Untersuchungen zum protektiver Einfluss verschiedener Futterzusatzstoffe auf die gastrointestinale und systemische Besiedlung mit Salmonella enterica nach experimenteller Infektion bei Broilern

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Untersuchungen zum protektiven Einfluss verschiedener Futterzusatzstoffe auf die gastrointestinale und systemische

Besiedlung mit Salmonella enterica nach experimenteller Infektion bei Broilern

INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae - (Dr. med. vet.)

vorgelegt von Nina Tippkemper

Warendorf

Hannover 2010

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Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. G. Breves

1. Gutachter: Prof. Dr. G. Breves

2. Gutachter: Prof. Dr. S. Rautenschlein PhD

Tag der mündlichen Prüfung: 18.5.2010

Diese Arbeit wurde unterstützt durch Lohmann Animal Health und das Land Niedersachsen

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für Jens und meine Eltern

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Inhaltsverzeichnis Abbildungsverzeichnis

Abkürzungsverzeichnis Tabellenverzeichnis

1 Einleitung ... 1

1.1 Rechtliche Grundlagen 1 1.2 Die aviäre Darmflora 2 1.3 Salmonellen – Epidemiologie, Klinik und Bekämpfung 4 1.4 Probiotika – Definition und Anwendung 7 1.5 Ziel dieser Studie 11

2 Material und Methoden ... 14

2.1 Versuchsaufbau 14 2.1.1 Gruppeneinteilung ... 14

2.1.2 Versuchsablauf... 17

2.2 Versuchstiere 18 2.2.1 Herkunft, Haltung und Fütterung ... 18

2.2.2 Temperatur- und Lichtregime ... 19

2.2.3 Kennzeichnung... 19

2.2.4 Töten der Tiere ... 19

2.3 Infektion 20 2.3.1 Herstellung der Challenge-Kultur... 20

2.3.2 Verabreichung der Challenge-Kultur... 21

2.3.3 Impfung... 21

2.4 Bakteriologische Untersuchung 22 2.4.1 Qualitative bakteriologische Untersuchungen... 22

2.4.2 Quantitative bakteriologische Untersuchung ... 22

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2.5 Epithel-physiologische Untersuchungen 25

2.5.1 Aufbau der Ussing-Kammer ... 25

2.5.2 Pufferlösungen ... 27

2.5.3 Gewinnung der Proben... 28

2.5.4 Präparation und Einspannen der Darmabschnitte ... 28

2.5.5 Eich- und Messperiode... 30

2.5.6 Bestimmung der unidirektionalen Fluxraten... 32

2.5.7 Auswertung elektrophysiologischer Parameter... 33

2.6 Histologische Untersuchung 34 2.6.1 Probenentnahme ... 34

2.6.2 Präparation der Darmabschnitte... 34

2.6.3 Anfertigung der Schnitte ... 34

2.6.4 Entparaffinierung ... 34

2.6.5 HE-Färbung ... 35

2.6.6 Statistische Auswertung ... 35

3 Ergebnisse ... 36

3.1 Gewichtsentwicklung 36 3.2 Bakteriologische Untersuchung 40 3.2.1 Quantitative bakteriologische Untersuchung ... 40

3.2.2 Tupferproben ... 47

3.3 Epithel-physiologische Versuche 51 3.3.1 Kurzschlussstrom Isc und Gewebeleitfähigkeit Gt... 51

3.3.2 Unidirektionale Fluxraten ... 67

3.4 Histologie 68

4 Diskussion ... 69

4.1 Die aviäre Darmflora 69

4.2 Probiotika 71

4.3 Salmonellen 72

4.4 Infektionsmodell 72

4.5 Gewichtsentwicklung 73

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4.6 Prinzip der Ussing-Kammer-Technik 74

