Aus der Klinik für Innere Medizin-Kardiologie Direktor: Prof. Dr. B. Schieffer
des Fachbereichs Medizin der Philipps–Universität Marburg in Zusammenarbeit mit dem Universitätsklinikum
Gießen und Marburg GmbH, Standort Marburg
Quantifizierung von Polymorphismen im
Tumor-Nekrose-Faktor-alpha Gen und im
Interleukin-10 Gen bei Patienten mit
dilatativer Kardiomyopathie
Inaugural-Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades der gesamten Humanmedizin dem Fachbereich Medizin der Philipps-Universität Marburg
vorgelegt von
Daniela Renata Pietz aus Deutsch Piekar
Angenommen vom Fachbereich Humanmedizin der Philipps- Universität Marburg am: 5.6.2013 Gedruckt mit Genehmigung des Fachbereichs. Dekan: Prof. Dr. M. Rothmund
Referent: Prof. Dr. B. Maisch 1. Koreferent: Prof. Dr. S. Vogt
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung ... 9
1.1. Kardiomyopathien ... 9
1.1.1. Definition und Klassifikation ... 9
1.1.2. Die dilatative Kardiomyopathie ... 10
1.1.2.1. Definition ... 10
1.1.2.2. Epidemiologie ... 11
1.1.2.3. Klinik und Prognose ... 14
1.1.3. Die familiäre dilatative Kardiomyopathie ... 15
1.2. Zytokine ... 16
1.2.1. Definition ... 16
1.2.2. Zytokine im Myokard ... 17
1.2.3. Tumornekrosefaktor - α ... 18
1.2.3.1. Klassifikation und erste Beschreibung ... 18
1.2.3.2. Biologische Effekte von TNF-α ... 19
1.2.3.3. Signaltransduktion ... 20
1.2.3.4. Polymorphismen des TNF-α Gens ... 22
1.2.3.5. TNF-α im Myokard ... 24
1.2.4. Interleukin-10 ... 26
1.2.4.1. Endeckung und Namensgebung ... 26
1.2.4.2. Biologische Effekte von IL-10 ... 26
1.2.4.3. Signaltransduktion ... 27
1.2.4.4. Polymorphismen des IL-10 Gens ... 28
1.2.4.5. IL-10 im Myokard ... 29
2. Fragestellung und Ziel der Arbeit ... 30
3. Materialien und Methoden ... 32
3.1. Materialien ... 32 3.1.1. Geräte ... 32 3.1.2. Chemikalien ... 32 3.1.3. Primer... 33 3.1.4. Enzyme ... 33 3.1.5. Puffer ... 33 3.2. Methoden ... 34 3.2.1. Untersuchungsdesign ... 34 3.2.1.1. Die Patientengruppe ... 34 3.2.1.2. Die Kontrollgruppe ... 35
3.2.2. Analyse des TNF-α -308- und des IL-10 -1082 Promotorpolymorphismus ... 35
Inhaltsverzeichnis
3.2.2.3. Gelelektrophorese ... 36
3.2.3. Analyse des TNF-α -308 Promotorgenpolymorphismus ... 37
3.2.3.1. PCR ... 37
3.2.3.2. Restriktionsverdau ... 38
3.2.4. Analyse des IL-10 -1082 Promotorgenpolymorphismus ... 40
3.2.4.1. PCR ... 40
3.2.4.2. Restriktionsverdau ... 41
3.2.5. Statistik ... 42
4. Ergebnisse ... 45
4.1. Tumornekrosefaktor-α ... 45
4.1.1. Exemplarische Gelelektrophoresebilder von TNF-α... 45
4.1.2. Analyse der Patienten- und Kontrollgruppe ... 46
4.1.2.1. Analyse der Genotypverteilung mittels Chi-Quadrat-Test ... 46
4.1.2.2. Analyse der Allelverteilung mittels Chi-Quadrat-Test ... 48
4.1.3. Analyse der Indexpatientengruppe ... 50
4.1.3.1. Überprüfung der Stichproben auf Normalverteilung im Kolgomorv Smirnov -Anpassungstest ... 50
4.1.3.2. Varianzalalyse normalverteilter Stichproben mittels ANOVA-Test ... 51
4.1.3.3. Vergleich relevanter Parameter im Tukey-Test... 52
4.1.3.4. Varianzanalyse nicht-normalverteilter Stichproben mittels H-Test nach Kruskal und Wallis ... 54
4.1.3.5. Vergleich biometrischer und erhobener Daten im Chi-Quadrat-Test ... 54
4.2. Interleukin-10 ... 56
4.2.1. Exemplarische Gelelektrophoresebilder von IL-10 ... 56
4.2.2. Analyse der Analyse Patienten- und Kontrollgruppe ... 57
4.2.2.1. Analyse der Genotypverteilung mittels Chi-Quadrat-Test ... 57
4.2.2.2. Analyse der Allelverteilung mittels Chi–Quadrat-Test ... 58
4.2.3. Analyse der Indexpatiengruppe... 60
4.2.3.1. Überprüfung des Stichprobe auf Normalverteilung im Kolgomorov-Smirnov-Anpassungstest ... 60
4.2.3.2. Varianzanalyse normalverteilter Stichproben im ANOVA-Test ... 61
4.2.3.3. Vergleich relevanter Parameter im Tukey-Test... 62
4.2.3.4. Vergleich biometrischer und erhobener Daten im Chi-Quadrat-Test ... 64
5. Diskussion ... 66
5.1. Darstellung und Interpretation der Ergebnisse ... 66
5.1.1. TNF-α ... 66
5.1.2. IL-10 ... 70
5.2. Grenzen der Untersuchung ... 72
5.3. Schlussfolgerung und Bedeutung für die Zukunft ... 73
Inhaltsverzeichnis 5.5.2. IL-10 ... 76 6. Zusammenfassung ... 78 7. Summary ... 80 8. Literaturverzeichnis ... 81 9. Anhang ... 114 9.1. Abbildungsverzeichnis ... 114 9.2. Tabellenverzeichnis ... 116
9.3. Verzeichnis der akademischen Lehrer ... 119
8.4. Lebenslauf ... 119
8.5. Danksagung ... 120
Abkürzungsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
A Adenin
ACTH Adrenocorticotropes Hormon AHAs Anti-Herz-Autoantikörper
AIDS acquired immunodeficiency syndrome =erworbenes Immundefizidsyndrom APC antigenpräsentierende Zellen
ARDS Acute respiratory distress syndrome =Atemnot-Syndrome des Erwachsenen
ARVCM Arrhythmogene rechtsventrikuläre Kardiomyopathie
Bp Basenpaare
BMBF Bundesministerium für Bildung und Forschung bzw. beziehungsweise
C Cytosin
COPD Chronisch obstruktive pulmonale Erkrankung dATP Desoxyadenosintriphosphat DCM Dilatative Kardiomyopathie DCMs Dilatative Kardiomyopathien dCTP Desoxycytidintriphosphat df Freiheitsgrade dGTP Desoxyguanosintriphosphat d.h. das heißt DNA Desoxyribonukleinsäure DNTPs Desoxynukleosidtriphosphate dTTP Desoxythymidintriphosphat EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
EDP endiastolic pressure =enddiastolische Druck EDVI enddiastolische Volumenindex
EF Ejektionsfraktion Etc. et cetera
fDCM familiäre dilatative Kardiomyopathie
Fu Follow-up
Abkürzungsverzeichnis
G-CSF Granulozyten-Kolonie stimulierende Faktor =Granulocyte-colony stimulating factor
GM-CSF Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor =Granulocyte macrophage colony-stimulating factor HCM Hypertrophe Kardiomyopathie
HF Herzfrequenz
HLA Human Leukocyte Antigen = humanes Leukozytenantigen
ICAM-1 intracellular adhesion molecule 1 = Intrazelluläres Adhäsionsmolekül 1 IFN-γ Interferon gamma
IL-10 Interleukin 10
IL-10 1*A Adenin an der Position -1082 im Il-10 Gen IL-10 1*G Guanin an der Position -1082 im Il-10 Gen JAK1 Rezeptor-assozierte Janus Kinase 1
kb Kilobasen
kDa Kilodalton
KHK Koronare Herzerkrankung
KH Krankenhaus
KI Konfidenzintervall
KNHI Kompetenznetz Herzinsuffizienz
ISFC International Society and Federation of Cardiology LPS Lypopolysaccharid
LVEDD linksventrikulärer enddiastolischer Durchmesser
MHC Major Histocompatibility Complex = Haupthistokompatibilitätskomplex
Min Minute
MnL1 Gen von Moraxella nonliquefaciens MRT Magnetresonanztomographie Noc1 Gen von Nocardia coralline
OR Odds Ratio
PB19 Parvovirus B19
PCR Polymerasekettenreaktion (Polymerase Chain Reaction) PGE2 Prostaglandin-E2
RCM Restriktive Kardiomyopathie
RFLP Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus RFLPs Restriktionsfragmentlängenpolymorphismen
Abkürzungsverzeichnis
Sek Sekunde
SD Standard deviation / Standardabweichung SNP Single Nucleotid Polymorphismus
SNPs Single Nucleotid Polymorphismen SF Verkürzungsfraktion
s.o. siehe oben
STAT1 Signal Transducer and Activator of Transcription 1 STAT3 Signal Transducer and Activator of Transcription 3 STAT5 Signal Transducer and Activator of Transcription 5 s.u. siehe unten
T Thymin
TBE Tris, Borsäure, EDTA
TH-2 Thymus-Lymphozyten-Helferzellen Typ 2 TNFA1 Guanin an der Position -308 im TNF-α Gen TNFA2 Adenin an der Position -308 im TNF-α Gen TNF-α Tumornekrosefaktor alpha
TNFR1 Tumornekrosefaktor alpha Rezeptor 1 TNFR2 Tumornekrosefaktor alpha Rezeptor 2 TSH Thyroid stimulating hormon
TYK2 Tyrosinkinase 2 z.B. zum Beispiel
1. Einleitung
1. Einleitung
1.1. Kardiomyopathien
1.1.1. Definition und Klassifikation
Kardiomyopathien sind neben der koronaren Herzerkrankung und der arteriellen Hyper-tonie eine der zahlreichsten Ursachen für das Syndrom chronische Herzinsuffizienz und stellen die häufigste Indikation für die Herztransplantation dar (McMurray et al., 2000; Aziz et al., 2000; Everly MJ, 2008; Regitz-Zagrosek et al., 2010; Maisch et al., 2010). Die Arbeitsgruppe für Myo- und Perikarderkrankungen der Europäischen Gesellschaft für Kardiologie definierte 2008 die Kardiomyopathien als „Erkrankungen des Herzmus-kels, die mit einer funktionellen und strukturellen Abnormalität des Myokards in Abwe-senheit einer koronaren Herzerkrankung, einer Hypertonie, kongenitalen Herzerkran-kungen oder Herzklappenfehlern einhergehen“ (Elliot et al., 2008).
