Aus der Abteilung für Gastroenterologie, Hepatologie und Endokrinologie der Medizinischen Hochschule Hannover
Myeloide Suppressorzellen inhibieren die Funktion von NK-Zellen bei Patienten mit hepatozellulärem Karzinom
DISSERTATION
zur Erlangung des Doktorgrades der Humanmedizin
(Dr. med.)
in der Medizinischen Hochschule Hannover
vorgelegt von
Torsten Voigtländer
aus Uelzen
Hannover 2009
Angenommen vom Senat der Medizinischen Hochschule Hannover am 21.04.2010
Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover Präsident: Prof. Dr. med. Bitter-Suermann
Betreuer: Prof. Dr. med. Tim Greten Referent: Prof. Dr. med. Georg Behrens Koreferent: Prof. Dr. Ludwig Wilkens Tag der mündlichen Prüfung: 21.04.2010 Promotionsausschussmitglieder:
Prof. Dr. Reinhold Ernst Schmidt Prof. Dr. Anke Schwarz
Prof. Dr. Bettina Wedi
meiner Familie und Helen
Inhaltsverzeichnis
Abbildungsverzeichnis ... III Tabellenverzeichnis... IV Abkürzungsverzeichnis ... V
1 Einleitung ... 1
1.1 Das hepatozelluläre Karzinom... 1
1.2 Therapie des hepatozellulären Karzinoms ... 3
1.3 Tumorimmunologie und Immuntherapie... 5
1.4 Natürliche Killerzellen... 8
1.5 Immunsuppressorzellen ... 11
1.5.1 Regulatorische T-Zellen ... 11
1.5.2 Myeloide Suppressorzellen ... 12
2 Zielsetzung... 15
3 Material und Methoden ... 16
3.1 Material... 16
3.1.1 Geräte und Utensilien ... 16
3.1.2 Verbrauchsmaterialien ... 17
3.1.3 Reagenzien ... 18
3.1.4 Medien und Puffer... 19
3.1.5 Antikörper... 21
3.1.6 Computer und Software ... 22
3.1.7 Statistische Auswertung... 22
3.2 Methoden... 23
3.2.1 Isolierung mononukleärer Zellen durch Dichtegradienten - Zentrifugation... 23
3.2.2 Bestimmung der Zellzahl... 24
3.2.3 Positive Selektion von CD14+ Zellen mit MicroBeads... 24
3.2.4 Durchflusszytometrie... 26
3.2.5 Zellsortierung ... 27
3.2.6 51Chrom-Zytotoxizitäts-Assay... 28
3.2.7 Kultur und Präparation der Targetzellen ... 29
3.2.8 Einfrieren und Auftauen von Zellen ... 30
3.2.9 Kokultivierung von CD14+HLA-DR-/low- und NK-Zellen ... 30
3.2.10 Enzymgekoppelter Immunabsorptionstest (ELISA)... 31
3.2.11 Transwell-Versuch ... 32
3.2.12 Untersuchung der Oberflächenmolekülexpression auf NK-Zellen nach Inkubation mit MDSC... 33
3.2.13 Inhibition der CD14+HLA-DR-/low- Zellen unter Einsatz klassischer MDSC-Inhibitoren ... 34
3.2.14 Versuch der Stimulation von CD14+HLA-DR-/low- Zellen mit LPS ... 34
4 Ergebnisse ... 35
4.1 Zellsortierung und Reanalyse... 35
4.2 Ermittlung der lytischen Kapazität von NK-Zellen gesunder Spender und HCC-Patienten ... 37
4.3 Ermittlung der lytischen Kapazität von NK-Zellen in Kokultur mit
CD14+HLA-DR-/low- Zellen von gesunden Spendern und HCC-Patienten... 39
4.4 Quantifizierung der IFN-γ Konzentration nach Kokultur von NK-Zellen und CD14+HLA-DR−/low- Zellen von gesunden Probanden... 42
4.5 Quantifizierung der IFN-γ Konzentration nach Kokultur von NK-Zellen und CD14+HLA-DR−/low- Zellen von HCC-Patienten ... 45
4.6 Quantifizierung der TNF-α Konzentration nach Kokultur von NK-Zellen und CD14+HLA-DR−/low- Zellen von gesunden Probanden und HCC-Patienten 47 4.7 Quantifizierung der IFN-γ Konzentration nach Kokultur von NK-Zellen und CD14+HLA-DR−/low- Zellen unter direktem Zellkontakt und separierten Bedingungen von gesunden Probanden ... 49
4.8 Bestimmung der Oberflächenmolekülexpression auf NK-Zellen nach Inkubation mit CD14+HLA-DR-/low- Zellen ... 52
4.9 Inhibition der CD14+HLA-DR-/low- Zellen unter Verwendung klassischer MDSC-Inhibitoren... 55
4.10 Stimulation der CD14+HLA-DR-/low- Zellen mit Lipopolysaccharid ... 58
5 Diskussion ... 60
5.1 Ermittlung der lytischen Kapazität von NK-Zellen gesunder Spender und HCC-Patienten ... 60
5.2 Ermittlung der lytischen Kapazität von NK-Zellen in Kokultur mit CD14+HLA-DR-/low- Zellen von gesunden Spendern und HCC-Patienten... 61
5.3 Quantifizierung der IFN-γ Konzentration nach Kokultur von NK-Zellen und CD14+HLA-DR−/low- Zellen von gesunden Probanden und HCC-Patienten 62 5.4 Quantifizierung der TNF-α Konzentration nach Kokultur von NK-Zellen und CD14+HLA-DR−/low- Zellen von gesunden Probanden und HCC-Patienten 64 5.5 Quantifizierung der IFN-γ Konzentration nach Kokultur von NK-Zellen und CD14+HLA-DR−/low- Zellen unter direktem Zellkontakt und separierten Bedingungen von gesunden Probanden ... 65
5.6 Bestimmung der Oberflächenmolekülexpression auf NK-Zellen nach Inkubation mit CD14+HLA-DR-/low- Zellen ... 67
5.7 Inhibition der CD14+HLA-DR-/low- Zellen unter Verwendung klassischer MDSC-Inhibitoren... 69
5.8 Stimulation der CD14+HLA-DR-/low- Zellen mit Lipopolysaccharid ... 70
5.9 Einordnung der Ergebnisse in einen wissenschaftlichen Zusammenhang. 71 6 Zusammenfassung... 75
7 Literaturverzeichnis ... 76
8 Anhang ... 83
8.1 Lebenslauf... 83
8.2 Eidesstattliche Erklärung... 84
8.3 Danksagung ... 85
8.4 Veröffentlichung der Dissertation ... 86
Abbildungsverzeichnis
Abb.1 Weltweite Mortalitätsraten des HCC, El-Serag et al. 1 Abb.2 NK-Zell-Effektormechanismen, Smyth et al. 28
Abb.3 Zellseparation mit CD14 MicroBeads, Miltenyi Biotec Abb.4 Prinzip eines ELISA, Bender MedSystems
Abb.5 Sortierung und Reanalyse der CD14+- Zellfraktion Abb.6 Sortierung und Reanalyse der CD14−- Zellfraktion
Abb.7 Zytotoxische Kapazität von NK-Zellen gesunder Probanden und HCC-Patienten
Abb.8 Zytotoxische Kapazität von NK-Zellen in Kokultur mit CD14+HLA-DR-/low- Zellen von gesunden Probanden und HCC-Patienten
Abb.9 Quantifizierung der IFN-γ Konzentration der Kokulturkonditionen bei gesunden Probanden
Abb.10 Quantifizierung der IFN-γ Konzentration der Kokulturkonditionen bei HCC-Patienten
Abb.11 Quantifizierung der TNF-α Konzentration der Kokulturkonditionen bei gesunden Probanden und HCC-Patienten
Abb.12 IFN-γ und TNF-α Konzentration unter regulärem Zellkontakt und separierten Bedingungen
Abb.13 NK-Zell-Oberflächenmolekülanalyse nach Kokultur
Abb.14 NK-Zell-Oberflächenmolekülanalyse nach Kokultur für NKp30 Abb.15 IFN-γ und TNF-α Konzentration nach Einsatz von MDSC-
Inhibitoren
Abb.16 IFN-γ bzw. TNF-α Konzentration nach LPS-Stimulation
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1 Verwendete Antikörper
Tabelle 2 Fluoreszenzfarbstoffe und ihre Charakteristika Tabelle 3 Inkubationsschema des Zytotoxizitäts-Assays
Tabelle 4 Kokulturschema von CD14+HLA-DR−/low- und NK-Zellen
Abkürzungsverzeichnis
1-MT 1-Methyltryptophan
7AAD 7-Amino-Actinomycin D
Abb Abbildung
ADCC Antikörper-abhängige zelluläre Zytotoxizität
AFP α-Fetoprotein
Ak Antikörper
APC Antigen-präsentierende Zelle
APC bei Ak: Allophyocyanin
BSA bovine serum albumin, Rinderserumalbumin
bspw. beispielsweise
bzw. beziehungsweise
C Celsius
CD cluster of differentiation
CO2 Kohlenstoffdioxid
CTLA-4 Zytotoxisches T-Lymphozyten Antigen 4
D Deutschland
DMEM Dulbecco's modified eagle medium
DMSO Dimethylsulfoxid
DNA Desoxyribonukleinsäure
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
ELISA enzyme linked immunosorbent assay
et al. und andere
FACS fluorescence activated cell sorting
FASL FAS Ligand
