Untersuchungen zur Suppression der IFN--Induktion
durch Proteine des Hepatitis A-Virus, unter besonderer
Berücksichtigung des HAV/2B-Proteins
Dissertation
zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften
im Fachbereich Biologie / Chemie
der Universität Bremen
vorgelegt von
Rebecca Lia Schwarz
1. Gutachter: Prof. Dr. Angelika Vallbracht
2. Gutachter: PD Dr. Bernd Kazmierczak
Erklärung gemäß § 6 Abs. 5 der Promotionsordnung
Ich versichere, dass ich die vorliegende Dissertation mit dem Titel „Untersuchungen zur Suppression der IFN--Induktion durch Proteine des Hepatitis A-Virus, unter besonderer Berücksichtigung des HAV/2B-Proteins“ selbständig verfasst und keine anderen als die angegebenen Quellen und Hilfsmittel verwendet habe.
Bremen, den 19.01.2011
Teile dieser Arbeit sind veröffentlicht in:
Paulmann D., Magulski T., Schwarz R., Heitmann L., Flehmig B., Vallbracht A.
& Dotzauer A.:
Hepatitis A virus protein 2B suppresses beta interferon (IFN) gene
transcription by interfering with IFN regulatory factor 3 activation
Danksagung
Meine Doktorarbeit wäre ohne die Unterstützung vieler Menschen nicht möglich gewesen. Deshalb geht von Herzen folgender Dank an:
Frau Prof. Dr. Angelika Vallbracht für die Möglichkeit, diese Doktorarbeit am Institut für Virologie durchführen zu können, für ihre Unterstützung während der theoretischen und praktischen Arbeit, vor allem aber für ihre Offenheit, Gesprächsbereitschaft und nicht zuletzt für ihr Vertrauen in mich.
Herrn PD Dr. Bernd Kazmierczak, der so freundlich war, die Rolle des Zweitgutachters zu übernehmen und dessen Vorlesungen während meines Studiums stets erfrischend und lehrreich waren.
Ein Besonderer Dank geht an Herrn Prof. Dr. Andreas Dotzauer für seine bereitwillige Unterstützung während meiner gesamten Promotionszeit. Danken möchte ich auch für seine hilfreiche und stetige Betreuung und Beratung, vor allem aber für seine ständige Diskussionsbereitschaft und Geduld dabei.
Zusätzlich geht ein großer Dank an alle aktuellen und ehemaligen Mitglieder der Arbeitsgruppe für die schöne Zeit, das angenehme Arbeitsklima, eine nette Zusammenarbeit und für die ständige Hilfsbereitschaft. Hier danke ich besonders Leena Krämer, Oliver Janssen-Weets, Dajana Paulmann, Sonja Händschke, Erna Domsgen und Thomas Magulski.
Renate Mester, Heike Kettler, Gisela Gunkel und Beate Piel danke ich für ihr Engagement. Ohne sie wäre ein reibungsloser Laborbetrieb nicht möglich gewesen.
Ein besonders herzlicher Dank gilt meiner Familie. Meine Eltern Heike und Ulrich Schwarz haben mir einen kontinuierlichen Rückhalt während meiner gesamten Ausbildung gegeben, haben mich immer unterstützt und allzeit an mich geglaubt. Meine Schwester Theresa Schwarz hatte immer ein offenes Ohr für mich, konnte mich stets aufmuntern und mir gut zureden.
Nicht zuletzt geht ein besonderer Dank an meinen Freund Tim Weilandt für seine immer währende Unterstützung. Tim hat immer Verständnis für mich gehabt und es stets geschafft, mich aufzumuntern und aufzubauen. Ohne ihn wäre ein Gelingen dieser Arbeit nicht möglich gewesen.
Inhaltsverzeichnis
ABKÜRZUNGEN 1 EINLEITUNG 1 1.1 Das Interferonsystem 1 1.1.1 Das Interferon--Enhanceosom 2 1.1.2 Interferon--Induktion 51.1.3 Der Transkriptionsfaktor IRF-3 11
1.2 Suppression der Interferon--Induktion durch HAV 14
1.3 Das Hepatitis A-Virus 15
1.3.1 Die Nicht-Strukturproteine 2B und 2C des Hepatitis A-Virus 20
1.3.2 Zellkulturadaption des Hepatitis A-Virus 23
1.4 Zielsetzung 26
2 MATERIAL UND METHODEN 27
2.1 Material 27 2.1.1 Viren 27 2.1.2 Zellen 27 2.1.3 Kompetente Bakterien 27 2.1.4 Plasmide 28 2.1.5 Synthetische Nukleinsäuren 30
2.1.5.1 RT-PCR-Primer zur Amplifikation der cDNA von HAV-Proteinen (biomers) 30 2.1.5.2 Primer für die Sequenzierung der cDNA von HAV-Proteinen (biomers) 31
2.1.5.3 Sonstige Nukleotide 32
2.1.6 Antibiotika 32
2.1.7 Antikörper, Enzyme und sonstige Proteine 33
2.1.7.1 Antikörper 33
2.1.7.2 Enzyme 33
2.1.7.3 Sonstige Proteine 33
2.1.8 Kits und Standards 34
2.1.9 Puffer, Lösungen und Kulturmedien 34
2.1.10 Chemikalien und Reagenzien 38
2.1.11 Verbrauchsmaterialien 40
2.1.12 Geräte und Hilfsmittel 41
2.2 Methoden 43
2.2.1 Zellkultivierung von FRhK-4-Zellen 43
2.2.2 Mycoplasmen-Test mittels PCR (VenorGeM) 43
2.2.3 Bestimmung der Zellzahl 43
2.2.4 Herstellung eines NDV-Pools und Bestimmung der TCID50/ml mittels Endpunkttitration 44
2.2.5 NDV-Infektion 44
2.2.6 Herstellung eines HAV/7-Pools und Bestimmung der TCID50/ml mittels Endpunkttitration 45 2.2.7 Infektion von FRhK-4-Zellen mit HAV/7 bzw. mit Mock-Lysat 46 2.2.8 Indirekte Immunfluoreszenz zum Nachweis von HAV-Antigen 46
2.2.9 Extraktion von HAV-RNA 47
2.2.9.1 Extraktion von HAV-RNA mit peqGOLD TriFastTm 47 2.2.9.2 Extraktion von HAV-RNA mit dem QIAamp® Viral RNA Kit 47 2.2.9.3 Extraktion von HAV-RNA aus Patientenstuhl mit dem QIAamp® DNA Stool Mini Kit 48 2.2.10 Reverse Transkription und Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) zur Amplifikation der cDNA
von HAV-Proteinen 48
2.2.11 Präparation von Vektor und Insert 49
2.2.11.2 Phenol-Chloroform-Extraktion und Ethanol-Präzipitation 50 2.2.11.3 Restriktionsenzymspaltung von DNA 50 2.2.11.4 Dephosphorylierung von Plasmid-DNA 51 2.2.11.5 DNA-Reinigung mit LMP-Agarose 51
2.2.11.6 Ligations-Reaktion 52
2.2.12 Vermehrung und Isolierung von Plasmiden 52
2.2.12.1 Transformation kompetenter Bakterien 52 2.2.12.2 Schnelltest zur Überprüfung von Plasmid-DNA (Miniprep) 53 2.2.12.3 Vermehrung und Isolierung bakterieller Plasmid-DNA mittels
Dichtegradientenzentrifugation (Maxiprep) 54 2.2.12.4 Restriktionsspaltungsanalyse nach der Maxiprep 55 2.2.13 Photometrische Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren 56
2.2.14 Agarose-Gelelektrophorese 56
2.2.15 Sequenzierung der cDNA der HAV-Proteine 57
2.2.16 Transfektion von FRhK-4 Zellen mittels PEI 57
2.2.17 Zelllyse nach der Freeze & Thaw-Methode 58
2.2.18 Proteinbestimmung nach Bradford 58
2.2.19 Luciferase-Assay 59
2.2.20 Immunfluoreszenz 59
2.2.21 Anfärben von Mitochondrien mit MitoTracker Rot 61
2.2.22 MTT-Test zur Bestimmung der Zellvitalität 61
3 ERGEBNISSE 63
3.1 Einfluss von HAV/7-Proteinen auf die IRF-3-Aktivierung 63
3.1.1 Einfluss von HAV/7-Proteinen auf die NDV-induzierte IRF-3-Aktivierung 64 3.1.2 Einfluss von HAV/7-Proteinen auf die RIG-I-vermittelte IRF-3-Aktivierung 66 3.1.3 Einfluss von HAV/7-Proteinen auf die MAVS-vermittelte IRF-3-Aktivierung 68 3.1.4 Einfluss von HAV/7-Proteinen auf die TBK1- und IKK-vermittelte IRF-3-Aktivierung 70
3.2 Untersuchung zur Lokalisation von HAV/7-2B in FRhK-4-Zellen 73
3.3 Untersuchungen des 2B- und 2C-Proteins aus HAV-Wildtypen 77
3.3.1 Sequenzvergleiche der codierenden Regionen der 2B-Proteine aus Zellkultur-adaptierten und
Wildtyp HAV-Varianten 78
3.3.2 Einfluss von HAV-2B aus HAV-Wildtypen auf die Aktivierung von IRF-3 81 3.3.3 Sequenzvergleiche der codierenden Regionen der 2C-Proteine aus Zellkultur-adaptierten und
Wildtyp HAV-Varianten 85
3.3.4 Einfluss von HAV-2C aus HAV-Wildtypen auf die Proteinexpression 88 3.3.5 Untersuchung der Cytotoxizität von verschiedenen 2C-Proteinen auf FRhK-4-Zellen 89
4 DISKUSSION 92
5 ZUSAMMENFASSUNG 109
Abkürzungen
AGMK-Zellen Primary African green monkey kidney Zellen
ALT Alanin-Aminotransferase
AP-1 Activating protein 1
AS Aminosäure
ASGPR Asialoglykoprotein-Rezeptor
AST Aspartat-Aminotransferase
ATF-2 Activating transcription factor-2 BLAST basic local alignment search tool
bp Basenpaare
BSA Bovines Serumalbumin
BS-C-1 African green monkey kidney Zellen
CARD Caspase recruitment domain
Cardif CARD adaptor inducing IFN-
CAT Chloramphenicol-Acetyltransferase
CBP CREB-binding protein (homolog zu p300)
cDNA complementary DNA
cER kristalloides ER
c-Jun cellular v-jun homolog
CMV Cytomegalievirus
CPE Cytopathischer Effekt
CREB cAMP response element (CRE)-binding protein
CTL Cytotoxischer T-Lymphozyt
DAPI 4,6-Diamidino-2-phenylindol-dihydrochlorid
DBD DNA-Bindedomäne
DEPC Diethylpyrocarbonat
DMEM Dulbecco´s modified Eagle´s medium
DNA Desoxyribonukleinsäure
dNTP Desoxyribonukleotidtriphosphat
DRAF1 dsRNA-activated factor 1
dsRNA doppelsträngige RNA
DTT Dithiothreitol
E. coli Escherichia coli
EDTA Ethylendiamintetraacetat