Angelehnt an die Klassifikation der Kardiomyopathien der WHO/ISFC (World Health Organization/International Society and Federation of Cardiology) Task Force aus dem Jahre 1980 sowie die überarbeitete Klassifikation der WHO/ISFC Task Force aus dem Jahr 1996 werden die Kardiomyopathien nach morphologischen und funktionellen As-pekten in die Entitäten dilatative (DCM), restriktive (RCM), hypertrophe (HCM), ar-rhythmogene rechtsventrikuläre (ARVCM) und nicht klassifizierte Kardiomyopathie (NKCM) eingeteilt (WHO/ISFC Task Force, 1980; Richardson et al., 1996).
Differenziert werden die fünf Entitäten der Kardiomyopathien weiterhin in eine geneti-sche bzw. familiäre und eine nichtgenetigeneti-sche bzw. nichtfamiliäre Form. Davon ausge-hend sind weitere Aufteilungen in Subtypen möglich. Die familiäre Kardiomyopathie kann nach dem zugrundeliegenden genetischen Defekt klassifiziert, die nichtfamiliäre Form der Kardiomyopathie, nach differenzialdiagnostischen, klinischen Aspekten (bei-spielsweise nach viralen, entzündlichen oder autoimmunen Erkrankungen) eingeteilt werden (Elliot et al., 2008).
Mit Hilfe dieser Klassifikation sowie zusätzlich publizierten Empfehlungen hinsichtlich der Durchführung einer Myokarsdbiopsie in entsprechenden klinischen Situationen (Cooper et al., 2007) ist heute die Bestimmung von genetischen, viralen und autoimmu-nen Ursachen (Maisch et al., 2012b) und infolge dessen die Durchführung einer adäqua-ten Therapie möglich.
1. Einleitung
Abbildung 1: Klassifikation der Kardiomyopathien nach ESC (Elliot et al., 2008)
1.1.2. Die dilatative Kardiomyopathie
1.1.2.1. Definition
Bei der DCM handelt es sich um eine Herzmuskelerkrankung, welche durch eine Dila-tation des linken Ventrikels sowie eine Dysfunktion der linksventrikulären Auswurfs-bahn in Abwesenheit einer Hypertonie, einer koronaren Herzerkrankung und Herzklap-penfehlern gekennzeichnet ist (Richardson et al., 1996; Elliott et al. 2008; Maisch et al., 2012b). Durch eine progrediente linksventrikuläre Dilatation und damit einhergehende Abnahme der Kontraktilität vermindert sich die Verkürzungsfraktion (=shortening frac-tion, SF) des linken Ventrikels und die systolische Ejektionsfraktion (EF) nimmt ab. Terminal führt die Erkrankung zu einer globalen systolischen Beeinträchtigung. Zusätz-lich kann der rechte Ventrikel betroffen sein (Elliott et al., 2008).
Diagnostiziert wird die DCM hauptsächlich echokardiographisch (Pankuweit et al., 2009a) nach zuvor durchgeführter Anamneseerhebung und Elektrokardiographie (Maisch et al., 2002b). Dabei sollte die Diagnose DCM nach den Empfehlungen der Europäischen Arbeitsgruppe über familiäre dilatative Kardiomyopathien (Collaborative Research Group of the Human and Capital Mobility Project on Familial Dilated Cardi-omyopathies) basierend auf den modifizierten Kriterien von Manolio et al. und Henry et al., wie in Tabelle Nr. 1 veranschaulicht, gestellt werden (Mestroni et al., 1999). Zur differentialdiagnostischen Abgrenzbarkeit einer DCM von anderen Herzerkrankungen, die das Syndrom Herzinsuffizienz verursachen, ist es in einigen Fällen notwendig zu-dem eine Koronarangiographie (Maisch et al., 2002b) oder eine Kardio-MRT
unidentifizierter genetischer Defekt Subtypen idiopathisch familiär/genetisch m Imm n-, und Freise zun e s- Prozesse, popto Imm n-, und Freise zun e s- Prozesse, popto Imm n-, und Freise zun e s- Prozesse, popto Imm n-, und Freise zung ess- Prozesse, poptose iliär / genetisch
nicht-familiär / nicht- genetisch
Subtypen NKCM RCM ARVC CM DCM HCM Kardiomyopathie
1. Einleitung
dem eine Myokardbiospie, mit deren Hilfe eine histologische, immunhistologische, vi-rologische und molekulare Differenzierungen erfolgen kann (Maisch et al., 2010). Eine Myokardbiopsie ist vor allem auch deswegen wichtig, weil „[d]ie Differentialtherapie dilatativer Kardiomyopathien […] ohne Endomyokardbiopsien nicht möglich [ist]“ (Maisch et al., 2010).
Tabelle 1: Kriterien für die Diagnose einer DCM nach Mestroni et al. (Mestroni et al., 1999) Einschlusskriterien der
Diagnosestellung der DCM
Ausschlusskriterien der Diagnosestellung der DCM
1. EF < 45% (>2SD) und/oder SF<25% 1. arterielle Hypertonie (>160/100 mmHg) 2. LVEDD > 117% (nach Henry) 2. KHK
(Obstruktion >50% in einem Hauptast) 3. chronischer Alkoholkonsum
4. anhaltende, rapide supraventrikuläre Arrhythmien 5. Systemerkrankungen 6. Perikarderkrankungen 7. Kongenitale Herzerkrankungen 8. Cor pulomale 1.1.2.2. Epidemiologie
Die DCM ist die häufigste Form der Kardiomyopathie (Paul et al., 2009). Aufgrund ihrer hohen Morbidität und Mortalität ist die DCM als eine schwerwiegende Erkran-kung anzusehen. Sie ist in ca. 13-18% für das Syndrom der chronischen Herzinsuffizi-enz verantwortlich (McMurray et al., 2000; Osterziel et al., 2000) und liegt damit nach der koronaren Herzerkrankung und Hypertonie ursächlich an dritter Stelle (Osterziel et al., 2005a). Des Weiteren stellt sie die häufigste Indikation für eine Herztransplantation dar (Kannel WB, 2000; Fu et al. 2002; Everly MJ, 2008). Die jährliche Inzidenz der DCM liegt bei ca. 5-8/100.000 (Codd et al, 1989; Abelman et al., 1989; Dec et al., 1994; Gregori et al., 2008), die Prävalenz bei ungefähr 36-40/100.000 (Codd et al., 1989; Richardson et al., 1996; Cowie et al., 1997; Maisch et al., 2012b). Männer sind häufiger als Frauen (2,5:1) und Afroamerikaner öfter als Kaukasier (2,5:1) betroffen (Dec et al., 1994; Towbin et al., 2002; Paul et al., 2009).
1. Einleitung
Auftreten kann eine DCM entweder familiär bzw. genetisch oder nichtfamiliär bzw. nichtgenetisch. Eine gute Anamneseerhebung ist zur Differenzierung wichtig. Dabei handelt es sich bei der familiären bzw. genetisch vererbten DCM um eine heterogene Erkrankung, die familiär gehäuft auftritt und für welche bereits mehrere Krankheitsgene identifiziert sind (Richardson et al., 1995; Mestroni et al., 1999; Osterziel et al., 2005b). Neben der Erstellung eines Familienstammbaumes, können genetische Untersuchungen zur Ermittlung der Ätiologie hilfreich sein (Pankuweit et al., 2009a). Genotyp und Phä-notyp korrelieren dabei nicht unbedingt miteinander. Mutationen in einem bestimmten Gen, können neben einen dilatativen auch einen hypertrophen Phänotyp hervorrufen (Maisch et al., 2012b).
Unter den nichtfamiliären bzw. nichtgenetischen DCMs ist die Ätiologie und Pathoge-nese in vielen Fällen nicht eindeutig zu eruieren. Der Anteil der DCMs ohne eindeutige Ursache macht etwa 50% aus (Paul et al., 2009). Neben diesen idiopathischen Formen der DCM, sind Formen bekannt, deren Ursache nachgewiesen ist. So spielen beispiels-weise inflammatorische, immunologische oder alkoholtoxische Faktoren bei der Patho-genese der DCM eine Rolle (Richardson et al., 1996; Maisch et al., 2010). Insbesondere scheinen auch kardiotrope Viren einen Einfluss auf die Entstehung einer DCM zu haben (Pankuweit et al., 2009).
Bei Vorliegen eines entzündeten, dilatierten Herzens und Nachweis eines ursächlichen kardiotropen Virus mittels PCR nach Myokardbiopsie wird eine DCM als virale in-flammatorische DCM bezeichnet (Maisch et al., 2012). In der zurzeit weltweit größten Untersuchung von Myokardbioptaten auf mikrobielle Erreger im Marburger Biopsiere-gister zeigte sich dabei ein Wechsel der für die virale inflammatorische Kardiomyopa-thie ursächlichen Viren in Europa (Maisch et al., 2000; Pankuweit et al., 2000; Panku-weit et al., 2003; Maisch et al., 2005; Kühl et al., 2005; Maisch et al., 2006; PankuPanku-weit et al., 2009b, Pankuweit 2012a). „Im Gegensatz zu den 1980er und 90er, in denen Ente-ro- und Adenoviren führten, prävalieren heute Parvovirus B19, HHV 6, EBV und CMV“ (Pankuweit et al., 2010a). Dabei hatte in der Marburger Untersuchung der Par-vovirus B19 die höchste Prävalenz unter den viralen Kardiomyopathien (Maisch et al., 2012a). Patienten mit einer EF <45% waren häufiger Parvovirus B19 positiv als Patien-ten mit einer EF >45% (Maisch et al., 2012a). Die drei aktuell führenden kardiotropen Viren „könnten [somit ein potentieller] Risikofaktor für die Entstehung [und den Pro-gress] einer DCM sein“ (Pankuweit et al., 2009a). Weiterhin wurde darüber berichtet,
1. Einleitung
dass Variationen in bestimmten Genen, welche z.B. für Zytokine kodieren, die Emp-fänglichkeit für diese Viren steigern können (Pankuweit et al., 2009a).