4.7 Untersuchung der parazellulären Permeabilität 75

4.8 Bakteriologische Untersuchungen 76

4.9 Histologische Untersuchungen 77

4.10 Versuchsreihe 1 77

4.10.1 Versuchsaufbau und eingesetzte Futterzusatzstoffe ... 77 4.10.2 Epithel-physiologische Versuche... 78 4.10.3 Bakteriologische Untersuchungen ... 79

4.15 Schlussfolgerungen 90

5 Zusammenfassung... 95

6 Summary ... 96

7 Literaturverzeichnis ... 97

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8 Danksagung ... 112

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Abbildungsverzeichnis

Abb. 1 Versuchsablauf 13

Abb. 2 Bakteriologische Untersuchung Caecuminhalt 23

Abb. 3 Bakteriologische Untersuchung Leber 24

Abb. 4 Schematischer Aufbau der Versuchsapparatur 25

Abb. 5 Einteilung der Blinddarmabschnitte 28

Abb. 6 Aufspannen des Darmgewebes 29

Abb. 7 Strukturformel des Diterpentans Forskolin 31

Abb. 8 Gewichtsentwicklung 1. VR 36

Abb. 13 Bakteriologische Untersuchung Caecum 1. VR 40

Abb. 14 Bakteriologische Untersuchung Leber 1. VR 41

Abb. 23 Tupferproben 1. VR 47

Abb. 28 Sekretorischer Response 51

Abb. 29 Epithel-physiologische Versuche Kurzschlussstrom 1. VR 52 Abb. 30 Epithel-physiologische Versuche Gewebeleitfähigkeit 1. VR 53

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Abb. 31 Gewebeleitfähigkeit im Gruppenvergleich 1. VR 53 Abb. 32 Gewebeleitfähigkeit; Vergleich der Gruppen über die Zeit 1. VR 54 Abb. 33 Epithel-physiologische Versuche Kurzschlussstrom 2. VR 55 Abb. 34 Epithel-physiologische Versuche Gewebeleitfähigkeit 2. VR 56 Abb. 35 Gewebeleitfähigkeit im Gruppenvergleich 2. VR 57 Abb. 36 Gewebeleitfähigkeit; Vergleich der Gruppen über die Zeit 2. VR 57 Abb. 37 Epithel-physiologische Versuche Kurzschlussstrom 3. VR 58 Abb. 38 Epithel-physiologische Versuche Gewebeleitfähigkeit 3. VR 59 Abb. 39 Gewebeleitfähigkeit im Gruppenvergleich 3. VR 59 Abb. 40 Gewebeleitfähigkeit; Vergleich der Gruppen über die Zeit 3. VR 60 Abb. 41 Epithel-physiologische Versuche Kurzschlussstrom 4. VR 61 Abb. 42 Epithel-physiologische Versuche Gewebeleitfähigkeit 4. VR 62 Abb. 43 Gewebeleitfähigkeit im Gruppenvergleich 4. VR 63 Abb. 44 Gewebeleitfähigkeit; Vergleich der Gruppen über die Zeit 4. VR 63 Abb. 45 Epithel-physiologische Versuche Kurzschlussstrom 5. VR 64 Abb. 46 Epithel-physiologische Versuche Gewebeleitfähigkeit 5. VR 65 Abb. 47 Gewebeleitfähigkeit im Gruppenvergleich 5. VR 65 Abb. 48 Gewebeleitfähigkeit; Vergleich der Gruppen über die Zeit 5. VR 66

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Abkürzungsverzeichnis

°C Grad Celsius

µ mikro

Abb. Abbildung

Aqua dest. destilliertes Wasser

BPLS Brillantgrün Phenolrot Lactose Saccharose

Bq Bequerel

BS Buttersäure

bzw. beziehungsweise

ca. circa

CE Competitive Exclusion

Ci Curie

cm Zentimeter

d Tag

dpi Tage nach der Infektion (days post infection)

