Medizinischen Hochschule Hannover
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Das Surfactantsystem der Lunge in der postnatalen Entwicklung der Ratte
Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin in der Medizinischen Hochschule
Vorgelegt von
Andreas Schmiedl
aus Heppenheim Hannover 2007
Angenommen vom Senat der Medizinischen Hochschule Hannover am 10.10.2007
Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover
Präsident: Prof. Dr. med. Dieter Bitter-Suermann Betreuer: Prof. Dr. med. Reinhard Pabst
Referent: Prof. Dr. med. Reinhard Pabst Koreferent: Prof.´in Dr. med. Gesine Hansen
Tag der mündlichen Prüfung: 10.10.2007
Promotionsmitglieder:
Prof. Dr. Ernst Ungewickell Prof. Dr. Johannes Gessner PD Dr. Peter Claus
Die Dissertation umfasst folgende Publikationen:
Publikation 1
Schmiedl, A., Vieten, G., Mühlfeld, C., Bernhard, W., 2007.
Distribution of intracellular and secreted surfactant during postnatal rat lung development.
Pediatr Pulmonol 42, 548-562.
Publikation 2
Schmiedl, A., Ochs, M., Mühlfeld, C., Johnen, G., Brasch, F., 2005. Distribution of surfactant proteins in type II pneumocytes of newborn, 14-day old, and adult rats: an immunoelectron microscopic and stereological study. Histochem Cell Biol 124, 465-476.
Verzeichnis der Abkürzungen
1. Einleitung 1
1.1. Funktionelle Anatomie der Lunge 1
1.2. Das Surfactantsystem der Lunge 1 1.3. Lungenentwicklung 3
1.4. Fragestellung und Ziel 3
2. Ergebnisse 5 2.1. Intrazelluläres Surfactant 5
2.2. Sezerniertes Surfactant 5
2.3. Surfactantlipide und SP-A 6
2.4. Korrelation morphologischer und biochemischer Veränderungen 6 2.5. Intrazelluläre Verteilung der Surfactantproteine 6 3. Diskussion 8 3.1. Methodenkritik 8
3.2. Postnatale Veränderungen des intrazellulären und sezernierten 9
Surfactant in Abhängigkeit von der Alveolarisierung 3.3. Postnatale Verteilung der Surfactantproteine 10
4. Zusammenfassung 12
5. Literatur 14
6. Publikationen 17
Publikation 1 17
Publikation 2 18
7. Danksagung 19
AE I Alveolarpithelzellen Typ I AE II Alveolarepithelzellen Typ II BAL Bronchoalveoläre Lavage BPD Bronchopulmonale Dysplasie cb composite body
Lk Lamellenkörper mvK multivesikuläre Körper mlV multilamelläre Vesikel tM tubuläres Myelin
RDS Respiratory Distress Syndrom SP Surfactantprotein
ulV unilamelläre Vesikel
1. Einleitung
1.1. Funktionelle Anatomie der Lunge
Die Lunge gliedert sich in luftleitende und respiratorische Abschnitte. Der Luftleitung dient das Bronchialsystem, ein Röhrensystem, das sich vom Lungenhilum distalwärts immer weiter aufteilt, wobei der Durchmesser kontinuierlich abnimmt, die Gesamtquerschnittsfläche jedoch zunimmt.
Die respiratorischen Abschnitte beginnen mit der Ausbildung der Alveolen als sack- bzw.
bläschenförmige Ausstülpungen der Wände der Bronchioli respiratorii. Die Bronchioli respiratorii gehen in die Ductus alveolares über, die in die Sacculi alveolares münden. Die von einem einschichtigen Alveolarepithel ausgekleideten luftgefüllten Alveolen gleichen den Waben eines Bienenstocks, die zum Ductus alveolaris hin offen sind. Benachbarte Alveolen sind jeweils durch ein gemeinsames gefäßführendes Bindegewebe enthaltendes Septum interalveolare getrennt.
Das strukturelle Korrelat der Gasaustauschregion, die Blut-Luft-Schranke der Septen besteht aus den schmalen Zytoplasmaausläufern der Alveolarepithelzellen Typ I (AE I) und dem einschichtigen Kapillarendothel sowie den dazwischen liegenden miteinander verschmolzenen Basallaminae. Die Austauschbarriere ist im arithmetischen Mittel 2,2 µm, im harmonischen Mittel sogar nur ca. 0,6 µm dick (Gehr et al., 1978) und somit 50mal dünner als ein Blatt Luftpostpapier. Die Gesamtoberfläche des Kapillarendothels und des Alveolarepithels entspricht mit je etwa 140 m2 annähernd der Größe eines Tennisplatzes und ist auf insgesamt etwa 300 Millionen Alveolen verteilt (Weibel, 1984). Eine derart zarte Struktur muss bei den Atembewegungen stabil gehalten werden. Zur Stabilität der Alveolen und der Blut-Luft-Schranke tragen bei
1. ein sehr gut ausgebildetes Bindegewebsgerüst mit einem hohen Anteil elastischer Fasern, die unter anderem korbflechtartig um die Alveolen angeordnet sind (Honda et al., 2000, Weibel& Bachofen, 1987),
2. das Surfactant-System, welches die an der Grenzfläche zwischen Gas und Flüssigkeit wirksame Oberflächenspannung reduziert (Clements et al., 1961).