Fc fragment crystalline, c-terminales Fragment von Immunglobulinen
FCS Fötales Bovines Serum
FITC Fluoreszeinisothiocyanat
Foxp3 forkhead box P3
FSC forward scatter channel
g Gramm
GITR glukokortikoid-induzierter Tumor Nekrose Faktor Rezeptor
GM-CSF Granulozyten-Makrophagen Kolonie-stimulierender Faktor
h Stunden
HBV Hepatitis-B Virus
HCC hepatozelluläres Karzinom
HCV Hepatitis-C Virus
HLA Humane Leukozytenantigene
H2SO4 Schwefelsäure
IDO Indoleamine-2,3- Dioxygenase
IFN Interferon
Ig Immunglobulin
IL Interleukin
IU International unit
KIRs Killer Immunglobulin-ähnliche Rezeptoren
l Liter
LIRs Leukozyten-immunglobulinähnliche-Rezeptoren
L-NMMA L-NG-Monomethyl Arginin
L-NOHA N (Omega)-hydroxy-L-Arginin
LPS Lipopolysaccharid
µ mikro (x 10-6)
m milli (x 10-3)
MACS magnetic activated cell sorting
MBq Megabequerel
MDSC myeloid-derived suppressor cells, Myeloide Suppressorzellen
MHC major histocompatibility complex, Haupthistokompatibilitätskomplex
min Minuten
mM Millimolar
n = Anzahl der Einzelbeobachtungen
N Niederlande
NaCl Natriumchlorid
NaN3 Natriumazid
NCR Natürliche Zytotoxizitätsrezeptoren NKT-Zellen Natürliche Killer T-Zellen
NK-Zellen Natürliche Killerzellen
NO Stickstoffmonoxid
PBMC periphere mononukleäre Zellen
PBS phosphate buffered saline, Phosphat-gepufferte physiologische Kochsalzlösung
PE Phycoerythrin
PECy5 PhycoerythrinCy5
ROS reactive oxygen species, reaktive Sauerstoffspezies
rpm Umdrehungen pro Minute
RPMI Roswell Park Memorial Institute
RT Raumtemperatur
S Schweden
s siehe
sep. separiert
SSC side scatter channel
stim. stimuliert
TACE transarterielle Chemoembolisation
TCR T-Zell Rezeptor
TGF transforming growth factor
TIL Tumor-infiltrierende Lymphozyten
TNF Tumor Nekrose Faktor
TRAIL TNF abhängiger Apoptose-induzierender Ligand
Treg regulatorische T-Zelle
u.a. unter anderem
unstim. unstimuliert
v.a. vor allem
v / v Volumen pro Volumen
1 Einleitung
1.1 Das hepatozelluläre Karzinom
Das hepatozelluläre Karzinom (HCC) gehört zu den fünf häufigsten Karzinomen und stellt weltweit die dritthäufigste krebsbedingte Todesursache dar 1. Verschiedene epidemiologische Faktoren wie die ethnische Zugehörigkeit, das Alter, das Geschlecht sowie umweltbedingte Risikofaktoren beeinflussen die HCC-Entwicklung.
Jährlich werden mehr als 1000000 Neuerkrankungen diagnostiziert, wobei die Inzidenz global nicht gleichmäßig verteilt ist, sondern regional erhebliche Unterschiede aufweist. Europa und die USA zählen zu den Regionen mit vergleichsweise niedrigen Inzidenzraten, wohingegen weite Teile Afrikas und Ostasiens erheblich stärker betroffen sind 2. Dies spiegelt sich in den Mortalitätsraten wider.
Abb. 1: Altersangepasste Mortalitätsraten des HCC nach El-Serag et al. 20071. Die Raten sind pro 100000 Personen angegeben.
Ursächlich für das Verteilungsmuster ist die hohe Prävalenz an chronischer Hepatitis-B-Virus-Infektion in den Hochrisikoländern und die enge Korrelation der Erkrankung mit der HCC-Entwicklung 3. Obwohl in den letzten Jahren in einigen Hochinzidenzregionen die Raten rückläufig sind, nimmt weltweit insbesondere in industrialisierten Ländern die Erkrankungshäufigkeit zu 4. Diese Entwicklung wird vorrangig durch die Zunahme der chronischen Hepatitis-C-Virus-Infektion bedingt, wobei Männer etwa 3-4-fach häufiger betroffen sind als Frauen. Der Erkrankungsgipfel liegt bei 75-80 Jahren, jedoch zeigen sich die größten Zuwachsraten bei jüngeren Patientengruppen 5. Im Gegensatz zur HBV-Infektion liegt für die HCV-Infektion bislang kein Impfstoff zur Immunisierung vor, was die Notwendigkeit der Primärprävention unterstreicht.
Die Entstehung des HCC ist im Allgemeinen das Endstadium einer typischerweise asymptomatisch verlaufenden chronischen Lebererkrankung. Der Prozess beginnt meist mit einer unerkannten akuten bis subakuten Leberschädigung, die allmählich über eine Fibrosierung zur Leberzirrhose fortschreitet 6. Die Leberzirrhose stellt den primären Risikofaktor dar, da weltweit 80 % aller HCCs in zirrhotischen Lebern diagnostiziert werden 7. Der chronische Schädigungsprozess führt zu vermehrtem Zelluntergang und stimuliert konsekutiv die Regeneration der Hepatozyten. Die erhöhte Zellteilungsrate begünstigt die Akkumulation von Mutationen, die eine maligne Entartung nach sich ziehen kann. Neben den viralen Hepatitiden zählen der chronische Alkoholabusus, die nicht-alkoholische Leberschädigung sowie hereditäre Erkrankungen wie der alpha-1-Antitrypsinmangel bzw. die Hämochromatose zu den Risikofaktoren der Hepatokarzinogenese. Ein weiterer Faktor ist die Ingestion von Aflatoxin B1. Es handelt sich um ein chemisches Kanzerogen, welches von Aspergillen in feucht warmer Umgebung produziert wird und zu einer charakteristischen Mutation im p53 Tumorsuppressorgen führt 8.
Die infauste Prognose des HCC erklärt sich durch die wenig ausgeprägte und unspezifische Klinik, die eine frühzeitige Diagnose des Malignoms erschwert. Die Überlebensrate beträgt bspw. 3-5 % in den USA und Entwicklungsländern 9. Wegweisend kann eine Hepato- bzw. Hepatosplenomegalie mit Aszites und Ikterus sein. Laborchemisch zeigen sich unspezifische Zeichen des chronischen Leberzellschadens mit eventueller Erhöhung des Tumormarkers α-Fetoprotein. Als
Komplikation der Leberzirrhose kann es zur hepatischen Enzephalopathie und Varizenblutung, infolge des erhöhten portalvenösen Druckes, kommen. Ungewollter Gewichtsverlust, Anorexie sowie Übelkeit und Erbrechen sind ebenfalls vorkommende unspezifische Symptome, die v.a. bei nicht-zirrhotischen Patienten imponieren. Die ausgeprägtere hepatische Reserve erlaubt ein längeres klinisch inapparentes Tumorwachstum, das häufig durch tumorbedingte Komplikationen auffällig wird. Extrahepatische Manifestationen des HCC umfassen paraneoplastische Syndrome sowie die hämato- und lymphogene Metastasierung, vorzugsweise in die Lungen und Knochen 10.
1.2 Therapie des hepatozellulären Karzinoms
Im Gegensatz zu anderen Tumoren ist die Prognose des HCC nicht alleine vom Tumorstadium abhängig, sondern wird erheblich von der in den meisten Fällen zugrunde liegenden Leberzirrhose beeinflusst. Dementsprechend wurden verschiedene Klassifikationssysteme entwickelt, die neben dem Tumorstadium die Leberfunktion berücksichtigen. Hierzu zählt die Okuda-Klassifikation des HCC, die die Tumorausdehnung, das Vorhandensein von Aszites sowie die Serumkonzentration an Albumin und Bilirubin einschließt. Der CLIP-Score (Cancer of the Liver Italian Groupe Programme) zur Stadienerfassung des HCC beinhaltet die Klassifikation der Leberzirrhose nach Child-Pugh, die Tumorausdehnung, den AFP-Spiegel sowie das etwaige Vorhandensein einer Portalvenenthrombose. Die BCLC-Kriterien (Barcelona-Clinic-Liver-Cancer) zur Definition des HCC-Tumorstadiums berücksichtigen den Allgemeinzustand der Patienten, die Tumorausdehnung, die Leberfunktion und die Einteilung der Patienten gemäß Okuda-Klassifikation. Bisher wird jedoch keines der vorhandenen Systeme universell angewandt 11.
