B IOLOGICAL  SAMPLES

media or supplements for human cell lines / strains  supplier 

biotin  Sigma‐Aldrich^® Co. LLC. 

DMEM (4.5 ^g/^l D‐glucose, with L‐glutamine)   Gibco^®  DMEM/F‐12 (1:1) (with L‐glutamine and 15 mM HEPES)  Gibco^® 

D‐pantothenic acid  Sigma‐Aldrich^® Co. LLC. 

F‐12K Nutrient Mixture Kaighnʹs Modification (with L‐glutamine)   Gibco^® 

FBS Superior  Biochrom GmbH 

MEM with Earle’s salts (with L‐glutamine)   PAA Laboratories GmbH 

AN T I B I OT IC S 

antibiotic  supplier 

ampicillin sodium salt, BioReagent  Sigma‐Aldrich^® Co. LLC. 

kanamycin solution from Streptomyces kanamyceticus,   BioReagent, sterile‐filtered, 50 ^mg/ml in 0.9 % NaCl 

        Sigma‐Aldrich^® Co. LLC. 

spectinomycin dichloride pentahydrate Sigma‐Aldrich^® Co. LLC. 

tetracycline hydrochloride, BioReagent Sigma‐Aldrich^® Co. LLC. 

Zeocin^TM Selection Reagent (100 ^mg/^ml)  Gibco^®

II.12.3. B

IOLOGICAL SAMPLES

 

human total RNA   supplier 

Human Total RNA Master Panel II (Lot. No.: 1112058A)  Clontech Laboratories, Inc.

Human Adipose Total RNA (Lot. No.: 1206519A) Clontech Laboratories, Inc.

Human Ovary Total RNA (Lot. No.: 1203295A) Clontech Laboratories, Inc.

Human Testis Total RNA (Lot. No.: 1105041) Clontech Laboratories, Inc.

 

human protein lysate  supplier 

Adipose (Human) Total Protein Lysate (Lot. No.: GR135207‐1) Abcam^®plc. 

Human Placenta Protein Medley (Lot. No.: 1302243A) Clontech Laboratories, Inc.

Human Testis Protein Medley (Lot. No.: 1207139A) Clontech Laboratories, Inc.

Human Thymus Protein Medley (Lot. No.: 1002151A)  Clontech Laboratories, Inc.

Placenta (Human) Tissue Lysate (Lot. No.: GR138837‐5) Abcam^®plc. 

Prostate (Human) Tissue Lysate (Lot. No.: GR79390‐2) Abcam^®plc. 

Skeletal Muscle (Human) Tissue Lysate (Lot. No.: GR68330‐8)  Abcam^®plc. 

     

II.12.4. P

LASMIDS

 

PU R C H A S E D A N D D O N A T E D PL A S M I D S 

purchased plasmid  supplier 

Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit 2.0 Addgene, Inc. 

pAcGFP‐N1  Clontech Laboratories, Inc.

pcDNA4‐myc/His B  Invitrogen^TM 

pcGoldyTALEN  Addgene, Inc. 

pCMV DsRed‐Express2 Clontech Laboratories, Inc.

pDsRed2‐ER  Clontech Laboratories, Inc.

pPICZ‐A  Invitrogen^TM 

 

donated plasmid  cloning sites (CDS)  supplier 

N‐myc‐pcDNA3   ‐ Ferdinand Haller, HMGU (IEG)

pCAG‐Rab‐ZFN‐A / ‐ZFN‐B   ‐ Ralf Kühn, HMGU (IDG)

pcDNA3.1(+)‐AKR1B15.1  HindIII / XhoI Oleg Barski, U of L  pcDNA3.1(+)‐AKR1B15.2  HindIII / XhoI Oleg Barski, U of L 

pcDNA4‐myc/His B‐HSD17B12  BamHI / EcoRI Ferdinand Haller, HMGU (IEG)

pCMV‐hLuci   ‐ Ralf Kühn, HMGU (IDG)

