Bedeutung der Cofilin1-Aktivität für T-Zellen

Abbildung 4.14: Southernblot-Analyse zur Untersuchung der Deletion in der konstitutiv aktiven und inaktiven Cof1-Mutante. Analysiert wurden Zellen von Cof1^fl/+-, Cof1^fl/Ala-, Cof1^fl/Asp-, Cof1^fl/Ala:CD4-Cre- und

Cof1^fl/Asp:CD4-Cre-Tieren aus Thymus, Lymphknoten und Schwanz. (Die WT-Banden bei den Proben der

Cof1^fl/Ala- und Cof1^fl/Ala:CD4-Cre-Tiere aller Organe sind unspezifischer Hintergrund.)

Die Analyse zeigt erwartungsgemäß eine nahezu vollständige Deletion des gefloxten Cofilin1-Allels mittels der CD4-Cre-Rekombinase in den Thymus-Zellen, sowohl bei der Ala- als auch bei der Asp-Mutante. Daraus kann man folgern, dass in den Thymozyten nur das mutierte Allel exprimiert wird. In den Zellen aus Lymphknoten ist bei der Ala-Mutante die Cofilin1-flox-Bande noch deutlich zu sehen. Bei der Asp-Mutante ist die Cofilin1-flox-Bande noch vorhanden, aber im Vergleich zum Cof1^fl/Asp-Kontrolltier schwächer ausgeprägt. Dies läßt darauf schließen, dass in peripheren T-Zellen beider Mutanten neben dem mutierten Allel auch weiterhin das gefloxte Allel exprimiert wird. Allerdings ist hier zu vermerken, dass in Lymphknoten neben T-Zellen auch andere Zellen, wie z.B. B-Zellen, dendritische Zellen, Makrophagen und Granulozyten vorkommen, in denen aufgrund der Verwendung der T-Zell-spezifischen CD4-Cre-Rekombinase keine Deletion vorliegen kann. Daher könnte man vermuten, dass auch in diesen Zellen eine Deletion vorliegt, sofern die T-Zellreifung nicht beeinträchtigt ist und die Zellen in die peripheren lymphatischen Organe auswandern können. Bei den Proben aus Schwanz-DNA ist sowohl bei der Ala- als auch bei der Asp-Mutante kein Verschwinden der Cofilin1-flox-Bande und damit keine Rekombination zu verzeichnen, da eine Thymozyten-spezifische Cre-Rekombinase verwendet wurde.

4.3.2.2. Nachweis der Mutationen auf Protein-Ebene

Neben der Untersuchung der Deletion auf DNA-Ebene wurde im Zuge einer Westernblot-Analyse auch die Cofilin1-Proteinexpression in Zellen aus Thymus und Lymphknoten von CD4-Cre (Kontrolle), Cof1^fl/fl:CD4-Cre (KO-Mutante), Cof1^fl/Ala- (Kontrolle), Cof1^fl/Asp- (Kontrolle), Cof1^fl/Ala:CD4-Cre- (Ala-Mutante) und Cof1^fl/Asp:CD4-Cre-Tieren (Asp-Mutante)

untersucht. Für die Westernblot-Analyse wurden im Gegensatz zum Southern als Kontrollen Mäuse der Genotypen CD4-Cre und Cof1^fl/fl:CD4-Cre dargestellt, da mit diesen der WT- und der KO-Cofilin1-Proteinlevel erfasst werden kann. Für die Untersuchung wurde ein Antikörper gegen Cofilin1 verwendet und zum Abgleich gegen das Haushaltsgen GAPDH geprobt (vgl. Abbildung 4.15).

Abbildung 4.15: Westernblot-Analyse zur Untersuchung der Deletion in der konstitutiv aktiven und inaktiven Cof1-Mutante. Analysiert wurden Zellen von CD4-Cre-, Cof1^fl/fl:CD4-Cre-, Cof1^fl/Ala-, Cof1^fl/Asp-, Cof1^fl/Ala:CD4-Cre- und Cof1^fl/Asp:CD4-Cre-Tieren aus Thymus und Lymphknoten. Es wurden Antikörper gegen Cofilin1 (KG40-Antikörper) und GAPDH verwendet.