Als kurative chirurgische Therapieoptionen kommen die Resektion der Herde und die Lebertransplantation in Betracht. In westlichen Industrienationen wird die Erkrankung durch die diskrete Klinik häufig in einem fortgeschrittenen Stadium diagnostiziert, sodass weniger als 5 % des Patientenkollektivs einer chirurgischen Intervention
zugänglich sind. Die Transplantation stellt hierbei das optimale Therapiekonzept dar, da neben der Malignomentfernung die häufig vorhandene Leberzirrhose mittherapiert wird 12. Zur Auswahl geeigneter Transplantatempfänger gelten die Milan-Kriterien, die die Anzahl und Größe der Leberherde einschließen. Eine Resektion des HCC ist nur bei ausreichender hepatischer Restfunktion möglich.
Eine weitere Modalität stellen die perkutanen Therapieverfahren dar, die bei rechtzeitiger Diagnose des HCCs ebenfalls kurativ eingesetzt werden können. Es handelt sich um bildgestützte tumorabladierende Techniken unter Verwendung von Chemikalien oder Wärme. Sie stellen derzeit die beste Therapieoption für chirurgisch nicht behandelbare HCCs dar 13. Einzelne noduläre Herde kleiner als 5 cm sowie bis zu 3 Herde, jeweils kleiner als 3 cm, werden als Indikation allgemein akzeptiert. Die Ergebnisse zeigen, dass bis zu 90 % der Tumoren kleiner als 2 cm durch perkutane Verfahren abladiert werden können 14. Die Ethanolinjektion wird derzeit, aufgrund der relativ geringen Kosten und des günstigen Risikoprofils, am häufigsten genutzt.
Daneben besteht die Möglichkeit Tumorgewebe mittels Radiofrequenzen, Mikrowellen, Lasern oder Kälteapplikation zu eliminieren.
Zur Therapie großer nicht resezierbarer HCC kommt die transarterielle Chemoembolisation (TACE) zum Einsatz. Es handelt sich um ein Verfahren, bei dem ein Chemotherapeutikum direkt über eine tumorversorgende Arterie injiziert und anschließend eine Embolisation des Gefäßes hervorgerufen wird. Die erzeugte Ischämie verstärkt die antitumorale Wirkung des Chemoterapeutikums. Insbesondere Patienten mit guter Leberfunktion (Child-Pugh A) und asymptomatischen multilokulären Tumoren ohne Gefäßinvasion profitieren von diesem Ansatz 15. Weitere Anwendung findet die TACE als adjuvante Therapie nach erfolgter Resektion und zur „bridging“-Therapie vor einer Lebertransplantation, wobei für diese Indikation wenige verlässliche Daten vorliegen 12. Die lokale Strahlentherapie des HCC bleibt bisher Einzelfällen vorbehalten.
Der Einsatz konventioneller Chemotherapeutika zur systemischen Therapie des HCC zeigt nur geringe Ansprechraten bei hohem Nebenwirkungsprofil. Gewöhnlich gilt das HCC als chemoresistent 16. Erstmalig konnte jedoch unter Therapie mit Sorafenib,
einem neuen Multityrosinkinaseinhibitor, das Gesamtüberleben für Patienten mit fortgeschrittenem HCC von 7,9 auf 10,7 Monate verlängert werden 17.
1.3 Tumorimmunologie und Immuntherapie
Die Säulen der Neoplasiebehandlung bilden die chirurgische Resektion, die Chemotherapie und die Bestrahlung. Aufgrund der hohen Prävalenz an Tumorerkrankungen, den teils unbefriedigenden Therapieerfolgen und den ernsten Nebenwirkungen der Therapiestrategien, werden kontinuierlich neue Verfahren der Malignombekämpfung erprobt. In dieser Hinsicht sind v.a. die Fortschritte auf dem Gebiet der Immuntherapie hervorzuheben.
Prinzipiell ist das körpereigene Immunsystem in der Lage maligne Zellen zu erkennen und zu eliminieren. Schon Ende des neunzehnten Jahrhunderts entdeckte William B. Coley, ein Chirurg aus New York, eine mögliche Beziehung zwischen der Krebsentstehung und dem Immunsystem. Er bemerkte, dass einige Krebspatienten, die sich von einer bakteriellen Infektion der Haut erholten, eine Tumorregression aufwiesen. Zur Prüfung des Kausalzusammenhanges applizierte er Patienten mit Krebs im fortgeschrittenen Stadium lebende pyogene Bakterien in die Haut. Nach Abklingen der resultierenden Infektion konnte er eine erhebliche Tumorregression und ein verlängertes Überleben beobachten. Nach weiterer Pionierarbeit und Beobachtungen entstand Mitte des zwanzigsten Jahrhunderts die Immunüberwachungs-Hypothese. Sie postuliert eine Überwachungsfunktion des Immunsystems mit Elimination entarteter Zellen, die in ähnlicher Frequenz auftreten wie Infektionen mit pathogenen Erregern. Hierbei ermöglicht die Expression von tumorspezifischen Antigenen die Detektion und Beseitigung der Zellen. Ergebnisse neuerer Studien unterstützen mehr und mehr die Vermutungen, dass das Immunsystem eine entscheidende Rolle im Rahmen der Tumorkontrolle spielt. Eine retrospektive Analyse von 163 chirurgisch resezierten HCC hat gezeigt, dass eine Lymphozyteninfiltration des Tumors mit einer besseren Prognose korreliert 18. Andere Studien zeigen ebenfalls, dass die Immuntherapie in Zukunft eine potentielle therapeutische Option für HCC Patienten sein kann 19.
Immuntherapeutische Behandlungsverfahren beinhalten einerseits die nicht-spezifische Aktivierung des Immunsystems durch Zytokingabe, andererseits
antigen-spezifische Aktivierungen unter Verwendung autologer und allogener Tumorzellen, Peptiden, Proteinen und DNA-Vakzinen sowie tumor-spezifischer Antikörper 20. Man unterscheidet ferner aktive Immunisierung (Vakzination), bei der Zellen des angeborenen oder adaptiven Immunsystems in vivo stimuliert und amplifiziert werden, und adoptive Immuntherapie. Letztere beruht auf der in vitro Vermehrung und Verabreichung von Immunzellen. Bisher standen insbesondere die CD8+ T-Zellen im Zentrum immuntherapeutischer Behandlungsversuche. Die zytotoxischen T-Zellen können mit ihrem T-Zellrezeptor das für sie spezifische Peptid erkennen, sofern dieses mittels MHC Klasse I Molekülen präsentiert wird. Daneben werden kostimulatorische Signale benötigt. MHC Klasse I Moleküle präsentieren intrazellulär synthetisierte Proteine in Form kleiner prozessierter Aminosäureketten.
Im Rahmen von Tumorerkrankungen werden Proteine überexprimiert, liegen in mutierter Form vor oder sind viraler Genese und können somit eine Immunantwort generieren. Ein weiterer Aktivierungsweg zytotoxischer T-Zellen erfolgt über die zytokinvermittelte Stimulation durch CD4+ T-Zellen. CD4+ T-Zellen interagieren mit professionellen Antigen-präsentierenden Zellen. Diese können exogene Peptide aufnehmen, prozessieren und gekoppelt an MHC Klasse II Moleküle präsentieren.
Das Konzept der Vakzination wird dem des adoptiven T-Zelltransfers aus ökonomischen Gründen zumeist vorgezogen.
Effektorzellen des unspezifischen Immunsystems besitzen ebenfalls immuntherapeutisches Potential. Insbesondere für NK-Zellen ist seit längerer Zeit bekannt, dass sie spontan in vivo MHC Klasse I defiziente Tumorzellen und ihre Metastasen eliminieren können 21. Des Weiteren sind NK-Zellen einer der Hauptproduzenten von IFN-γ, welches pro-apoptotische und anti-proliferative Effekte auf Tumorzellen hat 22. Es wurde in Mausmodellen gezeigt, dass IFN-γ eine wichtige Rolle in der Abstoßung transplantierter Tumore sowie in der Prävention der primären Tumorentwicklung spielt 23, 24.
Schließlich rücken aktuell die Immunsuppressorzellen vermehrt in den Fokus der Forschung. Die Blockade der immunsuppressiven Aktivität regulatorischer T-Zellen
und myeloider Suppressorzellen zur Generierung einer effektiveren Tumorimmunität könnte in Zukunft die Tumortherapie unterstützen 25,26.
1.4 Natürliche Killerzellen
Natürliche Killerzellen (NK-Zellen) sind Effektorzellen des unspezifischen, angeborenen Immunsystems. Ihr Anteil beträgt ca. 10 % aller im Blut zirkulierenden Lymphozyten. Phänotypisch sind NK-Zellen durch die Expression von CD56 und das
Fehlen von CD3 charakterisiert. Man unterscheidet zwei verschiedene NK-Populationen, anhand der Expressionsdichte von CD56. Die Mehrheit der
NK-Zellen (ca. 90 %) exprimieren geringe CD56 Level, sind CD16 positiv und werden als CD56dim bezeichnet. Im Gegensatz dazu weisen die CD56bright Zellen eine höhere CD56 Dichte auf und sind für CD16 negativ. Sie verfügen über eine geringere natürliche Zytotoxizität, produzieren jedoch mehr proinflammatorische Zytokine.