pCMV‐Rab‐Reporter   ‐ Ralf Kühn, HMGU (IDG)

pCMV‐Univ‐Duplirep   ‐ Ralf Kühn, HMGU (IDG)

pCMV‐βGal   ‐ Ralf Kühn, HMGU (IDG)

pET16b(+)‐3αHSD2 (= AKR1C3)  NcoI / BamHI Trevor Penning, UPenn 

pET28a(+)‐AKR1B1  NdeI / XhoI Oleg Barski, U of L 

generated plasmid  cloning sites (CDS)  template (CDS)  insert/mutagenesis primers

N‐myc‐pcDNA3‐AKR1B15.1  NotI / XhoI pcDNA3.1(+)‐AKR1B15.1  # 2544 + # 2546 N‐myc‐pcDNA3‐AKR1B15.1 S8R   ‐ N‐myc‐pcDNA3‐AKR1B15.1  # 2680 + # 2681 N‐myc‐pcDNA3‐AKR1B15.2  NotI / XhoI pcDNA3.1(+)‐AKR1B15.2  # 2545 + # 2546 pAcGFP‐N1‐AKR1B10 (Met1‐Ala38) 

alias: pAcGFP‐AKR1B10_1015‐RV‐3  HindIII / AgeI  pET28a(+)‐AKR1B10 # 2541 + # 2708 pAcGFP‐N1‐AKR1B10 (Met1‐Glu30) 

alias: pAcGFP‐AKR1B10_10‐RV‐1  HindIII / AgeI  pET28a(+)‐AKR1B10 # 2541 + # 2707 pAcGFP‐N1‐AKR1B10 K22R       

alias: pAcGFP‐AKR1B10 K22R (Met1‐Ala38)   ‐ pAcGFP‐AKR1B10_1015‐RV‐3  # 2921 + # 2922 pAcGFP‐N1‐AKR1B10 P24L      

alias: pAcGFP‐AKR1B10 P24L (Met1‐Ala38)   ‐ pAcGFP‐AKR1B10_1015‐RV‐3  # 2919 + # 2920 pAcGFP‐N1‐AKR1B15.1 (Met1‐Ala38) 

alias: pAcGFP‐AKR1B15.1_1015‐RV‐3  HindIII / AgeI  pcDNA3.1(+)‐AKR1B15.1  # 2541 + # 2708 pAcGFP‐N1‐AKR1B15.1 (Met1‐Glu30) 

alias: pAcGFP‐AKR1B15.1_15sl‐RV‐1  HindIII / AgeI  pcDNA3.1(+)‐AKR1B15.1  # 2541 + # 2705 pAcGFP‐N1‐AKR1B15.1 (Met1‐Gly26) 

alias: pAcGFP‐AKR1B15.1_15s‐RV‐4  HindIII / AgeI  pcDNA3.1(+)‐AKR1B15.1  # 2541 + # 2711 pAcGFP‐N1‐AKR1B15.2 (Met1‐Ala66) 

alias: pAcGFP‐AKR1B15.2_1015‐RV‐3  HindIII / AgeI  pcDNA3.1(+)‐AKR1B15.2  # 2542 + # 2708

generated plasmid  cloning sites (CDS)  template (CDS)  insert/mutagenesis primers

pAcGFP‐N1‐AKR1B15.2 (Met1‐Glu58) 

alias: pAcGFP‐AKR1B15.2_15sl‐RV‐1  HindIII / AgeI  pcDNA3.1(+)‐AKR1B15.2  # 2542 + # 2705 pAcGFP‐N1‐AKR1B15.2 (Met1‐Leu30) 