E. Escherichia

EcA E. coli Abbotstown EcN E. coli strain Nissle et al. et alii

EU Europäische Union

FDA Food and Drug Administration

g Gramm

GALT Gut Associated Lymphoid Tissue GIT Gastro-Intestinal-Trakt

Gt Gewebeleitfähigkeit

h Stunde

IfSG Infektionsschutz-Gesetz

Isc Kurzschlussstrom

Kap. Kapitel

KbE Koloniebildende Einheiten

kg Kilogramm

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l Liter

LAB lactic acid bacteria-based culture Lact. Lactobacillus

LT Lebenstag

mg Milligramm

ml Milliliter

mmol Millimol

mosmol Milliosmol

mS Millisiemens

ms mukosal Ł serosal

MW Mittelwert

n Stichprobenumfang

n.s. nicht signifikant

NA Nalidixin(säure)

P Probiotikum

PBS phosphate buffered saline ppm parts per million

S. Salmonella

Sac. Saccharomyces

SCFA short chain fatty acids

SD Standardabweichung

SE Salmonella Enteritidis

SEM Standardfehler

sm serosal Ł mukosal

sog. so genannte

SPF spezifisch pathogenfrei

spp Spezies

ST Salmonella Typhimurium

Tab. Tabelle

VO Verordnung

VR Versuchsreihe

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Tabellenverzeichnis

Tab. 1 Gruppeneinteilung 14

Tab. 2 Verwendete Futterzusätze 16

Tab. 3 Futterrezeptur [g/kg] 19

Tab. 4 Zusammensetzung der Krebs-Henseleit-Lösung für die Agarbrücken 26 Tab. 5 Pufferzusammensetzung Ussing-Kammer-Versuche 27 Tab. 6 Unidirektionale Fluxraten von ³H-Mannit [nmol·cm^-2·h^-1] 67

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1 Einleitung

Infektionen mit Salmonellen sind eine der häufigsten Ursachen für Durchfallerkrankungen beim Menschen. Im Jahr 2008 wurden gemäß Meldepflicht nach Infektionsschutz-Gesetz (IfSG) insgesamt 45.401 Infektionen gemeldet, davon 42.902 Erkrankungen (2009). Davon entfallen rund 70% auf Salmonella Enteritidis, 25% auf Salmonella Typhimurium und ca. 1% auf Salmonella Infantis (ROBERT- KOCH-INSTITUT 2006). Das weltweit dominierende Serovar ist Salmonella Enteritidis (GANTOIS et al. 2008).

Im Folgenden wird die vereinfachte Schreibweise mit der international verwendeten Abkürzung Salmonella für Salmonella enterica Subspezies enterica und der nachfolgenden Bezeichnung für das Serovar verwendet. Zum Beispiel wird statt der korrekten Schreibweise Salmonella enterica Subspezies enterica Serovar Enteritidis nur Salmonella Enteritidis ausgeschrieben.

1.1 Rechtliche Grundlagen

In der Hühner-Salmonellen-Verordnung (2009) werden Salmonellen in zwei Kategorien eingeteilt. Zur Kategorie 1 gehören Salmonella Enteritidis und Salmonella Typhimurium (jeweils ausgenommen Impfstämme) und zur Kategorie 2 Salmonella Hadar, Salmonella Virchow und Salmonella Infantis (ebenfalls ausgenommen Impfstämme). Der Verdacht auf eine Infektion mit Salmonellen dieser beiden Kategorien oder mit Salmonella Gallinarum Pullorum ist vom Besitzer eines Zuchtbetriebes oder einer Brüterei unverzüglich der zuständigen Behörde mitzuteilen. Besitzer eines Aufzucht-, Legehennen- oder Masthähnchenbetriebes sind verpflichtet, den Verdacht auf eine Infektion mit Salmonellen der Kategorie 1 oder mit Salmonella Gallinarum Pullorum unverzüglich mitzuteilen (§4). Die Impfung gegen Salmonellen der Kategorien 1 und 2 kann von der zuständigen Behörde für Betriebe angeordnet werden, in denen weniger als 250 Hühner zu Zucht- und Vermehrungszwecken, weniger als 350 Junghennen oder weniger als 350 Hühner zum Zwecke der Konsumeierproduktion gehalten werden (§3).