eIF2 eukaryotic (translation) initiation factor 2 ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay
ER Endoplasmatisches Retikulum
ERIS Endoplasmic reticulum IFN stimulator
FCS Fetal calf serum
FITC Fluorescein-5-isothiocyanat
FRhK-4-Zellen Fetal Rhesus monkey kidney Zelllinie-4 g Erdbeschleunigung (9,80665 m/s)
GAPDH Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase
GFP Green fluorescent protein
GP-Zellen Guinea pig Zellen (Meerschweinchen-Zellen)
h Stunde
HAV Hepatitis A-Virus
HAVcr-1 HAV cellular receptor-1
HAVcyt cytopathogenes HAV
HCV Hepatitis C-Virus
HMG-I(Y) High mobility group protein-I(Y)
HRP Horseradish Peroxidase
IAD IRF association domain
IBiD IRF-3-binding domain
ID autoinhibitorische Domäne
IFN Interferon
Ig Immunglobulin
IKAP IKK-complex-associated protein
IKK IB kinase (Komplex aus IKK, IKK und IKK) IKK Inhibitor of NF-B kinase
IL Interleukin
IPS-1 IFN- promoter stimulator 1 IRES Internal ribosomal entry site
IRF Interferon regulatory factor
ISG Interferon-stimulated gene
ISRE Interferon-stimulated response element
JAK Janus-Kinase
JNK c-Jun N-terminal kinase
kb Kilobasen
kDa Kilodalton
LCPS Luminescence counts per second
LMP Low melting point
Luc Luciferase
MAM Mitochondrien-assoziierte ER-Membran
MAPK Mitogen-activated protein kinase MAVS Mitochondrial antiviral signaling protein
MCS Multiple cloning site
MDA-5 Melanoma differentiation-associated gene-5
MHC Major histocompatibility complex
MITA Mediator of IRF3 activation
MOI Multiplicity of infection
MPYS N-terminal methionine-proline-tyrosine-serine amino acid sequence
mRNA messenger RNA
MTT 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid
Mx Myxovirus resistance
NADH Nicotinamidadenindinukleotid
NADPH Nicotinamidadenindinukleotidphosphat
NAP1 NAK-associated protein 1
NDV Newcastle Disease-Virus
NEMO NF-B essential modifier
NES Nuclear export signal
NF-B Nuclear factor B
NK-Zellen Natürliche Killerzellen
NLS Nuclear localization signal
nt Nukleotid
NRD Negative regulatory domain
NRF NF-B-repressing factor
NTR nicht-translatierte Region
OAS 2´,5´-Oligoadenylatsynthetase
OD Optische Dichte
ORF Open reading frame
p38 Mitogen-activated protein kinase 38 p300 300 kDa-Protein (homolog zu CBP)
PABP poly(A)-binding protein
PAMP Pathogen-associated molecular pattern
PBS Phosphate buffered saline
PCBP2 poly(rC)-binding protein
PCR Polymerase chain reaction
PEI Polyethylenimin
p.i. post infection
pIgR polymerer Immunglobulin-Rezeptor
PKR dsRNA-activated protein kinase R
poly(IC) poly-Inosinsäure:poly-Cytidylsäure
PRD Positive regulatory domain (II, III-I, IV des IFN--Enhancers)
PRDI-BF1 PRDI-binding factor 1
PTB Polypyrimidine tract binding protein
RD Regulatorische Domäne
rER rauhes ER
RIG-I Retinoic acid-inducible gene-I RIP1 receptor-interacting protein 1
RNA Ribonukleinsäure
RNase L latente Ribonuklease
RT Raumtemperatur
RT-PCR Reverse transcription-polymerase chain reaction
siRNA short interfering RNA
ssRNA einzelsträngige RNA
STAT Signal transducer and activator of transcription STING Stimulator of interferon genes
SV40 Simian virus 40
TAB1/2 TAK1-binding protein ½
TAE Tris Acetat EDTA-Puffer
TAK1 transforming growth factor -activated kinase 1
TANK TRAF family member-associated NF-B activator
TBK1 TANK-binding kinase 1
TBP TATA-Box binding protein
TCID50 Tissue culture infectious dose 50%
TFIID Transkriptionsfaktor D der RNA-Polymerase II TICAM-1 TIR domain-containing adapter molecule 1
TIM-1 T cell Ig- and mucin-domain-containing molecule-1 TIR Toll/IL-1 receptor homology domain
TNF Tumor necrosis factor
TLR Toll-like receptor
TRAF TNF-receptor associated factor
TRIF TIR-domain containing adaptor inducing IFN-
U Unit (Einheit)
Ub Ubiquitin
VAK Virus-activated kinase
VISA Virus-induced signaling adaptor
VPg Virus protein genome-associated
VT Volumenteil
v/v volume / volume
WT Wildtyp
w/v weight / volume
1 Einleitung
1 Einleitung
1.1 Das Interferonsystem
Virale Infektionen lösen die angeborene und die adaptive Immunantwort aus, welche für das Überleben des Wirts essentiell sind. Eine sehr effektive antivirale Immunantwort ist die Produktion und Sekretion von Interferonen (IFNs). Interferone wurden erstmals im Jahre 1957 von Isaacs und Lindenmann beschrieben. Hier stellte man fest, dass ein sezerniertes Makromolekül die Fähigkeit besaß, mit der Replikation von Influenza-Viren zu „interferieren“, sie also zu hemmen (Isaacs & Lindenmann, 1957). Innerhalb der nächsten 53 Jahre wurden die Induktion und die Wirkung jener „interferierenden“ Moleküle, sowie ihre zentrale Rolle innerhalb des angeborenen, unspezifischen Immunsystems untersucht.
Interferone sind multifunktionale sezernierte Proteine, die zu den Cytokinen zählen. Sie sind beteiligt an antiviralen Abwehrmechanismen, an der zellulären Wachstumsregulation und an der Aktivierung der Immunantwort. Sie werden ihrer Aminosäuresequenz nach in drei Klassen eingeteilt: Typ-I-, Typ-II- und Typ-III-IFN. Zu den Interferonen vom Typ-I gehören beim Menschen vor allem die bisher beschriebenen 13 Subtypen des IFN- und ein Subtyp des IFN-, sowie IFN-, - und - (Pestka et al., 2004). Während IFN- insbesondere von Leukozyten produziert wird, wird IFN- von den meisten Zelltypen, im besonderen Maße jedoch von Fibroblasten gebildet. Die Induktion der Expression von IFN-/ erfolgt direkt als Antwort auf eine virale Infektion. Vor einigen Jahren wurde noch ein weiterer Interferon-Typ beschrieben, Typ-III-IFN, dem 3 Subtypen des IFN- angehören, IFN-1, IFN-2 und IFN-3 (auch als Interleukin-29 (IL-29), IL-28A und IL-28B bekannt) (Pestka et al., 2004). Diese Cytokine werden ebenfalls als direkte Reaktion auf eine Virusinfektion produziert und deren Induktion scheinen sie ähnlich wie IFN-/ zu erlangen (Onoguchi et al., 2007). Typ-II-IFNs, zu denen ausschließlich IFN- zählt, werden als Antwort auf die Erkennung von infizierten Zellen durch aktivierte T-Lymphozyten und natürliche Killerzellen (NK) gebildet. Ihre Wirkung beruht hauptsächlich auf immunomodulatorischen Funktionen innerhalb des spezifischen Immunsystems. Sie spielen im Gegensatz zu Typ-I-Interferonen erst im späteren Infektionsverlauf eine Rolle (Goodbourn et al., 2000; Randall & Goodbourn, 2008).
Allen Interferonen gemein ist ihre zentrale Rolle bei der Immunantwort des Wirts. Sie stimulieren einen antiviralen Status in ihren Zielzellen, limitieren das Zellwachstum, können Apoptose auslösen und beeinflussen die Effektorzellen des Immunsystems. Die biologische Aktivität von Interferonen wird durch die Bindung an ihren entsprechenden Rezeptor auf der
1 Einleitung
Zelloberfläche vermittelt. Alle Typ-I-Interferone nutzen den gleichen heterodimeren IFN-/-Rezeptor, der ubiquitär verbreitet zu sein scheint. Durch die Bindung von sezerniertem IFN-/ an diesen Rezeptor wird mittels Signaltransduktion über den JAK-STAT-Weg die Expression von zahlreichen IFN-stimulierten Genen (ISG) aktiviert und über diese ein antiviraler Status in den Zellen erreicht (Darnell et al., 1994; Randall & Goodbourn, 2008). Bisher sind über 300 Proteine bekannt, deren Synthese durch Interferon induziert werden kann (Der et al., 1998). Zu ihnen gehören zum Beispiel die Proteinkinase R (PKR), die 2´-5´-Oligoadenylat-Synthetase (OAS) und die Mx-Proteine. Diese Proteine besitzen die Eigenschaft, die Replikation von Viren auf unterschiedlichste Weise negativ zu beeinflussen, was hier jedoch nicht näher erörtert werden soll (Goodbourn et al., 2000; Randall & Goodbourn, 2008).
Es bleibt festzuhalten, dass Typ-I-Interferone vor allem in der frühen Infektionsphase eine bedeutende Rolle bei der Unterbindung oder Verlangsamung der Replikation von Viren spielen. Diese Eigenschaft kann bis zur Eliminierung des Virus führen, wenigstens aber dem spezifischen Immunsystem genügend Zeit verschaffen, eine T- und B-Zellantwort zu etablieren. Aus diesem Grund haben die meisten Viren Mechanismen zur Beeinträchtigung der IFN-Induktion, des IFN-Signalweges oder der Funktion der ISGs entwickelt. Es sei an dieser Stelle vorweggenommen, dass das in dieser Arbeit untersuchte Hepatitis A-Virus (HAV) die Fähigkeit zur Suppression der IFN--Induktion besitzt. Daher werden in den folgenden Abschnitten die Signalwege zur Induktion der IFN--Expression näher betrachtet.