Hierzu zählen IFN-γ, TNF-α, TNF-β, IL-10, IL-13 und GM-CSF 27. NK-Zellen sind in der Lage, eine Vielzahl an Zielzellen spontan, ohne vorangegangene Sensibilisierung zu eliminieren. Sie sind von fundamentaler Bedeutung für die Auseinandersetzung mit virusinfizierten- und maligne transformierten Zellen. NK-Zellen verfügen nicht über rearrangierte, antigen-spezifische Rezeptoren wie beispielsweise B- und T-Lymphozyten, sondern erkennen ihre Zielzellen über inhibitorische und aktivierende Rezeptoren. Die Balance der entgegengesetzten Signale, hervorgerufen durch Bindung der Liganden an die verschiedenen Rezeptoren, bestimmt die resultierende biologische Antwort. Die inhibitorischen Rezeptoren der NK-Zellen
kontrollieren den Expressionsstatus der MHC Klasse I Moleküle (missing-self-Hypothese). Die regelrechte Bindung der inhibitorischen Rezeptoren an
die Moleküle führt zur Inhibition, sodass die NK-Zellen die gebundenen Zellen nicht lysieren können. Im Falle einer Herunterregulierung oder abberanten MHC Klasse I Molekülexpression, was häufig bei tumorösen oder virusinfizierten Zellen vorkommt, wird die Inhibition aufgehoben und das überwiegende aktivierende Potential führt zur Lyse der betroffenen Zelle.
Die hemmenden Rezeptoren können drei Hauptgruppen zugeordnet werden: Killer
Immunglobulin-ähnliche Rezeptoren (KIRs), Lectin-ähnliche Rezeptoren CD94 / NKG2A und „Leukozyten-immunglobulinähnliche-Rezeptoren“ (LIR). Die KIRs
erkennen verschiedene Allele von HLA-A, -B und -C. Die LIRs weisen ein breiteres
Spektrum auf und binden diverse MHC Klasse I Moleküle, wohingegen CD94 / NKG2A mit dem nicht-klassischen HLA-E interagiert 28.
Die wichtigsten aktivierenden Rezeptoren gehören zwei Gruppen an. NKp30, NKp44 und NKp46 sind natürliche Zytotoxizitätsrezeptoren, die NK-spezifisch exprimiert werden. Sie sind verantwortlich für die Abtötung der meisten NK-sensiblen Tumorzell-Linien und ihre Oberflächendichte korreliert mit der Größe der zytolytischen Kapazität. Die genauen Rezeptorliganden sind noch nicht bekannt.
NKG2D ist ein aktivierender Rezeptor, der auf zytotoxischen Zellen des angeborenen und adaptiven Immunsystems lokalisiert ist. NKG2D erkennt definierte Antigene, die auf abnormalen Zellen unter Stressbedingungen sowie primären und sekundären Tumoren induziert werden (induced-self-Hypothese). Daneben existieren noch zahlreiche kostimulatorische Moleküle, die an dem Aktivierungsprozess partizipieren.
NK-Zellen verfügen über mehrere Mechanismen, um ihre Zielzellen zu attackieren.
Die Exozytose von Perforin und Granzym enthaltenden Granula ist als Hauptweg der NK-Zell-vermittelten Apoptose anzusehen. Studien an Tiermodellen belegen, dass v.a. Perforin für die Zytotoxizität verantwortlich ist 29. Außerdem können NK-Zellen über zellmembrangebundene und sezernierte Zytokine der TNF Familie Apoptose induzieren. Dies bezeichnet man als Todesrezeptor-vermittelte Apoptose, wobei TNF, TNF abhängiger Apoptose-induzierender Ligand (TRAIL) und FAS Ligand (FASL) eine Rolle spielen 28. Die IFN-γ Produktion der NK-Zellen unterstützt neben den antitumorösen Wirkungen, die Effektorfunktionen des adaptiven Immunsystems, da diverse Zellen ihre MHC Klasse I und II Molekülexpression hochregulieren 28. Zudem unterstützt die IFN-γ Produktion die Todesrezeptor-vermittelte Apoptose, da es einerseits zu einer Herunterregulierung von antiapoptotischen Proteinen und andererseits zur vermehrten Synthese von Kaspasen kommt, welche essentiell für die Todesrezeptor-induzierte Apoptose sind. Ebenso können NK-Zellen über ihre niedrig-affinen FcγRΙΙΙ Rezeptoren (CD16) antikörperbeladene Zielzellen erkennen und lysieren, was man als Antikörper-abhängige zelluläre Zytotoxizität (ADCC) bezeichnet 30.
Abschließend ist festzustellen, dass NK-Zellen von immenser Bedeutung für die Immunhomöostase sind und ihre experimentelle in vivo Depletion in einer überaus schlechten Tumorkontrolle resultiert 31.
Abb.2: Schematische Darstellung der NK-Zell-Effektormechanismen nach Smyth et al.
2002 28.
Granula-Exozytose aktivierender
Rezeptor NK-Zelle
inhibitorischer
Rezeptor Tumorzellen Zelltod
Kaspase- abhängige und-
unabhängige Todeswege
Granula-Exozytose (Perforin, Granzym) Todesrezeptorweg
FASL
FAS (CD95) NK-Zelle
TRAIL
TRAILR (DR4 und DR5)
Tumorzellen Apoptose
IFN-γ
NK-Zelle IFN-γ
Zytotoxizität
Tumorzellen
Induktion von MHC Molekülen anti-angiogene Effekte
1.5 Immunsuppressorzellen
Obwohl zahlreiche immuntherapeutische Ansätze an Krebspatienten evaluiert wurden, bleiben die messbaren klinischen Erfolge limitiert. Neueste Ergebnisse deuten darauf hin, dass endogene regulatorische Zellen und suppressive myeloide Zellen einer der Hauptgründe für das Ausbleiben effektiver antitumoraler Immunantworten sein können.
Im folgenden Abschnitt sollen die einzelnen Immunsuppressorzell-Populationen näher betrachtet werden.
1.5.1 Regulatorische T-Zellen
Regulatorische T-Zellen (Tregs) können als T-Zellpopulation definiert werden, die Immunantworten unterdrücken können, indem sie die Aktivität anderer Zellen beeinflussen. Sie tragen zu peripheren Toleranzmechanismen bei und verhindern folglich die Entstehung von Autoimmunerkrankungen. Zu den bisher entdeckten Untergruppen regulatorischer T-Zellen gehören natürlich vorkommende CD4+CD25+ Tregs, antigen-induzierte Tr1 und Th3 Zellen, adaptiv-induzierte CD4+ Tregs, CD8+ Tregs und NKT regulatorische T-Zellen 32.
Die meisten Daten liegen bezüglich natürlich vorkommender CD4+CD25+ Tregs vor.
Diese Population differenziert unter normalen Bedingungen im Thymus zu einer reifen regulatorischen Zellfraktion und unterscheidet sich somit von den aus naiven CD4+ T-Zellen in der Peripherie entstehenden regulatorischen Zellen. Natürlich vorkommende CD4+CD25+ Tregs formen 5-10 % der peripheren CD4+ T-Zellen und exprimieren konstitutiv CD25, glukokortikoid-induzierten Tumor Nekrose Faktor Rezeptor (GITR), CTL Antigen 4 (CTLA-4) und den Transkriptionsfaktor Foxp3 33. Tregs liegen bei verschiedenen Tumorentitäten, u.a. beim HCC 34, im Blut und als TIL in erhöhter Anzahl vor und tragen zu einer schlechteren Prognose bei 35. Es konnte im Tiermodell gezeigt werden, dass die Entfernung der Tregs eine effektive antitumorale Immunantwort bei bestehenden Tumoren auslöst 36.
Die Tregs entfalten ihre suppressiven Eigenschaften wahrscheinlich über das Zusammenspiel mehrerer Mechanismen. Ein Weg läuft über die Enzyme Granzym B und Perforin, mit deren Hilfe Tregs APCs und T-Zellen eliminieren können. Eine weitere Möglichkeit involviert die vermehrte B7-H4 Expression der APCs, hervorgerufen durch Tregs. B7-H4 interagiert mit den gewöhnlichen T-Zellen und führt zum Zellzyklusarrest. Zusätzlich können Tregs über CTLA-4 / CD80 und / oder CD86 Interaktion mit APCs das Enzym IDO induzieren, welches die Aminosäure Tryptophan metabolisiert und die T-Zellaktivierung hemmt. Abschließend kann die erhöhte Produktion von IL-10 und TGF-β durch Tregs ein antiproliferatives Milieu schaffen 37.
1.5.2 Myeloide Suppressorzellen
Der Begriff myeloide Suppressorzellen (MDSC) umschreibt eine heterogene Zellpopulation, zu der unreife Makrophagen, Granulozyten, dendritische Zellen und andere myeloide Zellen in zumeist unreifen Entwicklungsstadien zählen. Sie sind bei Mäusen durch die Koexpression der Marker CD11b und Gr-1 charakterisiert und können Immunantworten in vivo und in vitro supprimieren.
