(1997) Isolate vom
2.3. Clostridium perfringens
2.3.2. Biochemische Differenzierung von Clostridium difficile und Clostridium perfringens
und 1,3 bis 19 µm langes, plumpes Stäbchen mit stumpfen Ende, das unbeweglich ist. Es reduziert Nitrat, fermentiert Glukose, Laktose, Maltose und Saccharose und verflüssigt Gelatine. Weiterhin ist es zur Gasbildung befähigt und bewirkt eine Verklumpung von Kasein, allerdings keine Verdauung (HATHEWAY 1990).
Der Erreger versport nur selten in vivo und in vitro. Wenn Sporen auftreten, sind sie zentral oder subterminal gelegen (BISPING u. AMTSBERG 1988; SEIFERT 1995).
Auf schafbluthaltigen Nährböden weisen die Kolonien einen Durchmesser von 2-5 mm auf. Sie sind rund, glattrandig, kuppelförmig und von grau-gelber bis grau-grüner Farbe. Es kann eine kolonienahe vollständige Hämolyse (ß-Hämolyse) und eine kolonieferne unvollständige Hämolyse beobachtet werden. Zwischen C. perfringens und Streptococcus agalactiae ist eine synergistische Hämolyse beschrieben worden (CAMP-Phänomen) (CATO et al. 1986; DART et al. 1988; ALLEN 1985).
2.3.2. Biochemische Differenzierung von Clostridium difficile und Clostridium perfringens
Zur Speziesidentifizierung stehen biochemische Reaktionen einer „Bunten Reihe“
(HOLDEMANN et al. 1977; CATO et al. 1986; SCHALLEHN 1990) sowie kommerzielle Systeme zur Verfügung.
Ein speziell für Anaerobier angefertigtes Basalmedium mit Bromkresolpurpur als Indikator zeigt durch Farbumschlag von violett nach gelb einen Abfall des pH-Wertes
und somit eine stattgefundene Kohlenhydratfermentation an. Dieser wird nach einer anaeroben Bebrütung von 72h bei 37°C beurteilt. Zur Absicherung der Farbauswertung ist die Messung des pH-Wertes mittels Indikatorpapier notwendig.
Nach SCHALLEHN (1990) gilt eine Reaktion als positiv, wenn die pH-Wert-Differenz zwischen dem jeweiligen Zucker und dem Basalmedium > 0,5 beträgt. Bei Differenzen < 0,5 ist die Reaktion als negativ zu bewerten. Aus der nachfolgenden Tabelle 7 sind die in der Regel zu testenden Reaktionen zu entnehmen.
Tab. 7: Biochemischen Reaktionen von C. difficile und C. perfringens (SCHALLEHN 1990)
Reaktion C. difficile C. perfringens Durchführung
Phosphatase - +
Die bakterielle Phosphatase spaltet eine Phosphatgruppe aus dem im Tropfreagenz enthaltenen a-Naphthyl-1-phosphat ab. Das freie a-Naphthyl verbindet sich mit dem Diazonium-o-dianisidin zu einem rotbraunen Azofarbstoff.
Lecithinase - +
Lecithinase spaltet Lecithin in Phosphorylcholin u. wasserunlösliches Diglycerid. Diese Reaktion wird durch eine Präzipitationszone um die Kolonie auf Eigelbagar sichtbar.
Lipase - -
Lipase spaltet Fettsäuren aus dem Lecithin, was durch einen Perlmuttglanz auf den Kolonien angezeigt wird
Nitrat-Reduktion - -
Nitratreduktase reduziert Nitrat zu Nitrit oder weiter zu molekularem Stickstoff. Nachweis durch Zugabe von Griess-Ilosvays-Reagenz u.
Zinkstaub
Indolbildung - - Nachweis durch Zugabe von Kovacs-Reagenz
Gelatinase - + Verflüssigung der Gelatine
Milchreaktion - ACD
Die beimpfte Lackmusmilch konnte sich wie folgt verändern:
a) Säuerung durch Laktose-spaltung (A-acid) b) Peptonisierung (C-clotted): Durch Kaseinhydrolyse entseht eine wässrige Flüssigkeit
c) Verdauung durch Labferment (D-digested):
Durch Enzymeinwirkung bildet sich ein Gerinnsel
d) Gasbildung bei der Laktosespaltung
Äskulin
Schwarzfärbung nach Zugabe von Eisen-III-Citrat durch hydrolytische Spaltung von Äskulin
Als kommerzielle Anaerobiersysteme stehen das RapID ANA II (Fa. LD Innovative Diagnostic Systems) und/oder das RapID -ID-32-A (Fa. bio Merieux) zur Verfügung.
Nach entsprechender Beimpfung der Systeme können nach vierstündiger aerober
Bebrütung die Reaktionen abgelesen und nach Ermittlung der Codezahl ausgewertet werden.
Zur weiteren Identifizierung kann die Gaschromatographie eingesetzt werden. In PYG- Bouillon (Pepton- Hefe- Glukose- Bouillon) produziert C. perfringens folgende Fettsäuren: Essigsäure, Propionsäure und Buttersäure (SCHALLEHN 1990)
Die fünf Toxin-Typen A-E von C. perfringens werden anhand der Toxinbildung unterschieden. Die Einteilung erfolgt nach der Synthese von vier Majortoxinen (siehe Tab. 8), die neben neun Minortoxinen in der logarithmischen Wachstumsphase gebildet werden und die unterschiedlichen Krankheitsbilder verursachen (siehe Tab.
11).
Allerdings ist zu beachten, daß die fünf Toxintypen anhand ihrer bakteriologischen und biochemischen Merkmale nicht differenziert werden können. Auch die Gaschromatographie erlaubt keine zuverlässige Typendifferenzierung. Dazu müssen andere Verfahren herangezogen werden, wie z.B. der Enterotoxämie-ELISA (Fa. Bio X, Machtens, Brüssel).
