D ETECTION  OF  ENDOGENOUS  AKR1B15   ISOFORMS

Chapter III.1.1.3 demonstrated that AKR1B15 is expressed on RNA level in distinct human  tissues as well as in the BeWo cell line and the SGBS cell strain. In addition, the subcellular  localization studies showed that AKR1B15.1 is a mitochondrial protein whereas AKR1B15.2  is a cytosolic one [III.1.3]. To analyze whether the RNA is translated into protein in vivo      and  to  verify  the mitochondrial  localization  of  AKR1B15.1 in an  immunocytochemical  independent manner, different approaches were performed. 

WE S T E R N B L O T T I N G W I T H H U M A N T O T A L T I S S U E A ND C E L L L YS A T E S  In the first instance, the abundance of AKR1B15 isoforms in different total protein tissues  lysates (adipose tissue, placenta, prostate, testis, skeletal muscle, and thymus) as well as total  cell lysates (BeWo and SGBS) on protein level was analyzed by Western blotting. For this, the  monoclonal rat‐anti‐AKR1B15 clone 9A5 and mouse‐anti‐AKR1B15.2 clone 29D4 antibody  supernatants were used as primary antibodies. 

The Western blots, performed with the monoclonal rat‐anti‐AKR1B15 clone 9A5 and mouse‐

anti‐AKR1B15.2 clone 29D4 primary antibodies, revealed no bands via ECL detection [data  not shown] but showed some more or less intense bands via the more sensitive infrared  fluorescence (IR) detection, using the Licor technology [Figure III‐20]. Exemplary results  gained from Western blots with total tissue and cell lysates using IR‐dye labeled secondary  antibodies are shown in Figure III‐20.  

Although AKR1B15.1 and AKR1B15.2 were easily detectable when transiently overexpressed  in HEK‐293 cells (AKR1B15.1/15.2) by using the monoclonal rat‐anti‐AKR1B15 clone 9A5 and  goat‐anti‐rat‐AlexaFluor 790 antibody pair, either no protein bands or protein bands with a  divergent molecular weight were visible in tissues [Figure III‐20B]. Here, the overexpressed  AKR1B15.1  appeared  as double band possessing a more intense band at the expected  36.5 kDa  and  a  weaker  0.5‐1 kDa  smaller  side  band.  The  rat‐anti‐AKR1B15  clone 9A5  primary antibody acted quite specifically in the HEK‐293 cell background since, with the  exception of one endogenous protein of approximately 45 kDa, no further endogenous  protein bands were visible in HEK‐293 cell samples [Figure III‐20B]. No protein bands  corresponding to the molecular weight of the in HEK‐293 cells overexpressed, untagged  AKR1B15 isoforms were detectable in tissue samples [Figure III‐20B]. Adipose tissue and  placenta samples revealed one to three very weak signals. Among the tissues tested, skeletal  muscle showed the most prominent signals at approximately 20 kDa and 45 kDa and some  weaker signals at approximately 33 kDa, 35 kDa, and 42 kDa. The 20 kDa band, which is far  from the expected molecular weight of the AKR1B15 isoforms, could be found in both  placenta and skeletal muscle samples [Figure III‐20B]. In contrast, the approximately 35 kDa  and 45 kDa bands in the skeletal muscle sample were also visible in the control blot (without  primary antibody) and negative control (HEK‐293), respectively, and thus seemed unlikely  to correspond to an AKR1B15 protein band [Figure III‐20A, B].  

The  monoclonal  mouse‐anti‐AKR1B15.2  clone 29D4  and  IRDye 800CW  goat‐anti‐mouse  antibody pair which should specifically detect the longer AKR1B15.2 isoform recognized,  beside the overexpressed AKR1B15.2 (approx. 40 kDa), several endogenous proteins in both  tissue lysates and HEK‐293 cell lysates [Figure III‐20C]. Some of these signals were also  present in the blots detected via the monoclonal rat‐anti‐AKR1B15 clone 9A5 antibody and  secondary goat‐anti‐rat‐AlexaFluor 790 antibody pair but also in the IRDye 800CW goat‐anti‐

mouse antibody control blot (without primary antibody) and differed from the expected  molecular weight for AKR1B15.2 [Figure III‐20B, C, D].  

  Figure III‐20: The existence of endogenous AKR1B15 isoforms in vivo can only be speculated by  Western blot analysis of total human tissue samples. 

