Adhäsionsassay in der Durchflusskammer

Zur Herstellung der unterschiedlichen Konzentrationen der bovinen Kollagen- Lösung wurde die 0,1 %-ige Ausgangslösung mit der entsprechenden Menge Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) verdünnt. Das canine Kollagen lag als lyophilisiertes Pellet vor. Die Lösung erfolgte wie vom Hersteller empfohlen in 0,5 -molarer Essigsäure mit einem pH-Wert von 2,5. Das 10 mg Pellet wurde über Nacht mit 10 ml der Essigsäure in einem Zentrifugenröhrchen im Kühlschrank bei +4°C auf einem Taumel-Rollmischer inkubiert. Verbliebenes Sediment wurde mit einem Homogenisator aufgelöst. Aus der Stocklösung wurden durch Verdünnung mit DPBS die Konzentrationen 30, 200 und 500 !g/ml hergestellt. Die Lagerung erfolgte laut Herstellerangaben für einen Monat im Kühlschrank bei +4°C.

4.2.2 Beschichtung der Substrate

Beim VenaEC$ Substrat (Abb. 2) handelt es sich um einen Plastikchip, der für die Versuche mit Kollagen beschichtet wurde. Zu Beginn wurde das Substrat gewaschen, in dem es zunächst mit einer Pinzette vorsichtig in einer Petrischale mit 70 %-igem Ethanol geschwenkt wurde. Anschließend wurde das Substrat mit der Pinzette in zwei mit DPBS gefüllten Petrischalen überführt und gespült, um alle Ethanolreste zu entfernen. Nun wurden 125 !l der entsprechenden Kollagenlösung in einer weiteren Petrischale vorgelegt und das vorbereitete Substrat darauf gelegt, so dass sich die Kollagenlösung gleichmäßig darunter verteilen konnte. Das Substrat auf der Kollagenlösung wurde für mindestens 12 Stunden im Kühlschrank bei +4°C inkubiert. Vor Montage des Substrates unter dem Biochip wurde das beschichtete Substrat vorsichtig in DPBS geschwenkt, um nicht gebundene Reste der Kollagenlösung zu entfernen.

Abb. 2 Schematische Darstellung des Substrats

III Material, Tiere und Methoden

4.2.3 Fluoreszenzfärbung der Thrombozyten

Zur Fluoreszenzfärbung der Thrombozyten in Citratblut wurde der Farbstoff 3,3’-Dihexyloxacarbocyanin-Iodid (DiOC6, 1 mmol/l) in einer Endkonzentration von 1

!mol/L verwendet. Dafür wurde die Stammlösung nochmals 1:10 nach den Angaben des Herstellers mit Ethanol verdünnt und davon 10 !l in 1 ml Citratblut gegeben. Die Probe wurde für 30 Minuten bei Raumtemperatur und unter Lichtausschluss inkubiert. Die Färbung wurde anschließend in einem Nativpräparat unter dem Mikroskop kontrolliert.

4.2.4 Protease aktivierender Rezeptor 4 Agonist (PAR-4-Agonist)

Zur Herstellung der Stammlösung des PAR-4-Agonisten (20 mmol/l), der laut Herstellerangaben canine Thrombozyten, außer Thrombozyten vom Beagle, aktiviert, wurde der lyophylisierte Reagent in 1 ml destilliertem Wasser aufgelöst. Gemäß Herstellerangaben wurde die Stammlösung bei -20°C für maximal 4 Wochen gelagert.

Zur Thrombozytenaktivierung wurden 100 !l Probenvolumen mit 5, 10 und 20

!l PAR-4-Agonist für 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend durch den Kanal der Messkammer perfundiert. Die Endkonzentration des Agonisten in der Probe lag bei 0,9, 1,8 und 3,3 mmol/l.

4.2.5 In vitro Experimente

Für die in vitro Experimente mit LPS wurden 100 !l fluoreszenz-gefärbtes Citratblut mit 10 !l LPS-Lösung (3 ng/mL) für 30 Minuten inkubiert. Die Endkonzentration von LPS in der Probe lag somit bei 0,3 ng/ml. Für die in vitro Substitution von HES wurden 12 !l HES 6 % zu 100 !l Probenvolumen hinzugefügt (Endkonzentration 6,4 mg/ml) und für 10 Minuten inkubiert und unmittelbar danach gemessen.