1.2. Das Surfactantsystem der Lunge
Nach dem Laplaceschen Gesetz ist ein der Oberflächenspannung entgegenwirkender transmuraler Druck umgekehrt proportional zum Radius. Die Alveolen, die nur einen
Durchmesser von 250 bis 300 µm haben, hätten daher aufgrund des hohen Drucks ständig die Tendenz zu kollabieren. Dies wird verhindert durch ein oberflächenaktives Agenz (Surface active Agent oder kurz Surfactant (Clements, 1970). Das Surfactant reduziert die Oberflächenspannung in den Alveolen in Abhängigkeit von ihrer Größe und wirkt einem Alveolenkollaps während der Atembewegungen entgegen (Antiatelektasefaktor) (Clements, 1997). Zudem werden seinen Komponenten immunmodulierende Wirkungen zugeschrieben (Phelps, 2001, Wright, 2005).
Das Surfactant, welches mittels bronchoalveolärer Lavage (BAL) gewonnen werden kann, besteht aus 90% Lipiden und 10% Proteinen, wovon nur 2% zu den Surfactant-spezifischen Proteinen gehören. Die Surfactantproteine (SP) werden entsprechend ihres abnehmenden Molekulargewichts als SP-A (32kD), SP-B (8kD) und SP-C (4kD) eingeteilt, während das SP-D (43 kD) erst später entdeckt wurde (Possmayer, 1988).
Das Surfactantsystem lässt sich in einen intrazellulären und intraalveolären Pool einteilen.
Der intrazelluläre Pool ist in den Alveolarepithelzellen Typ II (AE II) lokalisiert. Das Surfactant wird von diesem Zelltyp synthetisiert, gespeichert, sezerniert und größtenteils wieder aufgenommen (Weaver et al., 2002, Wright& Clements, 1987). Die Lamellenkörper (Lk) enthalten die am glatten ER synthetisierten Lipide (Chevalier& Collet, 1972) und die reifen hydrophoben SP-B und SP-C, die nach Bildung am rER zunächst als bedeutend größere Proproteine im Golgi-Apparat und in den multivesikulären Körpern (mvK) posttranslational modifiziert werden (Weaver, 1998). Die mvK fusionieren mit kleinen unreifen Lk zu so genannten composite bodies (cb, zusammengesetzte Körper) (Brasch et al., 2003). Die aus den cb hervorgehenden Lk enthalten dann vorwiegend reifes SP-B und SP-C (Brasch et al., 2002). Die hydrophilen SP-A und SP-D gelangen nach Bildung am rER und Modifizierung im Golgi-Apparat in die mvK (Hawgood& Poulain, 2001).
Sezerniertes Surfactant bildet den nach entsprechender Fixierung elektronenmikroskopisch sichtbaren oberflächenaktiven Oberflächenfilm ((Weibel& Gil, 1968). Zudem sind in der Hypophase aktive Vorstufen des Oberflächenfilms und inaktive Abbauprodukte zu finden, die auch in der BAL nachweisbar sind (Fehrenbach et al., 2000, Gross& Narine, 1989). Zu den aktiven Vorstufen gehören die Lk ähnlichen Strukturen und tubuläres Myelin (tM) (Veldhuizen& Possmayer, 2004). Multilamelläre Vesikel (mlV) werden als aktive Vorstufen, aber auch als inaktive Abbauprodukte angesehen. Unilamelläre Vesikel (ulV) sind inaktive Abbauprodukte des Surfactantfilms (Gross& Narine, 1989, Veldhuizen& Possmayer, 2004).
Die SP sind für die strukturelle und funktionelle Integrität, für die Homöostase des Surfactants sowie für die Stabilisierung des intraalveolären Surfactants verantwortlich
(Weaver& Conkright, 2001, Whitsett& Weaver, 2002). SP-A und SP-D gehören zu den Collectinen und besitzen immunmodulierende Wirkungen (Wright, 2006). SP-A ist zudem für die Ausbildung des tM von großer Bedeutung ((Palaniyar et al., 1999). SP-D spielt eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der Surfactant-Homöostase (Ikegami, 2006).
1.3. Lungenentwicklung
Die Lungenentwicklung lässt sich bei allen Säugern in eine pränatale und postnatale Periode unterteilen. In der pränatalen Phase folgt auf das embryonale Stadium die fetale Periode, die in verschiedene Stadien eingeteilt wird (Burri, 1984). In der pseudoglandulären Phase ähnelt die Lunge einer tubuloalveolären Drüse. In der kanalikulären Phase weiten sich die luftleitenden Tubuli, die ersten dünnen Blut-Luft-Schranken bilden sich und das Epithel differenziert sich zu AE I und AE II. Außerdem lässt sich der Beginn der Surfactantbildung nachweisen. In der sacculären Phase erfolgt die Ausbildung primärer Septen zwischen den Lufträumen. Diese frühen Septen enthalten viel Bindegewebe und ein doppeltes Kapillarbett.
