2.9.1 Analyse der Leptin- und Geschlechtshormonspiegel im Plasma
In Kooperation mit Herrn Prof. Georg Brabant (Department of Endocrinology, University of Manchester, England) wurde in den Proben von 4, 8 und 12 Monate alten Tieren gebundenes Leptin bestimmt.
Die Analyse der Blutproben der vier und 14 Monate alten Tiere, die vor der Euthanasie vorge-nommen wurde, geschah in Kooperation mit Herrn Prof. Rainer H. Straub (Abteilung Innere Medizin I, Universität Regensburg, F.J.-Strauss-Allee 11, 93042 Regensburg, Deutschland).
Dabei wurden die folgenden Parameter mittels kommerziell erhältlicher ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) bestimmt: 17-Östradiol, DHEA (Dehydroepiandrosteron), Östron so-wie Testosteron.
2.9.2 Immunhistochemie der Medium-sized Spiny Neurons mittels DARPP32-Färbung Diese Experimente wurden, wie bereits unter Punkt 2.8.2 beschrieben, unter Betreuung von Frau Dr. Åsa Petersén, MD, PhD, in Lund durchgeführt.
Die rechte Hemisphäre der Gehirne wurde an einem Mikrotom in koronarer Schnittebene mit einer Schnittdicke von 40 m in 8er Serien frei flottierend geschnitten. Die immunhisto-chemische Färbung verlief über zwei Tage. Die Schnitte wurden zuerst 3 x 10 min in 0.1M PBS gewaschen und daran anschließend 15 min in 3% Wasserstoffperoxid (H202) und 10% Methanol in 0.1M PBS inkubiert. Nach drei weiteren 10-minütigen Waschgängen in 0.1M PBS erfolgte die einstündige Vorinkubation mittels 10% Ziegenserum, 0.3% Triton X-100 in 0.1M PBS bei Raumtemperatur. Nach erneutem 10-minütigen Waschen mit 0.1M PBS wurde den Schnitten der primäre Antikörper (rabbit IgG polyklonal anti-DARPP-32, 1:1000, AB1656, Chemicon, Billerica, MA, USA) in einer Konzentration von 1:1000 mit 2.5% Ziegenserum in 0.1M PBS über Nacht bei Raumtemperatur zugesetzt.
Am folgenden Tag wurden die Schnitte zuerst wieder 3 x 10 min in 0.1M PBS gewaschen. Dar-an Dar-anschließend wurde der sekundäre Antikörper (biotinylated goat Dar-anti-rabbit IgG 1:200, E0353, DAKO, Stockholm, Schweden) in einer Konzentration von 1:200 in 0.1M PBS hinzu-gegeben. Die eigentliche Farbreaktion wurde mittels einer ABC-Lösung (VectaStain Elite Kit, PK-6100, Vector Laboratories, Järfälla, Schweden) und daran anschließender DAB-Lösung (Peroxidase Subtrate Kit, SK-4100, Vector Laboratories) erreicht, was zu einer Braunfärbung der Schnitte führte. Die Schnitte wurden nochmals 3 x 10 min gewaschen und dann auf gelati-nebeschichtete Objektträger aufgetragen, über Nacht getrocknet und am nächsten Tag auf den Objektträgern eingedeckelt.
2.9.3 Stereologische Quantifizierung der DARPP32+ Neurone im Striatum
Die quantitative Auswertung der gefärbten Schnitte wurde an einem Lichtmikroskop (Eclipse 80i; Nikon, Tokyo, Japan) mit Nikon-Objektiven (Plan UW 2x/0.06, Plan 4x/0.1, Plan 10x/0.25, Plan Apo UV 60x/1.40 oil), Objekttisch (Prior Modell H101, Rockland, Ma, USA) und Stereo-logie-Software (Visiopharm, Integrater System) vorgenommen. An das Mikroskop ist eine spe-zielle digitale Mikroskopkamera angeschlossen (PixeLINK PL-A622C, Ottawa, Kanada), mit welcher die dargestellten Aufnahmen gemacht wurden.
Bei dieser Untersuchung wurden insgesamt drei Parameter erhoben: 1.) das Volumen, 2.) die Zellzahl sowie 3.) die Zellgröße. Das Volumen des Neostriatums, welches zwischen 10.70 mm Interaural / 1.70 mm Bregma und 8.60 mm Interaural / -0.40 mm Bregma liegt (Paxinos and Watson 1998; Kantor et al. 2006), wurde bestimmt (siehe dazu auch die grau hinterlegten Be-reiche in Abb. 2.7).
Des Weiteren wurden von jedem Gehirn mindestens 13 striatale Schnittebenen ausgewertet, wobei die Rahmengröße 10% und die Fraktion 0.75% betrugen, so dass in jedem Gehirn mehr als 200 DARPP32+ Neurone gezählt wurden. Da die Schnitte mit 40 m eine relativ große Schnittdicke aufwiesen, wurde jeder Schnitt komplett durchfokussiert. Bei der Auswertung wurde zusätzlich eine weitere Analyse vorgenommen, um zu überprüfen, ob der jeweilige Schnitt vollständig von der Färbung penetriert worden ist. Sofern dies nicht der Fall war, wurde dies in der Statistik einberechnet.
