Charakterisierung der Beiträge einzelner Reste zur Bindung von Y-Box25

Erste detaillierte Einblicke in die Wechselwirkung zwischen CspB und einzelsträngigen Nukleinsäuren auf struktureller Ebene wurden mit dem Oligodeoxynukleotid Y-Box25 erhalten. Dieses Fragment wird von CspB mit einer moderaten Affinität gebunden (4 µM), wobei die Stöchiometrie 3:1 (CspB:Y-Box25) beträgt. Eine Titration von ¹⁵N markiertem CspB mit Y-Box25 wurde mit heteronuklearer 2D NMR-Spektroskopie verfolgt und daraus die für die Komplexbildung wichtigen Aminosäurereste identifiziert (Zeeb, 2000, Zeeb &

Balbach, 2003a). Direkt an der Wechselwirkung beteiligte Reste konnten durch die extreme Linienverbreiterung ihrer Kreuzsignale im 2D ¹H/¹⁵N HSQC-Spektrum bei einem ca.

10fachen Überschuss an CspB nachgewiesen werden (gelb in Abb. 27). Diese beinhalten K7, W8, F9, N10, S11, K13, G14, F15, G16, F17, F27, V28, H29, F30, S31, F38, Q59. Davon gehören acht Reste zu den beiden konservierten Bindungsmotiven RNP1 und RNP2.

Rückgratamide von sieben der neun aromatischen Aminosäuren von CspB zeigen eine

extreme Linienverbreiterung (F9, F15, F17, F27, H29, F30, F38). Außerdem wurden zwei Aminosäuren mit positiv geladenen Seitenketten gefunden (K7, K13), deren Kreuzsignale eine große Änderung in der chemischen Verschiebung erfahren. Diese zeigen konformationelle Änderungen im Zuge der Bindung von CspB an Y-Box25 und sind in Abb.

27 in grün dargestellt (Zeeb, 2000, Zeeb & Balbach, 2003a). Die einzelnen Beiträge dieser Reste zur Stabilisierung des Nukleoproteinkomplexes wurden durch verschiedene CspB-Varianten mit einzelnen Aminosäuresubstitutionen näher untersucht (Zeeb & Balbach, 2003a).

Als Sonde für die Bestimmung der Komplexdissoziationskonstanten KD diente die Fluoreszenzemission von CspB, welche durch Trp8 dominiert wird. Die Bindung von ssDNA führt zu einer spezifischen Löschung der Fluoreszenzemission von Trp8, da sich dieses in der Bindungsregion befindet und dadurch eine direkte Wechselwirkung zwischen dem Fluorophor und dem Bindungspartner erfolgen kann. Eine Löschung der Fluoreszenz durch zufällige Kollision der Moleküle konnte durch Titration von N-Acetyltryptophanamid mit verschiedenen ssDNA-Fragmenten ausgeschlossen werden, weil dort keine nennenswerte

Abb. 27: Identifikation von Aminosäureresten, die an der Nukleinsäurebindung von CspB beteiligt sind. Reste, die eine extreme Linienverbreiterung ihrer Kreuzsignale bei einer Y-Box25 Konzentration von 70 µM erfahren sind in gelb eingefärbt (K7, W8, F9, N10, S11, K13, G14, F15, G16, F17, F27, V28, H29, F30, S31, F38, Q59).

Reste deren Kreuzsignale eine signifikante Änderung der chemischen Verschiebung zeigen, sind in grün dargestellt (I18, I33, G35, G37, E53, G54, G57). Aminosäurereste die sich in den RNP-Bindungsmotiven befinden sind mit größeren Bindungsradien gekennzeichnet. Die Abbildung wurde mit MolMol (Koradi et al., 1996) und dem pdb-Eintrag 1CSP erstellt (Schindelin et al., 1993).

Reduktion der Fluoreszenzintensität gefunden worden ist (Lopez, et al., 1999a). Daher konnte diese leicht zugängliche Sonde zur Bestimmung der Bindungsaffinität der einzelnen CspB-Varianten zu Y-Box25 herangezogen werden. Repräsentative Titrationsexperimente von Wildtyp-CspB, G35A, F38A und G54P sind in Abb. 28 gezeigt. Das oben erwähnte Verhältnis von CspB zu Y-Box25 (3:1) wurde durch eine Titration unter stöchiometrischen Bedingungen mittels Fluoreszenzlöschung (10 µM CspB) bzw. Änderung der gemittelten

1H/¹⁵N chemischen Verschiebung (0.6 mM CspB) bestimmt (Zeeb & Balbach, 2003a).

Für die Berechnung der Dissoziationskonstante (KD) wurde Gl. 19 unter der Annahme verwendet, dass die drei Bindungsstellen für CspB auf Y-Box25 unabhängig sind und die Proteinmoleküle nicht interagieren. Die erhaltenen KD-Werte sind in Tab. 10 zusammengefasst (Zeeb & Balbach, 2003a). Das Ersetzen der hochkonservierten Phenylalanine in den beiden Bindungsmotiven RNP1 (F17) und RNP2 (F30) durch Alanin führt zu einer 10fachen Reduktion der Affinität. Die Austausche F15A und F27A resultieren ebenfalls in einem moderaten Anstieg des KD-Werts (7fach bzw. 4fach) und somit zu einer verringerten Affinität zur ssDNA. Aromatische Aminosäuren außerhalb von RNP1 und RNP2 tragen ebenfalls signifikant zur Affinität von CspB zu Y-Box25 bei. Der KD von F9A im C-terminalen Teil des β-Strangs β1 und F38A in der langen Schleife zwischen Subdomäne I und II ist 4fach bzw. 10fach erhöht im Vergleich zum Wildtypprotein (Tab. 10).