1.1.1 Das Interferon--Enhanceosom
Die Induktion von IFN- als Antwort auf eine virale Infektion erfordert die Erkennung von Pathogen-assoziierten molekularen Mustern (PAMPs) durch zelluläre Rezeptoren. Die größte Bedeutung zeigte hierbei dsRNA, welche sowohl von RNA- als auch von DNA-Viren gebildet werden kann. dsRNA kann sowohl intrazellulär über verschiedene Sensorproteine als auch extrazellulär über den Toll-like-Rezeptor 3 (TLR3) detektiert werden. Über unterschiedliche Signalwege kommt es dann zur Aktivierung von bestimmten Transkriptionsfaktoren. Diese translozieren in den Zellkern und induzieren dort die Transkription des IFN--Gens (Randall & Goodbourn, 2008).
Die regulatorischen Sequenzen, welche die Transkription des IFN--Gens kontrollieren, wurden innerhalb einer 110-bp Region unmittelbar stromaufwärts der Transkriptionsstartstelle
1 Einleitung
lokalisiert (Maniatis et al., 1992). Dieser Enhancer ist direkt einer TATA-Box vorgeschaltet und im Gegensatz zu dieser nicht von Histon-Proteinen eines Nukleosoms maskiert, somit also frei zugänglich (Maniatis et al., 1998; Lomvardas & Thanos, 2001). Der Interferon--Enhancer gliedert sich in drei positiv regulatorische Domänen (PRDs; PRDIV, PRDIII-I und PRDII), die von bestimmten Transkriptionsfaktoren erkannt und gebunden werden, sowie einer negativ regulatorischen Domäne (NRD I) (Maniatis et al., 1998). An die NDR I können Repressorproteine, wie der NF-B-repressing factor (NRF), binden, um den inaktiven Zustand des Gens zu gewährleisten und spontane Interaktionen mit anderen Transkriptionsfaktoren zu verhindern (Nourbakhsh & Hauser, 1999). Außerdem vermittelt der PRDI-binding factor 1 (PRDI-BF1) die Rekrutierung von Proteinen, welche die nukleosomale Chromatinstruktur der TATA-Box durch Deacetylierung oder Methylierung stabilisieren und somit das Gen inaktivieren (Keller & Maniatis, 1991; Yu et al., 2000; Györy, 2004).
Bei der Detektion einer viralen Infektion binden in der betreffenden Zelle aktivierte Transkriptionsfaktoren nach der Verdrängung der Repressoren an ihre spezifischen PRDs. Dabei bindet an die PRDIV ein Heterodimer aus ATF-2 (activating transcription factor 2) und c-Jun (cellular v-jun homolog), während die PRDII die Bindestelle für den dimeren Nuclear factor-B (NF-B) darstellt. An die PRDIII-I lagern sich ferner Dimere aus IRF-3-Proteinen (Interferon regulatory factor 3) an (Maniatis et al., 1998; Wathelet et al., 1998; Munshi et al., 1999), wobei zwei IRF-3-Dimere an eine PRDIII-I binden (Panne et al., 2004). Neben IRF-3-Homodimeren können Heterodimere aus IRF-3 und IRF-7 oder auch IRF-7 Homodimere an die PRDIII-I binden (Sato et al., 2000; Au et al., 2001; Yang et al., 2004). IRF-7 ist in den meisten Zellen ein Interferon-stimuliertes Genprodukt (ISG), dessen Expression erst durch die autokrine Wirkung des IFN- induziert wird und folglich sowohl die Expression des IFN--Gens verstärken als auch die Transkription der IFN--Subtypen auslösen kann. Alle IFN--Subtypen sind, mit Ausnahme des humanen IFN-1, nicht durch IRF-3 induzierbar (Lin et al., 2000a; 2000b).
Alle genannten Faktoren haben die Fähigkeit die Proteine p300 und CBP (CREB-binding protein) zu rekrutieren. Diese sind transkriptionelle Coaktivatoren, die viele weitere Transkriptionsfaktoren binden können und somit an der Induktion zahlreicher Gene beteiligt sind (Maniatis et al., 1998; Merika et al., 1998; Vo & Goodman, 2001). Des Weiteren besitzen diese funktionell homologen Proteine eine Acetyltransferase-Funktion (Ogryzko et al., 1996). Eine weitere Rolle bei der IFN--Induktion spielen die High mobility group proteins (HMG-I(Y)). Diese Proteine besitzen architektonische Wirkung und ihre Bindung an die DNA bewirkt eine Krümmung dieser, welche die Anlagerung der übrigen Proteine
1 Einleitung
erleichtert (Falvo et al., 1995; Yie et al., 1997, 1999). Zusammen mit den bereits erwähnten Transkriptionsfaktoren bilden die Coaktivatoren p300 und CBP und die HMG-I(Y) das IFN--Enhanceosom (Abb. 1) (Maniatis et al., 1998; Kim & Maniatis, 1997; Thanos & Maniatis, 1995).
Für die Transkription des IFN--Gens wird zunächst durch Acetylierung der Histone benachbarter Nukleosomen die Bildung einer offenen Chromatinstruktur gewährleistet. Dieser Prozess führt zu einer Auflockerung der Histon/DNA-Komplexierung. Somit kann die Bindung der, auf diese Weise freigelegten, TATA-Box durch den allgemeinen Transkriptionsfaktor TFIID, welcher das TATA-Box binding protein (TBP) enthält, erfolgen. Dies und die zusätzliche Anwesenheit der übrigen Transkriptionsfaktoren (wie TFIIB, TFIIA und TFIIH) ermöglichen die Assoziation der RNA-Polymerase II an das IFN--Enhanceosom und somit die Initiation der Transkription (Kee et al., 1996; Kim et al., 1998; Agalioti et al., 2000; Lomvardas & Thanos, 2001).
Abb. 1: Das IFN--Enhanceosom. Untergliederung des IFN--Enhancers in die positive regulatory
domains (PRDs), sowie Darstellung des Assemblys von Transkriptionsfaktoren und Coaktivatoren auf
dem Enhancer des IFN--Gens, was nach Rekrutierung der RNA-Polymerase II zur Induktion der IFN--Transkription führt (nähere Erläuterungen im Text).
Der spezielle Aufbau des IFN--Enhancers ermöglicht einen Synergie-Effekt des Enhanceosoms bezüglich der Aktivierung der Transkription. Jeder der erwähnten Transkriptionsfaktoren ist lediglich in der Lage, eine basale Transkriptionsrate zu initiieren; im Falle von IRF-3 ist diese am stärksten. Bei jedoch gleichzeitiger Bindung aller Komponenten kommt es zu einer überproportional gesteigerten Gentranskription (Thanos & Maniatis, 1995; Kim & Maniatis, 1997; Juang et al., 1998; Merika et al., 1998; Yang et al., 2004). Auf diese Weise wird eine ungewollte, übermäßige IFN--Induktion verhindert, zumal ATF-2/c-Jun und NF-B auch über eine Vielzahl anderer Signalmoleküle aktiviert werden können (Pahl, 1999; Schaeffer & Weber, 1999; Zhou et al., 2003; Hayakawa et al., 2004).
1 Einleitung
Nach dieser Einführung des Mechanismus der IFN--Transkription durch das Enhanceosom, wird sich der nächste Abschnitt mit den, über intra- und extrazelluläre dsRNA initiierten, Signalwegen zur Aktivierung der einzelnen Transkriptionsfaktoren befassen.
1.1.2 Interferon--Induktion
Wie bereits erwähnt, erfordert die Induktion von IFN- infolge einer Virusinfektion die Erkennung von dsRNA. Neben dsRNA kann auch die Erkennung von ssRNA mit 5´-Triphosphaten zu einer Induktion der IFN--Expression führen, worauf erst an späterer Stelle in diesem Kapitel eingegangen wird. DNA-Viren könnten dsRNA als Ergebnis von konvergenten Transkriptionsvorgängen generieren. Bei Viren mit einem RNA-Genom kann dieses selbst aus dsRNA bestehen (z.B. Reoviridae oder Birnaviridae) oder sie wird im Zuge der Genomreplikation als Replikationsintermediat gebildet (Jacobs & Langland, 1996), wie es bei HAV der Fall ist. Zusätzlich können mögliche doppelsträngige Sekundärstrukturen einzelsträngiger RNA auftreten. Schon seit Ende der 1960er ist bekannt, dass dsRNA aus Penicillium-Extrakten und das synthetische, experimentell oft eingesetzte, dsRNA-Analogon Poly-Inosinsäure:Poly-Cytidylsäure (poly(IC)) starke Induktoren der IFN--Expression sind (Field et al., 1967; Lampson et al., 1967). dsRNA kann sowohl intrazellulär über verschiedene Sensorproteine als auch extrazellulär über den TLR3 detektiert werden. Die Reaktion auf intrazellulär vorliegende dsRNA ist in Abb. 2 schematisch dargestellt.
Lange war die PKR als einziges dsRNA-Bindeprotein bekannt. Die PKR ist eine Serin/Threonin Kinase, die durch IFNs induziert und deren katalytische Aktivität durch Bindung von dsRNA aktiviert wird. Nach der Interaktion mit dsRNA autophosphoryliert die PKR als Dimer und phosphoryliert ihrerseits eine Anzahl von verschiedenen Substraten (Samuel, 2001).
