Die Dissoziation des Trigger-Faktor-Ribosomen-Komplexes erfolgt sehr langsam . 70

einer Fluoreszenzzunahme. Wie oben beschrieben, kann eine Verdünnung des Komplexes zu dessen Dissoziation führen. Dazu wurden 10 µM BADAN-TF R14C 30 min lang mit 10 µM Ribosomen inkubiert, um eine Ausbildung des Komplexes zu ermöglichen. Dieser wurde anschließend durch Verdünnung auf Endkonzentrationen von je 200, 100 und 50 nM dissozi-iert. Anhand der Zunahme der Fluoreszenz wurde diese Dissoziation beobachtet (Abb. 3-20).

Sie erfolgt sehr langsam mit Halbwertszeiten zwischen 11 s (bei 50 nM) und 19 s (200 nM). In Kontrollexperimenten wurde keine derartige Fluoreszenzänderung beobachtet, wenn 10 µM BADAN-TF R14C in Abwesenheit von Ribosomen auf 50, 100 und 200 nM verdünnt wurden (Abb. 3-20, gestrichelte Linien). Bei Vorliegen eines einfachen Ein-Schritt-Bindungsmodells für die Assoziation von Trigger-Faktor und Ribosom sollte keine derart gro-ße Abhängigkeit der Dissoziationsgeschwindigkeit von der Konzentration der Bindungspartner auftreten. Es deutet sich daher an, dass die Komplexbildung zwischen Trigger-Faktor und Ribosom möglicherweise einem komplexeren Mechanismus unterliegt. Es zeigt sich aber deutlich, dass die Dissoziation dieses Komplexes um Größenordnungen langsamer abläuft als die Dissoziation des Trigger-Faktor-Substrat-Komplexes, welche im Millisekundenbereich stattfindet (vgl. Abschnitt 3.1.1.2.).

180 150

120 90

60 30

0 50 40 30 20 10 0

Zeit (s)

rel. Fluoreszenz

Abb. 3-20: Kinetik der Dissoziation des Komplexes aus 10 µM BADAN-TF R14C und 10 µM Ri-bosomen nach Verdünnung auf 200 nM, 100 nM und 50 nM (von oben nach unten; durchgezogene Linien). Die gestrichelten Linien zeigen die Verdünnung von 10 µM BADAN-TF R14C auf dieselben Endbedingungen in Abwesenheit von Ribosomen. Die Dissoziation des Komplexes wurde durch die Fluoreszenzzunahme bei 507 nm in 10 mM MgCl₂, 6 mM β-Mercaptoethanol, 20 mM Tris/HCl pH 8,0 bei 20°C mit Anregung bei 387 nm beobachtet. Der Angleich monoexponentieller Funktionen an die Daten (glatte Linie) ergab apparente Geschwindigkeitskonstanten von 0,037 s^-1, 0,049 s^-1 und 0,063 s^-1 für 200 nM, 100 nM und 50 nM.

3.1.7.4. Konzentrationsabhängigkeit der Bindungskinetik

Zur genaueren Analyse von Assoziationsreaktionen variiert man die Konzentrationen der Reaktanden. Bei Verwendung markierter Bindungspartner hält man üblicherweise die Konzen-tration der markierten Spezies konstant, während man die KonzenKonzen-tration des Reaktionspartners verändert. Idealerweise wählt man die Konzentrationen dieses Reaktionspartners deutlich höher als die des markierten Moleküls, um sich im kinetischen Bereich „pseudo-erster Ord-nung“ zu bewegen, was die Auswertung der Daten erleichtert. Dies ist hier nicht möglich, da im vorliegenden Fall dann die Konzentration der Ribosomen im oberen mikromolaren Bereich

Abb. 3-21: Kinetik der Assoziation von fluoreszenzmarkiertem Trigger-Faktor mit Ribosomen.

(A) Zeitlicher Verlauf der Assoziation von 2 µM Ribosomen mit (von oben nach unten) 0,5, 1, 2, 3, 5 und 10 µM BADAN-TF R14C anhand der Fluoreszenzzunahme bei 507 nm. An die Daten wurden monoex-ponentielle Kurven angeglichen (glatte Linien) und die Fluoreszenzverläufe auf einen Startwert von null normiert. Die Messung erfolgte in 10 mM MgCl₂, 6 mM β-Mercaptoethanol, 20 mM Tris/HCl pH 8,0 bei 20°C mit Anregung bei 387 nm. (B) Abhängigkeit der Amplituden der Assoziationsreaktion von der Kon-zentration an BADAN-TF R14C (●). Die Amplitudenwerte, die durch Korrektur des Inner-Filter-Effekts (vgl. Teilabbildung D) errechnet wurden, sind mit (○) dargestellt. Der Angleich einer hyperbolischen Bindungskurve an diese korrigierten Datenpunkte (durchgezogene Linie) ergibt einen apparenten K_D-Wert von 7,1 µM. (C) Abhängigkeit der apparenten Raten der Assoziation von der Konzentration an BADAN-TF R14C. Die durchgezogene Linie entspricht einer Datenanalyse für einen Einschritt-Bindungsme-chanismus (Schema 3-6). Daraus ergeben sich Werte von k_on = 0,0010 µM^-1 s^-1 und k_off = 0,0077 s^-1 und somit ein apparenter K_D-Wert von 7,7 µM. Datenpunkte im substöchiometrischen Bereich (0,1 - 1 µM BADAN-TF R14C) wurden für die Analyse nicht berücksichtigt. (D) Fluoreszenz von freiem BADAN-TF R14C als Funktion seiner Konzentration. Die Gerade zeigt die lineare Abhängigkeit bei niedrigen Kon-zentrationen in Abwesenheit des Inner-Filter-Effekts. Der Quotient aus den gemessenen und den erwarte-ten (aus der Geraden berechneerwarte-ten) Fluoreszenzwererwarte-ten wurde benutzt, um die korrigiererwarte-ten Amplituden-werte in Teilabbildung B zu berechnen.