Kälteschockproteine aus thermophilen Organismen wie B. caldolyticus oder T. maritima binden bei 15 °C stärker an Y-Βox25 als CspB aus B. subtilis mit KD-Werten von 0.7 µM bzw. 0.01 µM. Ein Sequenzvergleich dieser drei Proteine zeigte, dass sie sich innerhalb der

Abb. 28: Löschung der Trp8-Fluoreszenz durch Bindung von Y-Box25 an CspB. Die hyperbolische Bindungs-isothermen von 0.25 µM () Wildtyp-CspB, () G35A, () F38A und () G54P verdeutlichen die unterschiedlichen Affinitäten zu Y-Box25 in 50 mM Na-cacodylat/HCl, 100 mM KCl pH 7.0 bei 15 °C. Aus der Anpassung von Gl. 19 an die Daten resultieren die KD-Werte, die in Tab. 10 enthalten sind.

beiden Bindungsmotive nur an einer bzw. zwei Positionen unterscheiden (BcCsp bzw.

TmCsp). BcCsp und TmCsp beinhalten an Position 15 ein Tyr und TmCsp an Position 30 ein Trp, während CspB an beiden Positionen ein Phe besitzt. Nimmt man diese Austausche in CspB vor (F15Y bzw. F30W), so wird die Affinität in beiden Fällen 2fach erhöht. Dies zeigt, dass die Bindungsstelle durch eine andere Zusammensetzung an aromatischen Aminosäuren noch verbessert werden kann (Tab. 10). Allerdings ist die Affinität von TmCsp noch ca.

100fach höher als von CspB F30W. Es ist möglich, dass dies auf das zusätzliche Tyr an Position 15 und die höhere Anzahl positiver Ladungen in TmCsp zurückgeführt werden kann (pI(TmCsp) = 6.7, pI(CspB) = 4.8).

Tab. 10: Dissoziationskonstanten (KD) der jeweiligen CspB/Y-Box25-Komplexe und thermodynamische Stabilität der einzelnen CspB-Varianten (Zeeb & Balbach, 2003a).

Protein KD⋅10^-6 (M) Tm (°C) ∆G_U (15 °C) (kJ/mol)

a zeigt eine extreme Linienverbreiterung im NMR-Titrationsexperiment

b zeigt eine große Änderung der chemischen Verschiebung im NMR-Titrationsexperiment

c Aminosäureaustausch aufgrund eines Sequenzvergleichs zu Kälteschockproteinen aus thermophilen Organismen (B. caldolyticus, T. maritima)

d Substitution zur Erhöhung der möglichen Rückgratkonformationen in der Schleife β4-β5

Neben der Identifizierung wichtiger Reste für die Komplexbildung innerhalb der beiden Bindungsmotive, enthielt das NMR-Titrationsexperiment auch Hinweise auf bedeutsame Reste, die außerhalb von RNP1 und RNP2 liegen. Gly35 und Gly37 befinden sich in der langen Schleife zwischen den beiden Subdomänen in der Nähe von Phe38 und zeigen eine starke Änderung der chemischen Verschiebung ihrer Kreuzsignale bei der Komplexbildung.

Um die Anzahl möglicher Rückgratkonformationen dieser Schleife einzuschränken, wurde Gly35 durch Alanin bzw. Prolin ausgetauscht. Die G35A Substitution begrenzt die zu erwartenden Rückgratkonformationen an dieser Position auf negative φ-Winkel, lässt die

Affinität jedoch unverändert. Eine drastischere Einschränkung durch Einführen eines Prolins führt zu einer 6.5fachen Verringerung der Affinität, die vergleichbar zu Austauschen innerhalb der Bindungsmotive RNP1 bzw. RNP2 ((F15A bzw. H29Q, beide 7fach) ist.

Äquivalente Aminosäureaustausche wurden für Gly54 in der Schleife zwischen den β-Strängen β4 und β5 gemacht. Auch hier lässt die Alanin-Substitution (G54A) den KD-Wert nahezu unverändert. Der Austausch G54P führt jedoch nur zu einer 3fachen Reduktion der Affinität, so dass die Einschränkung der möglichen Rückgratkonformationen in der Schleife zwischen β4 und β5 nicht so große Auswirkungen auf die Affinität hat, wie dies in der Schleife zwischen β3 und β4 der Fall ist. Bestätigt wird dies dadurch, dass die Affinität ebenso unverändert bleibt, wenn die Anzahl der möglichen Rückgratkonformationen erhöht wird (P58A). Zusammenfassend heißt das, dass die Einschränkung konformationeller Freiheit in der Schleife zwischen β4 und β5 keinen großen Einfluss auf die Affinität hat, diese jedoch in der Schleife zwischen β3 und β4 für eine feste Bindung von CspB an Y-Box25 notwendig ist (Zeeb & Balbach, 2003a).

Um auszuschließen, dass die unterschiedlichen Affinitäten der einzelnen CspB-Varianten auf verschiedene thermodynamische Stabilitäten basieren, wurden thermisch induzierte Entfaltungsübergänge aller Proteinvarianten gemessen. Die Mittelpunkte der thermischen Entfaltung (Tm) und die extrapolierten ∆GU-Werte bei 15 °C sind in Tab. 10 zu sehen. Die thermischen Übergänge aller Varianten haben bei 15 °C die Basislinie des nativen Proteins erreicht und zeigen positive ∆GU-Werte. Somit liegen alle Proteinvarianten unter den experimentellen Bedingungen der Titrationsexperimente vollständig nativ vor. Eine Korrelation zwischen der thermodynamischen Stabilität und der Bindungsaffinität konnte nicht gefunden werden.