Beim Menschen sind die MDSC bislang, aufgrund fehlender charakteristischer Oberflächenmarker, spärlicher untersucht. Der vorherrschende Phänotyp wird als CD33+, CD34+, CD15−, CD13+ und CD14− / lin− beschrieben. MDSC sind potente Inhibitoren von CD4+- und CD8+ T-Zellen und sind signifikant für die Immundysfunktion in tumorabhängigen sowie -unabhängigen Szenarien verantwortlich 38. Ihre Frequenz kann bei zahlreichen pathologischen Zuständen wie Infektionen, entzündlichen Erkrankungen, traumatischem Stress und neoplastischen Erkrankungen erhöht sein. Im Rahmen von Tumorerkrankungen wird angenommen, dass der wachsende Tumor die Myelopoese beeinflusst, indem die Differenzierung und Ausreifung Antigen-präsentierender Zellen aus ihren myeloiden Vorstufen inhibiert und die Akkumulation von unreifen myeloiden Zellen gefördert wird. Hierbei können die unreifen myeloiden Zellen erheblich zur Tumorprogression und zum Schutz des Tumors vor dem Immunsystem beitragen. Einerseits können sie in den Tumor migrieren und zu stark immunsupprimierenden Makrophagen differenzieren,
andererseits können sie die Entstehung einer adaptiven Immunantwort in lymphoiden Organen inhibieren 26. Verschiedene Mechanismen wie der gesteigerte L-Arginin Metabolismus, die Entstehung von Peroxynitriten, die Produktion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) und die TGF-β Produktion verhelfen den MDSC zu ihren immunsupprimierenden Eigenschaften. Die Aminosäure L-Arginin wird hauptsächlich durch die Enzyme Arginase und die NO-Synthase verstoffwechselt, wobei im ersten Fall L-Ornithin und Harnstoff, im zweiten Fall NO und L-Citrullin entstehen. Die Hochregulierung und gesteigerte Arginaseaktivität myeloider Zellen verringert den L-Arginingehalt im Milieu, befriedigt den hohen Tumorbedarf an Polyaminen und übt einen negativen Effekt auf die T-Zellfunktionen aus 39. Bei alleiniger Hochregulierung der induzierbaren NO-Syntase (NOS2) kommt es ebenfalls zu einem reversiblen Block der T-Zellproliferation. Im Falle der gemeinsamen Induktion der Arginin- metabolisierenden Enzyme resultiert der entstehende L-Argininmangel in der Produktion von Peroxynitriten durch die NOS2. Die Peroxynitrite veranlassen aktivierte T-Lymphozyten den programmierten Zelltod einzuleiten 40. Zudem produzieren MDSC hohe ROS- und TGF-β-Level, die gleichermaßen antiproliferativ wirken 26.
Eine neue Untergruppe von MDSC wurde bei Patienten mit HCC identifiziert. Sie sind CD14+ und exprimieren kein bzw. sehr wenig HLA-DR. Ansonsten unterscheiden sich die CD14+HLA-DR−/low- Zellen hinsichtlich der Oberflächenmarkerexpression nur geringfügig von gewöhnlichen CD14+HLA-DR+- Monozyten. Ihre Frequenz ist, im Vergleich zu gesunden Probanden, bei HCC-Patienten im peripheren Blut und als tumorinfiltrierende Lymphozyten deutlich erhöht. Des Weiteren sind diese MDSC in der Lage CD4+CD25+Foxp3+ regulatorische T-Zellen zu induzieren und offenbaren einen neuen möglichen Mechanismus der Immunsuppression 41.
Die Interaktion der MDSC mit anderen Zellpopulationen als T-Zellen ist bislang ungenügend untersucht. Eine durchgeführte Studie beschäftigt sich mit der MDSC / NK-Zellinteraktion. Im Mausmodell konnte gezeigt werden, dass MDSC die NK-Zellzytotoxizität in vivo und in vitro supprimieren können 42. In der vorliegenden
Arbeit soll die MDSC / NK-Zellinteraktion an gesunden Probanden und HCC-Patienten eingehender beleuchtet werden.
2 Zielsetzung
In unserer Arbeitsgruppe konnten humane MDSC erstmals als CD14+HLA-DR−/low - Zellen charakterisiert werden. Außerdem konnte gezeigt werden, dass MDSC bei Patienten mit HCC vermehrt zu finden sind. Es ergab sich, dass CD14+HLA-DR−/low- Zellen, sowohl im peripheren Blut als auch als tumorinfiltrierende Lymphozyten, bei HCC-Patienten im Vergleich zu gesunden Spendern erhöht sind. Ferner wurde demonstriert, dass CD14+HLA-DR−/low- Zellen CD4+CD25+Foxp3+ regulatorische T-Zellen induzieren können 41.
Unabhängig von den Untersuchungen in Hannover haben Liu et al. den Einfluss von MDSC auf die NK-Zell-Zytotoxizität untersucht. Sie konnten zeigen, dass die Anzahl an MDSC bei Tumormäusen erhöht ist und diese in vivo und in vitro die NK-Zell- Zytotoxizität wirksam inhibieren können 42. Es stellte sich somit die Frage, ob MDSC ebenfalls auf NK-Zellen von HCC-Patienten einen Effekt ausüben.
Folgende Punkte wurden hierbei einer genauen Evaluation unterzogen:
1. Unterscheidet sich die zytotoxische Kapazität der NK-Zellen zwischen gesunden Probanden und HCC-Patienten?
2. Haben CD14+HLA-DR−/low- Zellen einen Einfluss auf die NK-Zell-Zytotoxizität?
3. Beeinflussen CD14+HLA-DR−/low- Zellen die Zytokinsekretion von NK-Zellen?
4. Ist der Einfluss der CD14+HLA-DR−/low- Zellen auf NK-Zellen auf direkten Zellkontakt oder sezernierte Faktoren zurückzuführen?
5. Verändert sich die Oberflächenmolekülexpression von NK-Zellen bei Kokultur mit CD14+HLA-DR−/low- Zellen?
6. Führt der Einsatz von MDSC-Inhibitoren zu einer Veränderung hinsichtlich der Zytokinausschüttung?
7. Lassen sich CD14+HLA-DR−/low- Zellen durch LPS stimulieren?
3 Material und Methoden
3.1 Material
3.1.1 Geräte und Utensilien
-80ºC-Kühlschrank Typ 6485 GFL, D-Burgwedel
Absaugpumpe „BVC 21“ Vacuubrand, D-Wertheim
Autoklav „Selectomat PL“ Münchener Medizin Mechanik, D-Planegg
autoMACS™ Separator Miltenyi Biotec, D-Bergisch Gladbach
β-γ-Kontaminationsmonitor „LB 122 B“ Berthold Technologies, D-Bad Wildbad
Bleiabschirmung, mobile Elemente Mavig, D-München Brutschrank mit CO2-Begasung, Baureihe 5060 Heraeus, D-Hanau
Eismaschine „B 390“ Scotsman, USA-Vernon Hills
Einfrierkontainer „Nalgene Cryo 1°C Container“ Nunc , D-Düsseldorf
ELISA-Reader „ELx800UV“ BioTek, D-Bad Friedrichshall Fluoreszenz-Durchflusszytometer „FACSCalibur“ Becton Dickinson, D-Heidelberg Kühlschrank Liebherr Premium Liebherr, D-Ochsenhausen
Laborkittel Klopman International,
D-Ratingen
Lichtmikroskop „CK 30-F200“ Olympus, D-Hamburg
MicroBeta γ-Counter Wallac, F-Turku
Pipetten, regelbar (2, 10, 20, 200,1000 µl) Eppendorf, D-Hamburg
Pipettierhilfe „accu-jet“ Brand, D-Wertheim
Röhrchengestelle „Nalgene 30MM“ Nunc, D-Düsseldorf Röntgenschürze „Comfort 660“ Mavig, D-München Schilddrüsen-Sternumschutz „RA615“ Mavig, D-München Sicherheitswerkbank „HeraSafe KS 18“ Heraeus, D-Hanau
Schüttelgerät „Vortex-Genie 2“ Scientific Industries, USA-Bohemia
Stickstofftank Linde, D-Höllriegelskreuth
Strahlenschutztresor Ganuk GmbH, D-Hammersbach Wasserbad mit Temperaturregelung „Typ 1003“ GFL, D-Burgwedel
Zählkammer nach Neubauer Brand, D-Wertheim
Zentrifuge „Megafuge 1.0R“ Heraeus, D-Hanau
Zentrifugengehänge „Centri-Lab“ Heraeus, D-Hanau
3.1.2 Verbrauchsmaterialien
24 Well Zellkultur-Platte Corning Inc., USA-Corning
96 Well Proben-Platte Wallac, F-Turku
autoMacs Separationssäulen Miltenyi, D-Bergisch Gladbach Combitips (0,5 ml, 2,5 ml) Eppendorf, D-Hamburg
ELISA Platte “Costar”, 96 Well Corning Inc., USA-Corning