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Die Verordnung 2160/2003 sieht vor, dass Bekämpfungsmaßnahmen die gesamte Lebensmittelkette vom Erzeuger bis zum Verbraucher umfassen sollen. Bei Geflügelfleisch sei anzustreben, dass nur solches vermarktet wird, bei dem mit ausreichender Sicherheit davon ausgegangen werden kann, dass es frei von den betreffenden Salmonellen (Salmonella Enteritidis, Salmonella Typhimurium, Salmonella Hadar, Salmonella Virchow und Salmonella Infantis) ist. Auch Bekämpfungsmaßnahmen und Handelsbedingungen sowie Übergangsregelungen sind in dieser Verordnung festgelegt.

1.2 Die aviäre Darmflora

Neben der Leber ist die Darmflora das aktivste Stoffwechselkompartiment im ganzen Organismus. Fakultative Anaerobier sind dabei für die Entstehung und Aufrechterhaltung des anaeroben Milieus im Dickdarm essentiell. Zudem wirkt die intestinale Flora als Barriere gegen pathogene Keime, sorgt für die Energieversorgung der Mukosa und reguliert die Darmperistaltik sowie die Entwicklung und Funktion des intestinalen Immunsystems (SHANAHAN 2002;

GUARNER u. MALAGELADA 2003). Die ausgewogene mikrobielle Flora gesunder Individuen kann nicht detailliert definiert werden, da die Komposition variabel und von vielen Faktoren abhängig ist (HOLST u. BREVES 2005). Zwei wichtige Faktoren, die die mikrobielle Flora beeinflussen, sind die Ernährung und das Alter der Vögel (BARNES 1972). Die natürliche Darmflora schützt die Tiere in hohem Maße, wie es ein Experiment von COLLINS und CARTER (1978) verdeutlicht. Während keimfreie Mäuse bereits durch 10 KbE von Salmonella Enteritidis getötet wurden, betrug die letale Dosis bei konventionellen Mäusen 10⁶ KbE. Die im Darm etablierte Flora ist sehr stabil, kann jedoch durch diätetische und umweltbedingte Faktoren beeinflusst werden. Die drei wichtigsten Faktoren sind exzessive Hygiene, Antibiotika-Therapie und Stress. Wird die Komposition der Flora durch diese Faktoren verändert, führt das zu einer erhöhten Anfälligkeit des Tieres für Infektionskrankheiten (FULLER 1989).

Die Entwicklung der Darmflora wird bei Küken durch den oft fehlenden Kontakt zu

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(METHNER 2000). Der Hauptanteil der Entwicklung der Bakterienflora im Darm von Küken findet in den ersten 24 Stunden nach der Futteraufnahme statt. In diesem Zeitfenster sollten die Tiere im Idealfall mit der Mehrzahl der Keime in Kontakt kommen, mit denen sie auch weiterhin konfrontiert werden (LEV und BRIGGS 1956).

Die weitere Etablierung der Darmflora variiert in Abhängigkeit von den Haltungs- und Fütterungsbedingungen. Sie erstreckt sich im Dünndarm über einen Zeitraum von circa zwei Wochen und im Caecum über bis zu sechs Wochen (BARNES et al. 1972;

1980).

Die Darmmukosa ist nicht nur eine physikalische Barriere sondern auch der Initiator einer angeborenen Immunantwort auf die Salmonelleninfektion. BERNDT et al.