2002 gelang dann die Identifizierung zweier miteinander nahe verwandter intrazellulärer dsRNA-Rezeptoren aus der Familie der DExD/H-Box RNA-Helikasen. Hierbei handelt es sich um RIG-I (Retinoic acid-inducible gene I) und um MDA-5 (melanoma differentiation-associated gene 5) (Andrejeva et al., 2004; Kang et al., 2002; Silverman et al., 2003; Yoneyama et al., 2004). Beide Proteine besitzen eine carboxyterminale DExD/H-Box RNA-Helikase Domäne und zwei aminoterminale CARD-Domänen (Caspase recruitment domain). Über die RNA-Helikase Domäne erfolgt die Bindung viraler RNA und anschließend über die CARD-Domäne die Signaltransduktion zur Aktivierung von IRF-3, NF-B und ATF-2/c-Jun
1 Einleitung
(Yoneyama et al., 2004; 2005). Des Weiteren werden beide Proteine in vielen Geweben exprimiert und sind durch Interferon-Stimulation hochregulierbar. Dies erhöht die Sensitivität der Zelle gegenüber dsRNA und bedeutet somit eine positive-feedback Regulation des IFN-Signalweges, die damit indirekt dem antiviralen Status förderlich ist (Kang et al., 2002; Cui et al., 2004; Yoneyama et al., 2004). Die essentielle Rolle von RIG-I und MDA-5 bei der, durch eine virale Infektion, ausgelösten IRF-3-Aktivierung und IFN--Induktion, konnte durch genetische knock out-Studien bestätigt werden (Yoneyama et al., 2004; Sumpter at al., 2005; Kato et al., 2005, 2006). Bei der Detektion von intrazellulär vorliegender RNA scheinen RIG-I und MDA-5 unterschiedliche Erkennungs-Muster zu binden. Beide sind in der Lage auf transfiziertes poly(IC) zu reagieren (Yoneyama et al., 2005), wobei in bestimmten Systemen MDA-5 der bevorzugte cytosolische Rezeptor zu sein scheint (Kato et al., 2006). Auch bei der Detektion von Picornavirus-Infektionen, in deren Verlauf dsRNA generiert wird, scheint MDA-5 der primäre Detektor intrazellulärer dsRNA zu sein (Gitlin et al., 2006; Kato et al., 2006). RIG-I hingegen besitzt nicht nur die Fähigkeit dsRNA zu erkennen, sondern vermittelt auch eine Reaktion auf einzelsträngige RNA mit 5´-Triphosphaten (Hornung et al., 2006; Pichlmair et al., 2006), die während der Replikation einiger Viren entsteht oder bereits als virale genomische RNA vorliegen kann. So konnte RIG-I beispielsweise als Detektor des Influenzavirus und des in dieser Arbeit verwendeten Newcastle Disease-Virus (NDV) identifiziert werden (Kato et al., 2006; Pichlmair et al., 2006). Einzelsträngige zelluläre RNA-Spezies besitzen meist keine 5´-Triphosphate, sondern verfügen über Modifikationen, wie zum Beispiel 5´-Monophosphate oder 5´-Cap-Strukturen, so dass hier eine Differenzierung möglich ist. Es bleibt festzuhalten, dass RIG-I und MDA-5 zu kooperieren scheinen, um eine effektive IFN-Induktion während einer viralen Infektion zu gewährleisten.
Nach der Aktivierung von RIG-I und MDA-5 kommt es zur CARD-vermittelten Weiterleitung des Signals über das Adaptorprotein MAVS (mitochondrial antiviral signalling protein; analoge Bezeichnungen: Cardif, VISA und IPS-1), welches 2005 von vier verschiedenen Arbeitsgruppen identifiziert wurde (Seth et al., 2005; Meylan et al., 2005; Xu et al., 2005; Kawai et al., 2005). MAVS besitzt eine N-terminale CARD-Domäne, über die eine Interaktion mit den CARD-Domänen von MDA-5 und RIG-I vermittelt wird. Des Weiteren befindet sich am Carboxyterminus von MAVS eine hydrophobe Transmembrandomäne, die es in der äußeren Mitochondrienmembran verankert (Seth et al., 2005). Untersuchungen mit MAVS-defizienten Mäusen konnten seine essentielle Rolle bezüglich der IFN-Induktion bestätigen, wobei sowohl die CARD- als auch die
1 Einleitung
Transmembrandomäne für seine Funktion essentiell sind (Kumar et al., 2006; Sun et al., 2006).
Abb. 2: IFN--Induktion durch intrazelluläre dsRNA. Die dsRNA-Rezeptoren RIG-I und MDA-5
vermitteln über ihren Adapter MAVS die Aktivierung der Signalwege zu den Transkriptionsfaktoren IRF-3, NF-B und ATF-2/c-Jun, was in der Initiation der Transkription des IFN--Gens resultiert (nähere Erläuterungen im Text).
Nach der Aktivierung von MAVS kommt es über drei verschiedene Signalwege zur Aktivierung der IFN-relevanten Transkriptionsfaktoren ATF-2/c-Jun, NF-B und IRF-3. Es sei an dieser Stelle vorweggenommen, dass das Hepatitis A-Virus lediglich die
IRF-3-1 Einleitung
Aktivierung zu supprimieren vermag. Deshalb wird die Aktivierung von ATF-2/c-Jun und NF-B nur kurz erläutert, während der Signalweg zur IRF-3-Aktivierung ausführlicher beschrieben wird.
MAVS interagiert zunächst mit dem Protein TRAF6 (tumor necrosis factor receptor-associated factor 6) (Kawai et al., 2005; Xu et al., 2005), woraufhin dieses sich selbst sowie RIP1 (receptor-interacting protein 1) ubiquitinyliert (Chen, 2005). Dies führt zur Erkennung durch TAB1 und TAB2 (TAK1-binding protein 1/2) und einer anschließenden Komplexbildung mit TAK1 (transforming growth factor -activated kinase 1). Diese Komplexbildung führt zur Phosphorylierung und Aktivierung mitogen-aktivierter Proteinkinasen (MAPKs) (Jiang et al., 2003;Sakurai et al., 2000;Wang et al., 2001), an deren Ende die Phosphorylierung der beiden, zur AP-1-Familie gehörenden, nukleären Transkriptionsfaktoren ATF-2 und c-Jun steht. Auf diese Weise werden deren Heterodimerisierung und die Bindung an die PRDIV des IFN--Enhancers induziert (May et al., 1998; Maniatis et al., 1998;Schaeffer & Weber, 1999).
Ein weiterer Signalweg führt zur Aktivierung von NF-B. Dieser Transkriptionsfaktor ist ein, zur Familie der NF-B/Rel-Proteine gehörendes Heterodimer, bestehend aus den Untereinheiten p65 und p50. NF-B befindet sich normalerweise im Cytoplasma, gebunden an seinem Inhibitor IB (inhibitor of NF-B). IB maskiert somit ein nuclear localization signal (NLS) und verhindert den Transport von NF-B in den Zellkern. Durch verschiedene Signale wird IB durch eine spezifische, aus mehreren Komponenten bestehende IB-Kinase, den IKK-Komplex (IB kinase complex), phosphoryliert. Der IKK-Komplex besteht aus zwei katalytischen Domänen – IKK und IKK – und dem Protein NEMO (NF-B essential modifier), welches die regulatorische Untereinheit IKK darstellt, sowie dem Protein IKAP (IKK-complex-associated protein), das als Gerüstprotein im IKK-Komplex fungiert (Cohen et al., 1998;Zandi & Karin, 1999
).
Durch die Komplexbildung von TAK1 mit TAB1 und TAB2 kommt es zur Phosphorylierung der IKK-Untereinheit des IKK-Komplexes durch TAK1 (Jiang et al., 2003; Wang et al., 2001), was folglich zur Ubiquitinylierung und proteasomalen Degradation von IB führt (Alkalay et al., 1995;DiDonato et al., 1997;Chen, 2005). NF-B ist somit frei und kann in den Zellkern translozieren. Zuvor wird es ebenfalls an seiner p65-Untereinheit phosphoryliert, wodurch die Interaktion mit den Coaktivatoren p300/CBP stabilisiert wird (Zhong et al., 2002). Im Zellkern bindet NF-B an die PRDII-Domäne des IFN--Enhancers und unterstützt so die Transkription des IFN--Gens (Leonardo et al., 1989; Escalante et al., 2002).1 Einleitung
Der für diese Arbeit entscheidende Transkriptionsfaktor ist aber IRF-3. Sein genauer Aufbau wird im nächsten Abschnitt näher erläutert. Hier soll zunächst einmal nur seine Aktivierung dargestellt werden. IRF-3 wird ubiquitär exprimiert und liegt in unstimulierten Zellen als Monomer überwiegend im Cytoplasma vor (Au et al., 1995). Virale Infektionen führen zur Phosphorylierung von IRF-3, zu dessen Dimerisierung und der Translokation der IRF-3-Dimere in den Zellkern (Yoneyama et al., 1998; Hiscott et al., 1999; Kumar et al., 2000; Servant et al., 2001). Die Phosphorylierung von IRF-3 wird hierbei durch zwei Komponenten des virusaktivierten Kinase-Komplexes (VAK), gewährleistet. Hierbei handelt es sich um die zwei IKK-verwandten Kinasen TBK1 (TANK-binding kinase 1) und IKK (inhibitor of NF-B kinase ), die IRF-3 direkt phosphorylieren können (Fitzgerald et al., 2003; Sharma et al., 2003; Hemmi et al., 2004; McWhirter et al., 2004). TBK1 wird konstitutiv und ubiquitär exprimiert (Tojima et al., 2000), während die Expression von IKK möglicherweise zelltypabhängig ist (Shimada et al., 1999). Beide Kinasen funktionieren unabhängig voneinander, wobei IKK eher eine TBK1-unterstützende Funktion zugesprochen wird (Hemmi et al., 2004). Die Proteine TANK (TRAF familiy member-associated NF-B activator) und NAP1 (NAK associated protein 1) können in Komplexen mit TBK1 und IKK vorliegen und bilden somit weitere Komponenten des VAK-Komplexes (Cheng & Baltimore, 1996; Pomerantz & Baltimore, 1999; Chariot et al., 2002; Fujita et al., 2003; Sasai et al., 2005). Damit es zur Phosphorylierung von IRF-3 durch die Kinasen TBK1 und IKK kommt, erfolgt auch hier zunächst die Signalweiterleitung von MAVS. MAVS assoziiert dabei direkt mit IKK, während eine Interaktion mit TBK1 nicht beobachtet werden konnte (Kawai et al., 2005; Meylan et al., 2005), weshalb hier ein weiteres Protein interagieren könnte. Tatsächlich konnte gezeigt werden, dass das Protein TRAF3 eine entscheidende Rolle bei der RIG-I/MDA-5-induzierten IRF-3-Aktivierung spielt. TRAF3 interagiert dabei direkt mit MAVS und es erfolgt die Weiterleitung des Signals an den VAK-Komplex (Oganesyan et al., 2006; Saha et al., 2006). Hier konnte eine direkte Assoziation von TRAF3 sowohl mit den Kinasen (Oganesyan et al., 2006; Saha et al., 2006), als auch mit TANK (Li et al., 2002) gezeigt werden. TANK kann auch mit dem Protein NEMO des bereits beschriebenen IKK-Komplexes interagieren, was auf einen potentiellen Co-Regulationsmechanismus des IRF-3- und NF-B-Signalweges hindeutet (Chariot et al., 2002). Schlussendlich kommt es zur Phosphorylierung von IRF-3 durch TBK1 und IKK. Infolge seiner Phosphorylierung, dimerisiert IRF-3, transloziert in den Zellkern und bildet dort mit den Coaktivatoren p300 und CBP den DRAF1 (dsRNA-activated factor 1)-Komplex. Eine anschließende Acetylierung des IRF-3 durch p300/CBP vermittelt die Bindung an die PRDIII-I des IFN--Enhancers (Suhara
1 Einleitung
et al., 2002) und schlussendlich erfolgt zusammen mit ATF-2/c-Jun und NF-B die Expression des IFN--Gens (Maniatis et al., 1998).