Abzugrenzen von der viralen inflammatorischen DCM, ist die autoraktive inflammato-rische DCM. Bei dieser sind zwar >14 Entzündungszellen wie z.B. Lymphozyten pro mm² nachzuweisen, die eine Entzündung im Myokard aufrechterhalten und die Entste-hung einer DCM triggern, jedoch kein ursächlicher Virus (Maisch et al., 2012).
Neben den viralen, inflammatorischen und autoreaktiven Ursachen einer DCM, haben weiterhin sowohl Umweltfaktoren, wie u.a. Lebensstil, sozioökonomischer Status oder Stress, als auch sogenannte „modifier Gene“, d.h. Gene mit Mutationen wie zum Bei-spiel Polymorphismen, die bei Vorhandensein einer bestimmten Gesamtkonstellation des Patienten, die Prognose einer DCM beeinflussen können, einen Einfluss auf die Pa-thogenese einer DCM (Pankuweit et al., 2009a). Eine autoimmune Komponente spielt ebenfalls bei der Entstehung einer DCM eine Rolle. Berichtet wurde in diesem Zusam-menhang von einigen Autoantikörpern, sogenannten „Anti-Herz-Autoantikörpern (AHAs)“, die sich gegen bestimmte kardiale Autoantigene richten und so eine DCM mitverursachen können (Caforio et al., 2007). Diese AHAs zirkulieren im Blut einiger an einer DCM erkrankter Personen. Auch lassen sich die AHAs bei einem Drittel asymptomatischer Verwandten dieser Patienten detektieren (Caferio et al., 2007). AHAs fungieren dabei bei gesunden Verwandten von Patienten mit einer manifesten DCM als unabhängige Prädiktoren innerhalb von 5 Jahren eine DCM zu entwickeln (Caferio et al., 2007).
Insgesamt gesehen scheint es sich bei der Pathogenese einer DCM um einen multifakto-riellen Vorgang zu handeln (Shaw T. et al., 2002; Jefferies et al., 2010). Bei einer ent-sprechenden Gesamtkonstellation des Patienten, entwickelt sich die Erkrankung nach einem primären Myokardschaden in drei Phasen (Mason JW, 2003; Maisch et al., 2012b). Bedingt durch verschiedene Prädispositionen, Umwelteinflüsse und das Vor-handensein eines kardiotropen Virus entsteht in einer ersten Phase eine akute Myokardi-tis (Pankuweit et al., 2010a; Ruppert et al., 2012). In einer zweiten autoimmunen Phase kann diese dann in eine chronische Myokarditis mit zirkulierenden Autoantikörpern übergehen (Pankuweit et al., 2010a; Maisch et al., 2012; Ruppert et al., 2012). In dieser Phase wird „das Herz zum Zielorgan der eigenen humoralen und zellulären Abwehr“ (Maisch et al., 2007). Obgleich ein kardiotroper Virus in jeder der drei Phasen persistie-ren kann, ist er in der Regel ab der zweiten Phase beseitigt (Maisch et al., 2007). Etwa 10-20% aller Patienten mit einer histologisch bestätigten Myokarditis entwickeln dabei
1. Einleitung
im Verlauf eine chronische Form der entzündlichen Herzmuskelerkrankung (Pankuweit et al., 2010a). In einer dritten Phase entsteht durch Remodelling des Myokards und indi-rekte Schäden z.B. durch das aktivierte Renin-Angiotensin-System, eine DCM (Panku-weit et al., 2009a).
1.1.2.3. Klinik und Prognose
Klinisch manifest wird die DCM meistens im Alter von 18-50 Jahren, obgleich die Erstmanifestation im Kindesalter und bei älteren Menschen ebenso erfolgen kann (Dec et al., 1994; Schmaltz AA, 2001). Erste klinische Zeichen zeigen sich in 75-85% der Fälle in Form einer Herzinsuffizienz. Verminderte Belastbarkeit, progressive Belas-tungsdyspnoe, Orthopnoe, Palpitationen, Synkopen und periphere Ödeme entstehen als Ausdruck der Herzschwäche. Aber auch Angina pectoris und Müdigkeit machen sich bei ca. einem Drittel der Patienten bemerkbar (Taylor et al., 2006). Die Patienten haben zum Zeitpunkt der Diagnose größtenteils bereits ein NYHA-Stadium III -IV (Towbin et al., 2002; Taylor et al., 2006).
Die Erkrankung schreitet progressiv voran (Taylor et al., 2006), wobei der Verlauf der DCM innerhalb der Patientengruppe sehr stark voneinander differiert (Osterziel et al., 2001). Im Verlauf der Erkrankung leiden die Patienten häufig an ventrikulären, aber auch atrialen Thromben. Nicht ungewöhnlich für die Erkrankung sind ebenfalls Ar-rhythmien (Richardson et al., 1996; Taylor et al., 2006). Dabei stellen Thromben und Herzrhythmusstörungen allerdings selten eine initiale Manifestation einer DCM dar. Die Prognose ist abhängig von der Gesamtkonstellation der Erkrankung, d.h. den Schweregrad der Inflammation, der Ursache der zugrundeliegenden Infektion, dem NYHA-Stadium, den hämodynamischen Verhältnissen etc. (Maisch et al., 2012b). Pati-enten, welche eine niedrigere EF und einen höheren linksventrikulären enddiastolischen und endsystolischen Druck, aber auch größere endsystolische und endiastolische Volu-mina im Vergleich zu anderen Erkrankten aufweisen, haben insgesamt eine schlechtere Prognose (Diaz et al., 1987; Schwarz et al, 1984). Die linksventrikuläre EF und der linksventrikuläre systolische Druck sind dabei unabhängige Prädiktoren der Überle-bendzeit (Schwarz et al., 1984). Jüngere Patienten habe außerdem eine weitaus schlech-tere Lebenserwartung als älschlech-tere (Maisch et al., 2002b).
Die Patienten versterben schließlich überwiegend am plötzlichen Herztod oder aber am Pumpfehler des Herzens. Allerdings kann aktuell durch die medikamentöse Therapie sowie andere Interventionen, wie zum Beispiel die Implantation eines Defibrillators
1. Einleitung
oder eine Herztransplantation, das Überleben der Patienten verlängert werden (Towbin et al., 2002; Gregori et al., 2006; Maisch et al., 2012). Durchschnittlich verbessert sich die Lebenserwartung der Patienten dank dieser therapeutischen Maßnahmen um ca. 7-8 Jahre (Maisch et al., 2012). Ultima ratio ist im Verlauf der Erkrankung meist eine Herz-transplantation. Die 5-Jahres-Mortalität ist mit etwa 30-50% als nicht günstig zu bewer-ten (Dec et al., 1994; Grogan et al, 1995; Felker et al., 2000; Towbin et al., 2002; Maisch et al., 2012b).
1.1.3. Die familiäre dilatative Kardiomyopathie
Von einer familiären DCM (fDCM) spricht man, wenn die Erkrankung vererbt wird und sich aus diesem Grunde gehäuft in einer Familie manifestiert. Weisen entweder zwei oder mehr Individuen einer Familie eine DCM auf oder verstirbt ein Verwandter ersten Grades eines DCM-Patienten vor dem 35. Lebensjahr an einen unerklärten plötzlichen Herztod, so kann von einer fDCM ausgegangen werden. Diese für die Diagnosestellung der fDCM empfohlenen Kriterien, wurden von der „Collaborative Research Groupe of the European Human and Capital Mobility Project on Familial Dilated Cardiomyo-pathy“ aufgestellt (Mestroni et al.; 1999).
Der Anteil der familiären Formen unter den DCMs wird in der Literatur zwischen 25-40% angegeben (Grünig et al., 1998; Mestroni et al., 1999a; Seidman et al., 2001; Schönberger et al., 2001; Maisch et al., 2002a; Towbin et al., 2002; Maisch et al., 2012b) und macht damit einen nicht geringen Anteil an allen DCMs aus. Auch, wenn die Erkrankung sehr heterogen ist, scheint in den meisten Fällen (ca. 60-70%) ein somal-dominanter Erbgang vorzuliegen (Osterziel et al., 2005b). Der Anteil der auto-somal-rezessiv vererbten fDCM unter allen fDCM liegt ferner bei ca. 16% und der x-chromosomale Erbgang bei etwa 10% (Mestroni et al., 1999b). Auch mitochondriale Erbgänge sind bekannt (Hughes et al., 2005). Die Mutationen scheinen häufig Gene für kardiale Strukturproteine zu betreffen (Taylor et al., 2006). Oft sind Proteine des Zytos-keletts oder Sakromers mutiert (Hershberger et al., 2010; Waldmüller et al., 2011). Doch auch Mutationen in bestimmten Zytokinen scheinen eine Rolle in der Ätiologie und Pathogenese der DCM zu spielen (Huang et al. 2008; Spiroska et al, 2009; Liang et al., 2010).
Einige bekannten Gene, welche bei vorhandener Mutation eine DCM verursachen kön-nen, sind in Tabelle 2 aufgelistet.
1. Einleitung
Tabelle 2: Bekannte Gene der fDCM (angelehnt an Osterziel et al., 2005b)
Erbgang autosomal – dominant autosomal - rezessiv x - chromosomal
Gen
Troponin T Desmoplakin Dystrophin
β – Myosin - Schwerkette Troponin I Tafazzin α – Actinin 2
α – Myosin – Schwerkette α – Tropomyosin
ATP – sensitiver Kaliumkanal kardiales α – Actin
kardialer Natriumkanal 5A Cypher/ZASP
Eye absent homolog 4 Metavinculin
Muscle LIM protein Myosin – binding protein C Phospholamban Titin Telethonin/Titin-cap Troponin C Desmin Lamin A/G δ – Sacroglycan
1.2. Zytokine
1.2.1. DefinitionZytokine sind lösliche Proteine oder Glykoproteine von relativ geringem molekularen Gewicht (15 bis 30 kDa), welche als Mediatoren der intrazellulären Kommunikation fungieren (Mann et al., 1994; Ristić et al., 2012) und essentiell für die zelluläre Prolife-ration und Differenzierung sind (Callard et al., 1999; Ristić et al., 2012). Eine weitere wichtige Aufgabe kommt den Zytokinen bei der Immunreaktion zu. Sie induzieren und koordinieren beispielsweise die Abwehrreaktion im Organismus (Kaur et al., 2009) und stellen die Homöostase nach einer Entzündungsreaktion wieder her (Vacchelli et al., 2012).
