Bestimmung der relativen Heparinaffinität im chromatographischen System

zur Elution notwendige Ionenstärke ausdrücken. Diese Methodik liefert keine absolute Werte, eignet sich aber gut, um Änderungen der Affinitäten zu verdeutlichen und ist im Fall von HCII gebräuchlich ¹. Die Elution wurde durch eine linear ansteigende NaCl-Konzentration induziert. Die die Elution verursachende NaCl-Konzentration konnte durch die zur Ionen-stärke proportionale Leitfähigkeit ermittelt werden. Der Nachweis der Proteine in den Eluatfraktionen erfolgte durch einen Western-Blot (3.4.3), welcher auch die Kontrolle der Integrität der eluierten Proteine ermöglichte.

4.2.1.1 Relative Heparinaffinität von HCII

Der Einfluss von divalenten Kationen auf die Heparinbindung von anderen Proteinen ist in der Literatur bereits beschrieben ². Die Untersuchungen zur relativen Heparinaffinität von HCII in Anwesenheit verschiedener divalenter Kationen wurde wie unter 3.10.2 beschreiben durchgeführt. Gereinigtes HCII aus humanem Plasma wurde auf eine 1 mL Heparin-Sepharosesäule gebunden und durch einen NaCl-Gradienten eluiert. Dabei enthielten Lauf- wie auch Elutionspuffer verschiedene zweiwertige Kationen in mikromolaren Konzen-trationen. Um relative Heparinaffinitäten unter verschiedenen Bedingungen vergleichen zu können, mussten alle Versuche mit dem selben Säulenmaterial vorgenommen werden. Von der HiTrap^™ Heparin HP Sepharose^™-Matrix eluierte HCII in Abwesenheit von Kationen in einem Bereich von 180 bis 260 mM NaCl. Der größte Anteil des eluierten Proteins sammelte sich in einer Fraktion, die im Mittel 220 mM NaCl enthielt (Abbildung 4.2-1, Bild A). Unter vergleichbaren Versuchsbedingungen, jedoch mit 50 µM ZnCl2 in allen verwendeten Puffern, eluierte HCII von Heparin bei merklich höheren Ionenstärken. Die zur Elution notwendige NaCl-Konzentration betrug zwischen 370 und 470 mM, mit einem Elutionsmaximum bei ca. 400 mM NaCl (Abbildung 4.2-1, Bild B). Die relative Heparinaffinität wurde durch die Anwesenheit von Zinkionen nahezu verdoppelt.

1 Blinder & Tollefsen, 1990; Bauman & Church, 1999; Hayakawa et al., 2002

2 Bush et al., 1994

Abbildung 4.2-1: Fraktionierung von HCII unter Einfluss von Zinkionen

HCII aus humanem Plasma wurde auf eine HiTrap^™ Heparin HP Sepharose^™ Säule gebunden und durch einen linearen NaCl-Gradienten eluiert. Das Puffersystem enthielt entweder keine zweiwertigen Kationen (A) oder aber 50 µM ZnCl2 (B). Die Spuren 1 bis 13 entsprechen den Elutionsfraktionen 6 bis 18. Der Nachweis von HCII in den Eluaten erfolgte als Western-Blot nach einer denaturierenden SDS-PAGE. Die Ionenstärke wurde durch Leitfähigkeitsmessung ermittelt.

Der Western-Blot belegt, dass das eluierte HCII intakt war und die veränderte Affinität zu Heparin nicht durch Degradation des Proteins verursacht wurde. Weitere Untersuchungen zeigten zudem, dass die Elution in Gegenwart von Zinkionen nicht durch eine mögliche Denaturierung von HCII verursacht wurde, da dieses HCII bei erneuter Chromatographie auf der Heparin-Sepharose-Matrix unter Zugabe von EDTA (1 mM), im Mittel wieder bei 220 mM NaCl eluierte (Kontrolle nicht abgebildet). Der Effekt einer Veränderung des Elutionsmaximums in Gegenwart von Zinkionen war zudem schon bei geringeren Konzentrationen an ZnCl2 zu detektieren. Ein Einfluss auf das Elutionsmaximum konnte bereits bei 15 µM ZnCl2 beobachtet werden (Ergebnis nicht dargestellt). Das Ergebnis der höheren Affinität von HCII zu Heparin in Gegenwart von Zinkionen konnte auch auf anderen Heparin-Sepharose-Matrices reproduziert werden und war somit nicht auf eine Besonderheit einer einzigen Säulenmatrix zurückzuführen. Die ermittelte relative Affinität von HCII zu Heparin in Abwesenheit von Zn²⁺ liegt im Rahmen der Literaturwerte. Diese erstrecken sich über einen Bereich von 180 bis 400 mM NaCl ¹. Die Varianz dieser Daten wird durch die verwendeten, von einander abweichenden Affinitätsmatizes verursacht. Auch die Art und Form des Elutionsgradienten kann einen Einfluss auf die beobachtete Affinität haben. Dies verdeutlicht, dass ein Vergleich von relativen Affinitätswerten mit Literaturdaten nur eingeschränkt möglich ist und nur Daten, die auf der selben Matrix erhalten wurden, zueinander in Bezug zu setzen sind.