An die sacculäre Phase schließt sich die alveoläre Phase an, welche beim Menschen mindestens bis zum zweiten Lebensjahr anhält (Burri, 2006). In dieser Phase wird durch Einziehen weiterer Septen die Gasaustauschfläche sehr stark vergrößert. Es folgt die Reifung des septalen Gefäßbettes mit Ausbildung eines einschichtigen Kapillarbettes und starker Reduktion des septalen Bindegewebes (Burri, 2006).
Im Gegensatz zur humanen Lunge ist die Rattenlunge bei Geburt unreif (Burri, 1974). Weder Alveolen noch Ductus alveolares sind vorhanden. Das Lungenparenchym besteht aus dünnwandigen Kanälen und Sacculi. Diese sacculäre Phase dauert bis zum postnatalen dritten Tag an. Die Alveolarisierung beginnt erst ab dem postnatalen vierten Tag und erstreckt sich bis zum Ende der zweiten Woche. Gegen Ende der dritten postnatalen Woche ist die Ausreifung des Kapillarbettes weitestgehend abgeschlossen.
1.4. Fragestellung und Ziel
Die Reifung des Surfactantsystems ist verbunden mit strukturellen und biochemischen Veränderungen der AE II. Für die bei der Geburt einsetzende Atmung ist ein intaktes Surfactantsystem die Voraussetzung (Clements, 1997) Daher muss das Surfactantsystem neugeborener Ratten der Atmung trotz morphologisch unreifer Lungen in lufthaltiger Umgebung angepasst sein. Die Erfassung und das Verständnis möglicher Beziehungen zwischen Ausbildung der Surfactantkomponenten und Ausreifung der Alveolen ist gerade im Hinblick auf das Auftreten akuter und chronischer Erkrankungen wie Respiratory Distress
Syndrom (RDS) und Bronchopulmonale Dysplasie (BPD) bei frühgeborenen Kindern wünschenswert. Da im Gegensatz zum Menschen bei Ratten die Alveolarisierung und damit die Ausreifung der Lunge erst postnatal erfolgt, ist die Untersuchung des Surfactant in einer solch morphologisch unreifen Lunge sehr gut geeignet, um mögliche Beziehungen zwischen Lungenreifung und Surfactant aufzuzeigen. Zwar liegen einige wenige Untersuchungen zum Surfactantsystem in der perinatalen Periode vor (Flecknoe et al., 2003, Jobe& Ikegami, 2000), jedoch gibt es keine systematischen vergleichenden Untersuchungen über strukturelle Veränderungen des Surfactant vor, während und nach der Alveolarisierung.
Für die Beurteilung von strukturellen Veränderungen des Surfactant reicht eine alleinige qualitative Beurteilung jedoch nicht aus, da hiermit nur sehr drastische Veränderungen wahrgenommen werden können. Erst die Anwendung quantitativer, morphometrischer und stereologischer Methoden erlaubt an Hand der erhaltenen Zahlenwerte einen objektiven Vergleich verschiedener struktureller Parameter sowie deren Kombination und Korrelation mit biochemischen und molekularbiologischen Analysen.
In dieser Arbeit sollte folgende Hypothese überprüft werden: Die bei Ratten postnatal auftretende Ausreifung der Lunge ist mit charakteristischen Änderungen des pulmonalen Surfactant verbunden. Hierfür soll das intrazelluläre und intraalveoläre (intrasacculäre) Surfactant vor, während und nach der Alveolarisierung an Hand verschiedener morphometrischer bzw. stereologischer Parameter sowie mit quantitativer Immunelektronenmikroskopie und biochemischen Analysen charakterisiert werden.
Die zur Überprüfung der Hypothese durchgeführten Tierversuche wurden unter dem Aktenzeichen 509.6-42502-01/435 angezeigt und genehmigt.
2. Ergebnisse
2.1. Intrazelluläres Surfactant
Das absolute Volumen AE II war in der ersten postnatalen Woche vor und während der Alveolarisierung vergleichbar. Nach 14 Tagen - gegen Ende der Alveolarisierung - stieg ihr absolutes Volumen wieder signifikant an (Publ. 1, S. 554).
Die Größe der AE II nahm während der Alveolarisierung ab, erreichte jedoch bei den 42 Tage alten Ratten mit dem postnatalen Tag 1 wieder vergleichbare Werte (Publ. 1, Tab. 3).
Das relative und absolute Volumen der Lk zeigte am ersten postnatalen Tag die niedrigsten Werte. Während der Alveolarisierung erfolgte eine kontinuierliche Zunahme des Volumens.
An Tag 14 war das Volumen der Lk signifikant gegenüber dem Ausgangswert an Tag 1 erhöht (Publ. 1, Tab. 2a, 2b). Das Volumen der cb und der mvK zeigte nach dem Ende der Alveolarisierung die höchsten Werte (Publ. 1, Tab. 2a).