Außerdem ermöglichte die Funktion des „Nukleator-Prinzips“ (Gundersen 1988) die Bestim-mung der Zellgröße, indem der Nukleus sowie die Zellgrenzen eines Neurons markiert wurden.
Abb. 2.7: Striatale Schnittebenen. Links der Anfangsbereich und rechts der Endbereich der Aus-wertung im Striatum jeweils grau hinterlegt, modifiziert nach Paxinos und Watson 1998. Es wurde jeweils nur die rechte Hemisphäre ausgewertet.
2.9.4 Immunfluoreszenz von Medium-sized Spiny Neurons und Östrogenrezeptoren Hierzu wurden vier Gehirne (jeweils ein tgHD Weibchen und Männchen, sowie ein Kontroll-Weibchen und Männchen) an einem Mikrotom in koronarer Schnittebene mit einer Schnittdicke von 30 m in 8er Serien frei flottierend geschnitten. Vor der Inkubation wurden die ge-schnittenen Gehirne 60 min mit 10% Rinderserumalbumin (BSA = bovine serum albumine) zum Blocken versetzt und anschließend zweimal in PBS gewaschen. Danach wurden die Schnit-te über Nacht bei 4°C mit dem primären Antikörper gegen DARPP32 (rabbit monoklonal, 1:1000, EP720Y, Epitomics, Burlingame, Ca, USA) in einer Konzentration von 1:1000 zusam-men mit entweder dem Antikörper gegen den Östrogenrezeptor- (mouse IgG1 monoklonal, 1:250, ab858, Biozol, Eching Deutschland) oder Östrogenrezeptor- (mouse IgM monoklonal, 1:250, Ab-2 9.88, Calbiochem, Gibbstown, NJ, USA) in 1M PBS mit 2% BSA und 0.3% Triton X-100 inkubiert. Nach zweimaligem Waschen in PBS wurden die Schnitte zwei Stunden bei Raumtemperatur mit den sekundären Antikörpern versetzt (gegen DARPP32: Cy3 goat anti-rabbit IgG, 1:1200, Jackson ImmunoResearch, Suffolk, UK; gegen Östrogenrezeptor-: Alexa 488 donkey anti-mouse IgG, 1:200, Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland; gegen Östrogenrezep-tor-: Alexa 488 goat anti-mouse IgM, 1:200, Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland). Nach erneu-tem Waschen wurden die Nuklei mittels 4’,6-diamidino-2-phenylindole (= DAPI, 1:1000, In-vitrogen, Karlsruhe, Deutschland) gefärbt. Anschließend wurden die Schnitte wieder gewa-schen, auf Objektträger aufgetragen und mit Mowiol® eingedeckelt. Die Beurteilung der Schnitte wurde mit einem Nikon Lichtmikroskop (Eclipse 80i; Nikon, Tokyo, Japan), dem dazu gehörigen Nikon HiSN Fluoreszenz System und einer Bildbearbeitungssoftware (Stereo In-vestigator, MicroBrightField, Williston, VT) vorgenommen.
2.9.5 Rezeptorautoradiographie
Die kryokonservierten Gehirne wurden im Forschungszentrum Jülich unter Betreuung von Herrn Prof. Andreas Bauer (Arbeitsgruppe Molekulares Neuroimaging im Institut für Neuro-wissenschaften und Biophysik im Forschungszentrum Jülich) bearbeitet und ausgewertet. Eine detaillierte Beschreibung der Methodik ist bei Zilles et al. und Bauer et al. zu finden (Zilles et al. 1991; Bauer et al. 2005).
Die Gehirne wurden mit Gefrierkleber aufgeblockt und bei -20° C mit einer Schnittdicke von 20 μm geschnitten sowie auf beschichtete Objektträger aufgenommen. Hieran anschließend wur-den diese luftdicht verpackt und für 36 Stunwur-den bei 4° C auf Kieselgel getrocknet.
Zur Herstellung der radioaktiven Ligandenbindung wurden mittels einer Vorinkubation in Puf-ferlösung die noch vorhandenen Neurotransmitter aus dem Gewebe entfernt. In der Hauptinku-bation wurden die Schnitte in Pufferlösung mit den entsprechenden radioaktiven Liganden in-kubiert, siehe hierzu Tabelle 8.1 mit den experimentellen Details im Anhang.
Anschließend wurden diese für drei bis vier Tage gegen tritium(3H)-sensitive Speicherfolie exponiert (digitale Autoradiographie). Die Speicherfolien wurden daraufhin mit dem BAS 5000 Bioimaging-System (Fuji, Japan) gescannt. Das Ergebnis ist ein Autoradiogramm, welches die Verteilung des Liganden im Schnitt zeigt. Die Auswertung der Daten erfolgte mit spezieller Auswertungssoftware (AIDA, Raytest, Straubenhardt, Deutschland), dabei wurde die Rezeptor-dichte im Striatum anhand von fünf bis sechs Schnitten pro Tier analysiert. Die Auflösung die-ser Methode beträgt 50 bis 100 μm. Aufgrund der Kenntnis der Halbwertszeit des Tritiums so-wie der gemessenen Ligandenkonzentrationen in den Lösungen, erhält man als Ergebnis die Dichte der Rezeptoren (in fmol/mg).