Diskussion

über-führt werden. Auch bei den Aminen reagiert TA98 insgesamt etwas empfindlicher auf den sterischen Einfluß der Alkylreste als TA100.

volle para-Alkylgruppen bereits die Bindung an die Redoxenzyme stören und damit den ge-samten Prozeß der Mutagenese verlangsamen, ist es unwahrscheinlich, daß eine Inhibierung der oxidativen oder reduktiven Aktivierung allein für die starke Mutagenitätsreduktion der Nitroaromaten 4'iPr-4NBp 96, 4'tBu-4NBp 97, 4'tBu-2Ph5NP 105, 4'tBu-5Ph2NP 107 und 7tBu-2NF 109 oder der Amine 4'iPr-4ABp 115, 4'tBu-4ABp 116, 4'tBu-2Ph5AP 118 und 7tBu-2AF 120 verantwortlich ist. So haben die in Abschnitt D.4 vorgestellten QSAR-Studien zur Bindung an das P450-Redoxsystem keinerlei Hinweise auf einen sterischen Einfluß von para-Alkylgruppen geliefert, obwohl bei diesen Untersuchungen durchaus sterisch an-spruchsvolle Substrate miteinbezogen worden sind.⁹⁰ Auch bei der Reduktion von Nitroben-zolderivaten durch Xanthin-Oxidase spielen nach einer Studie von Tatsumi sterische Faktoren keine oder allenfalls eine untergeordnete Rolle.^216,111

Ein weiterer Beleg dafür, daß sterische anspruchsvolle Substituenten eher einen anderen Schritt der Mutagenese beeinflussen, ergibt sich aus den Mutagenitätsdaten der entsprechen-den Nitrosoderivate¹⁵² in Tabelle 38. Trotz der Tatsache, daß die Nitrosoverbindungen bereits aktiviert sind und sehr leicht in die Hydroxylamine überführt werden können, bewirkte der tert-Butylsubstituent immer noch eine erstaunlich deutliche Reduktion der Mutagenität. So erwies sich 4-Nitrosobiphenyl (4NOBp 89) in beiden Stämmen hochmutagen, während das para-tert-Butylderivat (4'tBu-4NOBp 335) jeweils viel weniger mutagen war (TA98: Faktor 12, TA100: Faktor 6).

Tabelle 38: Mutagenitäten alkylierter 4-Nitrosobiphenyle

Verbindung Revertanten/(10 nmol)^a

TA98-S9 TA98+S9 TA100-S9 TA100+S9

4NOBp 89 35.22 - 73.05 -

4'tBu-4NOBp 335 2.93 - 13.24 -

a Die angegebenen Mutagenitäten in Revertanten/nmol wurden auf Grundlage von Ames-Untersuchungen von Haack berechnet.

Bereits in Abschnitt D.3.1 ist darauf hingewiesen worden, daß die Planarität eines aromati-schen Systems eine wichtige Struktureigenschaft ist, damit ein solches Molekül als Frame-shift-Mutagen wirken und in die DNA interkalieren kann. Diese Annahme wurde durch die Ames-Tests der 2-Nitro-/2-Aminofluorene 3, 4, 108 und 119 in dieser Arbeit untermauert. So waren die flachen Moleküle 2NF 3, 2AF 4 und auch deren Methylderivate 7Me-2NF 108 und 7Me-2AF 119 in TA98±S9 sehr viel stärker aktiv als die entsprechenden, weniger flachen Biphenylverbindungen 4NBp 4, 4ABp 2, 4'Me-4NBp 94 und 4'Me-4ABp 111 (die

Dieder-winkel zwischen den Phenylgruppen betragen etwa 40°). Durch die Einführung von raumfül-lenden Alkylgruppen geht auch die Planarität der Fluorene insgesamt verloren. Dies ist an der Kristallstruktur von 7-Adamantyl-2-nitrofluoren 7Ad-2AF 121, die im Rahmen dieser Arbeit aufgeklärt wurde, klar zu erkennen.

Abb. 91: Kristallstruktur von 7-Adamantyl-2-nitrofluoren

Konsequenterweise verlieren Verbindungen mit iso-Propyl, tert-Butyl oder Adamantylresten ihre Fähigkeit, zwischen die DNA-Basen zu interkalieren und damit ihre mutagenen Eigen-schaften in TA98. Besonders beeindruckend ist ein Vergleich von 4'Me-4NBp 94 mit 4'tBu-4NBp 97, von 7Me-2NF 108 mit 7tBu-2NF 109 bzw. von den entsprechenden Aminen.

Relativ geringe Veränderungen – nämlich der Austausch einer Methyl- gegen eine tert -Butylgruppe – überführen ein hochgradig mutagenes Molekül in einen schwach oder nicht mutagenen Stoff. Diese Verringerung der Aktivität wird nur durch Modifikation der moleku-laren Form bewirkt, während die chemische Reaktivität der Amino- oder Nitrogruppe, die elektronischen Eigenschaften des Grundkörpers oder das Ausmaß an Aromatizität weitgehend unbeeinflußt bleiben.

