2.2.1. Beschreibung des Erregers
Das Vorkommen von C. difficile wurde erstmals 1935 von HALL und O`TOOLE beschrieben. Sie isolierten den Erreger aus dem Stuhl von menschlichen Neugeborenen. Aufgrund der Schwierigkeiten bei der Isolierung und Charakterisierung wurde es zunächst als Bacillus difficile bezeichnet und später in Clostridium difficile umbenannt.
HALL und O`TOOLE (1935) konnten gleichzeitig nachweisen, daß C. difficile ein Toxin produziert. Bei subkutaner Injektion in Meerschweinchen und Kaninchen wirkte es letal. Einige Jahre später konnte SNYDER (1937, 1940) ein Antiserum herstellen, das den letalen Effekt bei Labortieren neutralisierte.
Bei C. difficile handelt es sich um ein grampositives schlankes Stäbchen mit ovalen subterminal gelegenen Sporen. Die Größe variiert zwischen 2,5-5,9 x 0,3-1,5 µm.
Das Bakterium ist beweglich und zeigt peritriche Begeißelung. Es wächst nur in anaerober Atmosphäre (HAFIZ u. OAKLEY 1976).
C. difficile kann auf bluthaltigen Nährmedien angezüchtet werden. Auf Selektivnährböden wie z.B. Cycloserin-Cefoxitin-Fruktose-Agar (CCFA) wächst C. difficile nach 48h in anaerober Atmosphäre in typischen Kolonien: sie weisen einen Durchmesser von 4-8 mm auf, sind flach und gelblich. Ihre Form ist rund bzw.
unregelmäßig mit dünnen Ausläufern (JONES 1989).
C. difficile wächst auf allen bluthaltigen Nährmedien. Allerdings benutzen die meisten Laboratorien einen Selektivnährboden, Cycloserin- (500 mg/l) Cefoxitin- (16 mg/l), Fruktose-Agar mit 2,5% Eigelb. Dieser wurde in der Veröffentlichung von GEORGE et al. (1979) beschrieben. Der Nährboden weist eine hohe Sensitivität auf. Weniger als 2 x 103 koloniebildende Einheiten von C. difficile pro Milliliter Faeces können nachgewiesen werden. Die Sensitivität bezüglich der Sporen ist jedoch gering. Wird das Eigelb gegen Taurocholat ausgetauscht, steigt die Entdeckungsrate für Sporen (WILSON et al. 1982).
Unter langwelligem ultravioletten Licht (360 nm) zeigen die auf CCFA angezüchteten Kolonien eine gelblichgrüne Fluoreszenz. C. difficile weist einen besonderen Geruch nach p-Kreosol, beschrieben als „Pferdestall“-Geruch, auf (JONES 1989).
In PYG-Bouillon (Pepton-Hefe -Glukose-Bouillon) produziert C. difficile folgende flüchtige Fettsäuren : Essigsäure, Isobuttersäure, Buttersäure, Isovaleriansäure, Valeriansäure und Isocapronsäure (CATO et al. 1986; JONES 1989). Diese Eigenschaften werden genutzt, um C. difficile mittels der Gaschromatographie zu bestimmen.
ASPINAL u. HUTCHINSON (1992) präsentierten ein Selektivmedium, das dasselbe Basismedium wie der Cycloserin-Cefoxitin-Fruktose-Taurocholat-Agar enthielt, dem aber anstelle von Cycloserin und Cefoxitin Cysteinhydrochlorid (500 mg/l), Norfloxacin (16 mg/l) und Moxalactam (32 mg/l) als Supplemente zugesetzt waren.
Norfloxacin hemmt das Wachstum von Enterobacteriaceae und Faecalstreptokokken, Moxalactam das von Bacteroides Spezies und anderen Clostridium Spezies.
Cysteinhydrochlorid beeinflusst zwar nicht das Wachstum von C. difficile, es verbessert jedoch die grüne Fluoreszenz unter ultraviolettem Licht (366 nm).
Insgesamt betrachtet weist das C. difficile-Selektivmedium mit Moxalactam und Norfloxacin eine um 20% höhere Selektivität auf als der Cycloserin-Cefoxitin-Fruktose-Agar.
Weiterhin weist C. difficile auch in flüssigen Nährmedien wie Cooked Meat Glucose Broth (BARTLETT et al. 1978b), Brain Heart Infusion (BHI) (LYERLY et al. 1983) oder modifizierte BHI (HONDA et al. 1983; NAKAMURA et al. 1985) ein gutes Wachstum und eine hohe Toxinproduktion auf.