Tab. 8: Toxintypen und Majortoxine von C. perfringens (NIILO 1980; SEIFERT 1995)
Majortoxine Toxintypen
a ß e ι
A ++ - - -
B + ++ + -
C + ++ - -
D + - ++ -
E + - - ++
++ Produktion einer vorherrschenden Toxinfraktion + Produktion in geringerer Menge
- keine Produktion
Die biologische Aktivität der einzelnen Majortoxine ist aus Tab. 9 zu ersehen Tab. 9: Biologische Aktivität der Majortoxine von C. perfringens
(HATHEWAY 1990)
Toxine Biologische Aktivität α letal, Lecithinase
β letal, nekrotisierend, Trypsin labil
ε letal, Permease, durch Trypsin aktivierbar
ι letal, dermonekrotisch, aus zwei Einheiten bestehend, ADP- ribosylierend, durch Trypsin aktivierbar
Allgemein kann man sagen, daß die Wirkung der Majortoxine in erster Linie die Lysis der Zellmembran, intravaskuläre Hämolyse, sowie die die Steigerung der Gefäßpermeabilität in verschiedenen Organen umfaßt. Als Folge können Ödeme der betroffenen Organe und Gewebsnekrosen auftreten bzw. die Toxine können aus dem Darm in die Blutbahn übertreten (ROJO VAZQUEZ 1986).
Das Gen für das kürzlich entdeckte ß2-Toxin ist Plasmid-codiert (GIBERT et al.
1997).
Neuere Untersuchungen von HERHOLZ et al. (1999) haben gezeigt, daß aus dem
Kot von Pferden mit typischen und atypischen Typhlocolitissymptomen C. perfringens -Stämme isoliert werden konnten, die ein Gen (cpb2) besitzen, das für
die Produktion von ß2-Toxin verantwortlich ist. ß2-Toxin von C. perfringens wirkt zytolytisch und erzeugt das Bild einer nekrotisierend -hämorrhagischen Enteritis.
KLAASEN et al. (1999) untersuchten C. perfringens-Isolate aus Kotproben von Schweinen mit Diarrhoe. Nach Abklärung dessen, daß alle Stämme, die das Gen für die α-Toxinproduktion besaßen (cpa), weder zu den Toxintypen B und D gehörten noch enterotoxisch waren, wurde mit Hilfe der PCR das Vorhandensein der Gene cpb und cpb2 überprüft. In den Niederlanden waren 53% der C. perfringens-Stämme cpb- / cpb2+, in der Schweiz 68% cpb+ / cpb2+. Die Kombination cpb+ / cpb2- war nur selten bzw. gar nicht zu finden. Letzteres war mit den Ergebnissen von GIBERT et al. (1991) vergleichbar. So gehen die Autoren davon aus, daß das ß2-Toxin eine entscheidende Rolle bei Diarrhoe und Enteritis spielt.
Die Minortoxine und ihre biologische Aktivität sind aus Tabelle 8 zu entnehmen.
Einige Stämme aller Toxintypen produzieren Theta-, Kappa-, Mu-, Nu-Toxin und Neuraminidase. Deltatoxin wird von den Typen B und C produziert, Lambda von B, D und E. Bei letzterem handelt es sich um eine Protease, die in der Lage ist, Gelatine, Hämoglobin und Kasein bis zu einem gewissen Grad zu verdauen.
Kappa-, Mu- und Lambda- Toxin sind in der Lage Wirtszellen zu überwinden (HATHEWAY 1990).
Tab. 10: Minortoxine von C. perfringens (HATHEWAY 1990) Toxintypen Toxine Biologische
Aktivität A B C D E Gamma (γ) Nicht definiert
- ± ± - -
Delta (δ) Hämolysin
- ± + - -
Eta Nicht definiert
± - - - -
Theta Hämolysin (O2 labil),
Zytolysin
± + + + +
Kappa (κ) Kollagenase,
Gelatinase
+ + + + +
Lambda (λ) Protease
- + - + +
Mu (µ) Hyaloronidase
± + ± ± ±
Nu (η) Dnase
± + + ± ±
Neuraminidase
N- Acetylneuraminsäure-Glycohydrolase
+ + + + +
Die Toxintypen von C. perfringens sind in der Lage unterschiedliche Erkrankungen bei den verschiedenen Tierarten auszulösen. Die nachfolgende Tabelle 11 gibt einen Überblick über diese Erkrankungen.
Tab. 11: Pathogene Bedeutung der verschiedenen Toxintypen beim Tier Typ A: Gasgangrän bei Mensch und Tier
Enterotoxämie bei Rindern, Schafen, Ferkeln, Pferden, Kaninchen, verschiedenen Hirscharten und Nerzen
Enteritis bei Hunden
Aviäre nekrotisierende Enteritis Typ B: Lämmerdysenterie
Enterotoxämie in Fohlen
Enterotoxämie bei Schafen und Ziegen Typ C: Enterotoxämie bei Schafen
Neonatale hämorrhagische Enterotoxämie bei Kälbern, Fohlen und Lämmern Nekrotisierende Enteritis bei Ferkeln
Typ D: Enterotoxämie bei Schafen, Ziegen und Rindern Typ E: Enteritis bei Kaninchen
Isoliert aus Schafen und Kälbern
(STERNE u. WARRACK 1964; DANILOV 1967; AL KHATIB et al. 1969;
KUMMENEJE u. BAKKEN 1973; NIILO 1980; CARMAN u. LEWIS 1983; ROJO VAZQUEZ 1986; ALLEN 1985)