Erst kürzlich wurde von vier unterschiedlichen Arbeitsgruppen ein weiteres Protein im Signalweg zur IFN--Induktion identifiziert. STING (stimulator of interferon genes; analoge Bezeichnungen: MITA, MPYS und ERIS) scheint dabei als Adapterprotein zwischen MAVS und TBK1 zu fungieren. Bezüglich der Struktur, der Lokalisation und der Funktion des gleichen Proteins waren die Ergebnisse der verschiedenen Arbeitsgruppen kontrovers. Das Transmembran-Protein enthält entweder vier (Sun et al., 2009; Zhong et al., 2009) oder fünf mutmaßliche Transmembrandomänen (Ishikawa & Barber, 2008). Für die Lokalisation von STING wurden die äußere Mitochondrienmembran (Jin et al., 2008; Zhong et al., 2008), das Endoplasmatische Retikulum (Ishikawa & Barber; Sun et al., 2009) und die Mitochondrien-assoziierten ER-Membranen (MAMs) (Ishikawa et al., 2009) detektiert. Es konnte gezeigt werden, dass STING eine zentrale Rolle bei der sowohl RIG-I-induzierten (Ishikawa & Barber, 2008; Zhong et al., 2008; Sun et al., 2009), als auch bei der dsDNA-induzierten (Sun et al., 2009; Ishikawa et al., 2009; Saitho et al., 2009) IFN-Induktion spielt, während die MDA-5-induzierte Expression von IFN durch STING nicht beeinflusst wird (Ishikawa & Barber, 2008; Ishikawa et al., 2009). Im RIG-I-vermittelten Signalweg zur IFN--Induktion führte eine STING-Überexpression immer zur Aktivierung von IRF-3 (Ishikawa & Barber, 2008; Zhong et al., 2008; Sun et al., 2009), während die Rolle des Proteins bei der NF-B-Aktivierung umstritten ist. Ishikawa & Barber (2008) und Sun et al. (2009) stellten eine Aktivierung des Transkriptionsfaktors fest, während Zhong et al. (2008) keinen Effekt auf die NF-B-Aktivierung zeigen konnte. Im Signalweg zur IRF-3-Aktivierung fungiert STING, neben TRAF3, als zusätzliches Adapterprotein zwischen MAVS und TBK1. Dabei konnte eine direkte Assoziation von STING mit MAVS (Ishikawa & Barber, 2008; Zhong et al., 2008) und mit TBK1 (Zhong et al., 2008; Ishikawa & Barber, 2008; Sun et al., 2009) detektiert werden. Eine direkte Interaktion von STING mit IRF-3 wurde durch Zhong et al. (2008) beobachtet, während Sun et al. (2009) diese Assoziation nicht feststellen konnten. Des Weiteren konnte eine Assoziation von STING mit IKK beobachtet werden (Zhong et al., 2008; Sun et al., 2009), während Ishikawa & Barber (2008) auch eine direkte Interaktion des Proteins mit RIG-I detektierten.
Die bis hier beschriebenen Signalwege zur IFN--Induktion bezogen sich auf die Reaktion auf intrazellulär vorliegende dsRNA. Zusätzlich kann aber auch extrazelluläre oder
1 Einleitung
endosomal vorliegende dsRNA zur Expression von IFN- führen. Zunächst stellte man fest, dass manche Zelltypen nur nach vorangegangener IFN-Gabe auf extrazelluläres poly(IC) zu reagieren vermochten; Fibroblasten reagierten dabei besonders gut (King & Goodbourn, 1994; Nir et al., 1985). Die extrazelluläre Stimulation benötigte offenbar einen IFN-induzierbaren Oberflächenrezeptor, der möglicherweise auf Fibroblasten konstitutiv exprimiert wird. Tatsächlich gelang 2001 die Entdeckung solch eines Rezeptors, der TLR3 (Toll-like receptor 3) (Alexopoulou et al., 2001). Zunächst bindet dsRNA an die extrazelluläre Domäne des TLR3, was dessen Dimerisierung zur Folge hat (Choe et al., 2005). Anschließend erfolgt die Rekrutierung des Proteins TRIF (TIR domain containing adaptor-inducing IFN), auch bekannt als TICAM-1 (TIR domain-containing adapter molecule 1), an die intrazelluläre TIR (Toll-IL-1 receptor)-Domäne des TLR3 (Oshiumi et al., 2003; Yamamoto et al., 2002; 2003). Die Signalweiterleitung geschieht nun ähnlich wie bei der intrazellulären Signaltransduktion, wobei TRIF hier anstelle von MAVS als Adapterprotein fungiert. Die Aktivierung von ATF-2/c-Jun und NF-B geschieht über TRAF6, RIP1 und den TAK1-Komplex (Sato et al., 2003; Meylan et al., 2004), während eine Aktivierung von IRF-3 durch TBK1 und IKK über TRAF3 erfolgt (Oganesyan et al., 2006; Sasai et al., 2005).
Nachdem hier ausführlich die Signalwege beschrieben wurden, die zu einer Induktion der IFN--Expression führen, soll nun der, für die vorliegende Arbeit wichtigste Transkriptionsfaktor der IFN--Induktion, IRF-3, besprochen werden.
1.1.3 Der Transkriptionsfaktor IRF-3
1995 gelang die Entdeckung von IRF-3 als virusaktivierbarer Faktor, der die Fähigkeit besitzt, an die PRDIII-I des IFN--Enhancers zu binden (Au et al., 1995). IRF-3 ist ein Mitglied der IRF-Familie aus bislang neun humanen Vertretern. Diese besitzen eine aminoterminale DNA-Bindedomäne (DBD) und eine carboxyterminale Transaktivierungsdomäne und spielen vor allem bei der Immunregulation eine entscheidende Rolle (Mamane et al., 1999; Taniguchi et al., 2001). Es konnte gezeigt werden, dass IRF-3 sogar alleine zur IFN--Induktion befähigt und für diese auch essentiell notwendig ist (Schafer et al., 1998; Sato et al., 2000). Neben seiner Beteiligung bei der IFN--Induktion, induziert IRF-3 auch viele andere ISGs und er scheint eine Rolle bei der Apoptose-Induktion zu spielen (Au et al., 1995; Heylbroeck et al., 2000; Weaver et al., 2001).
1 Einleitung
IRF-3 ist ein 427 Aminosäuren umfassendes, 55 kDa großes Protein, welches in allen bisher untersuchten Zelltypen konstitutiv exprimiert wird. Für die Induktion der IFN--Transkription ist also keine de-novo-Proteinsynthese vonnöten (Au et al., 1995). IRF-3 liegt im inaktiven Zustand als Monomer vorwiegend im Cytoplasma vor (Lin et al., 1998; Lin et al., 1999). Es findet zwar ein kontinuierliches Shuttling zwischen Cytoplasma und Kern statt, das Gleichgewicht liegt aber klar auf cytoplasmatischer Seite (Kumar et al., 2000). Das Protein (Abb. 3) besteht aus einer aminoterminalen DNA-Bindedomäne, gefolgt von einem nuclear localization signal (NLS) und einem nuclear export signal (NES). Daran schließt sich eine Prolin-reiche Region und eine IRF association domain (IAD) an, welche die Homodimerisierung zweier IRF-3-Moleküle oder die Heterodimerisierung mit IRF-7 ermöglicht. Der Carboxyterminus von IRF-3 bildet schlussendlich eine Regulatorische Domäne (RD) (Lin et al., 1999). Analysen der Struktur von IRF-3 zeigten, dass sich innerhalb der Prolin-reichen Region und innerhalb der RD zwei autoinhibitorische Domänen (ID) befinden, die im inaktiven Zustand von IRF-3 miteinander reagieren. Auf diese Weise wird die IAD maskiert, so dass keine Dimerisierung stattfinden kann und somit IRF-3 in einem inaktiven Zustand bewahrt wird. Hierdurch wird möglicherweise auch die Funktion der NLS beeinträchtigt, was die dominante cytoplasmatische Lokalisation von IRF-3 erklären würde (Lin et al., 1999; Qin et al., 2003; Takahasi et al., 2003).
Die durch dsRNA induzierte Aktivierung von IRF-3 wird aufgrund von Phosphorylierungen an bestimmten Serin- und Threoninresten innerhalb der Regulatorischen Domäne durch die bereits beschriebenen Kinasen TBK1 und IKK vermittelt. Diese Reste befinden sich in Clustern an den Positionen 385/386 und zwischen den Aminosäuren 396-405 (Lin et al., 1998, 1999; Yoneyama et al., 1998). 3D-Strukturanalysen zeigten, dass Serin 385 und Serin 386 besonders zugänglich sind und dadurch wahrscheinlich dort die ersten Phosphorylierungen stattfinden. Sie wurden als die minimal benötigten und entscheidenden Phosphorylierungsstellen von IRF-3 beschrieben. Die anderen Reste werden womöglich erst durch Konformationsänderungen nach der Modifikation der ersten beiden zugänglich (Qin et al., 2003; Servant et al., 2003; Takahasi et al., 2003; Mori et al., 2004). Diese Phosphorylierungen in der Regulatorischen Domäne von IRF-3 führen zu konformatorischen Veränderungen des Proteins, wodurch zunächst die IAD freigelegt und eine Dimerisierung von IRF-3 möglich wird. Hierbei spielt vermutlich das chaperonähnliche Cyclophilin B eine Rolle (Lin et al., 1999; Obata et al., 2005). Durch die zusätzliche Freilegung des NLS transloziert das Dimer in den Zellkern, wo es über seine IAD und RD an die IRF-3-binding domain (IBiD) von CBP/p300 bindet und so den schon erwähnten DRAF1-Komplex bildet.
