Beurteilung der angewandten Methoden

Um den Effekt einer alimentären Calcium-Restriktion, einer Calcitriol-Behandlung sowie der Laktation auf die RNA-Expression von am Calcium-Transport und am Vitamin D-Metabolismus beteiligten Strukturen zu untersuchen, wurde die Methode der Real Time RT PCR angewandt.

Vor der Umschreibung der RNA in cDNA wurde mit Hilfe photometrischer Untersuchungen zunächst die Reinheit der RNA-Isolate bestimmt. Eingesetzt wurden nur Präparate, bei denen der Quotient aus der bei Durchstrahlung mit Licht einer Wellenlänge von 260 nm und 280 nm gemessenen Extinktion zwischen 1,7 und 2,0 lag. Die Durchführung einer PCR zum Nachweis der Expression von GAPDH (Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase) im Anschluss an jede Umschreibung diente als deren Erfolgskontrolle.

Zudem wurde GAPDH als interner Standard zur Normalisierung eingesetzt. Wie unter anderem in Versuchen an Ratten (Anderson et al., 2004; Cabiati et al., 2012), aber auch in Studien an Rindern (Lisowski et al., 2008) gezeigt werden konnte, wird das GAPDH-Gen im Nierengewebe verschiedener Individuen in vergleichbarem Umfang exprimiert und ist somit als Housekeeping Gene zur Normalisierung geeignet. Ein expressionsstimulierender Effekt der Calcitriol-Behandlung auf die GAPDH-RNA-Expression, wie er in Versuchen an humanen Mammakarzinom-Zellen auftrat (Desprez et al., 1992), wurde in der vorliegenden Arbeit nicht beobachtet.

Im Rahmen der Etablierung neuer Primer (PTHR, VDR, CYP24A1, CYP27B1) wurde die Spezifität der gewonnenen Amplifikate durch deren Sequenzierung und den Abgleich der Sequenzen mit den in der Datenbank des NCBI aufgeführten speziesspezifischen Sequenzen überprüft, bevor sie routinemäßig zur Quantifizierung der Transkription eingesetzt wurden.

Die Effizienzen der PCR-Assays wurden mit cDNA-Verdünnungsreihen und entsprechenden Standardreihen aus verdünnten, das entsprechende Amplifikat als Insert tragenden Plasmiden getestet. Sie lagen zwischen 90 und 105%.

Um sicherzustellen, dass die im Rahmen der SYBR^® Green PCR gemessenen Fluoreszenzsignale auf das gesuchte PCR-Produkt zurückzuführen sind, wurde im Anschluss an die PCR eine Schmelzkurvenanalyse durchgeführt.

5.1.2 Western Blot-Analyse

Die Expression der am renalen Calcium-Transport beteiligten Strukturen sowie des VDR und des PTHR wurde zusätzlich mittels Western Blot-Analyse untersucht, um mögliche Effekte der alimentären Calcium-Restriktion, der Calcitriol-Behandlung sowie der Laktation auf die Protein-Expression der entsprechenden Gene feststellen zu können.

Zur Normalisierung wurde das Actin-bindende Protein Villin eingesetzt, das vornehmlich in den Mikrovilli von Epithelzellen des Darms und des proximalen Nieren-Tubulus lokalisiert ist (Rodman et al., 1986). Aufgrund von Problemen bei der Villin-Detektion auf „gestrippten“

Membranen musste bei der Auswertung der PTHR-Western Blots auf eine Normalisierung verzichtet werden (siehe Kapitel 4). Stattdessen wurde in diesem Fall sowie im Fall des VDR- und des CaBPD28K-Western Blots, für die aufgrund der Verwendung von Zellkern-

beziehungsweise Cytosol-Isolaten keine geeigneten Normalisierungs-Syteme zur Verfügung standen, auf die aufgetragene Proteinmenge normalisiert.

Zum Zweck der Auswertung erfolgte der Vergleich der semiquantitativ bestimmten Werte nur zwischen Proben, die gemeinsam auf ein Gel aufgetragen und später zusammen auf eine Membran transferiert worden waren. Nur unter dieser Bedingung ist eine identische Behandlung der Proben während des Western Blots gewährleistet und damit eine Vergleichbarkeit gegeben. Aufgrund der hohen Probenanzahl war es im Rahmen der Untersuchung der Proben aus dem „Calcium-Restriktions-/Calcitriol-Versuch“ nicht möglich, alle Proben zusammen auf ein Gel aufzutragen. Stattdessen wurden hier die Proben jeder einzelnen Versuchsgruppe jeweils mit den Proben der unbehandelten Kontrollgruppe alternierend auf ein Gel aufgetragen. Im Anschluss an die Bestimmung der Optischen Dichte wurden die Werte der verschiedenen Gruppen jeweils zum Mittelwert der für die unbehandelte Kontrollgruppe bestimmten Werte in Relation gesetzt.