Die Größe der Lk wies an den postnatalen Tagen 1 und 7 vergleichbare Werte auf (Publ. 1, Fig. 5A, B). Gegen Ende der Alveolarisierung waren die Lk signifikant größer. Während in der ersten postnatalen Woche bedeutend mehr kleine Lk in den AEII zu finden waren, nahm sowohl nach 2 als auch nach 6 Wochen die Zahl größerer Lk zu (Publ. 1, Fig. 5).
2.2. Sezerniertes Surfactant
Einen Tag nach der Geburt fanden sich in der BAL neugeborener Ratten überwiegend Lk ähnliche Strukturen verschiedener Größe sowie mlV und ulV, aber nur wenig tM (Publ. 1, Abb. 4A). Die BAL sieben Tage alter Ratten enthielt weniger Lk ähnliche Strukturen (Publ.
1, Abb. 4C). 42 Tage alte Ratten wiesen große Aggregate aus tM in der BAL auf (Publ. 1, Abb. 4D).
Im Lungenparenchym enthielt die Hypophase der Sacculi von 1 Tag alten Ratten den höchsten Anteil an Testfeldern, die mit Surfactant bedeckte Septen enthielten (Publ. 1, Tab.
4). Während der Alveolarisierung verminderte sich signifikant die Testfeldzahl der mit Sufactant bedeckten Septen und tendierte bei den 42 Tage alten Ratten wieder zu höheren Werten. Der relative Anteil an tM war vor Beginn der Alveolarisierung höher als während der Alveolarisierung. Gegen Ende der Alveolarisierung und in ausgereiften Lungen wurde ein signifikanter Anstieg ermittelt. Der prozentuale Anteil der ulV zeigte während der Alveolarisierung die höchsten Werte, fiel am Ende der Alveolarisierung ab und war nach Abschluß der Lungenreifung signifikant erniedrigt.
2.3. Surfactantlipide und SP-A
Der absolute Phospholipidgehalt lavagierter Lungen stieg mit zunehmendem Alter an (Publ.
1, Tab. 5A). Der Gehalt an sezernierten Phospholipiden aus der BAL-Flüssigkeit war einen Tag nach Geburt etwas höher als sieben Tage später. Bis zum Ende der Lungenreifung folgte eine kontinuierliche Zunahme des Phospholipidgehaltes, der nach 42 Tagen signifikant höher als der Ausgangswert am ersten postnatalen Tag war (Publ. 1, Tab. 5A). Der SP-A Gehalt in der BAL-Flüssigkeit begann gegen Ende der Alveolarisierung anzusteigen und war in den 42 Tage alten Ratten signifikant erhöht (Publ. 1, Abb. 6C).
2.4. Korrelation morphologischer und biochemischer Veränderungen
Die Volumenfraktion der Lk und der Phospholipid-Gewebegehalt zeigten unabhängig von der postnatalen Entwicklung eine enge Korrelation (Publ. 1, Abb. 6B).
Der relative Anteil des intraalveolären Surfactant korrelierte ebenfalls sehr eng mit dem Phospholipidgehalt in der BAL (Publ. 1, Abb. 6A).
Der SP-A Gehalt in der BAL und der Anteil an tM wiesen eine sehr enge Beziehung auf (Publ. 1, Abb. 6D).
2.5. Intrazelluläre Verteilung der Surfactantproteine
Mittels der Bestimmung des relativen spezifischen Labelling Index (RLI) und der χ2-Werte wurde geprüft, ob die Verteilung des Labelling der SP signifikant und kompartimentspezifisch ist. Ein Kompartiment weist ein bevorzugtes Labelling auf, wenn sein RLI > 1 und sein partieller χ2-Wert mit mehr als 10% zum gesamten χ2-Wert beiträgt (Publ. 2, Tab. 3).
Die ermittelten Werte zeigten eine nicht zufällige Verteilung der an Antikörper gebundenen Goldpartikel in den AE II.
SP-A war vor, gegen Ende und nach Abschluß der Lungenreifung überwiegend in schmalen, meist von einer Membran umgebenen Vesikeln, am rER und in mvK lokalisiert (Publ. 2, Abb.
2a, b). Lk enthielten nur wenig SP-A. Nur das Zytoplasma (rER, mvK, kleine Vesikel) zeigte ein signifikant bevorzugtes Labelling für SP-A (Publ. 2, Tab. 2).
Nach der Alveolarisierung fand sich ein signifikantes spezifisches SP-B Labelling über den Lk und den mvK (Publ. 2, Abb. 3a-b). Das SP-B Labelling über den anderen subzellulären Kompartimenten war nicht signifikant. Lk in AE II neugeborener Ratten wiesen nur ein
schwaches, nicht signifikantes Labelling auf (Publ. 2, Abb. 3c, Tab. 3). SP-B war in den neugeborenen Ratten nur in den mvK signifikant und spezifisch verteilt (Tab. 3).
Für proSP-C fand sich ein hochsignifikantes sehr starkes spezifisches Labelling in den mvK vor und nach Alveolarisierung (Publ. 2, Tab. 4). Einige Goldpartikel wiesen auch die Lk und die cb auf (Publ. 2, Abb. 4b), allerdings ohne signifikanten Verteilungsindex (Tab. 4).