Aufgrund ihrer Funktion während der Immunantwort können sie in pro- und anti-inflammatorische Zytokine unterteilt werden (Kaur et al., 2009), welche basierend auf ihren gegensätzlichen Effekten für eine Balance im Organismus verantwortlich sind.
1. Einleitung
Produziert und sezerniert werden sie von nahezu allen Zelltypen des menschlichen Or-ganismus (Callard et al., 1999) und können abhängig von ihrem Bestimmungsort auto-, para- oder endokrin wirken (Mann et al., 1994).
Charakteristisch für die Zytokine ist ihre Pleiotropie, d.h. es können auch diverse Zyto-kine bei der gleichen Zelle zu nahezu gleichen Effekten führen, sowie die Redundanz, d.h. ein bestimmtes Zytokin kann mit etlichen Zelltypen interagieren (Kishimoto et al., 1994; Barrett et al. 1996).
Die Wirkung der Zytokine erfolgt durch Bindung an einen spezifischen Rezeptor der Zielzelle, wodurch eine intrazelluläre Kaskade induziert wird, die schließlich zu einer Aktivierung von Transkriptionsfaktoren und der gewünschten Genexpression führt (Kishimoto et al.1994; Callard et al., 1999).
1.2.2. Zytokine im Myokard
In der Literatur wird die Entstehung von kardialen Erkrankungen von vielen Autoren in Verbindung mit einer veränderten Zytokinexpression gesetzt.
In etlichen Untersuchungen wird beispielsweise die Beteiligung von erhöhten pro-inflammatorischen Zytokinen in der Pathogenese wie auch an dem Progress der Herzin-suffizienz verdeutlicht (Levine et al., 1990; McMurray et al., 1991; Finkel et al., 1992; Klappacher et al., 1993; Yokoyama et al., 1993; Dutka et al., 1993; Matsumori et al., 1994; Mann et al., 1994; Katz et al., 1994; Teseta et al., 1996; Torre-Amione et al., 1996a; Torre-Amione et al., 1996b; Seta et al., 1996; Kubota et al., 1997; Nozaki et al., 1997; Aukrust et al., 1999; Rauchhaus et al., 2000; Wang et al., 2009; Von Haehling et al., 2009). Pro-inflammatorische Zytokine können dabei ein myokardiales Remodelling induzieren und somit unter anderem zu einer kontraktilen Dysfunktion, Hypertrophie von Myozyten sowie einem fibrotischen Umbau des Myokards führen (Kelly et al., 1997; Li et al., 2000; McTiernan et al., 2000; Feldmann et al., 2000; Mann et al., 2001; Sivasubramanian et al., 2001; Uozumi et al., 2001; Ahmad et al.,2010). Auch die Aus-bildung von Kardiomyopathien oder einer Myokarditis kann durch eine Zytokinerhö-hung im Plasma bedingt sein (Matsumori et al., 1996; Ridker et al., 2000). Ebenfalls wurden erhöhte bzw. im Verhältnis zu pro-inflammatorischen Zytokinen inadäquat an-gestiegene anti-inflammatorische Zytokine mit kardialen Prozessen in Zusammenhang gebracht (Marriott et al., 1996; Aukrust et al., 1999; Yamaoka et al., 1999; Aukrust et al., 1999; Stumpf et al, 2003; Wykretowicz et al., 2004; Wang et al., 2009).
1. Einleitung
In den letzten Jahren wurden insbesondere Polymorphismen in den Genen, welche für Zytokine kodieren untersucht und geprüft, ob Assoziationen mit kardialen Erkrankun-gen bestehen (Ito et al., 2000; Alikasifoglu et al., 2003; Tiret et al., 2000; Liang et al., 2010). Unter Polymorphismen versteht man Variabilitäten innerhalb des Genoms, die durch die Veränderung von Basen innerhalb der DNA entstehen. Eine der häufigsten Polymorphismen sind die Einzelnukleotidpolymorphismen (Single nucleotid polymor-phism =SNP) (Aguillón JC et al., 2006), die in etwa 1% des Genoms aufzufinden sind (Brookes AJ, 1999). Bei SNPs kommt es zum Austausch von Basenpaaren innerhalb der DNA (Aguillón JC et al., 2006) und damit zu Variationen in der DNA, die zu ver-änderten Codons oder Nukleotidbasen-Tripletts, die für eine Aminosäure codieren, füh-ren. SNPs innerhalb einer regulatorischen Region in der DNA können zu einer abge-wandelten Genregulation führen. Auf diese Weise kann die Transkription von Genpro-dukten beeinflusst werden. Dies kann beispielsweise zur verstärkten oder verminderten Produktion eines bestimmten Enzyms führen, was sich wiederum auf biologische Pro-zesse auswirken kann. SNPs in Genen, die für Zytokinen kodieren können somit durch die Beeinflussung der Genexpression zu einer Verschiebung des Gleichgewichtes der Zytokine im Plasma führen. Ein veränderter Zytokinplasmaspiegel und ein Ungleich-gewicht von pro- und anti-inflammatorischen Zytokinen können wiederum zu einem erhöhten Risiko der Entstehung einer kardialen Erkrankung führen.
Im Folgenden werden das pro-inflammatorischen Zytokin TNF-α und das anti-inflammatorischen Zytokin IL-10 thematisiert und ihre Bedeutung im Myokard verdeut-licht.
1.2.3. Tumornekrosefaktor - α
1.2.3.1. Klassifikation und erste Beschreibung
Der Tumornekrosefaktor-alpha (TNF-α) gehört zu der Familie der Zytokine (von Haehling et al., 2004). Erstmals wurde TNF-α 1975 von Carswell et al. beschrieben. Aus dem Serum von mit Bacillus Calmette-Guérin infizierten Mäusen, die mit Lypopo-lysaccharid (LPS) behandelt wurden, isolierten Carswell et al. eine Substanz, welche die Eigenschaft hatte, in Tumorzellen Nekrosen zu verursachen. Diese Substanz wurde auf-grund ihrer nekrotisierenden Wirkung „TNF-α“ genannt (Carswell et al., 1975).
In der Literatur wird „TNF-α“ synonym mit „Cachectin“ verwendet. Dies resultiert dar-aus, dass einige Jahre nach der Beschreibung des TNF-α durch Carswell et. al, Cerami et al. bei chronisch an Trypanosoma brucei erkrankten Kaninchen eine ausgeprägte
1. Einleitung
Ausprägung der Kachexie ursächlich sein sollte isolierten. Diese Substanz nannten sie aufgrund der kachektischen Wirkung „Cachectin“ (Vassalli, 1992).
Erst Ende der 1980er Jahre entdeckten Beutler und Cerami, dass es sich bei TNF-α und Cachectin um dasselbe Molekül handelte (Beutler et al., 1988).
1.2.3.2. Biologische Effekte von TNF-α
Auch, wenn der TNF-α, wie sein Name impliziert, Nekrosen und den apoptotischen Zelltod induzieren kann (Schmid et al., 1986; Schwabe et al., 2006), ist seine Haupt-funktion die Expression von Genen, welche für die Zelldifferenzierung, das Zellwachs-tum und die Immunmodulation verantwortlich sind (Beyaert R et al., 1998; Staudt et al., 2002).
Dabei sind die biologischen Effekte von TNF-α im Organismus mannigfaltig. Es unter-stützt beispielsweise die Differenzierung von Makrophagen und steigert in Synergie mit INF-γ ihre Aktivität (Vassalli et al., 1992). Mit Hilfe von INF-γ verstärkt TNF-α zudem die Ausbildung von MHC II Molekülen an der Zelloberfläche von Monozyten und Makrophagen (van Deuren et al., 1992), was zu einer erhöhten Antigenpräsentation und damit zur einer stärkeren Immunantwort führt. TNF-α kann Chondrozyten, Fibroblasen und Osteoklasten in ihrer Aktivität stimulieren sowie den Glukosetransport in vielen Zellen fördern und den Katabolismus in Muskelzellen steigern (Vassalli et al., 1992). Es kann die Sekretion praktisch aller Zytokine triggern (Vassalli, 1992). Mit Hilfe von IL-1 und IL-7 steigert TNF-α die Thrombozytenproliferation (Ranges et al., 1988; Suda et al., 1990). Zusammen mit IL-1 induziert er außerdem die Synthese von Endothelzellen (Beutler et al., 1989).
Eine bedeutende Aufgabe kommt dem TNF-α bei inflammatorischen Prozessen zu (Va-ssali, 1992; Bazzoni et al., 1996; Aggarwal et al., 1996). TNF-α fungiert dabei als Me-diator allgemeiner Inflammationen (Ceconi et al. 1998; Staudt et al., 2002). Zusammen mit IL-1 induziert TNF-α als pyrogenes Endogen, durch Stimulation der Prostaglandin-E2 (PGProstaglandin-E2) Produktion im Hypothalamus, Fieber (Beutler et al., 1989; Ceconi et al., 1998). Es stimuliert die zytologische Aktivität von verschiedenen Abwehrzellen wie den natürlichen Killerzellen und lymphokinaktivierte Killerzellen (LAK-Zellen) in An-wesenheit von IL-2 (Ostensen et al., 1987) und hat somit eine bedeutende Aufgabe bei der Bekämpfung von parasitären, bakteriellen und viralen Infektionen. Dabei ist TNF-α das wichtigste Zytokin bei der Bekämpfung viraler Infektionen (Tayebi et al., 2012). Weiterhin triggert TNF-α die Aktivität von endothelialen Zellen, Monozyten,
Makro-1. Einleitung
phagen, Neutrophilen, Lymphozyten (Milenkovic L et al., 1989) und kann die Reakti-onsfähigkeit von aktivierten B-Lymphozyten verbessern (Kehrl et al., 1987; Jelinek, et al., 1987). Zusammen mit IL-1 fördert TNF-α die Expression von Adhäsionsmolekülen wie zum Beispiel ICAM-1 und Integrine, die zu einer Leukozytenrekrutierung zum Ort der Entzündung führt (Ceconi et al. 1998). Auch wirkt TNF-α chemotaktisch auf Ab-wehrzellen wie zum Beispiel auf Monozyten (Wang et al., 1990). In den Hepatozyten wird die Produktion von Akut-Phase-Proteinen gesteigert (Paltrinieri et al. 2007). TNF-α hat des Weiteren eine entscheidende Funktion bei der Entstehung des septischen Schocks (Männel et al., 2000). Steigen die TNF-α Plasmaspiegel akut stark an, bei-spielsweise bei einer Infektion, kann dies in einem septischen Schock resultieren. Über-exprimiertes TNF-α kann in diesem Zusammenhang unter anderem zu Fieber, Sekretion adrenerger Hormone, pulmonalen Ödemen, ARDS, Nekrosen des Gastrointestinaltrak-tes und der Nieren und zur disseminierten intravasalen Koagulopathie führen. Untersu-chungen zeigten weiterhin, dass TNF-α in diesem Kontext ein vermindertes Herzzeitvo-lumen, eine erniedrigte EF und erniedrigte Füllungsdrücken (Natanson et al., 1989) ver-ursachen kann.
