2. Ergebnisse 5
2.4. Korrelation morphologischer und biochemischer Veränderungen 6
Die Volumenfraktion der Lk und der Phospholipid-Gewebegehalt zeigten unabhängig von der postnatalen Entwicklung eine enge Korrelation (Publ. 1, Abb. 6B).
Der relative Anteil des intraalveolären Surfactant korrelierte ebenfalls sehr eng mit dem Phospholipidgehalt in der BAL (Publ. 1, Abb. 6A).
Der SP-A Gehalt in der BAL und der Anteil an tM wiesen eine sehr enge Beziehung auf (Publ. 1, Abb. 6D).
2.5. Intrazelluläre Verteilung der Surfactantproteine
Mittels der Bestimmung des relativen spezifischen Labelling Index (RLI) und der χ2-Werte wurde geprüft, ob die Verteilung des Labelling der SP signifikant und kompartimentspezifisch ist. Ein Kompartiment weist ein bevorzugtes Labelling auf, wenn sein RLI > 1 und sein partieller χ2-Wert mit mehr als 10% zum gesamten χ2-Wert beiträgt (Publ. 2, Tab. 3).
Die ermittelten Werte zeigten eine nicht zufällige Verteilung der an Antikörper gebundenen Goldpartikel in den AE II.
SP-A war vor, gegen Ende und nach Abschluß der Lungenreifung überwiegend in schmalen, meist von einer Membran umgebenen Vesikeln, am rER und in mvK lokalisiert (Publ. 2, Abb.
2a, b). Lk enthielten nur wenig SP-A. Nur das Zytoplasma (rER, mvK, kleine Vesikel) zeigte ein signifikant bevorzugtes Labelling für SP-A (Publ. 2, Tab. 2).
Nach der Alveolarisierung fand sich ein signifikantes spezifisches SP-B Labelling über den Lk und den mvK (Publ. 2, Abb. 3a-b). Das SP-B Labelling über den anderen subzellulären Kompartimenten war nicht signifikant. Lk in AE II neugeborener Ratten wiesen nur ein
schwaches, nicht signifikantes Labelling auf (Publ. 2, Abb. 3c, Tab. 3). SP-B war in den neugeborenen Ratten nur in den mvK signifikant und spezifisch verteilt (Tab. 3).
Für proSP-C fand sich ein hochsignifikantes sehr starkes spezifisches Labelling in den mvK vor und nach Alveolarisierung (Publ. 2, Tab. 4). Einige Goldpartikel wiesen auch die Lk und die cb auf (Publ. 2, Abb. 4b), allerdings ohne signifikanten Verteilungsindex (Tab. 4).
Unabhängig von der postnatalen Entwicklung war das SP-D Labelling nur schwach ausgeprägt. Goldpartikel zeigten sich hauptsächlich im Zytoplasma am rER, in kleinen Vesikeln und in mvK (Publ. 2, Abb. 5). Das SP-D Labelling in diesem Kompartiment war spezifisch.
3. Diskussion
3.1. Methodenkritik
Klinische und tierexperimentelle Untersuchungen zum Surfactantsystem erfolgen überwiegend an Surfactantmaterial, welches mittels BAL aus den terminalen Luftwegen gewonnen wurde. Denn die BAL ist die einfachste und vor allem beim Menschen praktikabelste Methode zur Beurteilung des alveolären Surfactant. Die BAL erlaubt jedoch keine hinreichend genauen Aussagen über Lokalisation und Verteilungsmuster des Surfactant.
Die einzige Möglichkeit, die Lokalisation und mögliche Abweichungen vom physiologischen Verteilungsmuster des intrazellulären und intraalveolären Surfactant in situ zu beurteilen - ohne seine Mikroorganisation zu verändern - ist eine Perfusionsfixierung der Lunge („fixation from behind“) (Gil, 1971), wie sie in Publikation 1 durchgeführt wurde. Die Voraussetzung für die anschließende ultrastrukturelle Beurteilung sind besondere Methoden zur Erhaltung und Darstellung der empfindlichen Surfactantkomponenten (Fehrenbach, 1998, Schmiedl et al., 2003).
