Durchführung der Medikamententestplattform zur Etablierung

Abb. 29: Aussaat- und Pipettierschema am Beispiel von Zellkulturen

Dargestellt ist das Beispiel eines Pipettierschemas für Zellkulturen unter Berücksichtigung aller Messmethoden, Mehrfachbestimmungen sowie notwendigen Behandlungs- und methodischen Kontrollen. Diese Plattenbelegung wird zur Messung eines jeden Zeitpunktes benötigt.

Am folgenden Tag wurden mikroskopisch Güte und Verwendbarkeit der Kulturen eingeschätzt (s. 3.1.2). Nur wenn nach spätestens drei Tagen eine Konfluenz von mindestens 30% erreicht war, wurden die Zellen behandelt.

Im Hinblick auf die eigentliche Zielsetzung, eine Medikamententestplattform mit An-wendbarkeit an Kurzzeit-Kulturen primärer Zellen und Gewebeschnitte zu entwickeln, werden die benötigten Zell- und Schnittzahlen beider Kultursysteme sowie weitere Parameter zur Durchführung im Abschnitt der Evaluierung näher erläutert (s. 3.2.2).

ersten Überblick über die Wirkung der verschiedenen Medikamente und Kombinatio-nen liefern und somit eine weitere Behandlungsauswahl zur Evaluation ermöglichen.

Die Ergebnisse zu Vitalität und Apoptose sind hier repräsentativ für die Langzeit-Kultur A413 gezeigt. In Abb. 30 sind Beispielmessungen zur Vitalität (ATP) und Apoptose (aktivierte Caspase 3/7) dargestellt.

Abb. 30: Analyse der Vitalität sowie Apoptose in Langzeit-kultivierten A413

Die Vitalität wurde durch ATP-Bestimmung (A), die Apoptose durch Messung des Levels an aktivierter Caspase 3/7 (B) bestimmt. Für die acht Behandlungsvarianten sind die Zeitverläufe von 24h, 48h und 72h abgebildet, wobei DMSO jeweils als Referenz (= 1) verwendet wurde.

Im Vergleich mit den DMSO-Kontrollen, die als Referenz (= 1,0) gesetzt wurden (schwarz), zeigte FOLFOX (dunkelblau) im Vergleich mit seinen Einzelkomponenten 5-FU und Oxaliplatin einen Synergieeffekt, der durch den im Vergleich zu den Einzelkomponenten 5-FU/L und Oxaliplatin schnelleren Abfall des ATP-Levels unter das 0,5-fache und den über 2-fachen Anstieg der aktivierten Caspase 3/7 angezeigt wurde. Die stärksten und am schnellsten auftretenden Effekte, ebenfalls synergis-tisch im Vergleich mit den Einzelkomponenten, zeigte die GOLF-Kombination.

Gemessen wurde ein rascher Abfall des ATP-Levels bis 72h auf nur das 0,1-fache der DMSO-Kontrollen sowie eine knapp 5-fache Aktivierung der Caspase 3/7 bis 48h, die anschließend wieder unter das 2-fache abfiel. Der Inhibitor Iressa^® (gelb) bewirkte im Gegensatz zu allen anderen Medikamenten und Kombinationen keine deutlich von den DMSO-Kontrollen abweichenden Veränderungen.

Die Medikamenteneffekte auf die Proliferation sind ebenfalls in A413 repräsentativ dargestellt. Nach 48h-Behandlung wiesen die DMSO-Kontrollzellen über 85%

proliferierende Zellen auf, durch Behandlung mit Iressa^®wurde dies nicht beeinflusst

A Vitalität

(ATP)

Apoptose (aktivierte Caspase 3/7)

rel.Level

B

(Abb. 31). Alle anderen Behandlungen verursachten einen deutlichen Abfall der Proli-feration, Anteile proliferierender Zellen von 45% bis 0%. Gleichzeitig waren weniger Zellen, eine geringere Konfluenz der Kulturen, erkennbar. Korrespondierend mit den vorherigen Daten zeigte die FOLFOX-Kombination einen deutlichen Proliferations-abfall auf 40%. In diesem Fall jedoch inhibierte die Einzelbehandlung Oxaliplatin die Proliferation der Zellen stärker (10%iger Anteil) als die Kombination. Nach Behand-lung mit GOLF hingegen war keinerlei Proliferation (Proliferationsrate 0%) fest-stellbar. Ein Vergleich mit den anderen Zeitpunkten und der jeweiligen Gesamtzahl der Zellen zeigte, dass schon nach 24h keine proliferierenden Zellen nachweisbar waren und die Zellen abstarben.

Abb. 31: Bestimmung der Proliferationsrate in Langzeit-kultivierten A413

Gezeigt sind repräsentative Beispielbilder der 48h behandelten A413 nach Immunfluoreszenzfärbung des inkorporierten BrdU, 200-fache Vergrößerung mit 100µm-Maßstab. Die BrdU-positiven Zellen (grün) und die Gesamtzahl der Zellen (Hoechst 33342-Kernfärbung, blau) wurden mittels einer Maske ermittelt und die Proliferationsverhältnisse der verschiedenen Behandlungsvarianten berechnet.

DMSO und Iressa^® weisen ein hohes Verhältnis proliferierender Zellen auf, über 85%. 5-FU/L, FOLFOX, IFOX und Oxa zeigen zwischen 45% und 10% proliferierende Zellen, während Gem und GOLF keine Proliferation anzeigen.