Obgleich TNF-α selbst nur eine Halbwertszeit von 6-20 Minuten im Plasma hat, kann seine Wirkung einige Stunden andauern. Dies ist durch die Aktivierung anderer Zytoki-ne und HormoZytoki-ne bedingt (Tracey et al., 1994).
Chronisch leicht erhöhte TNF-α Plasmaspiegel hingegen führen zu einer Kachexie. Dies ist häufig bei an einem Tumor erkrankten Patienten der Fall (Wajant et al., 2003). Indu-ziert wird dies durch die Hemmung der Lipoproteinlipase durch TNF-α (Beutler et al., 1989). Zudem führen chronische Erhöhungen von TNF-α zu einer Insulinresistenz, He-patospenomegalie, erhöhten Raten an Metastasierungen von Tumoren und erhöhtem Katabolsimus von Proteinen (Tracey et al., 1994).
1.2.3.3. Signaltransduktion
Das pro-inflammatorische Zytokin TNF-α (Alikasifiglu et al., 2003) kann von verschie-denen Zellen des menschlichen Organismus produziert werden, wobei die Makrophagen die Hauptquelle darstellen (Beyaert et al., 1998; Peschon et al., 1998; Männel et al., 2000; Anderson et al., 2004; Schwabe et al., 2006). Sowohl die Produktion als auch die biologische Aktivität von TNF-α wird auf trans- sowie posttranskriptioneller Ebene reguliert (Sariban E et al., 1988; Golfeld et al., 1990,; Goldfeld et al., 1991; Economou et al., 1990; Sung et al., 1991; Han et al., 1990; Han et al., 1991; Aguillón JC, 2006).
1. Einleitung
Hauptstimulus für die TNF-α Sekretion aus Makrophagen ist LPS (Vassalli P, 1992; Luster et al., 1999; Männel et al., 2000). LPS kann eine dreifach erhöhte Transkription des TNF-α Genes und einen damit verbundenen 50- bis 100-fachen Anstieg der TNF-α-mRNA bewirken. Dies ist mit einer in etwa 10000-fach erhöhten TNF-α Sekretion ver-bunden (Beutler et al, 1989). Neben LPS gibt es allerdings noch zahlreiche andere Sti-muli, die die TNF-α Sekretion triggern können. So kann die TNF-α Sekretion bei-spielsweise durch andere Zytokine verstärkt werden. Auch können Enzyme wie zum Beispiel Phospolipase S oder Proteinkinasen einen Anstieg von TNF-α bewirken (Beyaert et al., 1998).
Synthetisiert wird TNF-α als ein Polypeptid mit einem molekularen Gewicht von 26kD. Dieses Polypeptid stellt eine Vorstufe des bioaktiven TNF-α dar und wird nach der Syn-these in die Membran der Zelle inseriert (Kriegler et al., 1988; Perez et al., 1990; Jue et al., 1990). Nach entsprechendem Stimulus, beispielsweise durch LPS, wird das 26kD schwere, membrangebundene Polypeptid durch das TNF-α-konvertierende Enzym pro-teolytisch in die bioaktive 17kD schwere und aus 157 Aminosäuren bestehende Form gespalten (Pennica et al., 1984; Davis et al., 1987). Drei dieser 17kD schweren Mono-mere verbinden sich anschließend nicht-kovalent zu einem Trimer (Smith et al., 1987; Jones et al., 1989) und können in dieser Form mit der Zielzelle interagieren. Für die Interaktion eines Trimers müssen sich jeweils drei TNF-α Rezeptoren gruppieren (Tracey et al., 1994).
Dabei sind zwei verschiedene Oberflächenrezeptoren, TNF-α-Rezeptor 1 (TNFR-1) (Loetscher et al, 1990; Schall et al., 1990) und TNF-α-Rezeptor 2 (TNFR-2) (Dembic et al., 1990; Smith et al, 1990), welche auf beinahe allen kernhaltigen Zellen zu finden sind (Peschon et al., 1998; Luster et al., 1999; von Haehling et al., 2004), für die Inter-aktion mit der Zielzelle von Bedeutung. Hauptsächlich werden die Signale an die Ziel-zelle durch den 55 kDa schweren TNFR-1 vermittelt (Luster et al., 1999; Bolger et al, 2000). Der 75 kDa schwere TNFR-2 hingegen kann einerseits als TNF-α Antagonist fungieren, indem er TNF-α neutralisiert und somit durch Suppression extrem hoher TNF-α Plasmaspiegel die Exazerbation der Immunantwort inhibiert, andererseits als TNF-α Agonist, indem er die Interaktion von TNF-α mit dem TNFR-1 erleichtert (Pe-schon et al., 1998). Bereits bei einer Besetzung von zehn Prozent der TNF-α-Rezeptoren kommt es zu einer maximalen Zellreaktion (Engelmann et al., 1990).
Werden genügend TNF-α Rezeptoren besetzt, wird eine intrazelluläre Kaskade ausge-löst. Diese führt letztendlich dazu, dass die Transkriptionsfaktoren NF-κB und c-Jun
1. Einleitung
aktiviert werden, welche die Expression bestimmter Gene induzieren (Chen et al., 2002). Bei der Belegung der TNF-α Rezeptoren werden diese zudem proteolytisch ge-spalten und als sogenannte lösliche Rezeptoren (sTNFR-1 und sTNFR-2) freigesetzt (Torre-Amione et al., 1995; Torre-Amione et al., 1996a). Diese löslichen Rezeptoren, deren Funktion noch nicht eindeutig geklärt ist, scheinen in hoher Konzentration zu einer Inhibition der TNF-α Aktivität zu führen (Sharma et al., 2000).
Abbildung 2: Funktionsweise des TNF- α
1.2.3.4. Polymorphismen des TNF-α Gens
Das Gen, auf dem TNF-α kodiert ist, befindet sich in der Klasse III Region des MHC (major histocompatibility complex) auf dem Chromosom 6p21.3 ca. 250kb (Kilobasen) zentromerwärts des Lokus von HLA-B und etwa 850kb telomerwärts von HLA-DR (D’Alfonso S et al., 1994; Wilson et al., 1996; Hajeer AH et al., 2000; Aguillón JC et al., 2006; Schwabe et al., 2006).
Bei dem MHC handelt es sich um eine Region des Chromosoms 6, welche sich durch zahlreiche Polymorphismen auszeichnet (Hajeer AH et al., 2000). Auch für das TNF-α
membrangebundenes TNF-α (26kD) lösliches TNF-α (17kD) Verbindung dreier Monomere zu einem Trrimer Interaktion mit dem TNFR-1 TNFR-1 proteolitische Spaltung des TNF-α-Rezeptors und Freisetzung als löslicher TNF-α-Rezeptor sTNFR-1 Aktivierung von mehreren intrazel-lulären Kaspaden aktiviertes NF-κB aktiviertes c-Jun Expression von Genen im Zellkern Interaktion mit dem Zellkern proteolitische Spaltung durch das TNF-α-konvertierende Enzym und Freisetzung nach Stimulus durch zB. LPS
1. Einleitung
Gen sind diverse Polymorphismen beschrieben worden. Einige dieser Polymorphismen sind im ersten Intron sowie in der 3’ untranslatierten Region (Beutler et al., 1993) zu finden. Die am besten im TNF-α Gen untersuchten Polymorphismen liegen allerdings im Bereich der Promotorregion (Jongeneel et al., 1990).
Aufgrund der Lokalisation des TNF-α Gens innerhalb des MHC und seiner biologi-schen Aktivität konnten zahlreiche Polymorphismen des TNF-α Gens, insbesondere die SNPs im Promotorbereich, in Zusammenhang mit HLA-assoziierten Autoimmuner-krankungen und Infektionskrankheiten, aber auch mit der Entstehung von Karzinomen gebracht werden (Jacob CO., 1992;Wilson et al., 1995; Wilson et al., 1997; Hajeer et al., 2000; Rehmann et al., 2012; Tayebi et al., 2012; Wu et al., 2012; Shukla et al., 2012; Berhane et al., 2012; Xie et al., 2012).
Dabei sind die Polymorphismen im Promotorbereich von besonderen Interessen, da diese einen Einfluss auf die Transkription und Expression des Gens und somit auf die Produktions- und Sekretionsrate des TNF-α haben können (Bouma et al., 1996; Wilson et al., 1996; Luster et al., 1999; Abraham et al., 1999; Hajeer et al., 2000; Hajeer et al., 2001; Talaat et al., 2012). Erhöhte TNF-α Plasmaspiegel sind dabei für eine gesteigerte Anfälligkeit für bestimmte MHC-assozieierte Erkrankungen verantwortlich (Abraham et al., 1999).
Detektieren lassen sich in der Promotorregion viele Polymorphismen (D’Alfonso et al., 1994; Watanabe et al., 1994; Huang et al., 1997; Yamada et al., 1998; Uglialoro et al., 1998; Zhang et al., 2003), wobei die Promotorpolymorphismen an der Position -238 (D’Alfonso et al., 1994) und insbesondere an der Position -308 (Wilson et al., 1992; Wilson et al., 1997) am häufigsten untersucht worden sind.
Wilson et al. identifizierte den Promotorpolymorphismus an der Position -308 und zeig-ten, dass es sich dabei um die Substitution von einer Guanin Base (-308G/TNFA1) durch eine Adenin Base (-308A/TNFA2) handelt (Wilson et al., 1992).