In dieser Arbeit wurde ein elektronenmikroskopischer Ansatz in Verbindung mit morphometrischen und stereologischen Analysen gewählt, um die Veränderungen im Surfactantsystem während der Alveolarisierung zu erfassen und diese mit biochemischen Parametern zu korrelieren. Als Morphometrie werden quantitative Methoden in der Strukturforschung bezeichnet. Bei der Quantifizierung in der Mikroskopie - insbesondere der Elektronenmikroskopie - muss berücksichtigt werden, dass die untersuchte Probenmenge im Vergleich zum Organ, welches untersucht wird, extrem klein ist und dass die dreidimensionale Struktur durch zweidimensionale Ultradünnschnitte bedingt ist. Die Stereologie bietet die Möglichkeit, an diesen zweidimensionalen Objekten dreidimensionale Bestimmungen durchzuführen. Sofern bei der Probengewinnung und Auswertung bestimmte Zufallskriterien eingehalten werden und Vorzugsrichtungen vermieden werden, sind mit diesen Methoden Aussagen u. a. über Volumen, Größe und Oberfläche möglich (Cruz-Orive& Weibel, 1990, Howard CV, 1998, Ochs, 2006). Da Ultradünnschnitte nur einen sehr kleinen Teil einer Probe und diese wiederum nur einen Teil des Organs repräsentieren, ist ein systematisches zufälliges Sampling notwendig (Cruz-Orive& Weibel, 1990). Hierdurch erhält im Idealfall jeder Teil und jede Orientierung des Organs sowie der Probe und des Schnitts die gleiche Chance zur Auswertung ausgewählt zu werden (Cruz-Orive& Weibel, 1990, Mayhew et al., 2002).
Mittels konventioneller Transmissionselektronenmikroskopie lassen sich jedoch nur die Lipidkomponenten des Surfactant beurteilen. Das hier verwendete Protokoll zur Aufarbeitung der Proben (chemische Fixierung und Kryosubstitution, Einbettung in Lowicryl bei niedrigen Temperaturen; siehe Publ. 2) für die Immunelektronenmikroskopie ist ein guter Kompromiss zwischen Erhaltung der Ultrastruktur der Surfactantkomponenten und Erhaltung der Antigenität (Griffiths, 1993). Der Nachweis der SP erfolgte über eine indirekte Immunogoldmarkierung. Hierbei wurden zunächst die SP mit einem SP-spezifischen primären Antikörper markiert. Als Detektionssystem wurde dann ein Sekundärantikörper, der mit Gold konjugiert war gewählt (siehe Publ. 2). Entsprechend geben die Goldpartikel die Verteilung der SP wieder. Die in dieser Arbeit durchgeführte Quantifizierung des Immunogold-Labellings ermöglicht Aussagen über die Art der Verteilung und die Spezifität des Labellings (Mayhew et al., 2003, Mayhew et al., 2002). Der in dieser Arbeit bestimmte RLI (Relative Labelling Index; Publ. 2) basiert auf dem Vergleich der aktuellen beobachteten Verteilung mit der erwarteten Verteilung der Goldpartikel (siehe Publ. 2). Ein Kompartiment zeigt ein bevorzugtes Labelling, wenn sein RLI >1 ist und sein partieller χ2 – Wert einen signifikanten Beitrag zum Gesamt χ2 – Wert liefert (Mayhew et al., 2003).
3.2. Postnatale Veränderungen des intrazellulären und sezernierten Surfactant in Abhängigkeit von der Alveolarisierung
Die Ausreifung der Säugerlunge umfasst zum einen die Alveolarisierung und damit Vergrößerung der Gasaustauschfläche zum anderen die Bildung von Surfactant. Beide Reifungsprozesse sind für die postnatale Funktion der Lunge von entscheidender Bedeutung.
Entsprechend entstehen bei verminderter Ausreifung verschiedene Krankheitsbilder bei Neugeborenen (Chess et al., 2006, Clements& Avery, 1998). Die Ratte eignet sich für die Untersuchung des Surfactant in Abhängigkeit von der Alveolarisierung besonders, da sich die unreifen Lungen neugeborener Ratten noch in der sacculären Phase befinden. Der Reifegrad dieser Lungen entspricht somit demjenigen humaner Lungen in der 28. pränatalen Woche (Burri, 2006, Jobe& Ikegami, 2001).