gewählt werden müsste. Ribosomen sind jedoch sehr große Partikel, die Licht streuen und absorbieren – und dies auch noch im Wellenlängenbereich des hier verwendeten Anregungs-lichtes von 398 nm. Dadurch würde die Anregung des Fluorophors massiv beeinflusst, und somit ist der Bereich verwendbarer Ribosomenkonzentrationen auf maximal 5 µM beschränkt.

Aus diesem Grund wurde für die folgenden Assoziationsmessungen die Ribosomenkon-zentration bei konstant 2 µM belassen, während die KonRibosomenkon-zentration an BADAN-TF R14C von 0,1 µM bis 20 µM variiert wurde. Abbildung 3-21 A zeigt exemplarisch die Fluoreszenzver-läufe für sechs verschiedene Konzentrationen. Sie sind so normiert, dass ihre Fluoreszenzwerte zum Start der Messung bei null beginnen. Sowohl die Amplitude als auch die Rate der Assoziation steigen mit zunehmender Konzentration an Trigger-Faktor, und wie schon in Ab-bildung 3-19 A lassen sich alle Zeitverläufe gut durch monoexponentielle Kurven angleichen.

Die apparente Amplitude der Assoziation erreicht ein Maximum bei etwa 15 µM BADAN-TF R14C und sinkt dann wieder leicht ab (Abb. 3-21 B). Diese Abnahme resultiert aus dem so genannten „Inner-Filter-Effekt“: Die hohe Konzentration an Fluorophoren im Testansatz führt zu einer starken Absorption des Anregungslichtes. Das Ausmaß dieses Inner-Filter-Effekts wurde durch Messung der Fluoreszenz von BADAN-TF R14C-Lösungen in Abwesenheit von Ribosomen als Funktion der Konzentration an BADAN-TF R14C bestimmt (Abb. 3-21 D). Unterhalb von 10 µM nimmt dort die Fluoreszenz proportional zur eingesetz-ten Konzentration zu, darüber weicht sie deutlich von der Linearität ab. Das Ausmaß dieser Abweichung wurde verwendet, um die Amplitudenwerte in Abbildung 3-21 B zu normieren.

Die durch diese Korrektur erhaltenen Amplitudenwerte folgen einer hyperbolischen Bindungs-kurve, aus der sich eine Dissoziationskonstante von 7,1 µM für den Komplex zwischen mar-kiertem Trigger-Faktor und Ribosom errechnen lässt.

Abbildung 3-21 C zeigt die gemessenen Raten der Assoziation in Abhängigkeit von der Konzentration an BADAN-TF R14C. Bei einem Einschritt-Bindungsmechanismus (Schema 3-6) sollte unter Versuchsbedingungen „pseudo-erster Ordnung“ diese Auftragung eine lineare Konzentrationsabhängigkeit zeigen.

TFRibosom TF + Ribosom

k_off

TFRibosom TF + Ribosom

k_off

Schema 3-6: Einstufiges Modell für die Komplexbildung von Ribosom und Trigger-Faktor.

Dabei entspricht die Steigung der Geraden der Assoziationsrate kon und der Ordinaten-schnittpunkt der Dissoziationsrate koff. Für Konzentrationen zwischen 2 und 10 µM folgen die Daten näherungsweise diesem Einschrittmodell, wobei die lineare Analyse Werte von kon = 0,0010 µM^-1 s^-1 und koff = 0,0077 s^-1 ergibt. Aus dem Quotienten dieser Werte lässt sich

eine Dissoziationskonstante von 7,7 µM errechnen, welche sehr gut mit dem aus der Ampli-tudenanalyse (Abb. 3-21 B) ermittelten Wert übereinstimmt. Oberhalb von 10 µM weichen die erhaltenen apparenten Geschwindigkeitskonstanten deutlich vom linearen Verhalten ab. Dieses Verhalten ist typisch für ein Zweischrittbindungsmodell (vgl. Schema 3-1 für die Assoziation von Trigger-Faktor und Lactalbumin). Dabei folgt der primären Assoziation der Komplexpart-ner eine nachgelagerte strukturelle Veränderung, welche ganz oder teilweise für die beobachte-te Fluoreszenzänderung verantwortlich ist. Weibeobachte-terhin wäre es möglich, dass die Dimerisierung (vgl. Abschnitt 3.1.4.) und die weitere Tendenz zur Selbstassoziation des Trigger-Faktors bei höheren Konzentrationen (vgl. Abschnitt 3.1.7.5.) die Abweichung von der Linearität bewirken.

3.1.7.5. Verdrängung des markierten Trigger-Faktors vom Ribosom durch