alias: pAcGFP‐AKR1B15.2_15l‐RV‐2  HindIII / AgeI  pcDNA3.1(+)‐AKR1B15.2  # 2542 + # 2704 pcDNA3.1(+)‐AKR1B15.1 S8R   ‐ pcDNA3.1(+)‐AKR1B15.1  # 2680 + # 2681 pcDNA4‐myc/His B‐AKR1B15.1  NotI / HindIII pcDNA3.1(+)‐AKR1B15.1  # 2541 + # 2543 pcDNA4‐myc/His B‐AKR1B15.1 S8R   ‐ pcDNA4‐myc/His B‐AKR1B15.1  # 2680 + # 2681 pcDNA4‐myc/His B‐AKR1B15.2  NotI / HindIII pcDNA3.1(+)‐AKR1B15.2  # 2542 + # 2543

pcGoldyTALEN‐AcGFP DraIII pAcGFP‐N1 # 2945 + # 2946

pcGoldyTALEN‐AcGFP‐AKR1B15‐

E2(26)_TAL1  DraIII pAcGFP‐N1 # 2945 + # 2946

pcGoldyTALEN‐DsRed‐AKR1B15‐

E2(26)_TAL2  DraIII pCMV DsRed‐Express2 # 2943 + # 2944

pcGoldyTALEN‐ΔLNGFR‐AKR1B15‐

E2(26)_TAL2  DraIII pMACS‐ΔLNGFR # 2945 + # 2946

pCMV‐Duplirep‐AKR1B15.1  BstBI / NruI ‐ # 2818 + # 2819

pCMV‐Duplirep‐AKR1B15.2  BstBI / NruI ‐ # 2816 + # 2817

pCMV‐Duplirep‐AKR1B15‐E2  BstBI / NruI ‐ # 2820 + # 2821

pET28a(+)‐AKR1B15.2  NdeI / XhoI pcDNA3.1(+)‐AKR1B15.2  # 2799 + # 2546 pET28a(+)‐AKR1C3  NdeI / XhoI pET16b(+)‐3αHSD2 # 2914 + # 2913 pET28a(+)‐hAKR1A1  NdeI / XhoI human liver cDNA # 2883 + # 2884 pIRES‐hrGFP‐1α‐AKR1B15.2  NotI / XhoI pcDNA3.1(+)‐AKR1B15.2  # 2533 + # 2534 pPICZ‐A‐HSD17B12  EcoRI / NotI pcDNA4‐myc/His B‐HSD17B12  # 2242 + # 2243

 

pFUS‐A_AKR1B15.1_TAL1  pNH1, pNH2, pHD3, pHD4, pNI5, pHD6, pNH7, pNG8, pNG9, pNG10

pFUS‐A_AKR1B15.1_TAL2  pNH1, pHD2, pHD3, pHD4, pNI5, pNH6, pNH7, pHD8, pHD9, pHD10

pFUS‐A_AKR1B15.2_TAL1  pHD1, pNI2, pNI3, pHD4, pNG5, pNI6, pNI7, pHD8, pNI9, pNI10

pFUS‐A_AKR1B15.2_TAL2  pHD1, pNI2, pNI3, pNI4, pNH5, pNH6, pNH7, pHD8, pHD9, pNI10 

pFUS‐A_AKR1B15‐E2_TAL1  pNG1, pNG2, pNG3, pHD4, pNI5, pNH6, pNG7, pHD8, pNG9, pHD10

pFUS‐A_AKR1B15‐E2_TAL2  pHD1, pNI2, pNI3, pNG4, pNH5, pNH6, pHD7, pHD8, pNI9, pHD10