Unabhängig von der postnatalen Entwicklung war das SP-D Labelling nur schwach ausgeprägt. Goldpartikel zeigten sich hauptsächlich im Zytoplasma am rER, in kleinen Vesikeln und in mvK (Publ. 2, Abb. 5). Das SP-D Labelling in diesem Kompartiment war spezifisch.
3. Diskussion
3.1. Methodenkritik
Klinische und tierexperimentelle Untersuchungen zum Surfactantsystem erfolgen überwiegend an Surfactantmaterial, welches mittels BAL aus den terminalen Luftwegen gewonnen wurde. Denn die BAL ist die einfachste und vor allem beim Menschen praktikabelste Methode zur Beurteilung des alveolären Surfactant. Die BAL erlaubt jedoch keine hinreichend genauen Aussagen über Lokalisation und Verteilungsmuster des Surfactant.
Die einzige Möglichkeit, die Lokalisation und mögliche Abweichungen vom physiologischen Verteilungsmuster des intrazellulären und intraalveolären Surfactant in situ zu beurteilen - ohne seine Mikroorganisation zu verändern - ist eine Perfusionsfixierung der Lunge („fixation from behind“) (Gil, 1971), wie sie in Publikation 1 durchgeführt wurde. Die Voraussetzung für die anschließende ultrastrukturelle Beurteilung sind besondere Methoden zur Erhaltung und Darstellung der empfindlichen Surfactantkomponenten (Fehrenbach, 1998, Schmiedl et al., 2003).
In dieser Arbeit wurde ein elektronenmikroskopischer Ansatz in Verbindung mit morphometrischen und stereologischen Analysen gewählt, um die Veränderungen im Surfactantsystem während der Alveolarisierung zu erfassen und diese mit biochemischen Parametern zu korrelieren. Als Morphometrie werden quantitative Methoden in der Strukturforschung bezeichnet. Bei der Quantifizierung in der Mikroskopie - insbesondere der Elektronenmikroskopie - muss berücksichtigt werden, dass die untersuchte Probenmenge im Vergleich zum Organ, welches untersucht wird, extrem klein ist und dass die dreidimensionale Struktur durch zweidimensionale Ultradünnschnitte bedingt ist. Die Stereologie bietet die Möglichkeit, an diesen zweidimensionalen Objekten dreidimensionale Bestimmungen durchzuführen. Sofern bei der Probengewinnung und Auswertung bestimmte Zufallskriterien eingehalten werden und Vorzugsrichtungen vermieden werden, sind mit diesen Methoden Aussagen u. a. über Volumen, Größe und Oberfläche möglich (Cruz- Orive& Weibel, 1990, Howard CV, 1998, Ochs, 2006). Da Ultradünnschnitte nur einen sehr kleinen Teil einer Probe und diese wiederum nur einen Teil des Organs repräsentieren, ist ein systematisches zufälliges Sampling notwendig (Cruz-Orive& Weibel, 1990). Hierdurch erhält im Idealfall jeder Teil und jede Orientierung des Organs sowie der Probe und des Schnitts die gleiche Chance zur Auswertung ausgewählt zu werden (Cruz-Orive& Weibel, 1990, Mayhew et al., 2002).
Mittels konventioneller Transmissionselektronenmikroskopie lassen sich jedoch nur die Lipidkomponenten des Surfactant beurteilen. Das hier verwendete Protokoll zur Aufarbeitung der Proben (chemische Fixierung und Kryosubstitution, Einbettung in Lowicryl bei niedrigen Temperaturen; siehe Publ. 2) für die Immunelektronenmikroskopie ist ein guter Kompromiss zwischen Erhaltung der Ultrastruktur der Surfactantkomponenten und Erhaltung der Antigenität (Griffiths, 1993). Der Nachweis der SP erfolgte über eine indirekte Immunogoldmarkierung. Hierbei wurden zunächst die SP mit einem SP-spezifischen primären Antikörper markiert. Als Detektionssystem wurde dann ein Sekundärantikörper, der mit Gold konjugiert war gewählt (siehe Publ. 2). Entsprechend geben die Goldpartikel die Verteilung der SP wieder. Die in dieser Arbeit durchgeführte Quantifizierung des Immunogold-Labellings ermöglicht Aussagen über die Art der Verteilung und die Spezifität des Labellings (Mayhew et al., 2003, Mayhew et al., 2002). Der in dieser Arbeit bestimmte RLI (Relative Labelling Index; Publ. 2) basiert auf dem Vergleich der aktuellen beobachteten Verteilung mit der erwarteten Verteilung der Goldpartikel (siehe Publ. 2). Ein Kompartiment zeigt ein bevorzugtes Labelling, wenn sein RLI >1 ist und sein partieller χ2 – Wert einen signifikanten Beitrag zum Gesamt χ2 – Wert liefert (Mayhew et al., 2003).
3.2. Postnatale Veränderungen des intrazellulären und sezernierten Surfactant in Abhängigkeit von der Alveolarisierung
Die Ausreifung der Säugerlunge umfasst zum einen die Alveolarisierung und damit Vergrößerung der Gasaustauschfläche zum anderen die Bildung von Surfactant. Beide Reifungsprozesse sind für die postnatale Funktion der Lunge von entscheidender Bedeutung.