Neben Zinkionen wurden weitere zweiwertige Kationen aus der Gruppe der Übergangs-metalle hinsichtlich ihrer Wirkung auf die relative Affinität von HCII zu Heparin untersucht.

Die Versuchsdurchführung erfolgte in gleicher Weise wie zuvor als Heparin-Sepharose

1 Pratt et al., 1992; Gettins et al., 1996; Liaw, et al., 1999

Chromatographie in Gegenwart von 50 µM des jeweiligen Metallkations. Als divalente Ionen der Übergangsmetalle fanden die Kationen von Mangan, Nickel, Kupfer, Kobalt und Cadmium Verwendung. Nicht alle diese Ionen besitzen eine physiologische Relevanz, wurden aber als Kontrollen in die Untersuchungen miteinbezogen. Zink besitzt mit einer Elektronen-konfiguration [Ar] 3d¹⁰ 4s² keine Fähigkeit zu d-d-Übergängen, ein Charakteristikum welches normalerweise Elemente der Übergangsgruppe kennzeichnet. Auch ähneln Zink und andere Elemente der Gruppe IIb in ihrer Elektronenkonfiguration des Elements als auch des Ions eher den Elementen der zweiten Hauptgruppe. Daher wurden auch die beiden Kationen von Kalzium und Magnesium aus der zweiten Hauptgruppe des Periodensystems für Untersuchungen herangezogen. Die Ergebnisse der Bestimmung von relativen Affinitäten sind in Form von Tabelle 4.2-1 wiedergegeben.

Tabelle 4.2-1: Effekt von divalenten Kationen auf die rel. Bindungsaffinitäten an Heparin HP Sepharose^™

Protein Kationen Elutionsmaximum (mM NaCl)

HCII ohne Kationen oder in Gegenwart von EDTA 220

50 µM Zn²⁺ 400

50 µM Mn²⁺ 220

50 µM Ni²⁺ 280

50 µM Cu²⁺ 270

50 µM Co²⁺ 250

50 µM Cd²⁺ 230

1000 µM Mg²⁺ 220

1000 µM Ca²⁺ 220

50 µM Zn²⁺, 1000 µM Mg²⁺ 400

50 µM Zn²⁺, 1000 µM Ca²⁺ 400

α-Thrombin ohne Kationen 500

50 µM Zn²⁺ 500

Relative Bindungsaffinitäten der heparinbindenden Proteine zu Heparin HP Sepharose™, ermittelt durch Affinitätschromatographie (FPLC).

Von den untersuchten Kationen waren neben Zn²⁺ lediglich die Ionen von Nickel, Kupfer und in etwas geringerem Ausmaß Kobalt, befähigt die Heparinaffinität von HCII zu beeinflussen.

Andere Kationen zeigten keine Änderung des Elutionsmaximums. Der erzielte Einfluss von Nickel-, Kupfer- und Kobaltionen auf die Heparinaffinität von HCII war wesentlich geringer als der Effekt, der durch Zinkionen erzielt wurde. In der Literatur finden sich verschiedene Beispiele, bei der Proteine mit spezifischer Zinkaffinität im geringerem Umfang auch durch Kupfer- und Nickelionen beeinflusst werden ¹. Die Ionen der Elemente Magnesium und Kalzium zeigten keine Beeinflussung der Heparinaffinität von HCII. Auch in physiologischen Konzentrationen (1 mM) ² zeigten diese Ionen keinen Effekt auf das Elutionsverhalten, noch waren diese Ionen in Kompetitionsexperimenten in der Lage, den durch 50 µM Zn²⁺

1 Kluszynski et al., 1997; Borza & Morgan, 1998; Horne et al., 2001

2 Corkey et al., 1986

verursachten Effekt zu unterbinden. Durch diese Kompetitionsexperimente konnte ein unspezifischer, rein ionischer Effekt von Zn²⁺ auf die HCII/Heparin Wechselwirkung ausgeschlossen werden. Die Änderung der Heparinaffinität durch Zinkionen war spezifisch für HCII, wie durch Kontrollexperimente mit α-Thrombin belegt werden konnte. Diese Serinprotease besitzt zwei mögliche Heparin-Bindestellen und eluiert von Heparin-Sepharose zwischen 500 und 650 mM NaCl ¹. Die hier vorgenommenen Untersuchungen zeigten ein Elutionsmaximum von α-Thrombin bei ca. 500 mM NaCl, das unabhängig von der Anwesenheit von 50 µM ZnCl2 war. Der Effekt, den Zinkionen auf die HCII/Heparin-Wechselwirkung haben, ist somit spezifisch für HCII.