pFUS‐B4_AKR1B15.2(67)_TAL2  pNI1, pHD2, pNH3, pNH4

pFUS‐B4_AKR1B15‐E2(25)_TAL1  pNG1, pNG2, pHD3, pNG4

pFUS‐B5_AKR1B15.1(36)_TAL1  pNH1, pNG2, pNH3, pNH4, pNI5

pFUS‐B5_AKR1B15.2(66)_TAL2  pNI1, pHD2, pNH3, pNH4, pNH5

pFUS‐B5_AKR1B15‐E2(26)_TAL1  pNG1, pNG2, pHD3, pNG4, pHD5

pFUS‐B6_AKR1B15.1(40)_TAL2  pNI1, pHD2, pNI3, pNI4, pNG5, pNH6

pFUS‐B7_AKR1B15‐E2(26)_TAL2  pHD1, pNG2, pNG3, pHD4, pNI5, pHD6, pHD7 

pFUS‐B8_AKR1B15.2(66)_TAL1  pHD1, pNG2, pNG3, pHD4, pHD5, pNI6, pHD7, pHD8 

pFUS‐B8_AKR1B15‐E2(25)_TAL2  pHD1, pNG2, pNG3, pHD4, pNI5, pHD6, pHD7, pNH8 

pFUS‐B9_AKR1B15.1(36)_TAL2  pNI1, pHD2, pNI3, pNI4, pNG5, pNH6, pNH7, pNH8, pHD9 

pFUS‐B9_AKR1B15.1(40)_TAL1  pNH1, pNG2, pNH3, pNH4, pNI5, pNH6, pHD7, pNG8, pHD9 

pFUS‐B9_AKR1B15.2(67)_TAL1  pHD1, pNG2, pNG3, pHD4, pHD5, pNI6, pHD7, pHD8, pNI9 

II.12.5. A

NTIBODIES

 

primary antibody  from  working dilution  supplier 

Anti‐c‐Myc clone 9E10 (# 11667203001)  mouse 1:1000 Roche Diagnostics GmbH  His‐Tag Monoclonal Antibody  mouse 1:4000 ‐1:5000 Novagen^®

His‐Tag Antibody (# 2365) rabbit 1:1000‐1:2000 Cell Signaling Technology, Inc.

mouse‐anti‐AKR1B15.2 clone 29D4   mouse 1:10‐1:40 Elisabeth Kremmer, HMGU (IMI) rabbit‐anti‐AKR1B15 (polyclonal)  rabbit  1:200‐1:2000 21^stCentury Biochemicals, Inc. 

rat‐anti‐AKR1B15 clone 19E5   rat 1:10‐1:20 Elisabeth Kremmer, HMGU (IMI) rat‐anti‐AKR1B15 clone 7B1   rat 1:10‐1:20 Elisabeth Kremmer, HMGU (IMI) rat‐anti‐AKR1B15 clone 9A5   rat 1:10‐1:40 Elisabeth Kremmer, HMGU (IMI)

 

+ other tested monoclonal antibody clones listed in VI.3:

   mouse‐anti‐AKR1B15   mouse 1:10 Elisabeth Kremmer, HMGU (IMI)

   rat‐anti‐AKR1B15  rat 1:10 Elisabeth Kremmer, HMGU (IMI)

 

secondary antibody  from  working dilution  supplier 

anti‐mouse IgG1 ‐ HRP rat 1:1000 Elisabeth Kremmer, HMGU (IMI) anti‐mouse IgG2A ‐ HRP  rat 1:1000 Elisabeth Kremmer, HMGU (IMI) anti‐mouse IgG2B ‐ HRP rat 1:1000 Elisabeth Kremmer, HMGU (IMI) anti‐rabbit IgG (whole molecule)       

‐ Peroxidase (# A‐6154) goat 1:5000 Sigma‐Aldrich^® Co. LLC. 

anti‐rat IgG1 ‐ HRP  mouse 1:1000 Elisabeth Kremmer, HMGU (IMI) anti‐rat IgG2A ‐ HRP  mouse 1:1000 Elisabeth Kremmer, HMGU (IMI) anti‐rat IgG2B ‐ HRP  mouse 1:1000 Elisabeth Kremmer, HMGU (IMI) anti‐rat IgG2C ‐ HRP  mouse 1:1000 Elisabeth Kremmer, HMGU (IMI) goat‐anti‐mouse IgG (H+L)       

‐ Alexa Fluor^® 488   (# A‐11029)  goat 1:2000 Molecular Probes^® 

goat‐anti‐mouse IgG (H+L)       

