ChIP-Assay mit Nukleoprotein aus synchronisierten Zellen

Die bisherigen Versuche wurden mit asynchron proliferierenden HeLa S3 Zellen durchgeführt. Frühere Arbeiten zeigten, dass sich die Zusammensetzung des ORC-Komplexes während der S-Phase verändert, da hOrc1p vom Chromatin dissoziiert (Kreitz et al., 2000). Deshalb war es von Interesse, Chromatinpräpa-rationen aus Zellen der G1-Phase und S-Phase zu vergleichen, um festzustellen, ob sich die Lokalisation von hOrc1p und hOrc2p in den verschiedenen Zellzyklus-Phasen unterscheidet. Dazu wurde Nukleoprotein aus G1-Phase Zellen und S-Phase Zellen präpariert und mit hOrc1p- und hOrc2p-spezifischen Antikörpern präzipitiert.

Die im Immunblot dargestellten Daten zeigen (Abb. 4.28A), dass hOrc1p und hOrc2p effizient mit Chromatin aus G1-Phase Zellen präzipitiert werden können.

Untersuchungen mit Chromatin aus S-Phase Zellen ergaben, dass hOrc1p nicht im Nukleoprotein nachweisbar ist und somit auch nicht gefällt werden kann.

hOrc2p ist jedoch sowohl in Immunpräzipitaten von Chromatin aus G1-Phase Zellen als auch aus S-Phase Zellen nachweisbar.

Weiterhin wurde die kopräzipitierte DNA über quantitative ‘real time’ PCR analy-siert. Dabei wurden drei zusätzliche Primerpaare verwendet, die komplementär zu Sequenzen sind, die näher bei der MCM4-Promoterregion lokalisiert sind und somit eine genauere Eingrenzung der Binderegion zulassen (Abb. 4.28B). Die Ergebnisse von zwei unabhängigen Experimenten zeigen, dass in G1-Phase Chromatin hOrc1p und hOrc2p an die MCM4-Promoterregion binden, wohingegen in S-Phase Chromatin ausschließlich hOrc2p mit der Promoter-DNA assoziiert vorliegt (Abb. 4.28C). Ein weiterer Aspekt der in Abb. 4.28C gezeigten Daten sind die Ergebnisse der Quantifizierungen mit den Primerpaaren In1 und Ex2. Beide Amplikons weisen eine kurze Distanz (0,7 und 1 kb) zu der UPR Region auf. So präzipitieren hOrc1p- und hOrc2p-Antikörper Chromatinfragmente aus G1-Zellen die UPR- und Ex2-Sequenzen enthalten. In S-Phase Chromatin, das mit hOrc2p-spezifischen Antikörpern präzipitiert wurde, sind jedoch UPR- und zusätzlich In1-Sequenzen angereichert. Demnach scheint sich die Lokalisation von hOrc2p während der S-Phase geringfügig zu verändern. Unabhängig davon zeigen die Experimente, dass bei einem Amplikonabstand von 0,7 – 1 kb eine für die ChIP-Technik limitierende Auflösung erreicht wird. Die Binderegion von hOrc1p und hOrc2p konnte somit eindeutig auf die UPR-Sequenzen eingegrenzt werden.

A

In7 In6 In1UPR Ex2 Ex6 Ex7 Ex9 In7 In6 In1UPR Ex2 Ex6 Ex7 Ex9

ORC1 ppt/S

Abb. 4.28S-Phase Chromatin enthält kein hOrc1p.

(A) MNase-verdautes Nukleoprotein aus G1-Phase Zellen und S-Phase Zellen wurde mit hOrc1p-Antikörpern oder mit hOrc2p-hOrc1p-Antikörpern immunpräzipitiert. Auftrag (I), Überstände (S) und Präzipitate (P) wurden im Immunblot mit hOrc1p- und hOrc2p-spezifischen Antikörpern analysiert. (B) Schematische Darstellung der untersuchten genomischen Region. Die Positionen der Amplikons sind durch schwarze Boxen hervorgehoben. (C) Quantifizierung der DNA, die aus immunpräzipitiertem Chromatin präpariert wurde, das einerseits aus G1-Phase Zellen (oben) oder S-Phase Zellen (unten) gewonnen wurde. Die Abbildung zeigt zwei unabhängig voneinander durchgeführte Experimente.