Der Polymorphismus an der Position -308 führt zu einer signifikant erhöhten Transkrip-tion des TNF-α Gens in Makropagen (Wilson et al., 1997; Kroeger et al., 2000). Indivi-duen mit einem homozygoten TNFA2-Allel haben höhere TNF-α Blutspiegel als Men-schen, die das homozygote TNFA1-Allel besitzen (Bouma et al., 1996; Louis et al., 1998). Es besteht eine Assoziation des selteneren TNFA2-Allels zu den MHC Haploty-pen HLA-A1, -B8, -DR3 und -DQ2 (Wilson et al., 1993). Diese sind wiederum mit ei-ner erhöhten TNF-α Sekretion assoziiert (Jacob CO et al., 1990; Abraham et al., 1993;
1. Einleitung
Pociot et al., 1993; Candore et al., 1994) und stehen im Zusammenhang mir der Ent-wicklung von Autoimmunerkrankungen (Lv et al., 2006; Elahi et al., 2009).
Zu den mit dem SNP an der Position -308 assoziierten Autoimmunerkrankungen zählen beispielsweise die rheumatoide Arthritis (Breunan et al., 1992; Cuenca et al., 2003; Clark et al. 2012), der systemische Lupus erythematodes (Jacob et al., 1990; Wilson et al., 1994), die ankylosierende Spondylitis (Rudwaleit et al., 2001), der insulinabhängige Diabetes mellitus (IDDM) (Pociot F. et al., 1993) und die chronisch entzündlichen Darmerkrankungen (Bouma et al., 1996; Clark et al. 2012). Über eine Assoziation des -308 G/A-SNP wurde weiterhin im Zusammenhang mit der rheumatischen Herzerkran-kung (Rehmann et al., 2012), dem Mamma-Carcinom (Tayebi et al., 2012), dem Guilli-an-Barré-Syndrom (Wu et al., 2012), dem Endometriumkarzinom (Sasaki et al., 2000), dem Magenkarzinom (Machado et al., 2003); der COPD (Shukla et al., 2012) und dem Prostatakarcinom (Berhane et al., 2012) berichtet. Das Risiko eine Peridontitis (Xie et al., 2012) oder einer Akne vulgaris (Al-Shobaili et al., 2012) zu entwickeln ist ebenfalls bei Vorliegen des SNP erhöht. Träger der TNFA2 Allels weisen des Weiteren eine schlechtere Prognose bei infektiösen Erkrankungen wie zum Beispiel zerebraler Malaria (McGuire et al., 1994), AIDS (Hober et al., 1989) und Leishmaniose (Cabrera et al., 1995) auf.
1.2.3.5. TNF-α im Myokard
Im Zusammenhang mit dem Symptom Herzinsuffizienz wurde über TNF-α erstmals 1990 von Levine et al. berichtet. Die Autoren schilderten erhöhte TNF-α Plasmapiegel bei an Herzinsuffizienz leidenden Patienten im Vergleich zu gesunden Individuen (Le-vine et al., 1990). Nachfolgende Untersuchungen fanden ebenfalls erhöhte Plasmaspie-gel von TNF-α bei Patienten, welche die Symptome der Herzinsuffizienz präsentierten (McMurray et al., 1991; Dutka et al., 1993; Katz et al., 1994; Matsumori et al., 1994; Nozaki et al., 1997; Torre-Amione et al., 1996a; Torre-Amione et al., 1996b; Rauch-haus et al., 2000; Wang et al., 2009; Von Haehling et al., 2009) und zeigten auf, dass erhöhte TNF-α Plasmaspiegel bei Herzinsuffizienten mit einer schlechteren Prognose der Erkrankten einhergehen (Torre-Amione et al., 1996b; Deswal et al., 2001). Die Kor-relation der erhöhten TNF-α Expression mit einer erhöhten Sterblichkeitsrate konnte ebenfalls in Tierexperimenten verdeutlicht werden (Bryant et al., 1998).
1. Einleitung
Überexprimiertes TNF-α im Myokard wirkt negativ inotrop (Yokoyama et al., 1993) sowie kardiotoxisch. Es induziert den apoptotischen Zelltod (Satoh et al., 1999; Mel-drum et al., 1998; Ahmad et al., 2010) und eine vermehrte Fibrosierung (Kubota et al., 1997; Yokoyama et al., 1997 Sivasubramanian et al., 2001). Kardiodepressive Effekte werden durch eine Steigerung der Synthese von Stickstoffmonoxid (Stein et al., 1996) wie auch durch erhöhte Bildung von Sphingosin (Oral et al., 1998) verursacht.
In Experimenten an Mäusen wurde eine beeinträchtigte myokardiale Kontraktilität so-wie eine reduzierte EF bedingt durch eine Überexpression von TNF-α nachgeso-wiesen (Kubota et al., 1997; Bryant et al., 1998). Weiterhin kann TNF-α in hoher Konzentrati-on zu einer progressiven linksventrikulären DysfunktiKonzentrati-on, pulmKonzentrati-onalen Ödemen, Apopto-se von Myozyten, einer Hypertrophie des Myokards und der Ausbildung einer DCM führen (Kutoba et al., 1997; McTiernan et al., 2000; Feldmann et al., 2000; Mann et al., 2001; Ahmad et al., 2010). Dauerhafte Überexpression von TNF-α führt zu einem „my-okardialen Remodelling“ (Ahmad et al., 2010) und gründet letztendlich in einer kardia-len Dekompensation (Feldmann et al., 2000).
Obgleich in der Regel hauptsächlich Makrophagen und andere Zellen des Immunsys-tems TNF-α synthetisieren (Kinkhabwala et al., 1990), sind Myozyten unter besonderen Umständen ebenfalls in der Lage TNF-α zu bilden (Giroir et al., 1992; Kapadia et al., 1995). Torre-Amione et al. verdeutlichten, dass TNF-α in Kontrast zum gesunden Myo-kard nur im insuffizienten MyoMyo-kard gebildet wird (Torre-Amione et al., 1996a).
Die Synthese und Sekretion von TNF-α im Myokard scheint dabei durch verschiedene Ursachen getriggert werden zu können (Doyama et al., 1996; Habib et al., 1996). Anker et al. stellten 1997 die Hypothese auf, dass es bei Herzinsuffizienz durch die venöse Stauung zu einer erhöhten Permeabilität der Darmwand kommt, welche eine vermehrte Translokation von Bakterien bedingt. Dies führt zu einer verstärkten Freisetzung von Endotoxin, das die TNF-α Synthese im Myokard aktiviert (Anker et al., 1997). Neben einer Stimulation durch Endotoxin wird die TNF-α Synthese beispielsweise auch durch Ischämie im Myokard induziert (Shames et al., 2002). Aber auch ein erhöhter Druck im Ventrikel steigert die TNF-α Bildung in Myozyten (Staudt et al., 2002).
Myozyten besitzen zudem TNF-α Rezeptoren auf ihrer Oberfläche (Torre-Amione et al., 1995). Die Besetzung der Rezeptoren im insuffizienten Myokard führt zu steigenden löslichen TNF-α Rezeptoren (Ferrari et al., 1995; Torre-Amione et al. 1996a). TNF-α sowie sTNFR-1 und sTNFR-2 fungieren als unabhängige Prädiktoren für eine
gesteiger-1. Einleitung
te Mortalität bei Herzinsuffizienz (Ferrari et al. 1995; Rauchhaus et al., 2000; Deswal et al., 2001).
1.2.4. Interleukin-10
1.2.4.1. Endeckung und Namensgebung
Firorentiono et al. beschrieben 1989 ein von TH-2 Zellen sezerniertes Zytokin, welches die Eigenschaft hatte die Synthese von Zytokinen in TH-1 Zellen zu inhibieren. Auf-grund dieser Wirkung nannten sie es „Cytokin-inhibierender Faktor (cytokine synthesis inhibitory factor (CSIF))“ (Firomento et al., 1989). CSFI wurde später in Interleukin-10 (IL-10) umbenannt.
1.2.4.2. Biologische Effekte von IL-10
IL-10 hat pleiotrope Effekte auf die Immunregulation und Inflammation (de Waal et al., 1991a; Lelani et al., 1997). Als anti-inflammatorisches Zytokin (Kaur et al., 2006a; Mellati et al., 2007; Clark et al., 2012) ist die Begrenzung und letztendlich auch die Be-endigung einer inflammatorischen Reaktion eine seiner Hauptaufgaben (Moore et al., 2001). Dabei ist IL-10 ein potenter Inhibitor von pro-inflammatorischen Zytokinen und Chemokinen (Moore et al., 2001) und drosselt auf diese Weise die Immunreaktion. Bei-spielsweise kann durch IL-10 die Produktion von IL-1-α und -β sowie von TNF-α, IL-6, IL-8, IL-12 G-CSF und GM-CSF gehemmt werden (de Waal et al., 1991a; Moore et al., 2001; Mellati et al., 2007). Insbesondere wird mittels IL-10 auch die Synthese von IFN-γ in TH-1 Zellen inhibiert (de Waal et al., 1991b). In Tierversuchen mit Mäusen wurde gezeigt, dass die vollständige Ausschaltung von IL-10 zu einer massiven Entzündungs-reaktion im Organismus führt (Clark et al., 2012).
Die durch IL-10 bedingte Inhibition der Zytokinproduktion und -sekretion wird indirekt vermittelt und bedarf der Präsenz antigenpräsentierender Zellen (APC) (Fiorentino et al., 1989; Fiorentino et al., 1991). Diese sind spezielle Zellen, welche Erregerfragmente an der Oberfläche mit Hilfe des MHC präsentieren und auf diese Weise die humorale und zelluläre Abwehrreaktion des Immunsystems aktivieren. IL-10 ist in der Lage die Aktivität von antigenpräsentierenden Zellen, wie Makrophagen und Monozyten, zu blo-ckieren (Opal et al., 1998; Bogdan et al., 1999). Dies erfolgt dadurch, dass IL-10 eine verminderte Expression des MHC-II-Komplexes auf der Oberfläche antigenpräsentie-render Zellen bewirkt (de Waal et al., 1991a; Moore et al., 2001), wodurch zum Beispiel
1. Einleitung
die antigenspezifische T-Zellantwort gehemmt wird (de Waal et al., 1991a; de Waal et al., 1991b).