‐ IRDye^® 800CW   (# 926‐32210)  goat 1:20000 LI‐COR^®Biosciences GmbH 

goat‐anti‐mouse IgG + IgM (H+L)      

‐ HRPO   (# 115‐035‐068) goat 1:10000‐1:15000 Dianova GmbH 

goat‐anti‐rabbit IgG (H+L)      

‐ HRP   (# A16104)  goat 1:1000 ‐1:5000 Life Technologies / Novex^® 

goat‐anti‐rabbit IgG (H+L)      

‐ Alexa Fluor^® 488   (# A‐11008)  goat 1:2000 Molecular Probes^® 

goat‐anti‐rat IgG (H+L)      

‐ Alexa Fluor^® 488   (# A‐11006)  goat 1:2000 Molecular Probes^® 

goat‐anti‐rat IgG (H+L)      

‐ Alexa Fluor^® 790   (# 112‐655‐143)  goat 1:200000 Dianova GmbH 

goat‐anti‐rat IgG + IgM (H+L)      

‐ HRPO   (# 112‐035‐068) goat 1:8000 Dianova GmbH 

II.12.6. E

NZYMES

 

enzyme + buffer / enzyme mixture / enzyme kit  supplier 

AffinityScript qPCR cDNA Synthesis Kit Agilent Technologies, Inc. 

BigDye3.1^® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit Applied Biosystems^®  BsaI (10000 ^U/^ml)  +  10x CutSmart Buffer New England BioLabs, Inc. 

BsmBI (10000 ^U/^ml)  New England BioLabs, Inc. 

BstBI (20000 ^U/ml)  +  10x CutSmart Buffer New England BioLabs, Inc. 

enzyme + buffer / enzyme mixture / enzyme kit  supplier 

CloneAmp^TM HiFi PCR Premix (2x)  Clontech Laboratories, Inc. 

DpnI (20000 ^U/^ml)  New England BioLabs, Inc. 

DraIII‐HF (20000 ^U/^ml)  +  10x CutSmart Buffer New England BioLabs, Inc. 

DreamTaq DNA Polymerase (5 ^U/^μl)       +  10x DreamTaq Green Buffer 

       Thermo Scientific 

DreamTaq Green PCR Master Mix (2x)  Thermo Scientific  House‐Taq  +  10x Standard Taq Buffer  in‐house (lab‐made)  Lyticase from Arthrobacter luteus, lyophilized, ≥ 2000 ^u/^mg protein Sigma‐Aldrich^® Co. LLC. 

NdeI (20000 ^U/^ml)  +  10x CutSmart Buffer New England BioLabs, Inc. 

NruI (10000 ^U/ml)  +  10x NEB3.1 Buffer  New England BioLabs, Inc. 

Phusion^® High‐Fidelity DNA Polymerase (2000 ^U/^ml)        +  5x Phusion^® HF Buffer 

       New England BioLabs, Inc. 

Plasmid‐Safe^TM ATP‐dependent DNase (10 ^U/^μl)       +  25 mM ATP solution 

       Epicentre^®Biotechnologies  QuikChange Lightning Site‐Directed Mutagenesis Kit Agilent Technologies, Inc. 

RNase‐Free DNase I Set Qiagen GmbH 

SacI‐HF (20000 ^U/ml)  +  10x CutSmart Buffer New England BioLabs, Inc. 

T4 DNA Ligase (400000 ^U/ml)  +  10x T4 DNA Ligase Buffer New England BioLabs, Inc. 

Taq DNA Ligase (40000 ^U/^ml)  +  10x TaqLigase Buffer New England BioLabs, Inc. 

Trypsin‐EDTA (0.05 %), phenol red  Gibco^®

Im Dokument Characterization of the novel human aldo-keto reductase AKR1B15 and the 17beta-hydroxysteroid dehydrogenase 17beta-HSD12 and analysis of vitamin D metabolism in cells  (Seite 94-98)