(2007) untersuchten das Potential von vier Salmonella enterica-Serovaren, in die Darmmukosa einzudringen und eine Immunantwort auszulösen. Während für Salmonella Typhimurium und Salmonella Hadar eine moderate und für Salmonella Infantis fast keine Invasivität nachgewiesen werden konnte, zeigte sich Salmonella Enteritidis sehr invasiv. Diese Beobachtungen gehen mit den Daten über die zelluläre Immunantwort und Interleukin mRNA- Expression im Caecum einher. Die Invasivität in die Lamina propria korrelierte mit erhöhten Zahlen von Granulozyten, CD8⁺-Zellen und TCR1⁺-Zellen und erhöhten mRNA-Expressionsraten für Interleukin 12 und 18 sowie TNFα und iNOS (inducible nitric oxide synthase) im Caecum.

Veränderungen bei TCR2⁺- und CD4⁺-Zellen wie auch bei der IL2 mRNA-Expression zeigten sich dagegen eher von einer Infektion der Epithelzellen abhängig. Diese Studie zeigte neben einer schnellen und signifikanten mRNA-Expression von Cytokinen als Reaktion auf eine Salmonelleninfektion auch den Zusammenhang zwischen der Invasivität der Serovare und dem Level der Cytokin-Produktion.

Zur Erzielung einer effektiven Elimination wirkt ein hoch spezialisiertes lymphoides Gewebe im Darm: GALT (Gut Associated Lymphoid Tissue). Eine Eigenschaft des GALTs ist die Formung eines charakteristischen Epithels, welches das lymphoide Gewebe abdeckt und M-Zellen enthält. Diese M-Zellen können bestimmte Antigene aus dem Darmlumen aufnehmen. Im Gegensatz zum hoch organisierten GALT beim Säugetier ist das der Vögel weniger gut entwickelt. Das meiste aviäre Darmgewebe ist vom Lumen durch einfaches Epithel abgetrennt. Einige spezialisierte Gewebe wie

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die Caecaltonsillen, Peyer’sche Platten und das Meckel’sche Divertikel (BEFUS et al.

1980; BURNS u. MAXWELL 1986) komplettieren das Immunsystem beim Vogel.

Der Einsatz von Probiotika ist ein möglicher Ansatz zur Verminderung des Übertrittes von Salmonellen in die Lebensmittelkette. Es gibt zahlreiche Studien, die eine gesundheitsfördernde Wirkung von mit Mikroorganismen versetzten Lebensmitteln vermuten lassen (SULLIVAN u. NORD 2002a; b). LEV und BRIGGS (1956) zeigten, dass sich bei Hühnern nach der Fütterung mit einer Lactobacillus-Kultur eine ausbalancierte Milchsäure-Mikroflora in Duodenum, Ileum und Caecum innerhalb von 24 Stunden etablierte.

1.3 Salmonellen – Epidemiologie, Klinik und Bekämpfung

Aufgrund der Pathogenese und Infektionsbiologie kann Salmonella enterica Subsp.

enterica beim Geflügel in zwei Gruppen eingeteilt werden. Die erste beinhaltet die wirtsadaptierten Serovare Gallinarum Gallinarum und Gallinarum Pullorum, die die Pullorum-Krankheit bzw. Hühner-Typhus verursachen (CLARKE u. GYLES 1993).

Die andere Gruppe besteht aus nicht wirtsadaptierten Serovaren, die Paratyphus- Infektionen verursachen. Dies sind vor allem Salmonella Enteritidis, Salmonella Typhimurium, Salmonella Hadar, Salmonella Virchow und Salmonella Infantis. Die Übertragung von Salmonellen von Haus- (vor allem Geflügel, Schweine und Rinder) und Wildtieren auf den Menschen erfolgt vorwiegend über den Verzehr kontaminierter Lebensmittel tierischen Ursprungs. Bei den infizierten Tieren ruft diese Spezies jedoch oftmals keine Krankheitsanzeichen hervor (KELLER et al. 1995;