Entsprechend entstehen bei verminderter Ausreifung verschiedene Krankheitsbilder bei Neugeborenen (Chess et al., 2006, Clements& Avery, 1998). Die Ratte eignet sich für die Untersuchung des Surfactant in Abhängigkeit von der Alveolarisierung besonders, da sich die unreifen Lungen neugeborener Ratten noch in der sacculären Phase befinden. Der Reifegrad dieser Lungen entspricht somit demjenigen humaner Lungen in der 28. pränatalen Woche (Burri, 2006, Jobe& Ikegami, 2001).
Die Surfactantbildung beginnt pränatal zu einem Zeitpunkt, bei dem 80% der Tragzeit bereits vorüber sind. Einen normalen Geburtstermin vorausgesetzt, weisen alle Säuger ein intaktes Surfactant auf (Lin& Lechner, 1990).
Die Ergebnisse zeigen bedeutende morphologische und biochemische Unterschiede im Surfactantsystem, die teilweise mit der Alveolarisierung korrelieren. So nimmt das mittels stereologischer Parameter bestimmte Volumen der Lk und die Größe der Lk während der
Alveolarisierung kontinuierlich zu (siehe Publ. 1). Entsprechend erhöht sich der Phospholipid-Pool im Gewebe. Aufgrund der gleichzeitigen Zunahme des Körpergewichts vermindert sich das spezifische Lungenvolumen und der Phospholipid-Gewebegehalt pro Körpergewicht (Publ. 1, Tab. 5B). Die Größe der AE II ist vor und nach der Alveolarisierung nahezu gleich, zeigt jedoch während der Alveolarisierung eine Abnahme um bis zu 21%.
Andererseits nimmt das absolute Volumen der AE II kontinuierlich zu. Ursache dieser Größenabnahme bei gleichzeitiger Zunahme des Gesamtvolumens könnte eine vermehrte Proliferation der AE II und Umwandlung in AE I während der Ausbildung der Alveolen sein.
Hierdurch wären bedeutend mehr neu gebildete und damit kleinere AE II in dieser Phase zu finden.
Der morphometrisch wie auch biochemisch ermittelte sezernierte Surfactantpool ist vor Beginn der Alveolarisierung am höchsten und nimmt während der Alveolarisierung ab. Ein Grund hierfür könnte die von anderen Autoren beschriebene Vergrößerung der Oberfläche während der Alveolarisierung - insbesondere durch Einziehen neuer Septen und die Verkleinerung der Lufträume (Burri, 2006) - sein. Diese Daten sind vergleichbar mit solchen von Kindern vor und nach Ende der Lungenreifung (Mander et al., 2002).
Die ermittelte enge Beziehung zwischen den inaktiven intrasacculären bzw. intraavleolären Surfatcantkomponenten (ulV) lässt einen Einfluß der Respirationsrate auf die Konversion von sezernierten Surfactant vermuten. Die enge Korrelation zwischen dem Anstieg sezernierter aktiver Surfactantkomponenten (tM) und dem SP-A-Gehalt in der BAL-Flüssigkeit während der postnatalen Lungenreifung stimmt mit Befunden anderer Autoren überein, die zeigen konnten, dass für die Bildung und Stabilisierung des tM SP-A notwendig ist (Ikegami et al., 2000, Palaniyar et al., 1999). Der niedrige SP-A Gehalt in der BAL neugeborener Ratten könnte mit der verzögerten Bildung der Alveolen zusammenhängen. So entsprechen die SP-A Konzentrationen in neugeborenen Ratten denen von frühgeborenen Kindern. Andererseits findet sich in Vogellungen, die keine Alveolen ausbilden, weder tM noch SP-A (Bernhard et al., 2004). Zudem zeigen SP-A knockout Mäuse keine Veränderungen in der Surfactantaktivität und keine respiratorische Insuffizienz (Ikegami et al., 1998). Somit scheint ein im Vergleich zu anderen Säugern niedriger SP-A Gehalt in neugeborenen Ratten keinen unmittelbaren Einfluss auf die Surfactantfunktion zu haben (Publ. 1).
