly more sensitive to pain and stress than C3 mice. They reacted more sensitively and needed a longer recovery period in both models.
These findings illustrate the problem of transmission to other inbred mouse strains.
In summary, the results of this thesis demonstrate that telemetry provides an objective as well as reproducible method for the assessment of physiological parameters related to stress exposure in laboratory mice. Since the animals do not need to be manipulated for the collection of physiological parameters, telemetric monitoring provides robust and reliable data and is thus a valuable contribution to the refinement and reduction according to the 3R principle.
Literaturverzeichnis
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