4.2.6 Vorbereitung des Biochips

Der für die Durchflusskammer verwendete Einweg-Biochip (Abb. 3) benötigte nur ein geringes Probenvolumen, so dass zum Beispiel für ein Experiment über 3 Minuten bei einer Wandschubspannung von 14 dynes/cm² ein Probenvolumen von 100 !l ausreichend war. Jeder Biochip besteht aus zwei parallelen Kanälen (20 mm Länge x 600 !m Weite x 120 !m Tiefe), wobei die Messung der Kanäle im Versuch nacheinander erfolgte. Vor Versuchsbeginn wurde die schützende Basis des Biochips entfernt, welche zum Schutz der Kanäle angebracht ist. Der Biochip wurde

Abb. 3 Schematische Darstellung der Durchflusskammer.

anschließend laut Herstellerempfehlungen für mindestens 30 Minuten in DPBS eingelegt, um die Silikonmembranen einzuweichen, welche die Kanäle begrenzen.

Dies ist notwendig, um bei der Montage des Biochips auf dem Substrat die Dichtigkeit der Kanäle zu erreichen.

4.2.7 Versuchsdurchführung

Zu Beginn des Experiments wurde das Substrat mit einer Pinzette in den dafür angefertigten Basisrahmen gesetzt, so dass die mit Kollagen beschichtete Seite nach oben zeigte. Der zuvor wie beschrieben präparierte Biochip wurde an einer Seite des Substrates angesetzt und dann vorsichtig in Verlaufsrichtung der Kanäle abgesenkt, um eine Luftblasenbildung im Kanal zu vermeiden. Zum Schluss wurde der Deckrahmen aufgesetzt und mit 2 Schrauben fest angezogen, um den Biochip auf dem Substrat zu fixieren und die Kanäle abzudichten.

Der montierte Biochip wurde auf dem mit Kamera und Computer ausgestatteten Inversmikroskop positioniert (Abb. 4) und über das Schlauchsystem auf der einen Seite mit der Präzisionspumpe und auf der anderen Seite mit der fluoreszenzgefärbten Blutprobe verbunden. Die weitere Steuerung des Experiments erfolgte dann über die Software Vena Flux Assay 2.2.a, mit der zunächst der Kanal des Biochips mit Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) gespült wurde.

An der Präzisionspumpe wurde ebenfalls mit Hilfe der Software die gewünschte Wandschubspannung von 14, 40 oder 60 dynes/cm² gewählt. Die Blutprobe wurde dann für 3 Minuten durch den Kanal perfundiert. Im Anschluss wurde der Kanal für eine Minute mit HBSS gespült, um Reste der Blutprobe zu entfernen. Zur Detektion der adhärierenden Thrombozyten wurden entlang des Kanals mit manueller Einstellung unter 400-facher Vergrößerung 10 Bilder mit einer

III Material, Tiere und Methoden

Abb. 4 Versuchsaufbau für die Experimente in der Durchflusskammer

Größe von je 340 x 340 !m (115,6 mm²) aufgenommen. Während der Aufnahme der Bilder wurde der Kanal weiterhin mit HBSS perfundiert.

4.2.8 Messparameter

Die Bilder wurden mit der Software ImageJ 1.38x (National Institutes of Health, USA) ausgewertet. Gemessen wurde die Thrombozytenadhäsion bzw. die Thrombozyten-bedeckte Gesamtfläche in !m² und die Durchschnittsgröße der von Thrombozyten-bedeckten Fläche in !m². Zu Beginn der Auswertung wurde das Programm auf die Größe der Bilder kalibriert. In jedem Bild wurde mit Hilfe der Software die „Area of Interest“ (Parameter Threshold) definiert, so dass alle mit Thrombozyten-bedeckten Bereiche > 4 !m² detektiert wurden (dies entspricht in etwas einer Größe von zwei Thrombozyten). Es war nicht möglich, zwischen adhärierenden oder aggregierenden Thrombozyten zu unterscheiden. Für einen Kanal wurden 10 Bilder ausgewertet.