Die Bindung der MCM-Proteine an Chromatin ist ähnlich wie die Chromatinbindung von hOrc1p Zellzyklus-abhängig reguliert (siehe 1.3.2.4.). Deshalb wurde Nukleoprotein aus G1-Phase Zellen und S-Phase Zellen präpariert und mit hMcm3p-spezifischen Antikörpern sowie mit Kontroll-Antikörpern (IgG) präzipitiert (Abb. 4.29).

Bei der Untersuchung im Immunblot mit hOrc1p-, hOrc2p- und hMcm5p-spezifischen Antikörpern (Abb. 4.29A) ergab sich folgendes Ergebnis: Werden die Mengen an vernetztem hOrc2p und hMcm5p miteinander verglichen, so ist bei Nukleoproteinpräparationen von G1-Phase Zellen mehr hMcm5p an die DNA gebunden als hOrc2p, wohingegen bei S-Phase Chromatin gleiche Mengen vernetzt vorliegen. Demnach scheinen in S-Phase Zellen geringere Anteile von MCM-Proteinen Chromatin-gebunden vorzuliegen als in G1-Phase Zellen. Dieses Ergebnis ist aufgrund früherer Arbeiten zu erwarten, die zeigten, dass sich hMCM-Proteine während der S-Phase vom Chromatin ablösen (Todorov et al., 1995;

Krude et al., 1996). Analysiert man die Präzipitate im Immunblot mit hMcm5p-spezifischen Antikörpern, so zeigt sich, dass sowohl in S-Phase Chromatin als auch in G1-Phase Chromatin hMcm5p mit hMcm3p-Antikörpern kopräzipitiert werden kann. Die Menge an kopräzipitiertem hMcm5p ist bei Fällungen mit S-Phase Chromatin geringer als bei Nukleoprotein aus G1-S-Phase Zellen.

In Abb. 4.29B sind die Ergebnisse der quantitativen ‘real-time’ PCR dargestellt, bei der die mit hMcm3p-Antikörpern oder Kontroll-Antikörpern (IgG) kopräzipitierte DNA als Template-DNA eingesetzt wurde. Bei Präparationen aus G1-Phase Zellen ergab sich, dass in Chromatin, das mit hMcm3p-Antikörpern präzipitiert wurde, DNA-Sequenzen der UPR-Region und der Ex2-Region gegenüber benachbarten Regionen angereichert sind. Die Daten zeigen, dass in G1-Phase Zellen hMcm3p ebenso wie hOrc1p und hOrc2p spezifisch mit der MCM4-Promoterregion assoziiert vorliegt. Dies deutet auf eine Kolokalisation von ORC-Proteinen und MCM-Proteinen während der G1-Phase hin. Entsprechend der im Immunblot dargestellten Mengen an kopräzipitiertem hMcm5p ist bei Präparationen aus S-Phase Zellen die Menge an kopräzipitierter DNA geringer als bei Experimenten mit G1-Phase Zellen. Zudem scheinen die Sequenzen über einen größeren genomi-schen Bereich angereichert zu sein, was auf eine Veränderung der Lokalisation von hMcm3p während der S-Phase hindeutet.

ORC1

In7 In6 In1UPR Ex6Ex7 Ex9

1000

In7 In6 In1UPR Ex6Ex7 Ex9

MCM3 ppt/G1 IgG/G1

number of copies

In7 In6 UPREx2 Ex6Ex7 Ex9 In7 In6 In1UPREx2 Ex6Ex7 Ex9

1000

Abb. 4.29Die Lokalisation von hMcm3p verändert sich während der S-Phase.

(A) MNase verdautes Nukleoprotein aus G1-Phase und S-Phase Zellen wurde mit hMcm3p-spezifischen Antikörpern (α-MCM3) oder unspezifischen Kontroll-Antikörpern (IgG) präzipitiert. Auftrag (I) Überstand (S) und die Präzipitate (P) wurden im Immunblot mit hMcm5p-, hOrc1p- und hOrc2-spezifischen Antikörpern analysiert. (B) Quantifizierung der DNA, die aus immunpräzipitiertem Chromatin präpariert wurde, das einerseits aus G1-Phase Zellen (oben) oder S-Phase Zellen (unten) gewonnen wurde. Es sind zwei unabhängig voneinander durchgeführte Experimente dargestellt.