Die Surfactantbildung beginnt pränatal zu einem Zeitpunkt, bei dem 80% der Tragzeit bereits vorüber sind. Einen normalen Geburtstermin vorausgesetzt, weisen alle Säuger ein intaktes Surfactant auf (Lin& Lechner, 1990).
Die Ergebnisse zeigen bedeutende morphologische und biochemische Unterschiede im Surfactantsystem, die teilweise mit der Alveolarisierung korrelieren. So nimmt das mittels stereologischer Parameter bestimmte Volumen der Lk und die Größe der Lk während der
Alveolarisierung kontinuierlich zu (siehe Publ. 1). Entsprechend erhöht sich der Phospholipid-Pool im Gewebe. Aufgrund der gleichzeitigen Zunahme des Körpergewichts vermindert sich das spezifische Lungenvolumen und der Phospholipid-Gewebegehalt pro Körpergewicht (Publ. 1, Tab. 5B). Die Größe der AE II ist vor und nach der Alveolarisierung nahezu gleich, zeigt jedoch während der Alveolarisierung eine Abnahme um bis zu 21%.
Andererseits nimmt das absolute Volumen der AE II kontinuierlich zu. Ursache dieser Größenabnahme bei gleichzeitiger Zunahme des Gesamtvolumens könnte eine vermehrte Proliferation der AE II und Umwandlung in AE I während der Ausbildung der Alveolen sein.
Hierdurch wären bedeutend mehr neu gebildete und damit kleinere AE II in dieser Phase zu finden.
Der morphometrisch wie auch biochemisch ermittelte sezernierte Surfactantpool ist vor Beginn der Alveolarisierung am höchsten und nimmt während der Alveolarisierung ab. Ein Grund hierfür könnte die von anderen Autoren beschriebene Vergrößerung der Oberfläche während der Alveolarisierung - insbesondere durch Einziehen neuer Septen und die Verkleinerung der Lufträume (Burri, 2006) - sein. Diese Daten sind vergleichbar mit solchen von Kindern vor und nach Ende der Lungenreifung (Mander et al., 2002).
Die ermittelte enge Beziehung zwischen den inaktiven intrasacculären bzw. intraavleolären Surfatcantkomponenten (ulV) lässt einen Einfluß der Respirationsrate auf die Konversion von sezernierten Surfactant vermuten. Die enge Korrelation zwischen dem Anstieg sezernierter aktiver Surfactantkomponenten (tM) und dem SP-A-Gehalt in der BAL-Flüssigkeit während der postnatalen Lungenreifung stimmt mit Befunden anderer Autoren überein, die zeigen konnten, dass für die Bildung und Stabilisierung des tM SP-A notwendig ist (Ikegami et al., 2000, Palaniyar et al., 1999). Der niedrige SP-A Gehalt in der BAL neugeborener Ratten könnte mit der verzögerten Bildung der Alveolen zusammenhängen. So entsprechen die SP-A Konzentrationen in neugeborenen Ratten denen von frühgeborenen Kindern. Andererseits findet sich in Vogellungen, die keine Alveolen ausbilden, weder tM noch SP-A (Bernhard et al., 2004). Zudem zeigen SP-A knockout Mäuse keine Veränderungen in der Surfactantaktivität und keine respiratorische Insuffizienz (Ikegami et al., 1998). Somit scheint ein im Vergleich zu anderen Säugern niedriger SP-A Gehalt in neugeborenen Ratten keinen unmittelbaren Einfluss auf die Surfactantfunktion zu haben (Publ. 1).