Die Untersuchung Proteinebene zeigt eine starke Reduktion des Cofilin1-Proteins in den Cofilin1-KO-Tieren sowohl in den Zellen aus Thymus als auch aus Lymphknoten im Vergleich zu den Kontrollen, da in diesem Fall eine Deletion auf beiden Allelen des Cofilin1-Gens erfolgt. Das Cofilin1-Signal von Cof1^fl/Ala und Cof1^fl/Asp entspricht im Thymus als auch in den Lymphknoten dem in der CD4-Cre-Kontrolle. In diesen Tieren findet keine Deletion statt, sodass die Expression des Cofilin1-Proteins den WT-Level wiedergibt. Betrachtet man nun die Signale der Ala- und Asp-Mutante in den einzelnen Organen, exprimieren diese mehr Cofilin1 als die Cofilin1-KO-Tiere, aber weniger als die entsprechenden Kontrollen mit einem gefloxten und einem mutierten Cofilin1-Allel. Dies ist darauf zurückzuführen, dass die Deletion nur auf einem Allel erfolgt. Somit repräsentiert das exprimierte Protein das Cofilin1-Ala- bzw. Cofilin1-Asp-Protein bei diesen Tieren.

4.3.2.3. Für die T-Zellreifung ist konstitutiv aktives Cofilin1 essentiell

Nachdem auf DNA- und Proteinebene gezeigt werden konnte, dass sowohl in der konstitutiv aktiven Ala-Mutante als auch in der konstitutiv inaktiven Asp-Mutante nur das mutierte Allel in Thymozyten exprimiert wird, wurden nun weitere Untersuchungen durchgeführt. Aus

vorhergehenden Studien ist bekannt, dass die homozygote Expression des Asp-Allels zum gleichen Phänotyp wie der Cofilin1-KO und somit zu früher embryonaler Letalität führt. Das konstitutiv aktive Cofilin1 scheint noch stärkere Auswirkungen zu haben, da bisher keine ES-Zellen mit der Ala-Mutation erhalten wurden (persönliche Mitteilung, Christine Gurniak). Zur Analyse des Einflusses des Phosphorylierungsstatus von Cofilin1 auf die Reifung von T-Zellen im Thymus wurden diese durchflusszytometrisch untersucht. Dazu wurden aus Thymi von CD4-Cre- (Kontrolle), Cofilin1^fl/fl:CD4-Cre- (KO-Mutante), Cofilin1^fl/Ala:CD4-Cre- (Ala-Mutante) und Cofilin1^fl/Asp:CD4-Cre-Mäusen (Asp-Mutante) Einzelzellsuspensionen angefertigt und extrazelluläre Immunfluoreszenzfärbungen durchgeführt. Dabei wurden Marker für CD4- und CD8-positive Zellen verwendet. Mit Hilfe dieser Marker kann man überprüfen, ob sich die Thymozyten im Thymus normal entwickeln. Im Normalfall reifen sie, nachdem sie als Vorläuferzellen den Thymus erreicht haben, über doppelt negative (DN, CD4^-CD8^-), doppelt positive (DP, CD4⁺CD8⁺) hin zu einfach positiven Zellen (CD4⁺, CD8⁺) heran. Diese Entwicklungsphasen kann man anhand der beiden Marker CD4 und CD8 im FACS-Plot nachvollziehen. Das Ergebnis dieser Untersuchung ist in Abbildung 4.16 zu sehen.

Abbildung 4.16: Durchflusszytometrische Untersuchung von Thymozyten in der konstitutiv aktiven und inaktiven Cof1-Mutante. Thymozyten von CD4-Cre- (Kontrolle) (A), Cofilin1^fl/fl:CD4-Cre- (KO-Mutante) (B), Cofilin1^fl/Ala:CD4-Cre- (Ala-Mutante) (C) und Cofilin1^fl/Asp:CD4-Cre-Mäusen (Asp-Mutante) (D) wurden mit Immunfluoreszenzmarkern für CD4 und CD8 gefärbt und mit dem Durchflusszytometer untersucht. Dabei wurde auf die Thymozyten gegatet. (jeweils zwei unabhängige Experimente, n = 4)

Betrachtet man die Reifung der Thymozyten der konstitutiv aktiven Ala-Mutante, entspricht diese der Kontrolle. Sie verläuft über das DN- hin zum DP-Stadium und endet letztendlich bei reifen T-Zellen, die den Thymus verlassen können. Die konstitutiv inaktive Asp-Mutante dagegen bildet, genau wie die KO-Mutante, keine einfach positiven Zellen aus. Beide Tiere weisen einen erhöhten Anteil an Thymozyten im DP-Stadium auf.

4.3.2.4. Reife T-Zellen mit konstitutiv aktivem Cofilin1 emigrieren aus dem Thymus in das periphere lymphatische System

Da bei der Asp-Mutante die Thymozyten nicht das Stadium der einfach positiven Zellen erreichen und somit potentiell keine reifen T-Zellen in die Peripherie emigrieren, wurden die weiteren Untersuchungen auf die Ala-Mutante eingegrenzt.