1 Einleitung
Auf diese Weise wird IRF-3 im Zellkern gehalten und kann nicht durch sein NES ins Cytoplasma zurücktransportiert werden (Lin et al., 1998; Kumar et al., 2000; Lin et al., 2001; Qin et al., 2005). Eine anschließende Acetylierung des IRF-3 durch p300/CBP vermittelt die Bindung an die PRDIII-I des IFN--Enhancers (Suhara et al., 2002) und IRF-3 kann nun zusammen mit ATF-2/c-Jun und NF-B die Expression des IFN--Gens induzieren. Schlussendlich wird IRF-3 im Cytoplasma in einem Proteasom-vermittelten Mechanismus degradiert (Lin et al., 1998).
Abb. 3: Domänenstruktur von IRF-3. IRF-3 besitzt eine DNA-Bindedomäne (DBD), ein nuclear
localization signal (NLS) und ein nuclear export signal (NES). Im inaktiven Zustand des Proteins
interagieren die autoinhibitorischen Domänen (ID) in der Prolin-reichen Region (Pro) und der Regulatorischen Domäne (RD) miteinander. Durch die TBK1/IKK-vermittelte Phosphorylierung an drei Stellen in der RD von IRF-3, kommt es zur Dimerisierung des Proteins über die IRF association
domain (IAD) (nähere Erläuterungen im Text).
Es ist offensichtlich geworden, dass IRF-3 eine entscheidende Bedeutung bei der Induktion der IFN--Expression hat und dass das Interferon selbst eine zentrale Rolle bei der Reaktion auf eine virale Infektion spielt. Es ist nicht überraschend, dass die meisten Viren Mechanismen zur Beeinträchtigung von Interferonen entwickelt haben. So kann ein Angriffspunkt bereits schon die IFN-Induktion sein. Der nächste Abschnitt wird sich deshalb damit beschäftigen, auf welche Weise das Hepatitis A-Virus hier intervenieren kann.
1 Einleitung
1.2 Suppression der Interferon--Induktion durch HAV
Während des Replikationszyklus von HAV entsteht als Replikationsintermediat dsRNA. Da, wie bereits beschrieben, dsRNA zur Induktion der IFN--Expression führt, könnte man davon ausgehen, dass es auch durch eine HAV-Infektion zu einer Synthese von IFN- kommt. Das Hepatitis A-Virus ist interferonsensitiv. Denn eine exogene Gabe von geringen Mengen an IFN- führte zur Eliminierung einer HAV-Infektion in humanen Fibroblasten (Vallbracht & Flehmig, 1985). Es konnte jedoch gezeigt werden, dass während einer HAV-Infektion zu keiner Zeit weder IFN- in Fibroblasten noch IFN- in Lymphozyten gebildet wird (Vallbracht et al., 1985). Nach Stimulation HAV-infizierter Zellkulturen sowohl mit intra- als auch extrazellulärem poly(IC) blieb ebenfalls die Interferonsekretion aus und es war keine IFN--mRNA nachweisbar (Vallbracht et al., 1985; Brack et al., 2002). Das bedeutet, dass HAV nicht nur verhindert, selbst IFN- zu induzieren, sondern auch die Induktion der IFN--Synthese generell blockiert, also bereits schon die Transkription des IFN--Gens supprimiert. Außerdem war HAV in der Lage, die durch dsRNA ausgelöste Apoptose zu unterdrücken (Brack et al., 2002).
Durch Verwendung von Reporterplasmiden, die einzelne Subdomänen des IFN--Enhancers enthielten, konnte gezeigt werden, dass lediglich die PRDIII-I-Region durch eine HAV-Infektion negativ beeinflusst wird. Die Suppression der IFN--Expression durch HAV ist demnach auf den Signalweg zur Aktivierung des Transkriptionsfaktors IRF-3 beschränkt. Die PRDIV-abhängige Reportergenexpression blieb durch eine HAV-Infektion unbeeinflusst, auf Ebene der PRDII-Region konnte sogar eine Aktivierung detektiert werden. Analog zum Gesamtenhancer zeigte die PRDIII-I-abhängige Reportergenexpression nach poly(IC)-Induktion eine vollständige Blockade durch HAV (Astrosini, 2001; Brandt 2002; Kaumanns 2003; Fensterl et al., 2005). Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass der Transkriptionsfaktor IRF-3 in HAV-infizierten Zellen nicht phosphoryliert wird und keine Translokation in den Zellkern stattfindet, so dass auch keine Aktivierung der PRDIII-I-Region erfolgen konnte (Fensterl et al., 2005).
Es folgten Untersuchungen zur Klärung der Frage, wo HAV im Signalweg zur IRF-3-Aktivierung eingreift. Dabei konnte gezeigt werden, dass HAV die RIG-I-vermittelte IFN--Induktion oberhalb der aktivierenden Kinasen TBK1 und IKK und unterhalb des dsRNA-Rezeptors RIG-I blockiert. Zusätzlich kommt es zu einer Reduktion der TRIF-vermittelten IRF-3-Aktivierung des TLR3-Signalweges (Fensterl et al., 2005). Die Blockade der RIG-I-vermittelten IRF-3-Aktivierung durch HAV findet dabei wahrscheinlich auf Höhe von MAVS statt (Paulmann et al., 2008). Dabei scheint das 3ABC-Intermediat des Hepatitis A-Virus eine
1 Einleitung
Rolle zu spielen. 3ABC führte, vermittelt durch die virale Protease 3C, zu einer Spaltung von MAVS (Yang et al., 2007). Ähnlich diesem Mechanismus führt auch das virale NS3/4A-Protein des Hepatitis C-Virus (HCV) zu einer proteolytischen Spaltung von MAVS und somit zu einer Inhibition der Induktion der IFN--Expression (Meylan et al., 2005; Li et al., 2005). Auch das 2B-Protein von HAV ist möglicherweise bei der HAV-vermittelten Suppression der IRF-3-Aktivierung beteiligt (Magulski, 2007; Paulmann et al., 2008). Für dieses Protein konnte jedoch noch kein zelluläres Target im IRF-3-Signalweg identifiziert werden.
Eine HAV-Infektion führt also zu einer Unterdrückung der dsRNA- und NDV-induzierten IRF-3-Aktivierung und somit zu einer Suppression der IFN--Induktion. Der folgende Abschnitt soll sich deshalb nun eingehender mit dem in dieser Arbeit eingesetzten Hepatitis A-Virus beschäftigen.
1.3 Das Hepatitis A-Virus
Das weltweit verbreitete Hepatitis A-Virus (HAV) ist heute der häufigste Erreger der Gelbsucht. Die HAV-Infektion war bereits im Mittelalter unter dem Namen Feldzug-Gelbsucht (Campaign jaundice) als Erkrankung bekannt, ohne jedoch jegliche Kenntnisse über dessen Ursprung zu haben. 1947 führte MacCallum die Begriffe „Hepatitis A“ für die infektiöse Hepatitis und „Hepatitis B“ für eine ähnliche Erkrankung, bis dahin bekannt unter dem Namen „Serum Hepatitis“, ein (MacCallum, 1947). Mittlerweile kennt man weitere virale Hepatitiden, wie Hepatitis C, D und E. 1973 gelang dann mit Hilfe der Immunelektronenmikroskopie der Nachweis des Hepatitis A-Virus aus Stuhlproben infizierter Patienten (Feinstone et al., 1973), woraufhin sechs Jahre später die in vitro Kultivierung des Virus erreicht wurde (Provost & Hilleman, 1979). HAV lässt sich mittlerweile, im Gegensatz zu den anderen Hepatitis-Viren, in verschiedenen Zellkulturen vermehren. Anfänglich wurde das Hepatitis A-Virus innerhalb der Familie der Picornaviridae als Enterovirus klassifiziert (Gust et al., 1983). Bereits zehn Jahre später wurde, aufgrund neuer Erkenntnisse und dem in dieser Virusfamilie unüblichen Hepatotropismus, der Genus Hepatovirus definiert, dessen einziger Vertreter bis heute HAV ist (Minor, 1991). Alle bislang isolierten HAV-Stämme entsprechen einem Serotyp. Aufgrund genetischer Analysen wurde das Virus zunächst in sieben Genotypen eingeteilt (Robertson et al., 1992); später erfolgte ein Vorschlag zur Neuklassifizierung in nur fünf Genotypen (Costa-Mattioli et al., 2002). Ein Stammbaum mit den für diese Arbeit wichtigen HAV-Stämmen ist in Abb. 4 dargestellt. Der zum Subgenotyp
1 Einleitung
IB gehörende HAV-Stamm HM-175 gilt als gegenwärtiger HAV-Referenzsstamm und wird auch als solcher in der vorliegenden Arbeit verwendet. HAV HM-175 wurde 1976 aus Stuhlproben infizierter Patienten in Australien isoliert (Gust et al., 1985), während 1978 die komplette Nukleotidsequenz des Genoms beschrieben wurde (Cohen et al., 1987a).
Abb. 4: Stammbaum der Genotypen des Hepatitis A-Virus. Dargestellt ist der Stammbaum der
Genotypen von HAV, beruhend auf der kompletten VP1-Seqeunz (verändert nach Costa-Mattioli et al., 2002) mit den für diese Arbeit relevanten HAV-Stämmen und ihren Zellkultur-adaptierten Varianten (nähere Erläuterungen im Text). Die Länge der Balken zeigt keine genetische Distanz der Genotypen untereinander an. A.-Nr. = Accession-Number. Unpub. = Angabe aus, unter der A.-Nr. befindlichen Information.