ELISA Abdeckfolie Greiner, D-Frickenhausen
FACS-Röhrchen (1,4 ml) Micronic Systems, N-Lelystad Filter Tips (10, 20, 100, 200, 1000 µl) Sarstedt, D-Nürnbrecht
Gewebekulturflaschen (75 cm2, 175 cm2) Greiner, D-Frickenhausen
Kryoröhrchen (1,8 ml) Nunc, D-Düsseldorf
Labortücher Kimberly-Clark, UK-Surrey
Mikrotiterplatten (96 Vertiefungen, v-bottom) Greiner, D-Frickenhausen
„Multifly“-Kanülen, Schlauch 20 cm Sarstedt, D-Nürnbrecht Pasteurpipetten aus Glas (22,5 mm) Brand, D-Wertheim
„Perfusor“-Einmalspritzen (50 ml) Braun, D-Melsungen
Pflaster „Hansaplast“ BSN medical, D-Hamburg
Pipettenspitzen (10, 200, 1000 µl) Sarstedt, D-Nürnbrecht
Reagenzbassins Thermo Scientific, F-Vantaa
Reaktionsgefäße (0,5 ml, 1,5 ml, 2 ml) Eppendorf, D-Hamburg
Rundbodenröhrchen „Falcon“ (5 ml) Becton Dickinson, D-Heidelberg Rundbodenröhrchen mit integriertem Zellsieb (5 ml) Becton Dickinson, D-Heidelberg Serologische Pipetten (1, 2, 5, 10, 25 ml) Sarstedt, D-Nürnbrecht
S-Monovetten Sarstedt, D-Nürnbrecht
Transfer-Pipetten (3,5 ml) Sarstedt, D-Nürnbrecht
Tupfer „Pur Zellin“ Paul Hartmann AG, D-Heidenheim Untersuchungshandschuhe „Digitil PF“ Paul Hartmann AG,
D-Heidenheim
Vernichtungsbeutel Sarstedt, D-Nürnbrecht
Zellkultureinsätze (3 µm Porendurchmesser) Greiner, D-Frickenhausen Zentrifugenröhrchen „Falcon Tubes“ (15 ml, 50 ml) Sarstedt, D-Nürnbrecht
3.1.3 Reagenzien
1-Methyl-Tryptophan Sigma-Aldrich, D- Steinheim
7AAD Becton Dickinson, D-Heidelberg
Aqua Spüllösung Delta Select, D-Dreieich
BSA Serva Electrophoresis,
D-Heidelberg
Chrom (51Cr) Hartmann Analytic, D-Braunschweig
Desinfektionsmittel für Blutentnahme „Softasept N“ Braun, D-Melsungen
DMSO Merck, D-Darmstadt
ELISA Substrat, Lösung A und B Bio-Rad, USA-Hercules
Ethanol (99 %) BÜFA Chemikalien, D-Hude
EDTA Sigma-Aldrich, D-Steinheim
FACSClean™ Becton Dickinson, D-Heidelberg
FACSFlow™ Becton Dickinson, D-Heidelberg
FACSRinse™ Becton Dickinson, D-Heidelberg
FCS Biochrom, D-Berlin
Ficoll „Biocoll Separation Solution“ Biochrom, D-Berlin
H2SO4 Merck, D-Darmstadt
IL-2 (Proleukin) Chiron, N-Amsterdam
Klebefolie „Scotch Pad“ Qiagen, USA-Valencia
L-Glutamin Biochrom, D-Berlin
L-NMMA Sigma-Aldrich, D-Steinheim
L-NOHA Sigma-Aldrich, D-Steinheim
LPS Sigma-Aldrich, D-Steinheim
NaCl-Lösung (0,9 %) Delta Select, D-Dreieich
Natrium-Pyruvat Biochrom, D-Berlin
Nicht-essentielle-Aminosäuren Biochrom, D-Berlin
PBS (D-PBS, 10 x) Gibco-Invitrogen, D-Karlsruhe
Penicillin/Streptomycin 100x Gibco-Invitrogen, D-Karlsruhe
RPMI-Medium 1640 Gibco-Invitrogen, D-Karlsruhe
Seife „Baktolin basic“ Bode Chemie, D-Hamburg
Händedesinfektionsmittel „Sterillium Virugard“ Bode Chemie, D-Hamburg
Stickstoff Linde, D-Höllriegelskreuth
Streptavidin-HRP R&D Systems,
USA-Minneapolis
Szintillationsflüssigkeit „OptiPhase SuperMix“ PerkinElmer, USA-Waltham
Trypanblau (0,5 %) Sigma-Aldrich, D-Steinheim
Tween-20 Calbiochem, D-Schwalbach
Kits
IFN-γ-ELISA set, human ImmunoTools, D-Friesoythe
IL 10-ELISA set, human ImmunoTools, D-Friesoythe
TNF-α-ELISA set, human ImmunoTools, D-Friesoythe
3.1.4 Medien und Puffer ELISA
Coating Puffer
• 100 mM Carbonat / Bicarbonat Puffer, pH 9,6 PBS
• 10 mM Phosphat-gepufferte Saline, pH 7,3 Blocking Puffer
• PBS mit 1 % BSA
Waschpuffer
• PBS mit 0,01 % Tween-20 Verdünnungspuffer
• PBS mit 1 % BSA und 0,05 % Tween-20 Stopplösung
• 1 mol / l H2SO4
MACS Puffer MACS Run / Puffer
• PBS mit 2 mM EDTA und 0,5 % BSA MACS Run wurde vor Gebrauch steril filtriert.
MACS Rinse
• PBS mit 2 mM EDTA MACS Reinigungslösung
• 70 % Ethanol (v / v), verdünnt von 100 % Ethanol FACS-Puffer
PBS mit 10 % FCS (v / v) und 1 mg / ml NaN3 Humanes T-Zellmedium
Das humane T-Zellmedium zur in vitro Kultivierung humaner Blutzellen setzt sich aus folgenden Bestandteilen zusammen:
• RPMI 1640, 10 % humanes AB-Serum (v / v), 2 mmol / l L-Glutamin und 100 U / ml Penicillin / Streptomycin
K562 Zellmedium
Die Tumorzell-Linie K562 wurde aus dem Pleurapunktat einer 53-jährigen, an chronischer myeloischer Leukämie erkrankten Patientin gewonnen. Das Kulturmedium weist folgende Komponenten auf:
• RPMI 1640, 10 % FCS (v / v), 2 mmol / l L-Glutamin, 1 mmol / l Natrium-Pyruvat, 1 mmol / l nicht-essentielle Aminosäuren und 100 U / ml
Penicillin / Streptomycin Humanes AB-Serum
Humanes AB-Serum wurde für die Kultur humaner Zellen sowie für das Auffangen von Zellen nach der Zellsortierung verwendet. Zur Herstellung wurden die Seren dreier Spender gepoolt und bei -20 °C eingefroren. Vor der Verwendung erfolgte eine Hitzeinaktivierung für 45 min bei 56 °C im Wasserba d.
Einfriermedium
Zur Kryokonservierung von Zellen wurde ein Medium folgender Zusammensetzung verwandt:
• 90 % FCS (v / v), 10 % DMSO (v / v)
3.1.5 Antikörper
Es folgt die tabellarische Auflistung der verwendeten Antikörper. Die Anwendung erfolgte gemäß Herstellerangaben.
Tabelle 1: Antikörper
Spezifität Klon Isotyp Markierung Hersteller
CD3 HIT3a IgG2a PE Becton Dickinson, D-Heidelberg CD14 TÜK4 IgG2a PE/Cy5 Immunotools, D-Friesoythe CD14 TÜK4 IgG2a APC Miltenyi, D-Bergisch Gladbach CD16 LNK16 IgG1 FITC Immunotools, D-Friesoythe CD56 AF12-7H3 IgG1 APC Miltenyi, D-Bergisch Gladbach CD69 FN50 IgG1 FITC Miltenyi, D-Bergisch Gladbach CD94 HP-3D9 IgG1 FITC Becton Dickinson, D-Heidelberg
NKp30 Z25 IgG1 PE Beckman Coulter, D-Krefeld
NKp44 2.29 IgG1 PE Miltenyi, D-Bergisch Gladbach NKG2D BAT221 IgG1 PE Miltenyi, D-Bergisch Gladbach Maus IgG1
Isotypkontrolle PPV-06 IgG1 PE Immunotools, D-Friesoythe Maus IgG1
Isotypkontrolle PPV-06 IgG1 FITC Immunotools, D-Friesoythe HLA-DR MEM-12 IgG1 PE Immunotools, D-Friesoythe
CD14 IgG2a MicroBeads Miltenyi, D-Bergisch Gladbach
FcR-Block Miltenyi, D-Bergisch Gladbach
3.1.6 Computer und Software
Adobe Illustrator CS2 Version 12.0.0 Adobe Software, USA-San Jose
CellQuest Version 5.2.1 Becton Dickinson, D-Heidelberg γ-Strahlen-Zähler Software Wallac, F-Turku
„Wallac Oy 1450 MicroBeta“ Version 2.7
FACSDiva Version 4.2.3 Becton Dickinson, D-Heidelberg
FlowJo Version 6.3.3 Tree Star, USA-Ashland
Mac OS X Version 10.4.11 Apple, USA-Cupertino
Medion Notebook „speedmaster RAM2000“ Medion, D-Essen
Microsoft Works 8 Microsoft, USA-Redmond
Microsoft Office 2003 Microsoft, USA-Redmond
Power Mac G5 Apple, USA-Cupertino
Prism Version 4.02 GraphPad Software,
USA-San Diego
3.1.7 Statistische Auswertung
Die statistische Auswertung der generierten Daten erfolgte mit den Softwareprogrammen Excel und Prism. Die Ergebnisse sind als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwertes angegeben. Die statistische Analyse wurde mit dem t-Test für unverbundene Stichproben („Student's t-test“) durchgeführt, um einen Unterschied in den verschiedenen Proben zu ermitteln. P < 0,05 (*) wurde als statistisch signifikant, P < 0,01 (***) als statistisch hochsignifikant angesehen. Die Erstellung und Bearbeitung der Graphen geschah unter Verwendung der Programme Excel, Prism und Adobe Illustrator.