METHNER et al. 1995), wodurch eine Einschätzung des Risikos einer möglichen Kontamination erschwert wird. Klinische Symptome sind von der Verlaufsform der Salmonellose abhängig. Latente Infektionen zeigen oft keine klinischen Merkmale, wohingegen in akuten septikämischen Fällen Somnolenz, starker Durst, Appetitlosigkeit, Mattigkeit, Gefiedersträuben, vermehrtes Wärmebedürfnis, Flügelhängen und profuser Durchfall auftreten können. Klinisch auffällige Tiere erholen sich in der Regel rasch. Die Inkubationszeit beträgt zwei bis sechs Tage (HEIDER u. MONREAL 1992). In den meisten europäischen Geflügelbeständen

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Wie auch bei Hühnern verläuft die Salmonellose mit Serovaren der Paratyphus- Gruppe bei Enten überwiegend ohne das Auftreten klinischer Krankheitsanzeichen.

Laut HENRY (2000) wird vermutet, dass eine genetisch bedingte Toleranz der Grund hierfür ist. Die Hauptsymptome einer Salmonellose (Apathie, Diarrhoe, Kachexie, Dehydration) treten lediglich bei sehr jungen Entenküken auf. Durch Salmonella Typhimurium verursachte septikämische Infektionen, die sich bei älteren Mastenten seltener äußern, führen bei Entenküken in den ersten Lebenswochen zu Lungenödemen, Leber- und Lungenstauungen und einer Vergrößerung der Milz.

Infektionen mit Salmonella Enteritidis führen nach einer Septikämie in der ersten Lebenswoche zu einer Absiedlung des Erregers auf seröse Häute und innere Organe, evt. gefolgt fibrinöser Perikarditis und Polyserositis sowie Nekrosen.

Bei Puten führen Infektionen mit Salmonellen unter den bakteriellen Infektionen zu den höchsten wirtschaftlichen Verlusten (HAFEZ u. JODAS 2000). Die Mortalität beträgt bei Puten bis zu 20% und in schweren Fällen bis zu 80% (BIERER 1960).

Während die Mehrzahl der klinischen Symptome sich mit denen anderer Geflügelspezies deckt, tritt Diarrhoe bei Puten oft nicht auf. Lahmheiten als Folge von Arthritiden sind nicht ungewöhnlich (HAFEZ u. JODAS 2000).

Die Empfänglichkeit von Küken für eine Infektion mit Salmonellen, die nicht wirtsadaptiert sind, wie z. B. Salmonella Enteritidis und Salmonella Typhimurium (ROLLE u. MAYR 2002), nimmt mit steigendem Alter ab (METHNER 2000).

Salmonellen sind hauptsächlich in den Blinddärmen lokalisiert (BARROW et al.

1988). Während Salmonella Enteritidis eher systemische Infektionen auslöst (NAKAMURA et al. 2002), siedelt sich Salmonella Typhimurium lokal vor allem im Kropf, den Caeca sowie der Kloake an und weniger in anderen Teilen des Intestinaltraktes. In Abwesenheit der üblichen mikrobiellen Flora scheinen Salmonellen sich durch die entstandenen verfügbaren Nischen an jedem Punkt des Verdauungstraktes ansiedeln zu können (SOERJADI et al. 1982). Um eine Enteritis auszulösen, müssen Salmonellen in der Lage sein, im sauren Milieu des Magens zu überleben und gegenüber Gallensalzen zu bestehen. Sie müssen zudem Kontakt zu den basolateralen Seiten der Epithelzellen haben, um eine inflammatorische Antwort

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auszulösen, da ein wichtiger Rezeptor für bakterielles Flagellin, der Toll-like Rezeptor 5, nur basolateral lokalisiert ist (GEWIRTZ et al. 2001). In Makrophagen kann Salmonella Typhimurium in die Leber und Milz transportiert werden. Die Bakterien, die extrazellulär bleiben, können oben genannte Organe über die Lymphe im Ductus thoracicus und das Blut erreichen. Salmonellen vermehren sich dort mit einer Rate von 0,5-1,5 log/Tag (COTTER u. DIRITA 2000).