Die Infektion mit dem Hepatitis A-Virus erfolgt normalerweise über eine fäkal-orale Übertragung und kann eine akute Leberentzündung hervorrufen, die keinen chronischen Verlauf nimmt und in der Regel ausheilt. Während eine HAV-Infektion bei Kindern sogar häufig inapparent verläuft, kann eine, in seltenen Fällen und meist bei älteren Personen, fulminante Hepatitis, eine sehr schwere Verlaufsform, auftreten (Lemon, 1997; Cuthbert, 2001). Eine Ausscheidung großer Virusmengen über den Stuhl findet schon in der frühen
1 Einleitung
Phase der Erkrankung, während der etwa einmonatigen Inkubationszeit, statt. Außerdem ist in dieser Phase die Viruslast im Blut (Virämie) am höchsten; auch einige Monate nach der Erkrankung können detektierbare Mengen an HAV-Genom im Serum nachweisbar sein (Stapleton, 1995; Normann et al., 2004). Mit Auftreten der ersten Symptome wie Appetitlosigkeit, Übelkeit und Erbrechen, Erschöpfung und Fieber, sind im Serum HAV-spezifische Antikörper (IgM, IgG und IgA) nachweisbar. Kurze Zeit nach Auftreten der ersten Symptome kann es zu einer Gelbsucht (Ikterus) mit typischer Gelbfärbung von Haut und Augen kommen, die durch eine Ablagerung von freiem Bilirubin in Haut und Bindegewebe des Auges hervorgerufen wird. Zusätzlich zeigt ein Anstieg von Leberenzymen (AST und ALT) im Blut eine Schädigung der Leberzellen an (Stapelton, 1995; Lemon, 1997). Diese ist jedoch keine direkte Wirkung des Virus auf die Zellen, sondern ist vielmehr immunpathologisch zu erklären. CD8-positive cytotoxische T-Lymphozyten (CTLs) wandern im Zuge der Infektion in die Leber ein, zerstören infizierte Zellen und bewirken nekrotische Gewebeveränderungen in der Leber (Vallbracht et al., 1986; 1989; Fleischer et al., 1990).
Nach der oralen Aufnahme gelangt das Hepatitis A-Virus aus dem Magen-Darm-Trakt über das Blut in die Leber und infiziert dort die Hepatozyten. Das Virus weist in vivo einen starken Hepatotropismus auf und die Leber ist wahrscheinlich der einzige Replikationsort des Virus, obwohl eine schwache extrahepatische Vermehrung im Tiermodell diskutiert wurde (Heitmann, 2008). Die Leber spielt eine zentrale Rolle im IgA-Metabolismus, indem sie IgA und IgA-Komplexe aus dem Organismus eliminieren kann. Da auch HAV aus der Leber in das Darmlumen gelangt und daraufhin ausgeschieden wird, könnte dies ein Hinweis auf eine Verbindung des Virus und seinem strikten Hepatotropismus mit dem IgA sein. Tatsächlich wurde der Übergang des Virus aus dem Darm in den Blutstrom und der Transport zur Leber durch Komplexierung mit IgA postuliert (Dotzauer et al., 2005). Der Rücktransport neusynthetisierter Virionen aus der Leber in das Darmlumen erfolgt über die Gallenwege, bis schließlich das Virus über die Faeces ausgeschieden werden kann (Schulman et al., 1976; Lemon, 1997).
Der zelluläre Rezeptor für das Hepatitis A-Virus konnte noch nicht eindeutig identifiziert werden. Lediglich das Bindeprotein HAVcr-1 (HAV cellular receptor-1), auch bezeichnet als TIM-1 (T cell Ig- and mucin-domain-containing molecule-1), wurde bislang als möglicher Rezeptor beschrieben (Kaplan et al., 1996; Ashida & Hamada, 1997; Feigelstock et al., 1998). Dieses Transmembran-Protein wird ubiquitär und nicht selektiv in der Leber exprimiert und
1 Einleitung
steht somit in keinem Zusammenhang mit der selektiven Infektion von Leberzellen durch HAV. Allerdings konnte gezeigt werden, dass eine Infektion von Hepatozyten mit HAV über die Bindung von den bereits beschriebenen HAV-IgA-Komplexen an den Asialoglykoprotein-Rezeptor (ASGPR) vermittelt wird (Dotzauer et al., 2000). Dieser Asialoglykoprotein-Rezeptor wird nur auf Hepatozyten exprimiert (Spiess, 1990) und könnte somit den starken Hepatotropismus von HAV erklären. Des Weiteren können HAV-IgA-Komplexe von polarisierten Epithelzellen über den Immunglobulin-Rezeptor (pIgR) transcytiert werden (Dotzauer et al., 2005). So könnte HAV im Komplex mit IgA also vom Darmlumen in die Blutbahn und daraufhin zur Leber als sein Targetorgan gelangen.
Das Hepatitis A-Virus besteht aus einem nicht umhüllten ikosaedrischen Nukleocapsid mit einem Durchmesser von 27-32 nm. Das 7,5 kb große Genom liegt als ssRNA in Plusstrangorientierung vor und enthält einen einzigen open reading frame (ORF), der für ein etwa 250 kDa großes Polyprotein codiert (Abb. 5) (Feinstone et al., 1973; Provost et al., 1975; Ticehurst et al., 1983).
Abb. 5: Genomorganisation und Polyprotein des Hepatitis A-Virus. Das einzelsträngige
RNA-Genom des Hepatitis A-Virus liegt in Positivstrangorientierung vor und enthält einen einzigen open
reading frame (ORF). Dieser wird von einer 5`-NTR, die eine internal ribosomal entry site (IRES)
enthält, und einer polyadenylierten 3´-NTR flankiert und ist zudem am 5´-Ende kovalent mit dem viralen VPg verbunden. Durch die IRES-vermittelte Translation entsteht ein Polyprotein, welches in die einzelnen HAV-Proteine prozessiert wird.
1 Einleitung
Der ORF wird am und 3´-Ende von nicht translatierten Regionen (NTR) flankiert. Die 5´-NTR ist reich an Sekundärstrukturen und enthält eine internal ribosomal entry site (IRES), welche die Cap-unabhängige Translationsinitiation vermittelt und somit dem Genom den Charakter einer mRNA verleiht (Glass et al., 1993). Des Weiteren ist an das 5´-Ende des HAV-Genoms kovalent ein Peptid, das VPg (virus protein genome-associated), gebunden (Weitz et al., 1986). Die 3´-NTR enthält eine schwächer ausgeprägte Sekundärstruktur und zudem einen poly-A-Tail (Ticehurst et al., 1983).
Das von dem ORF codierte Polyprotein wird co- und posttranslational in seine Komponenten, die Strukturproteine und Nicht-Strukturproteine, prozessiert. Die Strukturproteine (P1) bilden das Capsid und werden als VP4, VP3, VP2 und VP1 bezeichnet. Bei den Nicht-Strukturproteinen handelt es sich um 2A, 2B, 2C (P2), sowie 3A, 3B, 3C und 3D (P3) (Totsuka & Moritsugu, 1999). Fast alle Spaltungen übernimmt die virale Protease 3C (Jia et al., 1991; Schultheiss et al., 1994) lediglich die VP1/2A (Martin et al., 1999; Rachow et al., 2003) und VP4/VP2 Spaltung (Gauss-Müller et al., 1986; Tesar et al., 1993; Probst et al., 1999) geschieht in einer 3C-unabhängigen Weise. Die Primärspaltung des Polyproteins findet zwischen 2A und 2B statt (Martin et al., 1995; Jia et al., 1993).
Das 2A-Protein des Hepatitis A-Virus verfügt im Gegensatz zu den anderen Vertretern der Picornaviren über keine Protease-Funktion. Es scheint vielmehr beim Assembly eine Rolle zu spielen und wird zeitweilig in Form des Vorläufers VP1-2A auf der Oberfläche der HAV-Virionen gefunden (Martin et al., 1999; Probst et al., 1999; Cohen et al., 2002; Rachow et al., 2003).
Der Vorläufer 3AB vermittelt über den hydrophoben Anker des 3A die Membranassoziation des viralen Genoms, wobei das 3B-Protein nach seiner Abspaltung das VPg darstellt. Dieses dient vermutlich, wie auch beim Poliovirus, als „Primer“ für die Replikation der RNA durch die RNA-abhängige RNA-Polymerase 3D (Beneduce et al., 1999; Totsuka & Moritsugu, 1999).
Die Nicht-Strukturproteine 2B und 2C sind vermutlich an der viralen Replikation beteiligt und liegen membranassoziiert vor (Kusov et al., 1998; Gosert et al., 2000). HAV-2B und 2C spielen in der vorliegenden Arbeit eine besondere Rolle, weshalb ihnen ein eigenes Kapitel im nächsten Abschnitt gewidmet wird.
Nach der Translation der HAV-RNA liegt nun ein an Membranen, die vermutlich dem zellulären endoplasmatischen Retikulum entstammen, lokalisierter makromolekularer Replikase-Komplex aus Nicht-Strukturproteinen vor. Der Wechsel zu der RNA-Synthese wird möglicherweise durch die HAV-3C-Protease-vermittelte Spaltung von dem
poly(A)-1 Einleitung
binding protein (PABP) und dem poly(rC)-binding protein (PCBP2) eingeleitet (Zhang et al., 2007a; 2007b).
Nach der Replikation und Translation akkumuliert virales Antigen um den Zellkern (Klinger et al., 2001) und die Virionen gelangen nach dem Assembly über einen noch unbekannten Weg aus der Zelle.
1.3.1 Die Nicht-Strukturproteine 2B und 2C des Hepatitis A-Virus
Die biochemischen Eigenschaften der Nicht-Strukturproteine 2B und 2C des Hepatitis A-Virus und ihre Rolle bei der HAV-Replikation sind noch weitestgehend unklar, zum Teil wahrscheinlich auch dadurch, dass 2B und 2C, sowie ihr proteolytischer Vorläufer 2BC lange Zeit nicht in HAV-infizierten Zellen nachgewiesen werden konnten (Updike et al., 1991). Die primäre Spaltung des HAV-Polyproteins findet zwischen 2A und 2B statt, so dass das 2BC-Intermediat zusammen mit den Produkten P1-2A und P3 früh im Repliaktionszyklus entsteht (Martin et al., 1995; Jia et al., 1993). Die nachfolgende 3C-vermittelte Spaltung von 2BC scheint am effizientesten zu sein, wenn 3C in Form des proteolytischen Vorläufers 3ABC vorliegt, so dass eine Membranassoziation für die Prozessierung von großer Bedeutung zu sein scheint (Jecht et al., 1998).