Shown are exemplary Western blots for the detection of endogenous AKR1B15 isoforms in human tissue  samples. The Western blots were performed with total tissue lysate samples of human adipose tissue,  placenta, and skeletal muscle. Lysates of non‐transfected HEK‐293 cells (negative control) and a mixture  of HEK‐293 cells transiently transfected with either pcDNA3.1‐AKR1B15.1 or pcDNA3.1‐AKR1B15.2  (AKR1B15.1/15.2) served as negative and positive controls, respectively. (A, D) Controls without  primary  antibody  for  the identification  of  nonspecific  secondary  antibody  signals.  The  control  membranes  were  only  incubated  in  the  respective  secondary  antibody  dilution:  goat‐anti‐rat‐

AlexaFluor 790  (1:200000)  (A)  or  IRDye 800CW goat‐anti‐mouse  (1:20000) (D).  (B, C)  Membranes  incubated with primary and secondary antibodies for the detection of endogenous AKR1B15 isoforms. 

For the detection of both AKR1B15 isoforms, the membranes were stained via the monoclonal rat‐anti‐

AKR1B15 clone 9A5 primary antibody dilution (1:25) and the respective goat‐anti‐rat‐AlexaFluor 790  secondary antibody dilution (1:200000) (B). The longer AKR1B15.2 was selectively detected by the  monoclonal mouse‐anti‐AKR1B15.2 clone 29D4 primary (1:25 diluted) and the IRDye 800CW goat‐anti‐

mouse secondary antibody (1:20000 diluted) pair (C). 

Protein bands which possibly resulted from endogenous AKR1B15 isoforms are marked by double  daggers; overexpressed AKR1B15.1 and AKR1B15.2 protein bands are marked by stars and arrow heads,  respectively.  

So far, none of the protein bands resulting from the Western blots with the monoclonal  rat‐anti‐AKR1B15 clone 9A5 and mouse‐anti‐AKR1B15.2 clone 29D4 antibodies could have  been directly assigned to the AKR1B15 isoforms in total tissue and cell lysates because none  of the detected signals did accord with the theoretical molecular weight of AKR1B15.1 or  AKR1B15.2 and the signals of the overexpressed AKR1B15 isoforms [Figure III‐20, data not  shown]. However, due to the high specificity of the monoclonal rat‐anti‐AKR1B15 clone 9A5  antibody and the assumption that the antibodies were simply not sensitive enough to detect  endogenous AKR1B15 isoforms in the crowded environment of total tissue lysates, the rat‐

anti‐AKR1B15 clone 9A5 antibody was further used in Western blots with enriched samples. 

PR E D I C T I O N O F P O S T‐T R A N S L A T I O N A L M O D I F I C A T I O N S I T E S        I N AKR1B15 IS O F O R M S 

Since it was not possible to ambiguously detect endogenous AKR1B15 isoforms in human  total tissue or cell lysates, both AKR1B15 isoform sequences were analyzed in silico for sites  of  post‐translational  modifications,  perhaps  preventing  or  diminishing  the  binding  of  antibodies or shifting the molecular weight of the endogenous isoforms.  

  Figure III‐21: Several post‐translational modification sites are predicted in AKR1B15 isoforms. 

Summarized are the results from in silico predictions of post‐translational modification sites in  AKR1B15 isoforms.  

Please note that the prediction of residues which are surface exposed is based on the structure of the  highly related AKR1B10. Residues of the catalytic tetrad are highlighted in bold. The epitopes  targeted by AKB‐1, AKB‐2, and AKB‐3 antibodies are colored in green, yellow, and red, respectively. 

Here  it  was  found  that  various  phosphorylation  sites  as  well  as  some  glycation,  SUMOylation,  and  ubiquitination  sites  are  predicted  for  the  AKR1B15  isoforms  [Figure III‐21]. Although predicted, a glycosylation of the proteins seems unlikely since no  signal peptide for ER or Golgi apparatus import was detectable in any of both isoforms. In  addition, no sulfation site was predicted by the Sulfinator server (ExPASy). Based on the  structure of the highly identical AKR1B10, a portion of the predicted post‐translational  modification sites do not face the surface, e.g., the catalytic Lys106 and Lys78 in AKR1B15.2  and AKR1B15.1, respectively [Figure III‐21, highlighted in bright gray]. Thus, these sites  represent  most probably  false  positive  predictions.  However,  some  predicted sites  are  located within the epitopes targeted by the generated antibodies and might prevent the  binding of antibodies to the AKR1B15 isoforms. Yet, the presence of post‐translational  modifications within the endogenous AKR1B15 isoforms needs to be analyzed by molecular  biological methods in the future. 