KARASAWA et al. (1995) fanden heraus, daß bestimmte Aminosäuren wie Cystein, Isoleucin, Leucin, Tryptophan und Valin und Vitamine wie Biotin, Pantothensäure und Pyridoxin essentiell das Wachstum von C. difficile fördern.
2.2.2. Toxine
Toxinogene C. difficile-Isolate produzieren zwei Toxine. Sie werden gemäß ihrer biologischen Aktivität als Enterotoxin (A) b zw. als Zytotoxin (B) bezeichnet.
Wesentliche Moleküleigenschaften sind das hohe Molekulargewicht der Toxine und ihr Aufbau aus nur einer Kette. Toxin A hat ein Molekulargewicht von 440-550 kDA und Toxin B von 360-470 kDa.
Die Pathogenität in vivo korreliert nicht mit der Menge an produziertem Toxin, daß auch in vitro gebildet wird (DOVE et al. 1990; ROTHMANN et al. 1984). Stämme, die
in vitro nur geringe Mengen an Toxin produzieren, können allerdings in vivo das vollständige Krankheitsbild auslösen.
Bei beiden Toxinen handelt es sich um Glykosyltransferasen, deren Glucosylat-Faktor rho, ein GTP-bindendes Protein, in die Regulation des Zytoskeletts von Säugetierzellen eingreift. Es handelt sich bei dem Wirkungsmechanismus um eine rezeptorvermittelte Endozytose (BOURNE et al. 1991).
Beide Toxine sind bei Zugabe zu kultivierten Zellen zytotoxisch und bewirken charakteristische morphologische Veränderungen.
Toxin A ist letal und zytotoxisch und meist Ursache für die klinischen Symptome.
Toxin B ist ebenfalls letal und 1000mal mehr zytotoxisch als Toxin A, allerdings nur synergistisch mit Toxin A wirksam (LYERLY et al. 1998).
Toxin A bewirkt eine Anhäufung von Flüssigkeit in ligierten Darmschlingen von Kaninchen und eine vaskuläre Permeabilität (BANNO et al. 1984; LYERLY et al.
1985; ROLFE u. FINEGOLD 1979). Weiterhin verursacht Toxin A eine Infiltration von Neutrophilen ins Ileum, in deren Folge die Entzündungsmediatoren eine Flüssigkeitsansammlung, hämorrhagische Nekrosen und eine Veränderung der Membranpermeabilität bewirken (TRIADAFILOPOULOS et al. 1987b). Auch werden strukturelle Veränderungen an den Zottenspitzen induziert (MOORE et al. 1990), eine Zerstörung der tight junctions und damit eine Veränderung der Permeabilität. Es kommt zu einer Bewegung von Natri umionen entgegen dem elektrochemischen Gradienten, was ein passives Mitziehen von Chlorionen nach sich zieht (MITCHELL et al. 1987a).
Toxin B verursacht in ligierten Ileumschlingen von Kaninchen keine Flüssigkeitsansammlung und keine entzündlichen Erscheinungen TRIADAFILOPOULOS et al. 1987b). Es kann aber, wie in der Zellkultur gezeigt, schon in geringen Mengen durch Hemmung der Proteinsynthese eine Abrundung der Zellen hervorrufen (CHANG et al. 1979; MITCHELL et al. 1987b). Das Toxin B scheint auch an der Depolymerisation der Aktinfilamente beteiligt zu sein, in dem es das Zytoskeletts der Zelle zerstört, was wiederum eine Abrundung der Zellen bewirkt (POTHOULAKIS et al. 1986; OTTLINGER u. LIN 1988). Bei einer Vorschädigung der Darmschleimhaut ist Toxin B a llein in der Lage Symptome hervorzurufen.
C. sordellii produziert zwei Toxine, das HT (Hämorrhagisches Toxin) und LT (Letales Toxin). Diese sind den Toxinen A und B von C. difficile sehr ähnlich. Aus diesem
Grund ist es auch möglich, die Toxine von C. difficile mit C. sordellii-Antitoxin zu neutralisieren (MARTINEZ u. WILKENS 1992).
2.2.3. Molekularbiologische Methoden
Neben der Kultur und der Toxinbestimmung haben sich keine weiteren Verfahren in der routinemäßigen Diagnostik etabliert. Es existieren molekularbiologische Methoden, die aber hauptsächlich der Beantwortung von wissenschaftlichen Fragen dienen.
