Cofilin1-Deletion während der T-Zell-Entwicklung mit Hilfe der CD4-Cre-

Cofilin1 spielt eine wichtige Rolle bei der Embryonalentwicklung. Ein KO des Proteins führt letztendlich zu einem Defekt beim Schließen des Neuralrohrs und ist embryonal letal (G^URNIAK et al., 2005). Um dies zu umgehen und den KO von Cofilin1 in T-Zellen untersuchen zu können, wurde auf ein konditionales Mausmodell zurückgegriffen (vgl. Abbildung 4.10).

Abbildung 4.10: Rekombinationsschema des konditionalen Cofilin1-Mausmodells. In dieser Mauslinie ist das Exon 2 des Cofilin1-Gens durch loxP-Stellen flankiert, sodass dieses nach Cre-vermittelter Deletion herausgeschnitten und das Cofilin1-Gen nicht mehr exprimiert wird. Weiterhin ist auch die Lage der EcoRI-Schnittstellen und die Lage der Southern-Sonde, die in der 5‘-UTR-Region des Cofilin1-Gens bindet, in der Abbildung markiert.

Das Cofilin1-Gen umfasst 4 Exons, wobei das Exon 1 nur das Startcodon beinhaltet. In dieser Mauslinie wird das Exon 2 von loxP-Stellen flankiert, welches über Cre-vermittelte Deletion entfernt werden kann und dann eine Leserasterverschiebung hervorruft. Dadurch wird die Translation verfrüht abgebrochen und das Cofilin1-Protein kann nicht transkribiert werden.

Durch den Einsatz gewebespezifischer Cre-Rekombinasen kann somit die Expression von Cofilin1 gezielt deletiert werden.

Vorangegangene Studien haben gezeigt, dass die Deletion mit Hilfe der CD4-Cre-Rekombinase von Cofilin1 während einer frühen Phase der T-Zellentwicklung im Thymus zu einer Blockade der Reifung führt und somit keine T-Zellen heranreifen, die in die peripheren lymphatischen Organe emigrieren (S^ALZ, 2011). Für den KO von Cofilin1 in reifen, einfach positiven T-Zellen wird daher eine Cre-Rekombinase benötigt, die in einer späten Phase der T-Zellreifung aktiv ist. Dazu wurde im Rahmen dieser Arbeit die distalLck-Cre-Rekombinase verwendet (ZHANG et al., 2005). Abbildung 4.11 zeigt schematisch die T-Zellreifung im Thymus und die Phasen, zu welchen die genannten Cre-Rekombinasen aktiv sind.

Abbildung 4.11: Cre-vermittelte Deletion zu verschiedenen Phasen der T-Zellreifung im Thymus. Die CD4-Cre-Rekombinase deletiert während der DN3-Phase, während die distalLck-Cre-CD4-Cre-Rekombinase hingegen ihre Aktivität im Anschluss an die positive Selektion zeigt.

Die Entwicklung der T-Zellen erfolgt aus Vorläuferzellen, die aus dem Knochenmark stammen, in den Thymus einwandern und über vier doppelte negative Stadien (DN1-DN4) hin zu doppelt positiven Thymozyten (DP) heranreifen. Darauf folgt die positive Selektion, wobei die Thymozyten weiter vermehrt werden, die körpereigene MHC-Moleküle erkennen können. Dann erfolgt die negative Selektion, wobei Thymozyten eliminiert werden, die körpereigene Antigene erkennen, bevor die T-Zellen als reife, einfach positive Zellen in die Peripherie auswandern. Die Bezeichnung der Stadien bezieht sich auf die Expression der beiden Co-Rezeptoren CD4 und CD8. Die CD4-Cre-Rekombinase (CD4-Cre) zeigt ihre Aktivität in der DN3-Phase, während die distalLck-Cre-Rekombinase (dLck-Cre) erst nach der postiven Selektion aktiv ist.

4.3.1.1. Rosy-Reportermaus-Untersuchungen belegen die Aktivität der verwendeten-Cre-Rekombinasen

Zur Analyse der Aktivität der CD4- und der dLck-Cre-Rekombinase im Hinblick auf den Zeitpunkt während der T-Zellreifung im Thymus wurden Cre-Mäuse mit Rosy-Reportermäusen gekreuzt. In Rosy-Rosy-Reportermäusen befindet sich stromabwärts des ROSA26-Promotors eine gefloxte Stopp-Kassette gefolgt von der kodierenden Region des eYFP-Gens. Eine Cre-vermittelte Rekombination führt zur Deletion der Stopp-Kassette und zur Expression des eYFP-Reportergens (SRINIVAS et al., 2001), welches dann in allen Zellen exprimiert wird, in denen die Cre-Rekombinase aktiv war. Für die Untersuchung wurden Thymozyten, sowohl von Rosy:CD4-Cre-, als auch von Rosy:dLck-Cre-Mäusen gewonnen, mit

Antikörpern gegen CD4 und CD8 gefärbt und im FACS auf grüne Fluoreszenz hin analysiert (siehe Abbildung 4.12).