Während pro-inflammatorische Zytokine wie TNF-α, IL-1α, IL-1β und IL-6, ihren Pro-duktionsgipfel 8-12 Stunden nach Aktivierung haben (te Velde et al., 1990), wird IL-10 erst 24-36 Stunden nach Aktivierung maximal produziert (de Waal et al., 1991a). Die Sekretion von IL-10 in der „Späten Phase“ der Makrophagenaktivierung betont seine Bedeutung für die Neutralisierung der Immunreaktion (Spits et al., 1992).
Im Sinne einer selbstregulierenden negativen Rückkopplung induziert IL-10 weiterhin die Hemmung seiner eigenen Synthese in aktivierten Monozyten (de Waal et al., 1991a; Moore et al., 2001; Mellati et al., 2007).
Neben den hauptsächlich anti-inflammatorischen Effekten von IL-10 sind allerdings ebenfalls einige pro-inflammatorische Wirkungen beschrieben worden. So stimuliert IL-10 die Proliferation sowie die Differenzierung von B-Lymphozyten (Rousset et al., 1992). Durch Aktivierung von B-Lymphozyten triggert IL-10 zudem die Sekretion von den Immunglobulinen IgA, IgG und IgM (Rousset et al., 1992). Weiterhin führt IL-10 bei B-Lymphozyten zur Hochregulierung von MHC-Klasse-II Molekülen (Go et al., 1990).
1.2.4.3. Signaltransduktion
IL-10 wird hauptsächlich von aktivieren TH2-Lymphozyten (Mosmann et al. 1986; Fio-rentino et al., 1989; Mellati et al., 2007), aber auch von B-Lymphozyten (O'Garra et al., 1990; Suda et al., 1990) sowie aktivierten Makrophagen (Mellati et al., 2007), Kera-tinozyten, Mastzellen und Monozyten (Lalani et al. 1997) synthetisiert. Als Synthese- und Sekretionsreiz dient dabei LPS (de Waal et al., 1991a; de Waal et al., 1991b). Van der Poll et al. schilderten weiterhin die Stimulation der IL-10 Sekretion durch TNF-α im Sinne einer autoregulatorischen Rückkopplungsschleife (van der Poll et al., 1994). Bei IL-10 handelt es sich um ein 18,5 kDa schweres Protein, das sich aus 160 Amino-säuren zusammensetzt (Khatri et al., 1998). In seiner aktiven Form agiert es als 37 kDa schweres, nicht-kovalent gebundenes Dimer (Moore et al., 1993; Tan et al., 1993; Wal-ter et al., 1995; Khatri et al., 1998).
Wird IL-10 freigesetzt so interagiert es mit seiner Zielzelle, indem es an den IL-10 Re-zeptor-Komplex (IL-10R) andockt (Khatri et al., 1998). Bei dem ReRe-zeptor-Komplex handelt es sich um ein Tetramer, welches sich aus jeweils zwei identischen α- (IL-10RA) (Ho et al., 1993) und zwei identischen β-Ketten (IL-10RB) (Kotenko et al.,
1. Einleitung
1997) zusammensetzt. IL10RA, kodiert auf Chromosom 11 (Khatri et al., 1998), fun-giert als Liganden-bindende Untereinheit (Moore et al., 2001) und hat ein Molekular-gewicht von 90-120 kDa (Ho et al., 1993; Tan et al., 1993; Liu et al., 1997; Liu et al., 2004). IL-10RB ist auf Chromosom 21 kodiert (Asadullah et al., 1999), hat ein Moleku-largewicht von 40 kDa (Riley et al., 1999) und dient als akzessorische Untereinheit (Moore et al., 2001).
Die Interaktion von IL-10 mit dem IL-10 Rezeptor-Kompex aktiviert intrazellulär den JAK-STAT Signalweg (Riley et al., 1999; Moore et al., 2001). Es findet eine Phospho-rylierung der mit IL-10RA verbundenen Rezeptor-assozierte Janus Kinase 1 (JAK1) und der mit IL-10RB assoziierten Tyrosinkinase 2 (TYK2) statt (Finbloom et al., 1995; Ho et al., 1995). Dies bewirkt durch Phosphorylierung die Aktivierung von STAT1, STAT3 und in einigen Zellen von STAT5 (Finbloom et al., 1995; Ho et al., 1995; Lai et al., 1996; Weber-Nordt et al., 1996; Wehinger et al., 1996) und führt letztendlich durch spezifische Signale an den Zellkern zur Transkription von bestimmten Genen (Fin-bloom et al., 1995; Williams et al., 2004; Murray PJ, 2007).
1.2.4.4. Polymorphismen des IL-10 Gens
Das Gen, welches für IL-10 kodiert ist auf Chromosom 1q31-q32 lokalisiert (Kim et al., 1992; Chatterjee et al., 2005; Núñez et al., 2006). Die Höhe der Expression und Sekre-tion von IL-10 differiert in Individuen und scheint unter genetischem Einfluss zu sein (Westendorp et al., 1997). Es wird vermutet, dass bis zu 75% der interindividuellen Va-riationen in der IL-10 Produktion genetisch bedingt sind (Turner et al., 1997; Eskdale et al., 1998).
Hauptsächlich wird dabei die Expression auf transkriptioneller Ebene reguliert (Bien-venu et al., 1995). Im hochpolymorphen IL-10 Gen (Eskdale et al., 1999) können dabei insbesondere Polymorphismen, die in der regulatorischen Region des Gens beschrieben worden sind Einfluss auf die IL-10 Synthese nehmen (Núñez et al., 2006).
Von den zahlreichen detektierten SNPs in der Promotorregion des IL-10 Gens wurden die SNPs an den Positionen -1082, -819 und -592 in der proximalen Promotorregion am häufigsten untersucht (Núñez et al., 2006; Mellati et al., 2007).
Der Polymorphismus an der Position -1082 steht dabei in einem Zusammenhang mit der Produktions-bzw. Sekretionsrate von IL-10 (Turner et al.. 1997; Crawley et al., 1999; Lio et al., 2002). Es handelt sich bei diesem SNP um eine Substitution von Guanin (-1082G/ IL-10 1*G) durch Adenin (-1082A/IL-10 1*A) (Turner et al., 1997; Cordeiro et
1. Einleitung
al., 2008). Träger des IL-10 1*A Allels haben in Kontrast zu den Individuen, welche ein IL-10 1*G Allel besitzen eine geringer Produktionsrate von IL-10 durch T-Lymphozyten (Kube et al., 1995; Turner et al., 1997; Hutchinson et al., 1999).
Assoziationen des -1082 G/A Polymorphismus des IL-10 Gens zu diversen immunolo-gischen und entzündlichen Erkrankungen sind von verschiedenen Autoren beschrieben worden (Tagore et al., 1999; Lio et al., 2003; Castro-Santos et al., 2006; Sainz et al., 2007; Zhou et al.. 2012, Zhu et al., 2013). Träger des IL-1 10*A Allels mit einer gerin-geren IL-10 Produktion sind beispielsweise mit einem höheren Risiko an einer entzünd-lichen Darmerkrankung wie Morbus Crohn oder Colitis ulcerosa zu erkranken assoziiert (Tagore et al., 1999; Castro-Santos et al., 2006; Zhu et al., 2013). Auch steht das IL-10 1*A Allel mit einem höheren Risiko an einer invasiven pulmonalen Aspergillose (Sainz et al., 2007) oder einer toxoplasmotischen Retinochoroiditis (Cordeiro et al., 2008) zu erkranken im Zusammenhang. Der G/A-SNP an der Position -1082 im IL-10 Gen ist ebenfalls mit einem erhöhten Risiko einem Myokardinfarkt zu erleiden (Donger et al., 2001) oder an einer KHK (Koch et al., 2001) zu erkranken assoziiert. Bei Vorhanden-sein des -1082 G/A-SNPs liegt zudem ein erhöhtes Risiko an einem systemischen Lu-pus erythematodes (Zhou et al., 2012) oder an Asthma (Nie et al., 2012) zu erkranken vor.
1.2.4.5. IL-10 im Myokard
Über die Beteiligung von IL-10 bei der Pathogenese von Herzerkrankungen wurde nur von wenigen Autoren referiert. Bei Patienten, die an einer chronischen Herzinsuffizienz leiden wurden erhöhte IL-10 Plasmaspiegel gefunden (Wang et al., 2009). Einige Auto-ren berichteten ebenfalls über erhöhte IL-10 Konzentrationen bei an DCM erkrankten Patienten im Vergleich zu gesunden Probanden (Marriott et al., 1996; Aukrust et al., 1999; Yamaoka et al., 1999; Wykretowicz et al., 2004). Dabei lässt sich der Anstieg der IL-10 Plasmaspiegel zum Teil durch die Stimulation des ebenfalls während einer DCM und chronischen Herzinsuffizienz erhöhten TNF-α im Serum erklären (Aukrust et al., 1999).
Interessant ist in diesem Kontext insbesondere das Verhältnis von IL-10 zu TNF-α. Während der Plasmaspiegel von TNF-α deutlich ansteigt (Satoh et al., 1997; Ito et al., 2000, Wang et al., 2009), erfolgt ein im Verhältnis inadäquater Anstieg von IL-10 (Aukrust et al., 1999; Stumpf et al., 2003; Wang et al., 2009). Bei einem erhöhten TNF-α/IL-10 Verhältnis (Aukrust et al., 1999; Stumpf et al, 2003; Wang et al., 2009) herrscht
1. Einleitung / 2. Fragestellung und Ziel der Arbeit
folglich bei einer DCM wie auch einer Herzinsuffizienz eine Imbalanz der anti-inflammatorischen gegenüber den pro-anti-inflammatorischen Zytokinen vor.
Während das pro-inflammatorische TNF-α überwiegt und auf diese Weise die Entzün-dungsreaktion im Myokard und damit die Pathogenese der DCM und des Symptoms der Herzinsuffizienz fördert, ist der kardioprotektive Effekt von IL-10, bei relativ erniedrig-tem Plasmaspiegel, beeinträchtigt (Aukrust et al., 1999).