3.3. Postnatale Verteilung der Surfactantproteine
Mit Hilfe quantitativer Immunelektronenmikroskopie konnte gezeigt werden, dass sich die Kompartiment-spezifischen Verteilungen der SP-A, SP-D und SP-C während der postnatalen
Entwicklung nicht ändern. Unabhängig von der postnatalen Entwicklung sind die hydrophilen SP bevorzugt am rER, Golgi-Apparat sowie in schmalen zytoplasmatischen Vesikeln und mvK lokalisiert (siehe Publ. 2). Diese Ergebnisse decken sich mit dem Konzept der Lk unabhängigen Sekretion der hydrophoben SP (Hawgood& Poulain, 2001). Die Bestimmung des RLI in der humanen Lunge ergab eine schwache, aber spezifische Verteilung von SP-A - auch in den Lk (Ochs et al., 2002). Es handelt sich hierbei vor allem um wieder aufgenommenes SP-A (Kalina et al., 1993, McCormack& Whitsett, 2002, Osanai et al., 1998). In Rattenlungen war dieser geringe Anteil von SPA in den Lk zwar qualitativ sichtbar, zeigte allerdings im Gegensatz zur humanen Lunge (Ochs et al., 2002) keine signifikanten RLI-Werte. Eine verminderte Antigenität des SP-A und damit eine geringere Detektion durch den SP-A Antikörper in den Lk könnte durch stärkeren strukturellen Umbau des hydrophilen Proteins in den hydrophoben azidophilen Lk bedingt sein (Publ. 2). Denn Western Blot Analysen zeigten SP-A auch in aus Rattenlungen isolierten Lk (Publ. 2, Abb. 6). Die hochsignifikante spezifische Verteilung von proSP-C im rER, Golgi-Apparat und den mvK und nicht in den Lk unterstützt die These, dass die Prozessierung zum reifen SP-C mit der Bildung von zusammen gesetzten Körpern (cb) nahezu abgeschlossen ist und daher die aus den cb hervorgehenden Lk überwiegend reifes SP-C enthalten (Beers& Mulugeta, 2004, Guttentag et al., 2003) vgl. auch Publ. 2).
Das Labelling von SP-B ist vor der Alveolarisierung in den Lk nur sehr gering und statistisch nicht signifikant. Dies bestätigen auch biochemische Analysen, die nur einen geringen SP-B Gehalt in neugeborenen Rattenlungen nachweisen konnten (Stahlman et al., 1992). Mit zunehmender Volumenfraktion und Größe der Lk gegen Ende und nach der Alveolarisierung findet sich dann auch ein signifikantes bevorzugtes SP-B Labelling in den Lk (Publ. 2, Tab. 1, 3). Die spezifische Verteilung von SP-B in mvK und Lk unabhängig von der postnatalen Entwicklung stützt das Konzept, dass das Processing von proSP-B zu reifem SP-B bereits in den mvK erfolgt. Reifes SP-B wird anschließend durch Fusion von mvK mit den Lk zu cb aufgenommen (Publ 2). Somit ist anzunehmen, dass SP-B für die Bildung ausgereifter Lk mitverantwortlich ist (Brasch et al., 2004, Guttentag et al., 2003).
4. Zusammenfassung
Pulmonales Surfactant erniedrigt die Oberflächenspannung in den distalen Atemwegen. Ein intaktes Surfactantsystem ist die Voraussetzung für die Atemfunktion nach der Geburt. Ratten werden mit unreifen Lungen geboren, denn in der Rattenlunge beginnt die Alveolarisierung erst postnatal. Somit eignen sich Ratten sehr gut zur Untersuchung des Surfactantsystems während der Ausreifung der Lunge. In dieser Arbeit sollte die Hypothese bestätigt werden, dass die Alveolarisierung mit charakteristischen strukturellen und biochemischen Veränderungen des Surfactant einhergeht.
Das Surfactantsystem wurde vor der Alveolarisierung (einen Tag alte Ratten), während der Alveolarisierung (sieben Tage alte Ratten), gegen Ende der Alveolarisierung (14 Tage alte Ratten) und in reifen Lungen (42 Tage alte Ratten) untersucht. Die strukturellen Komponenten der Lipide des intrazellulären und sezernierten Surfactantpools wurden mittels Elektronenmikroskopie und Morphometrie bzw. Stereologie bestimmt. Die Quantifizierung der Phospholipide erfolgte mit biochemischen Methoden. Die quantitative Immunelektronenmikroskopie wurde angewendet, um die intrazelluläre Verteilung der Surfactantproteine zu ermitteln. Hierbei gab die Bestimmung des relativen Labelling Index (RLI) Auskunft darüber, ob die Verteilung der SP nicht zufällig und Kompartiment-spezifisch ist. Zudem wurde der Western Blot zur Bestimmung des intrazellulären SP-A und des SP-A aus der Bronchoalveolären Lavage angewendet.
Die Ergebnisse lassen sich wie folgt zusammenfassen:
1. Die Alveolarepithelzellen Typ II sind vor und nach Alveolarisierung ähnlich groß, werden jedoch während der Alveolarisierung kleiner. Das absolute Volumen der Alveolarepithelzellen Typ II steigt kontinuierlich an und ist nach 14 Tagen signifikant erhöht.
2. Die Volumenfraktion und das absolute Volumen der Lamellenkörper nahmen kontinuierlich zu. Gegen Ende der Alveolarisierung war nicht nur das Volumen sondern auch die Größe der Lamellenkörper signifkant erhöht.
3. Die Volumenfraktion der Lamellenkörper korrelierte eng mit dem Gewebegehalt der Phospholipide.
4. Sezerniertes Surfactant zeigte einen Tag nach Geburt die morphometrisch und biochemisch ermittelten höchsten Werte. Während der Alveolarisierung nahm der sezernierte Surfactantpool ab und war in den ausgereiften Lungen wieder erhöht, ohne die Werte für die einen Tag alten Ratten zu erreichen.