Um zu überprüfen, ob konstitutiv aktives Cofilin1 einen Einfluss auf das Auswandern der T-Zellen aus dem Thymus in die peripheren lymphatischen Organe hat, wurden weiterhin die CD4- und CD8-positiven Zellen nicht nur aus Thymus, sondern auch aus den peripheren lymphatischen Organen von CD4-Cre- (Kontrolle), Cofilin1^fl/Ala-, Cofilin1^fl/Ala:CD4-Cre- und Cofilin1^fl/fl:CD4-Cre-Mäusen untersucht. Dazu wurden Einzelzellsuspensionen aus Thymus,

Lymphknoten, Milz und Blut hergestellt und einer Färbung für die Marker CD4 und CD8 unterzogen (vgl. Abbildung 4.17).

Abbildung 4.17: Analyse von CD4- und CD8-positiven Zellen im Thymus und in den peripheren lymphatischen Organen der Ala-Mutante. Thymozyten (A) und Einzelzellen aus Lymphknoten (B), Milz (C) und Blut (D) von CD4-Cre-, Cofilin1fl/Ala-, Cofilin1fl/fl:CD4-Cre- und Cofilin1fl/Ala:CD4-Cre-Mäusen wurden mit Immunfluoreszenzmarkern für CD4 und CD8 gefärbt und mit dem Durchflusszytometer untersucht. Dabei wurde auf die Lymphozyten gegatet. Für die Auswertung wurde der Anteil CD4- bzw. CD8-positiver Zellen der Kontrolle auf 100 % und die Werte der anderen Genotypen dazu ins Verhältnis gesetzt. (zwei unabhängige Experimente, n = 4)

Die Analyse der CD4- und CD8-positiven Zellen der Ala-Mutante zeigt, dass sowohl der Anteil der CD4- als auch der Anteil der CD8-Zellen in der Mutante in keinem der untersuchten Organe deutlich von dem der Kontrollen abweicht.

4.3.2.5. In Thymozyten und reifen T-Zellen mit konstitutiv aktivem Cofilin1 ist der F-Aktinlevel erhöht

Weiterhin wurde der Aktinstatus im Thymus und in den peripheren lymphatischen Organen von Cof1^Ala/fl:CD4-Cre- und CD4-Cre-Tieren untersucht. Es ist bekannt, dass das Aktinzytoskelett nicht nur eine Rolle bei der Migration von T-Zellen spielt, sondern auch eine wichtige Funktion bei der Ausbildung der immunologischen Synapse besitzt (D^USTIN, C^OOPER, 2000). Eine konstitutive Aktivität von Cofilin1 und gegebenenfalls dadurch veränderte Aktinlevel können somit möglicherweise einen starken Einfluss auf die Funktion der T-Zellen

haben. In den in vitro-Studien konnte bereits gezeigt werden, dass sich das Cofilin1-Ala-Protein sehr ähnlich gegenüber Aktin verhält wie das Cofilin1-WT-Cofilin1-Ala-Protein. Zur Überprüfung der Auswirkung von Cofilin1-Ala-Protein auf Aktin in T-Zellen wurden die gewonnenen Zellen aus CD4-Cre- (Kontrolle) und Cof1^fl/Ala:CD4-Cre-Mäusen (Ala-Mutante) einer intrazellulären Immunfluoreszenzfärbung mit den FACS-Farbstoffen DNaseI, welcher an G-Aktin bindet, und Phalloidin, der an F-Aktin bindet, unterzogen (siehe Abbildung 4.18).

Abbildung 4.18: Untersuchung des Aktinstatus im Thymus und in den peripheren lymphatischen Organen der Ala-Mutante. Thymozyten (A) und Einzelzellen aus Lymphknoten (B), Milz (C) und Blut (D) von CD4-Cre- (Kontrolle) und Cofilin1^fl/Ala:CD4-Cre-Mäusen wurden mit Immunfluoreszenzmarkern für G- (DNaseI) und F-Aktin (Phalloidin) gefärbt und mit dem Durchflusszytometer untersucht. Dabei wurde auf die Thymozyten bzw.

Lymphozyten gegatet. Für die Auswertung wurde der Mittelwert der Fluoreszenz für G- bzw. F-Aktin der Kontrolle auf 100 % und die Werte der Mutante dazu ins Verhältnis gesetzt. (zwei unabhängige Experimente, n

= 4)

Die Analyse des Aktinstatus zeigt, dass der G-Aktin-Level in der Ala-Mutante im Vergleich zur Kontrolle nicht verändert ist. Dagegen ist der F-Aktin-Gehalt in der Mutanten deutlich erhöht. Dies ist im Thymus der Fall und auch in den Lymphknoten zeigt sich eine leichte Erhöhung. In der Milz ist der F-Aktinlevel um 100 % erhöht, während im Blut sogar eine Erhöhung um 200 % vorliegt.

4.3.3. Die T-Zellreifung nach Ausschalten von Cofilin1 in einer späten Phase