Eine Reihe von Genomtypisierungsmethoden, wie die Pulsfeldgelelektrophorese, Polymerase Kettenreaktion (PCR), Restriktionsenzymanalyse (REA), Plasmidprofilanalyse und Ribotypisierung sowie einige andere Typisierungsverfahren wie Proteinprofilanalyse (PP), Immunblotting, Bacteriocin-Produktionsanalyse und Bakteriophagen Sensitivitätstest stehen der Typisierung von C. difficile-Stämmen zur Verfügung (BRAZIER et al. 1997; SAMORE et al. 1997).
Viele Autoren konnten nachweisen, daß sich einige Methoden wie z.B. die Plasmidprofilanalyse und die Pulsfeldgelelektrophorese als inadäquat herausstellten, da einige Stämme nicht typisierbar bzw. die erhaltenen Daten zu schwierig zu interpretieren waren.
RAFFERTY et al. (1998) wählten zur Typisierung von 211 C. difficile-Stämmen aus der Umgebung die Polymerase Kettenreaktion (PCR), die Restriktionsenzymanalyse (REA) sowie die Proteinprofilanalyse (PP). Die PP lieferte 11 Typen (I-XI), die REA 29 sowie die PCR 38 Typen. Diese drei Methoden wiesen eine 85%ige Übereinstimmung bei der Identifizierung der Stämme auf. Dabei kristallisierte sich ein dominanter Stamm mit dem Typ 4-01-I (REA Typ 4, PCR Typ 01, PP Typ I) heraus.
KATO et al. (1998) benutzten die PCR zur Amplifikation eines Segments der sich wiederholenden Sequenz des Gens von Toxin A, um Stämme mit Toxin A-/Toxin B+
von Stämmen mit Toxin A+/Toxin B+ und Toxin A-/Toxin B- zu unterscheiden.
Sie stellten fest, daß eine unterschiedliche geographische Verteilung der Toxin A-/Toxin B+ Stämme auftraten. Japanische Erwachsene konnten häufiger als
Träger von Stämmen mit Toxin A-/Toxin B+ identifiziert werden als Erwachsene in den USA (0,2%) (LYERLY et al. 1998).
Im Gegensatz dazu konnten ALTAIE et al. (1996) aus keiner von 300 Stuhlproben von Patienten mit dem klinischen Verdacht einer Antibiotika-assoziierten Diarrhoe C. difficile-Stämme mit Toxin A-/Toxin B+ isolieren.
ALFA et al. (2000) beschrieben einen C. difficile-Stamm (HSC 98), der sich als Toxin A-/Toxin B+ Bildner herausstelle. Dieser wurde während des Ausbruchs einer C. difficile-assoziierten Diarrhoe aus sieben von 16 Patientenstuhlproben isoliert.
Hauptmerkmal dieses Stammes war das Fehle n von 1,8 kb in der CROP-Region (carboxy repetitive oligopeptide) des Gens von Toxin A. Seine Virulenz war ebenso stark wie bei Toxin A+/Toxin B+ Stämmen, was auch anhand der voll ausgebildeten Symptome bei den Patienten zu erkennen war. Auffällig war, daß HSC 98 nicht die typische biologische Aktivität aufwies, wie Stämme, die das nicht modifizierte Toxin A-Gen besaßen. Ein Vergleich zeigte, daß der cytopathogene Effekt (CPE) in der Zellkultur unterschiedlich war. In der Zellkultur des HSC 98-Stammes kam es zur Abrundung der Zellen ohne Spindelformation, im Gegensatz dazu erzeugte Stamm 10463 (Toxin A+/Toxin B+) abgerundete Zellen mit einer Spindelformation. Beide Effekte konnten durch Zugabe von C. sordellii- Antitoxin bzw. C. difficile-Antitoxin neutralisiert werden.
2.2.4. Antibiotikaresistenz
In der Humanmedizin werden therapeutisch zur Bekämpfung der Antibiotika-assoziierten Diarrhoe bzw. der Pseudomembranösen Colitis vorwiegend zwei Antibiotika eingesetzt: Metronidazol oder Vancomycin (BARTLETT 1985, LEVETT 1988).
Resistenzprüfungen haben Resistenzen von C. difficile gegenüber verschiedenen Antibiotika aufgedeckt. Die Ergebnisse verschiedener Autoren erscheinen, bis auf wenige Ausnahmen (Clindamycin, Penicillin), relativ einheitlich. Die nachfolgende Tabelle 6 zeigt diese Ergebnisse. Allerdings müssen bei der Bewertung der Ergebnisse die unterschiedlichen Methoden berücksichtigt werden.
Auffällig war in der Untersuchung von DZINK und BARTLETT (1980), daß C. difficile empfindlich auf bestimmte Antibiotika reagierte, die zuvor eine AAC ausgelöst hatten.
Tab. 6: Empfindlichkeit von C. difficile gegenüber Antibiotika