4.2.1.2 Relative Heparinaffinität des HCII/α-Thrombin-Komplexes

Neben der Affinität von HCII zu Heparin ist ebenso die Wechselwirkung des HCII/α-Thrombin-Komplexes mit Heparin von Interesse. Beide Komponenten des SDS-stabilen Komplexes, Protease wie auch HCII, besitzen Heparinbindestellen. α-Thrombin besitzt zwei anionenbindende Domänen, bindet an Heparin aber ausschließlich über die Exosite II. Die zweite Anionenbindestelle (Exosite I) ist beim Komplexierungsmechanismus mit HCII von Bedeutung ². Bislang konnte die Affinität des HCII/α-Thrombin-Komplexes zu Heparin nicht eindeutig geklärt werden, da die Elutionswerte des Komplexes weder denen von HCII noch denen von α-Thrombin entsprechen ³. Als Lösungsansatz zu diesem Problem wurden Affinitätsuntersuchungen des Komplexes an Heparin-Sepharose unter Verwendung von 50 µM Zn²⁺ im Puffersystem vorgenommen, welches die Affinität zu HCII, aber nicht die zu α-Thrombin beeinflusst (s.u). Die Komplexierung wurde wie unter 3.10.1 beschrieben in Abwesenheit von Glykosaminoglykanen durchgeführt, um eine Kompetition zwischen immobilisiertem Heparin der Affinitätsmatrix und Glykosaminoglykanen im Analyten zu verhindern. Die Fraktionierung des Reaktionsansatzes mit allen darin enthaltenen Komponenten wurde wie unter 3.10.2 beschrieben mit einem FPLC^®-System durchgeführt.

Das Ergebnis als Western-Blot ist in Abbildung 4.2-2 wiedergegeben.

1 Pratt & Church, 1992; Ding & Xu, 1995; Han & Tollefsen, 1998

2 Sheehan et al., 1994

3 Böhme, 2001

Abbildung 4.2-2: Fraktionierung von HCII, α-Thrombin und deren Komplex unter den Einfluss von Zinkionen.

Ein HCII/α-Thrombin-Komplexierungsansatz wurde einer Chromatographie auf HiTrap^™ Heparin HP Sepharose^™ unterworfen. Die Elution erfolgte gegen einen linear ansteigenden NaCl-Gradienten (0 - 1 M) in Abwesenheit (A) und Anwesenheit (B) von 50 µM ZnCl2. Die Spuren 1-13 sind Eluatfraktionen des linearen Gradienten von 170 bis 670 mM NaCl. Die Detektion erfolgte durch einen Western-Blot mit Primärantikörpern gegen HCII sowie α-Thrombin. In den dargestellten Bildern sind die Banden den Komplexbestandteilen folgendermaßen zuzuordnen: HCII (72 kDa), α-Thrombin (33 kDa), Komplex (ca. 110 kDa).

Die HCII-Affinität zu Heparin wurde durch Zinkionen beeinflusst, die von α-Thrombin jedoch nicht. In Abwesenheit von Zinkionen eluierte HCII über einen Bereich von 200 bis 245 mM NaCl und in Gegenwart von 50 µM ZnCl2 bei höheren NaCl-Konzentrationen von 340 bis 430 mM. Demgegenüber blieb die Elution von α-Thrombin von Zinkionen unbeeinflusst. In beiden Fällen betrug die zur Elution der Serinprotease notwendige NaCl-Konzentration 470 bis 550 mM. Damit bestätigte die Fraktionierung des HCII/α-Thrombin-Komplexes an Heparin-Sepharose die zuvor gemachtem Aussagen (Tabelle 4.2-1). Der Komplex aus HCII und α-Thrombin ist im 10 % SDS-PAGE als ca. 110 kDa Bande sichtbar.

Sein Elutionsverhalten war ebenso wie das von HCII mittels Zinkionen modifiziert. Der größte Anteil des Komplexes eluierte unter Standardbedingungen zwischen 335 und 470 mM NaCl. Doch bei Anwesenheit von Zinkionen (50 µM) im Puffersystem waren höhere Ionenstärken (470 bis 630 mM NaCl) notwendig um den Komplex zu eluieren. Eine Angabe von Elutionswerten des Komplexes ist nicht exakt möglich, da der Komplex über sehr viele Fraktionen eluierte. Zweifelsfrei erkennbar ist die Tatsache, dass die Gegenwart von Zinkionen einen Einfluss auf die Affinität des HCII/α-Thrombin-Komplexes zu Heparin hatte. Damit besteht die Möglichkeit, dass der HCII/α-Thrombin-Komplex über die Heparin-bindestelle vom HCII an Heparin gebunden wird, da er wie reines HCII – aber im Gegensatz zu α-Thrombin - eine Affinitätssteigerung durch die Ionen erfährt.