3.2 Methoden
Das für die Experimente verwendete Blut stammt zum einen von gesunden, freiwilligen Spendern, zum anderen von HCC-Patienten, die in der Abteilung für Gastroenterologie, Hepatologie und Endokrinologie der Medizinischen Hochschule Hannover behandelt werden.
Die Diagnose HCC wurde gemäß der Richtlinien der Europäischen Gesellschaft für Leberforschung (European Association for the Study of Liver) gestellt. Vor der Blutentnahme wurden die Patienten über den Verwendungszweck aufgeklärt und die schriftliche Einverständniserklärung wurde eingeholt. Das Studienprotokoll wurde von der Ethikkommission der Medizinischen Hochschule Hannover akzeptiert.
3.2.1 Isolierung mononukleärer Zellen durch Dichtegradienten-Zentrifugation Das benötigte Blut wurde durch periphere Venenpunktion gewonnen. Die Antikoagulation erfolgte entweder durch EDTA oder Heparin. Von dem gewonnenen Vollblut wurden unter sterilen Bedingungen 10-15 ml in 50 ml Röhrchen überführt.
Das Blut wurde mit 0,9 % Natriumchlorid-Lösung auf 40 ml aufgefüllt und vorsichtig mit 10 ml Ficoll (Dichte: 1,077 g / ml) unterschichtet. Anschließend wurden die Röhrchen bei 833 x g und Raumtemperatur für 30 Minuten ohne Bremse zentrifugiert. Es erfolgte eine Auftrennung der Blutbestandteile gemäß ihrer Dichte.
Die peripheren mononukleären Zellen (PBMC) sammeln sich als Interphase zwischen Überstand (Thrombozyten und Plasma) und Ficoll als so genannter „buffy coat“ an. Am Boden des Röhrchens befinden sich aufgrund ihrer höheren Dichte die Erythrozyten und Granulozyten. Die PBMC-Phase wurde mit Hilfe einer Transfer-Pipette in ein weiteres 50 ml Röhrchen übertragen und mit NaCl-Lösung auf 50 ml aufgefüllt. Die folgende Zentrifugation wurde bei 425 x g und 4 ºC für 8 Minuten durchgeführt. Das Zellpellet wurde von dem Überstand getrennt und gegebenenfalls mit weiteren PBMC des Spenders gepoolt.
3.2.2 Bestimmung der Zellzahl
Die vorliegende Zellzahl wurde mit Hilfe der Neubauer-Zählkammer bestimmt. Hierzu wurden die Zellsuspension und Trypanblau im Verhältnis 1:1 (je 10 µl) gemischt und davon 10 µl auf die Zählkammer übertragen. Bei höheren Zellzahlen, bedingt durch größere Blutentnahmen, wurde eine Vorverdünnung der Zellsuspension durchgeführt und anschließend äquivalent, unter Berücksichtigung des Verdünnungsfaktors, vorgegangen. Die Zählkammer besteht aus vier Großquadraten, die jeweils aus sechzehn Kleinquadraten gebildet werden. Es werden zwei Großquadrate ausgezählt.
Folgende Formel gibt die Berechnung der Gesamtzellzahl wider:
Gesamtzellzahl = Wert der Auszählung x Gesamtvolumen x 104 x Verdünnungsfaktor
3.2.3 Positive Selektion von CD14+ Zellen mit MicroBeads
Die gewonnenen PBMC wurden in 80 µl MACS Puffer pro 107 Zellen resuspendiert und mit 20 µl CD14 MicroBeads für 15 Minuten bei 4 ºC inkubiert. Hierbei kam es zu einer Bindung der Beads an die CD14+ Zellen (Abb. 3a, s. Seite 25). Dieser Vorgang wurde durch mehrmaliges Mischen der Probe optimiert. Es folgte ein Waschschritt mit 1-2 ml MACS Puffer pro 107 Zellen bei 425 x g und 4 ºC für 8 min. Der Überstand wurde abgenommen und das Pellet in 10 ml MACS Puffer resuspendiert. Die magnetische Auftrennung der Zellen wurde mit dem autoMACS™ Separator durchgeführt. Bei Anwendung des Programmes „Possel“ (positive Selektion) wurden die paramagnetisch markierten Zellen an der autoMACS™ Säule im erzeugten magnetischen Feld festgehalten. Die CD14− Zellen wurden am Port „neg1“ in ein Röhrchen eluiert (Abb. 3b). Abschließend werden die angereicherten CD14+ Zellen am Port „pos1“ eluiert (Abb. 3c). Nach erfolgter Zentrifugation wurden die beiden Fraktionen mittels Antikörper markiert und für die Zellsortierung vorbereitet.
Abb. 3: Schematische Darstellung der Zellseparation mit CD14 MicroBeads
a b c
3.2.4 Durchflusszytometrie
Die fluoreszenzaktivierte Zellanalyse (FACS) ist ein Verfahren, um die individuellen Eigenschaften von Partikeln zu erfassen. Die Grundlage des Verfahrens bildet die Antigen-Antikörper-Reaktion, da bei Verwendung fluoreszenzmarkierter Antikörper Oberflächenmarker sowie intrazelluläre Proteine spezifisch nachgewiesen werden können. Die sich in Lösung befindende Probe wird aufgenommen und es wird ein Einzelpartikelstrom erzeugt. Dieser Vorgang wird als hydrodynamische Fokussierung bezeichnet. Die Zellen passieren einen gebündelten Laserstrahl, wodurch die Elektronen der Fluoreszenzfarbstoffe auf ein höheres Energieniveau gehoben werden. Unter Aussendung von Photonen kehren die Elektronen in ihren energetischen Ausgangszustand zurück. Detektoren messen die emittierten Photonen, wobei sich die Signalstärke proportional zur gebundenen Menge an Antikörper pro Zelle verhält. Die Farbstoffe verfügen über charakteristische Emissionsspektren und werden gemäß der Wellenlänge von verschiedenen Kanälen des FACS Gerätes detektiert (siehe Tabelle 2).
Fluoreszenzfarbstoff Fluoreszenzkanal Absorptions- maximum
Emissions- maximum Fluorescein-Isothiocyanat
(FITC) Kanal 1 495 nm 519 nm
Phycoerythrin (PE) Kanal 2 480 nm; 565 nm 578 nm
PE-Cy5 Kanal 3 480 nm; 565 nm 667 nm
7-AAD Kanal 3 546 nm 647 nm
Allophyocyanin (APC) Kanal 4 650 nm 660 nm
Tabelle 2: Fluoreszenzfarbstoffe und ihre Charakteristika
Ein weiterer Faktor von Bedeutung ist die Lichtstreuung. Vorwärts gestreutes Licht wird im „forward scatter channel“ (FSC) erfasst und gibt Auskunft über die Partikelgröße, wodurch eine Unterscheidung zwischen vitalen Zellen und Debris möglich ist. Demgegenüber steht der „side scatter channel“ (SSC), der Auskunft über
die Granularität der Zellen gibt. Granulozyten und Makrophagen beispielsweise enthalten mehr Granula als Lymphozyten und weisen folglich ein höheres SSC-Signal auf. Die Kombination aus FSC, SSC und Fluoreszenzemission ermöglicht eine exakte Differenzierung der zellulären Probenbestandteile. Die computergestützte Auswertung der Daten erfolgte mit den Programmen „Cell Quest“
und „FlowJo“. Hierbei wurden einzelne Zellpopulationen markiert und hinsichtlich Streuung und Fluoreszenz analysiert. Als häufigste Darstellungsweise wurde das Punktediagramm (dot plot) verwendet. Als wichtige Kenngröße wurde die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) ermittelt, die ein Maß für die Menge gebundenen Fluoreszenzfarbstoffes pro Partikel ist.