Dabei fungiert das anti-inflammatorische Zytokin IL-10 im Myokard als Gegenspieler des pro-inflammatorischen TNF-α. Es inhibiert nicht nur die Synthese von TNF-α (de Waal et al., 1991a; Moore et al., 2001; Mellati et al., 2007), sondern neutralisiert eben-falls die Inflammation im Myokard, indem es beispielsweise die durch TNF-α getrigger-te Synthese von Stickstoffmonoxid in Makrophagen und den TNF-α vermitgetrigger-telgetrigger-ten oxida-tiven Stress hemmt (Kaur et al., 2006b). Der anti-oxidative Effekt sowie die Verschie-bung der Proteasen/Anti-Proteasen-Balance im Myokard fördert die Heilung von ge-schädigten Myozyten (Lacraz et al., 1995).
2. Fragestellung und Ziel der Arbeit
Über die Beteiligung von Zytokinen am immunologischen und entzündlichen Gesche-hen bei der Entstehung einer DCM wurde von diversen Autoren referiert (Mann et al., 1994; Aukrust et al., 1999). In diesem Kontext wurden insbesondere das pro-inflammatorische Zytokin TNF-α und das anti-pro-inflammatorische Zytokin IL-10 unter-sucht. Ausgehend von der Annahme, dass SNPs in den o.g. Zytokinen mit einem erhöh-ten Risiko an einer DCM zu erkranken bzw. an einem progressiven Krankheitsverlauf einer DCM mit einer schlechteren Prognose assoziiert sind, wurden der G/A-SNP an der Position -308 im TNF-α Gen und der G/A-SNP an der Position -1082 im IL-10 in den letzten Jahren insbesonders untersucht.
Von diesem Hintergrund aus sollen speziell in dieser Arbeit dabei die nachfolgenden Hypothesen überprüft werden:
Ein G/A-SNP am Genlocus -308 im TNF-α Gen bzw. am Genlocus -1082 im IL-10 Gen, d.h. das Vorhandensein eines A-Allels anstelle eines G-Alles an o.g. Positionen, führt zu einem erhöhten Risiko an einer DCM zu erkranken.
Ein homozygoter A/A-Genotyp am Genlocus -308 im TNF-α Gen bzw. am Gen-locus -1082 im IL-10 Gen hat ein höheres Risiko an einer DCM zu erkranken als ein heterozygoter A/G-Genptyp. Ein heterozygoter A/G-Genotyp an den o.g.
2. Fragestellung und Ziel der Arbeit
Genloki hat gegenüber dem homozygoten G/G-Genotyp ein höheres Risiko an einer DCM zu erkranken.
Das Vorhandensein eines G/A-SNP am Genlocus -308 im TNF-α Gen bzw. am Genlocus -1082 im IL-10 Gen ist mit relevanten klinischen Parametern bei an einer DCM erkrankten Patienten assoziiert. Konkret bedeutet dies, dass sich der G/A-SNP an den o.g. Genloki auf relevante klinische Parameter wie die HF, die EF, die in der Echokardiographie ermittelte EF und die echokardiographisch er-mittelte EF im Follow-up, den EDP, den EDVI, die SP, den echokardiogra-phisch ermittelten LVEDD und den echokardiograechokardiogra-phisch ermittelten LVEDD im Follow-up auswirkt. Der G/A-SNP führt bei DCM erkrankten Patienten zu einer Verschlechterung der o.g. Parameter.
Da der Parvovirus B19 mit einer Prävalenz bis zu 45% als die häufigste Ursache einer viralen Myokarditis ist, aus welcher sich im Verlauf eine DCM entwickeln kann (Kühn et al., 2005; Pankuweit et al., 2010a), soll in dieser Arbeit außerdem die nachfolgende Hypothese überprüft werden:
DCM Patienten mit einem G/A-SNP am Genlocus -308 im TNF-α Gen bzw. am Genlocus -1082 im IL-10 Gen besitzen eine höherer Prävalenz Parvovirus B19 positiv zu sein.
Weiterhin sollen in dieser Arbeit die sich anschließenden Fragestellungen geklärt wer-den:
Führt der G/A-SNP am Genlocus -308 im TNF-α Gen bzw. am Genlocus -1082 im IL-10 Gen dazu, dass sich eine DCM in einem früheren Lebensalter manifes-tiert?
Tritt der G/A-SNP am Genlocus -308 im TNF-α Gen bzw. am Genlocus -1082 im IL-10 Gen gehäuft familiär auf (fDCM)?
Wirkt sich der G/ASNP am Genlocus 308 im TNFα Gen bzw. am Genlocus -1082 im IL-10 Gen auf das Gewicht bei DCM Patienten aus?
Ist der G/A-SNP am Genlocus -308 im TNF-α Gen bzw. am Genlocus -1082 im IL-10 Gen bei Frauen oder bei Männern, welche an einer DCM erkrankt sind, häufiger vertreten?
3. Materialien und Methoden
3. Materialien und Methoden
3.1. Materialien
3.1.1. Geräte
Geräte Hersteller
Elektrophoresekammer: SUNRISE™ Life Technologies; Heidelberg Gefriertruhe: Premium No Frost Liebherr, Deutschland
Inkubator Heraceus Instruments, Hanau, Deutschland
Magnetrührer: Ikamag RET IKA Labortechnik Janke & Kunkel GmbH & Co. KG, Staufen, Deutschland
Mikrowelle AFK, Deutschland
Pipetten (10µl - 1000µl) Eppendorf, Hamburg, Deutschland
Stromquelle Biometra, Göttingen, Deutschland
Thermocycler: PCR System 2700 Applied Biosystems; Groton, CT, USA Transilluminator: Universal Hood Biorad Laboratoires Inc., Hercules, CA,
USA
Vortex Reax 2000 Heidolph Instruments, Schwabach, DE Zentrifuge Rotilabo® Carl Roth®; Karlsruhe, Deutschland
3.1.2. Chemikalien
Chemikalien Hersteller
Agarose SIGMA®, Dreisenhofen, Deutschland
Aqua dest. Eppendorf, Hamburg, Deutschland
DNA Längenstandard Rocher, Mannheim, Deutschland
dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) Rocher, Mannheim, Deutschland
Ethidiumbromid Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland
3. Materialien und Methoden
3.1.3. Primer
Primer Hersteller
TNF-α Primer F TIB MOLBIOL, Berlin, DE
(sense 5’- AGGCAATAGGTTTTGAGGGCCAT-3’)
TNF-α Primer R TIB MOLBIOL, Berlin, DE
(sense 5’- TCCTCCCTGCTCCGATTCCG-3’)
IL-10 Primer F TIB MOLBIOL, Berlin, DE
(sense 5’- TCCCTTACTTTCCTCTTACCTA-3’)
IL-10 Primer R TIB MOLBIOL, Berlin, DE
(sense 5’- ACACAAATCCAAGACAACACTA-3’)
3.1.4. Enzyme
Enzyme Hersteller
Amplifi Taq Gold ™ Roche, Mannheim, Deutschland MnL1 (500 units, 5000 U/ml) New England BioLabs, Frankfurt,
Deutschland
Nco1 (1000 units, 10000U/ml in 50mM KCl, New England BioLabs, Frankfurt, 10mM Tris- HCL (pH 7,4), 0,1mM EDTA, Deutschland
1nm Diethiothreitol, 200µg/ml BSA, 50% Glycerol)
3.1.5. Puffer
Puffer Hersteller
TBE Puffer Invitrogen™ Life Technologies,
(1,0m Tris, 0,9m Borsäure, 0,01m EDTA) Karlsruhe, Deutschland
PCR Puffer (mit 15mM MgCl2) Roche, Mannheim, Deutschland Puffer 2 (50mM NaCl, 10mM Tris- HCL, New England BioLabs, Frankfurt, 10mM MgCl2, 1mM pH 7,9 bei 25°C) DTT, Deutschland
Puffer 3 (100mM NaCl, 50mM Tris-HCl, New England BioLabs, Frankfurt, 10mM MgCl2, 1mM DTT, pH 7,9 bei 25°C) Deutschland
3. Materialien und Methoden
3.2. Methoden
3.2.1. Untersuchungsdesign
Bei der Untersuchung handelt es sich um eine retrospektive Assoziationsstudie. Es wur-de geprüft, inwiefern eine Assoziation zwischen einer DCM und einem G/A-Promotorpolymorphismus an der Position -308 im TNF-α Gen bzw. -1082 im IL-10 Gen an der Position besteht.
Grundlage der Untersuchung war ein Fall-Kontroll-Design, in dem nicht miteinander verwandte Patienten mit nicht miteinander verwandten gesunden Probanden bezüglich der SNPs an den oben erwähnten Genloki verglichen wurden.
Die Untersuchung wurde durch das vom BMBF geförderte Kompetenznetz Herzinsuffi-zienz (KNHI) gefördert (Teilprojekt 9a Prof. Dr. B. Maisch, Prof. Dr. S. Pankuweit).
3.2.1.1. Die Patientengruppe
Die Patientengruppe setzte sich aus 421 Patienten, welche an einer DCM erkrankt wa-ren zusammen. Das Screening der Patienten erfolgte von Juli 2004 bis zum Juli 2007. Die Patienten wurden nach mindestens 12 Monaten nachuntersucht (Follow-up).
Die Einschluss- und Ausschlusskriterien der Patienten lehnten sich an die Empfehlun-gen der Europäischen Arbeitsgruppe (Collaborative Research Group of the Human and Capital Mobility Project on Familial Dilated Cardiomyopathies) hinsichtlich der Diag-nose DCM an (siehe Kapitel 1.1.2.1./Tabelle 1).
Zur Untersuchung wurde aus Vollblut isolierte DNA verwandt. 268 DNA Proben des KNHI und 153 Proben der Marburger kardiologischen Biobank wurde in Marburg bzw. in der Klinik für Kardiologie der Charité Berlin (Direktor Prof. Dr. Dietz) isoliert und für die vorliegende Arbeit zur Verfügung gestellt.
Bei 153 Patienten -im Folgenden als Indexpatienten bezeichnet- wurden koronarangio-graphisch und echokardiokoronarangio-graphisch ermittelte Parameter wie Ejektionsfraktion (EF) und linksventrikulärer enddiastolischer Durchmesser (LVEDD) zum Zeitpunkt der Rekrutie-rung so wie im Follow-up notiert. Des Weiteren wurden die Herzfrequenz (HF), der enddiastolische Druck (EDP), der enddiastolische Volumenindex (EDVI) und die Ver-kürzungsfraktion (SF) bestimmt. Zudem wurde vermerkt, ob eine Infektion mit einem kardiotropen Erreger wie Parvovirus B19 (PB19) vorlag oder, ob es sich um eine fDCM handelte.