In TA100 werden statt Frameshift-Mutationen Basen-Substitutionsreaktionen detektiert. Die Planarität des Mutagens sollte daher insgesamt deutlich weniger wichtig sein. Setzt man ein-mal voraus, daß para-Alkylgruppen weder die NO₂-Reduktion noch die NH₂-Oxidation bzw.

die Adduktbildung selbst signifikant inhibieren, würde man in TA100 relativ ähnliche Induk-tionsraten für alle Verbindungen erwarten.ⁱ Dennoch zeigten die experimentellen Daten, daß es auch in TA100 einen deutlichen sterischen Effekt gibt. Spielt die Planarität der Verbindun-gen also hier ebenfalls eine Rolle?

In Kapitel B.3 wurde ausgeführt, daß die meisten aromatischen Amine und Nitroverbindun-gen, darunter 4-Amino-/4-Nitrobiphenyle und 2-Amino-/2-Nitrofluorene, in vivo und in vitro

i Auch hier könnte die geringe Aktivität der extrem hydrophoben Verbindungen durch die geringe Löslichkeit erklärt werden.

hauptsächlich C8-Desoxyguanosinaddukte bilden. Auch auf die konformative Heterogenität als Ursache für unterschiedliche Mutationsraten bei verschiedenen Addukten wurde bereits hingewiesen. Tatsächlich ist die Existenz von unterschiedlichen Konformeren bei DNA-Oligonukleotiden mit C8-Desoxyguanosinaddukten von 4-Aminobiphenyl,²¹⁷ 2-Amino-fluoren,²¹⁸ N-Acetyl-2-aminofluoren^219,220 oder 1-Aminopyren²²¹ durch NMR-Studien (¹H,

13C, ¹⁹F) und Computersimulationen zweifelsfrei bewiesen. Es konnte auch gezeigt werden, daß sich diese Konformationen bei 37 °C ineinander umwandeln können.²²² In der Literatur werden zwei Klassen von Konformationen unterschieden: Bei den sogenannten "B-type"-Konformeren ragt der aromatische Rest des Addukts in die große oder kleine Furche der DNA-Doppelhelix und verändert die Gesamtstruktur der DNA relativ wenig. Anders bei den

"stacked"-Konformeren, bei denen der Adduktkörper in die Helix insertiert ist und die ur-sprüngliche Position des Guanosins einnimmt, während die Base selbst nach außen (in die DNA-Furche) gedreht wird.²²² Man nimmt an, daß insbesondere solche strukturell stark ge-störten Konformere für eine hohe Mutationsrate bei der Replikation verantwortlich sind.²²² Das Verhältnis der Konformere zueinander hängt dabei vom Mutagen selbst (Größe, Planari-tät, Stereochemie), von der Bindung an die DNA (Basentyp, Bindungsstelle C8, N², etc.), aber auch von der Basensequenz um das Addukt ab. Beim direkten Vergleich von Addukt-modifizierten DNA-Oligonukleotiden beobachtete Cho, daß C8-Guanosin-Adduktbildung mit 7-Fluor-2-aminofluoren zur Einstellung einer 45:55 Mischung von "stacked"- zu "B-type"-Konformeren führte, während dieselben Oligonukleotide mit 4'-Fluor-4-aminobiphenyl-addukten ausschließlich in der "B-type"-Konformation vorlagen.²²² Nach dieser und ähnli-chen Studien deutet alles darauf hin, daß der Anteil der "stacked"-Konformere mit zunehmen-der Interkalationsfähigkeit zunehmen-der Addukte generell zunimmt. Für Addukte von 4-Aminobiphenyl 2, 2-Aminofluoren 4 und 2-Aminopyren (2AP) 336 hat man beispielsweise folgende Anteile von "stacked"-Konformeren ermittelt:²²²

Abb. 92: Einfluß der Struktur auf die Konformation (Anteil "stacked"-Konformation)

NH₂ NH₂

NH₂

2 ~10 % 4 ~50 % 336~100 %

Wenn bereits die Struktur des Grundkörpers einen so deutlichen Einfluß auf das Verhältnis der DNA-Konformationen ausübt, ist davon auszugehen, daß auch Substituenten, die die Mo-lekülform verändern, einen ähnlichen Einfluß haben. Besonders bei Addukten mit großen

Alkylresten, die aus dem flachen aromatischen System ein ausgeprägt dreidimensionales Ge-bilde machen, sind starke sterische Wechselwirkungen mit der DNA denkbar, die die Fähig-keit zur Interkalation und damit die konformative Freiheit einschränken. Durch Störung der Interkalation sollte das Verhältnis der Konformere zugunsten des "B-type"-Konformers ver-schoben werden. Wahrscheinlich sind solche Einflüsse auf die konformative Heterogenität für das geringere mutagene Potential der Amino-/Nitroaromaten mit sperrigen Alkylresten im Ames-Test verantwortlich.