3.2.5 Zellsortierung
Um unterschiedliche Zellpopulationen für weitere Untersuchungen zu separieren, bedarf es eines Zellsorters. Eingesetzt wurde der FACSAria™ Zellsorter. Es handelt sich um ein Durchflusszytometer, welches mittels festlegbarer Kriterien Zellen, die diese Kriterien erfüllen, sortieren kann. Dazu wird nach erfolgter hydrodynamischer Fokussierung jeder Partikel von einem Laserstrahl gescannt. Der Zentralstrom wird in regelmäßige Tropfen zerlegt, wobei sich idealerweise eine Zelle im Zentrum eines Tropfens befindet, umschlossen von zwei Tropfen, die keine Zelle enthalten. Bei Erfüllung der Sortkriterien wird der Tropfen elektrisch aufgeladen und mithilfe eines statischen elektrischen Feldes abgelenkt. Die einzelnen Fraktionen wurden mit 15 ml Röhrchen, in denen sich 500 µl humanes Serum befanden, aufgefangen. Im Falle der CD14+ Zellfraktion wurde die Probe zur Sortvorbereitung mit den fluoreszenzmarkierten monoklonalen Antikörpern CD14-APC und HLA-DR-PE gefärbt. Die CD14− Zellen wurden mit den Antikörpern CD56-APC und CD3-PE markiert. Die Inkubation erfolgte für 15 min bei 4 ºC. Die Zellen wurden schließlich gewaschen und in MACS Puffer aufgenommen. Aus den CD14+ Zellen wurden Monozyten und MDSCs sortiert. Beide Populationen sind für CD14-APC positiv, aber unterscheiden sich in der HLA-DR Expression. MDSC sind für diesen Marker negativ bzw. exprimieren ihn nur in geringem Maße. Aus dem CD14− Anteil wurden NK- Zellen isoliert. Diese sind positiv für CD56-APC und negativ für den T-Zellmarker
CD3-PE. Um die Sortreinheit zu gewährleisten, wurde nach erfolgter Separation eine Reanalyse durchgeführt und im Bedarfsfalle eine Nachsortierung vorgenommen.
3.2.6 51Chrom-Zytotoxizitäts-Assay
Beim angewandten Zytotoxizitäts-Assay handelt es sich um einen Test, der die NK-Zellfähigkeit zur Lyse von Zielzellen untersucht. Als Zielzellen dienten K562
Zellen, die aufgrund ihrer Entdifferenzierung und MHC Klasse I Negativität, optimale Voraussetzungen für die NK-Zell-vermittelte Lyse bieten. Das Experiment beruht auf dem Prinzip, dass die Zielzellen während einer Inkubationsphase mit radioaktivem Chrom dieses aufnehmen und im folgenden Schritt durch NK-Zell-vermittelte Lyse wieder in das umgebende Medium abgeben. Die Aktivität der freigesetzten Menge an radioaktivem Chrom kann hierbei mit einem γ-Strahlen-Zähler gemessen und mit der stattgefundenen Lyse korreliert werden. Zu diesem Zweck muss ein Minimal- bzw.
Maximalwert der Lyse bestimmt werden, um einerseits Hintergrundphänomene bzw.
spontane Chromfreisetzung zu quantifizieren und um andererseits die maximal mögliche Lyse zu bestimmen. Zunächst wurden die benötigten Zellpopulationen (NK-Zellen, MDSC und Monozyten) aus dem Blut separiert und über Nacht (12 h) im Brutschrank inkubiert. Folgendes Schema gibt die Ausplattierung in der 96-Well Platte wider:
Tabelle 3: Inkubationsschema des Zytotoxizitäts-Assays. Ermittelt wurde die prozentuale Lyse 51Chrom-markierter K562-Zellen. Getestet wurden verschiedene Verhältnisse von CD14+HLA-DR-/low- bzw. CD14+HLA-DR+- und NK-Zellen sowie CD14+HLA-DR-/low-, CD14+HLA-DR+- und NK-Zellen allein (1: 1,25 × 104 Zellen). Nach einer Vorinkubation über Nacht (12 h) wurde der Versuch durch Zugabe der Zielzellen (5 × 103) gestartet. Die Inkubation erfolgte für 4 h im Brutschrank ohne zusätzliche IL-2 Stimulation.
CD14+HLA-DR-/low ++ + + - - - -
CD14+HLA-DR+ - - - ++ + + -
NK-Zellen + + - + + - +
Das Gesamtvolumen pro Well betrug 100 µl. Alle Ansätze wurden in Triplikaten durchgeführt. Es erfolgte keine IL-2 Stimulation. Nach Ablauf der Inkubationszeit wurde die Targetzellzahl in der Zellkulturflasche bestimmt und die gewünschte Menge an Zellen (5 × 105) entnommen. Nach einem Waschschritt wurden die Zellen in humanem T-Zellmedium resuspendiert und mit 51Chrom der Aktivität 0,925 MBq für 1-2 h im Brutschrank inkubiert. Danach folgten 3 Waschschritte in NaCl-Lösung und die Aufnahme in humanem T-Zellmedium. Zu allen Wells wurden 50 µl der Zellsuspension gegeben, wobei in diesem Volumen 5000 Targetzellen enthalten waren. Die Mikrotiterplatte wurde für 4 h im Brutschrank aufbewahrt. Nach abgelaufener Reaktion wurden von jedem Well vorsichtig 75 µl Überstand abpipettiert und auf eine andere 96-Well-Platte übertragen. Zur Bestimmung der spontanen Chromfreisetzung wurden aus 6 separaten Wells, die nur Targetzellen enthielten, vorsichtig 75 µl Überstand entnommen. Die Bestimmung der maximalen Lyse geschah ebenfalls mithilfe von 6 separaten, nur Targetzellen enthaltenden Wells, wobei jedoch 75 µl Überstand nach mehrmaligem Pipettieren entnommen wurden. Dies führte zu einer Durchmischung des Wells mit Aufwirbelung der sich am V-Boden befindenden, Chrom enthaltenden Zellen, die somit ebenfalls entnommen wurden. Der Counter differenziert nicht zwischen freiem und sich intrazellulär befindendem Chrom, sondern misst lediglich die vorhandene Aktivität. Dies verdeutlicht die Wichtigkeit der behutsamen Überstandsentnahme. Vor der Quantifizierung der abgelaufenen Lyse wurde allen Wells 100 µl Szintillationsflüssigkeit zugegeben. Es folgte die Analyse am γ-Strahlen-Zähler.
Folgende Formel gibt die Berechnung der spezifischen Lyse wider:
experimentelle Chrom-Freisetzung - spontane Chrom-Freisetzung spezifische Lyse in % =
maximale Chrom-Freisetzung - spontane Chrom-Freisetzung
3.2.7 Kultur und Präparation der Targetzellen
Die K562-Zellen wurden zügig im Wasserbad bei 37 °C aufgetaut und danach mit 50 ml NaCl-Lösung gewaschen (4 °C, 8 min, 425 x g). Es folgte die Bestimmung der Zellzahl in der Neubauer-Zählkammer und die Überführung der gewünschten Menge
an Targetzellen in Zellkulturflaschen. In diese wurden zuvor 20 ml Nährlösung (K562 Medium) vorgelegt. Die Langzeit-Kultivierung der K562-Zellen vollzog sich im Brutschrank bei 37 °C mit 100 % Luftfeuchtigkeit un d 5 % CO2-Atmosphäre. Das Kulturmedium wurde etwa alle 2 Tage gewechselt und die überschüssigen Zellen wurden eingefroren.
3.2.8 Einfrieren und Auftauen von Zellen
Zum Einfrieren der verwendeten Zelllinie wurden zwischen 5 x 106 und 1 x 107 Zellen pro ml Einfriermedium verwendet und in Kryoröhrchen überführt. Die Röhrchen wurden im Einfrierkontainer platziert und bei -80 °C eingefroren. Das Auftauen vollzog sich im Wasserbad bei 37 °C. Die Zellen wur den nach einem Waschschritt mit 50 ml NaCl-Lösung gezählt und für die entsprechenden Assays eingesetzt.
3.2.9 Kokultivierung von CD14+HLA-DR-/low- und NK-Zellen
Für die meisten der anderen Versuche wurden die NK-Zellen, Monozyten und MDSC unter anderen Bedingungen kokultiviert. Nach Gewinnung der Zellpopulationen durch Zellsortierung wurden die Zellen auf Eis transportiert und bei 425 x g und 4 ºC für 8 min zentrifugiert. Der Serumüberstand wurde vorsichtig abgesaugt und die Zellen in T-Zellmedium resuspendiert. Daraufhin wurden die Zellen gemäß folgendem Schema in einer 96-Well-Platte ausplattiert:
Tabelle 4: Kokulturschema. NK-Zellen wurden unter verschiedenen Bedingungen kultiviert.
Neben der Negativ- (NK-Zellen allein ohne IL-2) und Positivkontrolle (NK-Zellen mit IL-2) wurden NK-Zellen mit CD14+HLA-DR-/low- bzw. CD14+HLA-DR+- Zellen inkubiert. Bei
CD14+HLA-DR-/low ++ + - - - -
CD14+HLA-DR+ - - ++ + - -
IL-2 + + + + + -