5. Der relative Anteil der aktiven Vorstufe des Oberflächenfilms (tubuläres Myelin) zeigte am ersten postnatalen Tag höhere Werte als während der Alveolarisierung. In 14 und 42 Tage alten Ratten nahmen die Werte signifikant zu.
6. Der SP-A Gehalt in der Bronchoalveolären Lavage korrelierte signifikant mit den relativen Anteilen des tubulären Myelins.
7. Der prozentuale Anteil der unilamellären Vesikel zeigte während der Alveolarisierung die höchsten Werte. Mit zunehmender Lungenreifung verminderte sich ihr Anteil. In den 42 Tage alten Ratten fanden sich signifikant niedrigere Werte.
8. Die intrazelluläre Verteilung der SP-A, SP-D und der Vorstufe von SP-C (proSP-C) wies eine Kompartiment-spezifische Verteilung unabhängig von der Alveolarisierung auf. So fand sich ein bevorzugtes zytoplasmatisches Labelling (rER, kleine Vesikel, mvK) für die hydrophilen SP-A und SP-D. ProSP-C war bevorzugt in den mvK lokalisiert.
9. Ein bevorzugtes Labelling für SP-B zeigte sich in den neugeborenen Ratten nur in den multivesikulären Körpern. Mit zunehmender Größe und Volumenfraktion war das Labelling auch in den Lamellenkörper spezifisch.
Die Untersuchungen zeigten, dass bei Ratten die postnatale Ausreifung der Lunge mit charakteristischen Veränderungen im Surfactantsystem einhergeht. Diese Veränderungen können 1. nur mit der Alveolarisierung verbunden sein wie die reversible Größenabnahme der Alveolarepithelzellen Typ II, 2. direkt auch mit der postnatalen Entwicklung korrelieren wie Größe und Volumenfraktion der Lamellenkörper und absolute Phospholipidkonzentrationen, 3. mit der postnatalen Entwicklung invers korrelieren wie die Volumenfraktion des Zellkerns und relative Anteile der inaktiven Surfactantkomponenten.
Die in dieser Arbeit vorgestellten Ergebnisse über Veränderungen des Surfactantsystems in Abhängigkeit von der Alveolarisierung stellen im Hinblick auf die klinische Relevanz des Respiratory Distress Syndrom - hervorgerufen u. a. durch Surfactantmangel - und der Bronchopulmonalen Dysplasie, einer Erkrankung mit gestörter postnataler Alveolarisierung, ein wichtiges Bindeglied zwischen Grundlagen- und klinischer Forschung dar.
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Publikation 1
Publikation 2
7. Danksagung
Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. R. Pabst für die wohlwollende und großzügige Unterstützung sowie für die wertvollen Ratschläge und konstruktive Kritik. Zudem trugen seine Ermutigungen entscheidend zur Vollendung dieser Arbeit bei.
Herrn Prof. Dr. Dr. W. Bernhard danke ich für die Durchführung der biochemischen Untersuchungen und für seine konstruktiven Beiträge bei der Durchsicht des Manuskripts für die Publikation 1. Außerdem führten wir zusammen die tierexperimentellen Untersuchungen durch.
Herrn Prof. Dr. M. Ochs danke ich für die Einweisung in die quantitative Immunelektronenmikoskopie und für seine konstruktive Kritik bei der Durchsicht des Manuskripts zur Publikation 2.
Herrn Prof. Dr. F. Brasch danke ich für die Etablierung und Einweisung in die Labelling- Technik für Surfactantproteine und für seine substantiellen Beiträge bei der Durchsicht des Manuskripts der Publikation 2.
Herrn Dr. C. Mühlfeld danke ich für die Unterstützung bei der Lungenentnahme, Fixierung und Probengewinnung und der Dokumentation und für seine konstruktive Kritik bei der Durchsicht beider Manuskripte.
Dr. G. Vieten und Dr. G. Johnen sei für die Durchführung der Western Blots gedankt.
Für die technische Assistenz möchte ich mich bei Frau C. Acevedo, Frau M. Hanke, Frau H.
Hühn, Frau V.S. Müller, Frau B. Philippens und Frau D. von Meyersbach bedanken.
Erklärung nach § 2 Abs. 2Nrn. 5 und 6
Ich erkläre, dass ich die in der Medizinischen Hochschule Hannover zur Promotion eingereichte Dissertation mit dem Titel „ Das Surfactantsystem der Lunge in der postnatalen Entwicklung der Ratte“ in der Abteilung Funktionelle und Angewandte Anatomie des Zentrums Anatomie unter der Betreuung von Herrn Prof. Dr. R. Pabst ohne sonstige Hilfe durchgeführt und bei der Abfassung der Dissertation keine anderen als die dort aufgeführten Hilfsmittel benutzt habe.
Ich habe diese Dissertation bisher an keiner in- oder ausländischen Hochschule zur Prompotion eingereicht. Weiterhin versichere ich, dass ich den beantragten Titel bisher noch nicht erworben habe.
Ergebnisse der Dissertation wurden in folgenden Publikationsorganen „ Pediatr Pulmonol und Histochem Cell Biol“ veröffentlicht.
Hannover, den 16.05.2007