3.3. Postnatale Verteilung der Surfactantproteine
Mit Hilfe quantitativer Immunelektronenmikroskopie konnte gezeigt werden, dass sich die Kompartiment-spezifischen Verteilungen der SP-A, SP-D und SP-C während der postnatalen
Entwicklung nicht ändern. Unabhängig von der postnatalen Entwicklung sind die hydrophilen SP bevorzugt am rER, Golgi-Apparat sowie in schmalen zytoplasmatischen Vesikeln und mvK lokalisiert (siehe Publ. 2). Diese Ergebnisse decken sich mit dem Konzept der Lk unabhängigen Sekretion der hydrophoben SP (Hawgood& Poulain, 2001). Die Bestimmung des RLI in der humanen Lunge ergab eine schwache, aber spezifische Verteilung von SP-A - auch in den Lk (Ochs et al., 2002). Es handelt sich hierbei vor allem um wieder aufgenommenes SP-A (Kalina et al., 1993, McCormack& Whitsett, 2002, Osanai et al., 1998). In Rattenlungen war dieser geringe Anteil von SPA in den Lk zwar qualitativ sichtbar, zeigte allerdings im Gegensatz zur humanen Lunge (Ochs et al., 2002) keine signifikanten RLI-Werte. Eine verminderte Antigenität des SP-A und damit eine geringere Detektion durch den SP-A Antikörper in den Lk könnte durch stärkeren strukturellen Umbau des hydrophilen Proteins in den hydrophoben azidophilen Lk bedingt sein (Publ. 2). Denn Western Blot Analysen zeigten SP-A auch in aus Rattenlungen isolierten Lk (Publ. 2, Abb. 6). Die hochsignifikante spezifische Verteilung von proSP-C im rER, Golgi-Apparat und den mvK und nicht in den Lk unterstützt die These, dass die Prozessierung zum reifen SP-C mit der Bildung von zusammen gesetzten Körpern (cb) nahezu abgeschlossen ist und daher die aus den cb hervorgehenden Lk überwiegend reifes SP-C enthalten (Beers& Mulugeta, 2004, Guttentag et al., 2003) vgl. auch Publ. 2).
Das Labelling von SP-B ist vor der Alveolarisierung in den Lk nur sehr gering und statistisch nicht signifikant. Dies bestätigen auch biochemische Analysen, die nur einen geringen SP-B Gehalt in neugeborenen Rattenlungen nachweisen konnten (Stahlman et al., 1992). Mit zunehmender Volumenfraktion und Größe der Lk gegen Ende und nach der Alveolarisierung findet sich dann auch ein signifikantes bevorzugtes SP-B Labelling in den Lk (Publ. 2, Tab. 1, 3). Die spezifische Verteilung von SP-B in mvK und Lk unabhängig von der postnatalen Entwicklung stützt das Konzept, dass das Processing von proSP-B zu reifem SP-B bereits in den mvK erfolgt. Reifes SP-B wird anschließend durch Fusion von mvK mit den Lk zu cb aufgenommen (Publ 2). Somit ist anzunehmen, dass SP-B für die Bildung ausgereifter Lk mitverantwortlich ist (Brasch et al., 2004, Guttentag et al., 2003).
4. Zusammenfassung
Pulmonales Surfactant erniedrigt die Oberflächenspannung in den distalen Atemwegen. Ein intaktes Surfactantsystem ist die Voraussetzung für die Atemfunktion nach der Geburt. Ratten werden mit unreifen Lungen geboren, denn in der Rattenlunge beginnt die Alveolarisierung erst postnatal. Somit eignen sich Ratten sehr gut zur Untersuchung des Surfactantsystems während der Ausreifung der Lunge. In dieser Arbeit sollte die Hypothese bestätigt werden, dass die Alveolarisierung mit charakteristischen strukturellen und biochemischen Veränderungen des Surfactant einhergeht.
Das Surfactantsystem wurde vor der Alveolarisierung (einen Tag alte Ratten), während der Alveolarisierung (sieben Tage alte Ratten), gegen Ende der Alveolarisierung (14 Tage alte Ratten) und in reifen Lungen (42 Tage alte Ratten) untersucht. Die strukturellen Komponenten der Lipide des intrazellulären und sezernierten Surfactantpools wurden mittels Elektronenmikroskopie und Morphometrie bzw. Stereologie bestimmt. Die Quantifizierung der Phospholipide erfolgte mit biochemischen Methoden. Die quantitative Immunelektronenmikroskopie wurde angewendet, um die intrazelluläre Verteilung der Surfactantproteine zu ermitteln. Hierbei gab die Bestimmung des relativen Labelling Index (RLI) Auskunft darüber, ob die Verteilung der SP nicht zufällig und Kompartiment-spezifisch ist. Zudem wurde der Western Blot zur Bestimmung des intrazellulären SP-A und des SP-A aus der Bronchoalveolären Lavage angewendet.