Abbildung 4.12: Vergleich der Aktivität der CD4- und der dLck-Cre-Rekombinase in Thymozyten mit Hilfe der Rosy-Reportermaus. Thymozyten von Rosy:CD4-Cre- und Rosy:dLck-Cre-Mäusen wurden mit Immunfluoreszenzmarkern für CD4 und CD8 gefärbt und mit dem Durchflusszytometer untersucht. Dabei wurde auf die Thymozyten gegatet. In grün sind jeweils die YFP-positiven Zellen dargestellt, während in grau alle nicht rekombinierten Zellen abgebildet sind. Die Dotplots zeigen eine Gesamtübersicht über alle Zellen. In den Histogrammen sind die Ergebnisse für die einzelnen Populationen (DN, DP, CD4, CD8) im Thymus aufgeschlüsselt. (A-E) zeigt die Resultate für die Rosy:CD4-Cre-Zellen, (E-J) für die Rosy:dLck-Cre-Zellen.

Die FACS-Analyse zeigt, dass bei den Thymozyten der Rosy:CD4-Cre-Tiere in der DN-Phase YFP-positive Zellen vorliegen und der Anteil an rekombinierten Zellen ab dieser Phase deutlich zunimmt. Allerdings kommen letztendlich bei den CD4⁺-T-Zellen verhältnismäßig mehr grüne Zellen vor als bei CD8⁺-T-Zellen. Die Rekombination findet schon in einem DN-Stadium statt, sodass in CD4⁺- als auch in CD8⁺-T-Zellen Rekombination erfolgt. In den CD4⁺ -T-Zellen sind mehr rekombinierte Zellen zu finden, da die Rekombinase unter dem CD4-Promotor exprimiert wird. Bei den Rosy:dLck-Cre-Thymozyten findet man YFP-positive Zellen erst ab der einfach positiven Phase, wobei der Anteil in der CD8⁺-Population fünfmal höher ist als bei den CD4⁺-T-Zellen. Die durch die dLck-Cre vermittelte Rekombination erfolgt erwartungsgemäß später in der T-Zellreifung und ist in CD8⁺-T-Zellen stärker ausgeprägt, was die Literatur bestätigt (ZHANG et al., 2005).

Da die durch die CD4-Cre-Rekombinase vermittelte Deletion von Cofilin1 zu einer Blockade in der T-Zellreifung führt, wurden nun periphere T-Zellen mit einer Cofilin1-Deletion mit Hilfe der dLck-Cre-Rekombinase erhalten. Um die Rekombination der dLck-Cre-Rekombinase in T-Zellen der Peripherie beurteilen zu können, wurden ebenfalls T-Zellen aus Lymphknoten, Milz

und Blut der Rosy:dLck-Cre-Tiere, wie im Abschnitt zuvor bereits beschrieben, untersucht.

Die Ergebnisse sind in Abbildung 4.13 zusammengestellt.

Abbildung 4.13: Untersuchung der Aktivität der dLck-Cre-Rekombinase in peripheren T-Zellen mittels der Rosy-Reportermaus. T-Zellen aus Lymphknoten, Milz und Blut von Rosy:dLck-Cre-Mäusen wurden mit Immunfluoreszenzmarkern für CD4 und CD8 gefärbt und mit dem Durchflusszytometer untersucht. Dabei wurde auf die Lymphozyten gegatet. In grün sind jeweils die YFP-positiven Zellen dargestellt, während in grau alle nicht rekombinierten Zellen abgebildet sind. Die Dotplots zeigen eine Gesamtübersicht über alle Zellen. In den Histogrammen sind die Ergebnisse für die CD4⁺- und CD8⁺-T-Zellen aufgeschlüsselt. Es wurde auf die Lymphozyten gegatet. In (A-C) sind die Ergebnisse für T-Zellen aus Lymphknoten, in (D-F) für T-Zellen aus Milz und in (G-I) die Ergebnisse für T-Zellen aus Blut dargestellt.

Die Untersuchung der peripheren T-Zellen aus Rosy:dLck-Cre-Tieren zeigt, dass der Anteil an YFP-positiven Zellen in allen lymphatischen Organen sehr hoch ist. Während er in CD4-positiven Zellen bei um die 70 % liegt, ist er bei CD8-CD4-positiven Zellen um die 95 % angesiedelt. Eine 100 %ige Deletion ist mit Hilfe des Cre/loxP-Systems nicht möglich.