5.1.3 Nachweis des VDR in Zellkernisolaten

Grundsätzlich stellt sich die Frage, ob zwecks semiquantitativer Bestimmung des VDR-Protein-Gehalts einer Gewebeprobe die Verwendung von Zellkernisolaten sinnvoll ist, oder ob stattdessen besser Gesamtzell-Lysate oder aus der jeweiligen Probe gewonnene Zellkern- und Cytosol-Fraktionen genutzt werden sollten. Tatsächlich belegen die Ergebnisse verschiedener Studien neben einer nukleären auch die cytosolische Lokalisation des VDR.

Demnach erfolgt nach Bindung des Calcitriols der Transfer dieser cytoplasmatischen VDR in den Zellkern. So führte beispielsweise die Zerstörung des mikrotubulären Apparates in humanen Monozyten zu einer Blockade der Calcitriol-vermittelten CYP24A1-Induktion (Kamimura et al., 1995). Walters et al. untersuchten bereits 1985 die subzelluläre Lokalisation des VDR in renalen Zellkulturen, indem sie unter anderem den Rezeptor im nukleären und cytoplasmatischen Kompartiment nachwiesen. Dabei zeigte sich, dass sich rund 70% der freien VDR im Cytoplasma befanden, wohingegen in Calcitriol-behandelten Zellen 90% der Hormon-Rezeptor-Komplexe im Zellkern lokalisiert waren (Walters et al., 1986). Später wurden zunehmend Immunfluoreszenz-Techniken zur Untersuchung der intrazellulären Verteilung des VDR genutzt. Auch in diesen Studien zeigte sich oftmals eine Calcitriol-induzierte Umverteilung cytoplasmatischer Rezeptoren in den Nukleus. So hatte die Kultivierung von Fibroblasten in Calcitriol- und Östrogen-freiem Medium eine ausschließlich cytoplasmatische Lokalisation des VDR zur Folge. Eine Zugabe von Calcitriol löste eine

Umverteilung des VDR in den Nukleus aus, wobei ein gewisser Anteil im Cytoplasma verblieb (Barsony et al., 1990). In einer weiterführenden Studie wurden gentechnisch veränderte renale Zellkulturen, die einen Fluoreszenzfarbstoff-gekoppelten VDR exprimierten, eingesetzt. Während vor der Calcitriol-Behandlung der Zellkern nur zu etwa 25% zur Gesamtfluoreszenz der Zellen beitrug, stieg der Anteil nach Calcitriol-Gabe auf rund 70% an (Racz u. Barsony, 1999).

Es bleibt also festzuhalten, dass der VDR sowohl im Zellkern als auch im Cytoplasma lokalisiert ist, wobei unter dem Einfluss von Calcitriol der Anteil nukleärer Rezeptoren deutlich zunimmt. Unklar ist, inwieweit die Menge von cytoplasmatischem und nukleären VDR korreliert, ob das Verhältnis der beiden Größen zum Beispiel auch durch den Zellzyklus beeinflusst wird und inwiefern die Modulation der Expressionsrate des VDR von Bedeutung ist. So wäre es denkbar, dass cytoplasmatisch vorliegende Rezeptoren quasi als schnell verfügbare Reserve dienen und eine Anpassung der Expression des Rezeptors erst bei anhaltend hohem Bedarf erfolgt. Hinzu kommt, dass die Ergebnisse von In-vitro-Versuchen nicht einfach auf die Vorgänge in vivo übertragen werden können. Die Ergebnisse der oben angeführten Studien sprechen jedoch dafür, dass gerade in Situationen eines Calcium-Mangels, unter dem Einfluss eines entsprechend erhöhten Calcitriol-Spiegels, eine vermehrt nukleäre Lokalisation des VDR erwartet werden kann. Demzufolge entspräche der Nachweis des VDR aus Zellkernisolaten eher einer funktionellen Untersuchung, die Unterschiede in der Menge transkriptionell aktiver VDR aufdeckt, als einer Untersuchung der Gesamt-Expression dieses Rezeptors.

5.2 Trans- und parazellulärer Calcium-Transport