WE S T E R N B L O T T I N G W I T H E NR IC H E D M I T O C H O N D R I A        F R O M BEWO C E L L L I N E 

Despite the fact that the rat‐anti‐AKR1B15 clone 9A5 antibody was not very useful for the  detection of endogenous AKR1B15 isoforms in total cell or tissue lysates (probably due to a  limited sensitivity), it was also used in Western blots with enriched mitochondria which  were isolated from BeWo cell line cultures. These Western blots pursued more or less two  objectives: Primary, the detection of endogenous AKR1B15 isoforms in enriched fractions  and secondary, the verification of the mitochondrial subcellular localization of AKR1B15.1.  

  Figure III‐22: The procedure for the isolation of mitochondria from BeWo cell line cultures  yielded sound mitochondria.  

Shown are exemplary Rhodamine 123 fluorescence time curves for the determination of the  integrity of isolated BeWo mitochondria via the relative membrane potential ΔΨ^m.  

The relative membrane potential of 50 ng isolated mitochondria (protein mass) was calculated  according to Equation II‐4 from the intensity of Rhodamine 123 fluorescence prior (‐FCCP)  and after (+FCCP) the decoupling of the respiratory chain by the addition of FCCP in technical  triplicates. Immediate addition of FCCP at the beginning of the measurements served as  negative control.  

FCCP, carbonyl cyanide‐4‐(trifluoromethoxy)‐phenylhydrazone. 

Five confluent cultures in 75 cm² culture flasks were required to harvest a total number of 

2x10⁷ BeWo cells, which were needed per isolation batch. The procedure described in II.3.4 

resulted in a mitochondrial fraction of 360 μg protein per 2x10⁷ BeWo cells. The integrity of  the mitochondrial fraction was analyzed via the membrane potential of intact mitochondria  using Rhodamine 123 fluorescence quenching. Figure III‐22 illustrates that the mitochondrial  fraction (9000xg pellet) contained intact mitochondria with sufficient purity by showing a  relative membrane potential ΔΨ^m of 1.7. 

Western blots with the 800xg and 9000xg pellets, resulting from the isolation of mitochondria  from BeWo cells, demonstrated the endogenous existence of AKR1B15.1 and AKR1B15.2      on protein level in the BeWo cell line [Figure III‐23]. Here, both AKR1B15 isoforms could        be detected in the 800xg pellet (including nuclei, unbroken cells, and cell debris) as well         as the 9000xg pellet (including mitochondria) by using the monoclonal rat‐anti‐AKR1B15  clone 9A5 supernatant and the polyclonal goat‐anti‐rat‐AlexaFluor 790 antibody as primary  and secondary antibody, respectively [Figure III‐23B].  

As a result, both AKR1B15 transcripts, AKR1B15.1 and AKR1B15.2, are translated into low  amounts of protein in vivo since weak protein bands were detected in Western blots with  BeWo cell fractions. The fact that both AKR1B15 isoforms were only visible in enriched  fractions but not in total protein tissue lysate could be explained by a poor expression of  AKR1B15, which was also seen on RNA level [III.1.1.3], and a reduced sensitivity of the  monoclonal antibodies due to possible post‐translational modifications at the epitope sites. 

  Figure III‐23: Endogenous AKR1B15.1 and AKR1B15.2 could be detected in BeWo  cell fractions.  

Shown are Western blots for the detection of endogenous AKR1B15 isoforms. The  Western blots were carried out with fractions (800xg and 9000xg pellets) resulting  from the isolation of mitochondria from BeWo cells. Lysates of non‐transfected  HEK‐293  cells  (negative  control)  and  a  mixture  of  HEK‐293  cells transiently  transfected with pcDNA3.1‐AKR1B15.1 or pcDNA3.1‐AKR1B15.2 (AKR1B15.1/15.2)  served as negative and positive control, respectively. Membranes were stained using  either only the goat‐anti‐rat‐AlexaFluor 790 secondary antibody in a final dilution of  1:200000 (A) or the monoclonal rat‐anti‐AKR1B15 clone 9A5 primary (1:25 diluted)  and goat‐anti‐rat‐AlexaFluor 790 secondary antibody (1:200000 diluted) pair (B).