Das 2C-Protein ist innerhalb der Picornaviren das am stärksten konservierte Nicht-Strukturprotein; HAV-2C zeigt dennoch nur etwa 23-29% Sequenzidentität zu den anderen Viren dieser Familie (Ticehurst et al., 1989). Das etwa 35 kDa große HAV-Protein besitzt eine N-terminale amphipathische -Helix und zeigt, wie auch das Intermediat 2BC, Eigenschaften eines integralen Membranproteins (Schultheiss et al., 1994; Jecht et al., 1998). Für die Assoziation von 2C mit Membranen scheint die N-terminale amphipathische -Helix essentiell zu sein, da ein N-terminal verkürztes 2C-Protein diese Eigenschaft aufhebt (Kusov et al., 1998). Des Weiteren konnte die Kapazität zur Bindung von RNA in vitro gezeigt werden, die unabhängig von der N-terminalen amphipathischen -Helix statt findet (Kusov et al., 1998). Nach einer Überexpression von sowohl 2C als auch 2BC kam es in HeLa- und FRhK-4-Zellen zu einem Rearrangement von intrazellulären Membranen. Diese als kristalloides Endoplasmatisches Retikulum (cER) bezeichnete Membran-Veränderung war bei der Expression von 2C und 2BC aus Wildtyp- und Zellkultur-adaptierten HAV-Varianten identisch. Lediglich die Überexpression von 2C aus einem cytopathogenen HAV-Stamm führte zu einer anderen Erscheinungsform des Rearrangements (Teterina et al., 1997). Diese HAV-Variante enthält in der 2C-codierenden Region Mutationen, die zu acht
Aminosäure-1 Einleitung
Substitutionen im Protein führen und Computeranalysen zeigten, dass diese Mutationen die Ausbildung der N-terminalen -Helix erschweren. Durch diese Erkenntnisse könnte demnach spekuliert werden, dass ein Zusammenhang zwischen Membran-Assoziation, Induktion von intrazellulären Membran-Veränderungen und der viralen Replikation besteht (Teterina et al., 1997). Allerdings konnten derartige 2C- und 2BC-induzierten Membran-Strukturen nicht bei einer HAV-Infektion beobachtet werden. Es ist denkbar, dass eine Überexpression von einem Membran-bindenden Protein zu einem Rearrangement der assoziierten Membranen führt, ohne dass dieses der Fall bei einer Infektion sein muss. Des Weiteren konnte für HAV-2C ein cytotoxischer Effekt in Bakterienzellen nachgewiesen werden. Eine Expression von 2C führte in Escherichia coli (E. coli) zu einer Inhibition des Wachstums der Bakterien, zur Reduktion der Proteinsynthese und zu einer gesteigerten Durchlässigkeit der Bakterien-Membranen. Auch hier scheint die N-terminale amphipathische -Helix von 2C essentiell für dessen Funktion zu sein, da eine Deletion des N-Terminus zum Aktivitätsverlust führte (Kusov et al., 1998).
Im Gegensatz zu 2C und 2BC zeigt das 2B-Protein von HAV nicht die Eigenschaften eines integralen Membranproteins, sondern besitzt den Charakter eines peripheren Membranproteins, das an der luminalen Seite von Membranvesikeln lokalisiert zu sein scheint (Jecht et al., 1998). HAV-2B ist mit fast 28 kDa (251 Aminosäuren) größer als das von anderen Picornaviren und zeigt weniger als 20% Sequenzidentität im Vergleich mit weiteren Viren dieser Familie (Gosert et al., 1996; de Jong et al., 2008). Computer-Analysen zeigten für HAV-2B eine C-terminale hydrophobe Region, die das Potential zur Bildung einer amphipathischen -Helix besitzt (Gosert et al., 2000). Eine Überexpression von HAV-2B führte in FRhK-4-Zellen, wie schon für 2C und 2BC gezeigt, zu einem Rearrangement intrazellulärer Membranen. Allerdings offenbarten sich diese Membran-Veränderungen eher in einem tubulär-vesikulären Netzwerk, das immer in enger Nachbarschaft zum rER, Mitochondrien und dem Zellkern zu finden war (Gosert et al., 2000). Im Gegensatz zu den 2C-induzierten kristalloiden Strukturen, konnten jedoch die 2B-induzierten Membran-Veränderungen auch und in gleicher Weise in HAV-infizierten Zellen detektiert werden (Teterina et al., 1997; Gosert et al., 2000). Dabei konnten morphologisch keine Unterschiede zwischen Wildtyp-, Zellkultur-adaptierten, und cytopathogenen HAV-Varianten beobachtet werden (Gosert et al., 2000). Es zeigte sich, dass das 2B-Protein dabei immer mit den veränderten Membranen assoziiert ist, was seine Rolle bei der Induktion des intrazellulären Membran-Rearrangement unterstützen würde; ungeklärt bleibt jedoch, ob dort auch die virale Replikation statt findet (Gosert et al., 2000). Auch blieb bis dahin unklar, welchen Ursprung
1 Einleitung
die veränderten Membranstrukturen hatten. Später konnte jedoch in der Immunfluoreszenz gezeigt werden, dass HAV-2B mit dem ER colokalisiert (de Jong et al., 2008). Das 2B-induzierte tubulär-vesikuläre Netzwerk könnte demnach, zumindest zum Teil, dem ER entstammen (Gosert et al., 2000; de Jong et al., 2008). Im Gegensatz zu den Polio-, Coxsackie- und Rhinovirus-2B-Proteinen, erfolgte aber keine Colokalisation von HAV-2B mit dem Golgi (de Jong et al., 2008). Obwohl bereits gezeigt werden konnte, dass HAV-2B und -2BC zu einer gesteigerten Permeabilität eukaryotischer Membranen führt (Jecht et al., 1998), konnte für das 2B-Protein von HAV kein Effekt auf die Calcium-Homöostase von ER und Golgi detektiert werden (de Jong et al., 2008). Im Gegensatz zu anderen Vertretern der Picornaviren führte eine Expression von HAV-2B nicht zu einer Inhibition des Protein-Transports durch den Golgi-Komplex (de Jong et al., 2008). Dies würde auch die Hypothese unterstützen, dass das nicht-cytolytische Hepatitis A-Virus den sekretorischen Weg benutzt, um die Zelle zu verlassen. Dabei konnte gezeigt werden, dass die HAV-Freisetzung aus polarisierten Epithelzellen sensitiv gegenüber Proteintransport-inhibierenden Substanzen ist (Blank et al., 2000).
Zusammenfassend zeigt sich also, dass sich die HAV-Proteine 2B, 2C und 2BC sowohl strukturell als auch funktionell deutlich von den entsprechenden Proteinen anderer Picornaviren unterscheiden. Alle drei HAV-Proteine zeigen Eigenschaften von Membranproteinen (Jecht et al., 1998) und induzieren intrazelluläre Membran-Veränderungen, deren Erscheinung sich jedoch unterscheiden. Während eine Überexpression von 2C und 2BC zu kristalloiden Strukturen führt, induziert HAV-2B ein tubulär-vesikuläres Netzwerk, mit dem es assoziiert und dessen Erscheinung mit den HAV-induzierten Membran-Veränderungen identisch ist (Teterina et al., 1997; Gosert et al., 2000). Unklar bleibt der mögliche Zusammenhang zwischen HAV-induzierten Membran-Veränderungen, der Assoziation von Proteinen mit diesen Membranen und der Beteiligung dieser Proteine an der viralen Replikation.
Den HAV-Proteinen 2B und 2C wird noch eine weitere Funktion zugesprochen. Das Hepatitis A-Virus unterscheidet sich in Bezug auf seinen langsamen und nicht-cytolytischen Lebenszyklus deutlich von anderen Picornaviren. Mutationen in den Regionen, die für die Nicht-Strukturproteine 2B und 2C codieren, konnten in schneller replizierenden HAV-Varianten identifiziert werden und lassen vermuten, dass diese Proteine eine wichtige Rolle bei der viralen Replikation und der Zellkultur-Adaption spielen (Emerson et al., 1993; Graff
1 Einleitung
et al., 1994b). Deshalb soll sich der folgende Abschnitt mit der Anpassung von HAV an die Zellkultur beschäftigen.
1.3.2 Zellkulturadaption des Hepatitis A-Virus
Die Replikationseffizienz von Wildtyp (WT) Hepatitis A-Viren in Zellkultur (ZK) ist in der Regel minimal und es braucht Wochen bis Monate, um maximale Virus-Titer zu erreichen (Provost & Hilleman, 1979; Daemer et al., 1981; Flehmig, 1981; Flehmig et al., 1981). HAV-Varianten dagegen, die beschleunigt in Zellkultur wachsen, wurden durch kontinuierliche Passagierung des Virus in kultivierten Zellen selektiert. Sie erreichten eine schnellere Produktion von viralem Antigen und einen höheren Virus-Titer (Daemer et al., 1981; Jansen et al., 1988; Cohen et al., 1987b). Das Virus muss also einen Prozess der Zellkulturadaption durchmachen, um die Fähigkeit einer effizienten Replikation zu etablieren. Hierbei kommt es zu ZK-adaptierenden Mutationen, die dem Virus diese Fähigkeit verleihen.
Eine dieser ZK-adaptierten Varianten ist das in dieser Arbeit verwendete HAV/7 (Abb. 4). Das Virus war nach 32 Passagen des HAV-Wildtypstammes HM-175 in AGMK-Zellen an das Wachstum in Zellkultur adaptiert und für Schimpansen und Krallenaffen attenuiert (Cohen et al., 1987b; Karron et al., 1988). Ein Vergleich der Nukleotidsequenz von HAV HM-175 und der ZK-adaptierten Variante HAV/7, zeigt 24 Nukleotidveränderungen innerhalb des 7,5 kb Genoms. Nukleotidsubstitutionen treten dabei in allen Regionen des Genoms, mit Ausnahme der VP4- und der 3C-Region auf. Auch in der 5´- und 3´-NTR treten Mutationen auf, wobei 5 Basen in der 5´-NTR der adaptierten Variante deletiert sind. 12 Aminosäure-Substitutionen in 7 der 11 viralen Proteine konnten im Polyprotein identifiziert werden (Cohen et al, 1987b).
Die Sequenz einer zweiten Zellkultur-adaptierten Variante von HAV HM-175 (HM175/p16), die 16 Mal in Zellkultur passagiert wurde (Jansen et al, 1988), zeigt im Vergleich zur Sequenz von HAV/7 (Cohen et al., 1987b) drei identische Mutationen in den NTRs der RNA und vier Mutationen, die zu den gleichen Aminosäuren-Substitutionen im Polyprotein führen. Das Auftreten identischer Mutationen in beiden HAV-Varianten lässt vermuten, dass diese Mutationen besonders wichtig für die Zellkulturadaption sind (Jansen et al, 1988).
Konstruktionen von Chimären, die Teile von WT und ZK-adaptierten HAV-Varianten enthielten, erlaubten eine Abschätzung, welche Mutationen zur ZK-Adaption beitragen. Zunächst wurden diese Mutationen in der P2/P3-Region des Genoms identifiziert (Cohen et al., 1989), später gelang eine weitere Beschränkung auf die 2B/2C-Region