Die Ergebnisse lassen sich wie folgt zusammenfassen:
1. Die Alveolarepithelzellen Typ II sind vor und nach Alveolarisierung ähnlich groß, werden jedoch während der Alveolarisierung kleiner. Das absolute Volumen der Alveolarepithelzellen Typ II steigt kontinuierlich an und ist nach 14 Tagen signifikant erhöht.
2. Die Volumenfraktion und das absolute Volumen der Lamellenkörper nahmen kontinuierlich zu. Gegen Ende der Alveolarisierung war nicht nur das Volumen sondern auch die Größe der Lamellenkörper signifkant erhöht.
3. Die Volumenfraktion der Lamellenkörper korrelierte eng mit dem Gewebegehalt der Phospholipide.
4. Sezerniertes Surfactant zeigte einen Tag nach Geburt die morphometrisch und biochemisch ermittelten höchsten Werte. Während der Alveolarisierung nahm der sezernierte Surfactantpool ab und war in den ausgereiften Lungen wieder erhöht, ohne die Werte für die einen Tag alten Ratten zu erreichen.
5. Der relative Anteil der aktiven Vorstufe des Oberflächenfilms (tubuläres Myelin) zeigte am ersten postnatalen Tag höhere Werte als während der Alveolarisierung. In 14 und 42 Tage alten Ratten nahmen die Werte signifikant zu.
6. Der SP-A Gehalt in der Bronchoalveolären Lavage korrelierte signifikant mit den relativen Anteilen des tubulären Myelins.
7. Der prozentuale Anteil der unilamellären Vesikel zeigte während der Alveolarisierung die höchsten Werte. Mit zunehmender Lungenreifung verminderte sich ihr Anteil. In den 42 Tage alten Ratten fanden sich signifikant niedrigere Werte.
8. Die intrazelluläre Verteilung der SP-A, SP-D und der Vorstufe von SP-C (proSP-C) wies eine Kompartiment-spezifische Verteilung unabhängig von der Alveolarisierung auf. So fand sich ein bevorzugtes zytoplasmatisches Labelling (rER, kleine Vesikel, mvK) für die hydrophilen SP-A und SP-D. ProSP-C war bevorzugt in den mvK lokalisiert.
9. Ein bevorzugtes Labelling für SP-B zeigte sich in den neugeborenen Ratten nur in den multivesikulären Körpern. Mit zunehmender Größe und Volumenfraktion war das Labelling auch in den Lamellenkörper spezifisch.
Die Untersuchungen zeigten, dass bei Ratten die postnatale Ausreifung der Lunge mit charakteristischen Veränderungen im Surfactantsystem einhergeht. Diese Veränderungen können 1. nur mit der Alveolarisierung verbunden sein wie die reversible Größenabnahme der Alveolarepithelzellen Typ II, 2. direkt auch mit der postnatalen Entwicklung korrelieren wie Größe und Volumenfraktion der Lamellenkörper und absolute Phospholipidkonzentrationen, 3. mit der postnatalen Entwicklung invers korrelieren wie die Volumenfraktion des Zellkerns und relative Anteile der inaktiven Surfactantkomponenten.
Die in dieser Arbeit vorgestellten Ergebnisse über Veränderungen des Surfactantsystems in Abhängigkeit von der Alveolarisierung stellen im Hinblick auf die klinische Relevanz des Respiratory Distress Syndrom - hervorgerufen u. a. durch Surfactantmangel - und der Bronchopulmonalen Dysplasie, einer Erkrankung mit gestörter postnataler Alveolarisierung, ein wichtiges Bindeglied zwischen Grundlagen- und klinischer Forschung dar.
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