Die Messungen zur Vitalität, Apoptose und Proliferation in den anderen Langzeit-kultivierten primären Zellen und den HT29 zeigten Medikamenteneffekte, die unter-schiedlich stark waren. Gleichzeitig wiesen die verschiedenen Medikamente im Vergleich miteinander dieselben Tendenzen auf. Korrespondierend mit den Daten der A413 zeigte immer GOLF die stärksten und schnellsten Effekte, FOLFOX mäßig ausgeprägte und Iressa^® in keinem der Fälle eine erkennbare Wirkung. Die gezeigten Ergebnisse der A413 galten daher als repräsentativ.

Um die Möglichkeit, mit dieser Plattform Reaktionsunterschiede zwischen den ver-wendeten Zellkulturen festzustellen, und die Art der Unterschiede zu zeigen, sind die

Oxa

Iressa^®

FOLFOX 5-FU/L

Gem GOLF

IFOX DMSO

Ergebnisse des multi-funktionellen ELISA zu Expressions- und Phosphorylierungsle-veln der Signaltransduktionskinasen Akt und GSK-3 gezeigt. Die Abb. 32 zeigt den Vergleich der Zellkulturen und der Behandlungsvarianten über die drei Zeitpunkte.

Abb. 32: Expressions- und Phosphorylierungslevel von Signaltransduktionsproteinen

Aufgetragen sind die Ergebnisse der Signaltransduktionskinasen Akt und GSK-3(s. 2.3.4.8).ApAkt, B Akt, C pGSK-3 und D GSK-3. Die Daten der behandelten Zellkulturen HT29, A413, A806 und B429 wurden auf die jeweiligen DMSO-Kontrollen bezogen (= 1) und der Zeitverlauf dargestellt. Die Mittelwerte und Standardabweichungen der vier Zellkulturen sind ebenfalls aufgetragen.

In allen vier Diagrammen wurden die jeweiligen DMSO-Kontrollen der Zellkulturen als Referenzen verwendet und die Messwerte der anderen Behandlungen als relative Änderungen sowie der Mittelwert der vier verschiedenen Zellkulturen aufgetragen.

Wie schon in den Analysen zuvor, erzeugte die Behandlung mit Iressa^®kaum Verän-derungen. Der pAkt-Level (s. Abb. 32 A) stieg mit der Zeit in den HT29 und den B429 auf knapp das 2-fache der DMSO-Kontrollzellen. Die Werte von pGSK-3 sowie der Expressionslevel von Akt und GSK-3 wichen hingegen nicht von denen der DMSO-Kontrollen ab.

Alle anderen Behandlungen führten bei den Langzeit-kultivierten primären Zellen zu einem erkennbaren Abfall unter das 0,5-fache an Akt und pAkt, wobei GOLF nur einen geringfügig stärkeren Effekt als FOLFOX aufwies. Die Level von GSK-3 und

Akt Akt

rel.Änderung

B ^GSK-3beta

GSK-3

rel.Änderung

D

pAkt pAkt

rel.Änderung

A ^pGSK-3beta

pGSK-3

rel.Änderung

C

pGSK-3zeigten als Folge der GOLF-Behandlung hingegen einen deutlich stärkeren Abfall (≤0,1-fach) als FOLFOX (≥0,3-fach).

Wie in den Genexpressionsanalysen (s. 3.1.3.1) wichen die HT29 in ihrer Reaktion deutlich von primären Zellkulturen ab. Die rot hervorgehobenen Messwerte der HT29 verhielten sich kaum oder nur geringfügig anders als ihre mit DMSO behandelten Kontrollzellen. Nach Oxaliplatin-, FOLFOX- bzw. IFOX-Behandlung war bei pGSK-3

hingegen, anders als bei den primären Zellen, ein deutlicher Anstieg auf über das 2-fache zu erkennen. Der steigernde Iressa^®-Effekt auf den Level von pAkt war eben-falls in den HT29 am stärksten ausgeprägt.

Zusammenfassend zeigten diese Analysen zur Entwicklung der Medikamententest-plattform erstens folgende Medikamentenwirkungen:

 Die FOLFOX-Behandlung wies überwiegend stärkere und synergistische Effekte im Vergleich mit den Einzelkomponenten Oxaliplatin und 5-FU/L auf.

 Iressa^®verursachte so gut wie nie signifikante Änderungen.

 Gemcitabin erzeugte als Einzelsubstanz größere Veränderungen in Proliferation, Apoptose und verschiedenen Signaltransduktionskinasen als Oxaliplatin und 5-FU/L.

 Die GOLF-Kombination rief die schnellsten und stärksten Synergieeffekte hervor.

Zweitens unterschieden sich die Zellkulturen hinsichtlich ihrer Sensitivität auf die verschiedenen Medikamente und Kombinationen:

 Die A413 und B429 reagierten insgesamt sehr sensitiv.

 Die A806 waren geringfügig weniger empfindlich.

 Die Zelllinie HT29 zeigte die geringsten Reaktionen allen Behandlungen gegen-über und unterschied sich – wie schon die Qualitätsanalysen mit primären Zellen gezeigt haben (Microarray-Analysen, s. 3.1.1) – auch in ihren Reaktionen auf Medikamente deutlich von anderen In vitro-Zellkulturen.

An sehr geringen Zellzahlen konnten mehrere Parameter der Medikamentenwirkung auf zelluläre und molekulare Prozesse analysiert sowie verschiedene Medikamente, Kombinationen und der zeitliche Verlauf der Wirkungen getestet werden. Gleichzeitig konnten Unterschiede hinsichtlich Reaktionen auf Medikamente verschiedener Langzeit-Kulturen und der Zelllinie HT29 analysiert werden.

Da die Zielsetzung war, eine Medikamententestplattform mit Anwendbarkeit an Kurzzeit-Kulturen primärer Zellen und Gewebeschnitte zu entwickeln, wurde deshalb die etablierte Plattform im Folgenden an diesen beiden Kultursystemen evaluiert.