Eine wirkungsvolle Bekämpfung der Salmonellose sollte die gesamte Lebensmittelkette wie auch die Geflügelbestände betreffen (METHNER et al. 1995).

Sie wird durch die Fähigkeit der Bakterien, im gesunden Tier zu persistieren, und die Entstehung unüberschaubarer Infektketten erschwert (SELBITZ et al. 2006). Eine Bekämpfung ist bei Salmonellen im Sinne der Hühnersalmonellen-Verordnung (2009) (Salmonella Enteritidis und Salmonella Typhimurium, ausgenommen Impfstämme) vorgeschrieben. Neben Hygienemaßnahmen in den Beständen ist vor allem die Impfung in Zuchtbeständen ab einer bestimmten Betriebsgröße als Maßnahme zur Minderung des Salmonellen-Vorkommens bei Hühnern vorgesehen. Die Impfung gegen Salmonellen zielt nicht nur auf eine Verbesserung der Gesundheit der Tiere oder eine höhere Produktivität, sondern vor allem auf den Schutz des Menschen vor dieser Zoonose (BARROW 2003). Sie soll Ausmaß und Dauer der Ausscheidung durch infizierte Tiere vermindern, die Zahl symptomloser Trägertiere reduzieren und die Immunität stimulieren. Da Salmonellen fakultativ intrazellulär sind, werden vor allem Lebendimpfstoffe eingesetzt. Anforderungen an Lebendimpfstoffe sind im Anhang I der Richtlinie 2001/82 der EU zur Schaffung eines Gemeinschaftskodes für Tierarzneimittel im Titel II unter „Besondere Anforderungen an lebende Vakzinen“

beschrieben (VO_2001/82/EG). Eine wichtige Voraussetzung für den Einsatz von Lebendimpfstoffen ist die Unterscheidbarkeit des Impfstoffes von „wilde(n) Salmonellastämmen“ (VO_1091/2005; SELBITZ et al. 2006). Lebendimpfstoffe bewirken im Gegensatz zu inaktivierten Vakzinen eine humorale und zellvermittelte Immunität (BARROW 2005). Die beim Huhn angewandten Lebendimpfstoffe werden oral verabreicht und nehmen so den natürlichen Weg der Infektion. So wird den Lymphozyten des darmassoziierten Lymphgewebes das Antigen direkt präsentiert

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und die Produktion sekretorischen IgAs induziert (CLARKE u. GYLES 1993). In einer Studie von BARROW et al. (1993) wurden nach der Verabreichung von Lebendimpfstoffen weniger Salmonellen nachgewiesen als bei ungeimpften Tieren.

Zudem war die Zeitspanne, in der Salmonellen detektiert werden konnten, kürzer.

1.4 Probiotika – Definition und Anwendung

Fermentierte Milchprodukte werden schon seit Jahrtausenden medizinisch eingesetzt. Jedoch erst in den letzten Jahrzehnten wurde die Wirksamkeit von Probiotika intensiv erforscht.

Der Begriff „Probiotikum“, der aus dem Griechischen stammt und „für das Leben“

bedeutet („pro bios“), wurde von LILLY und STILWELL (1965) eingeführt. Sie verstanden darunter von Mikroorganismen gebildete Substanzen, die andere Mikroorganismen beeinflussen können. Die Bezeichnung „Probiotikum“ basiert darauf, dass die von ihnen untersuchten Mikroorganismen (Ciliaten) sich gegensätzlich zu Antibiotika verhielten. Es wurde allerdings lediglich eine Wachstumsförderung der Ciliaten beschrieben, der Einfluss auf Gesundheitsaspekte blieb gänzlich unbehandelt (HOLST u. BREVES 2005). Die Definition von LILLY und STILWELL wurde von PARKER (1974) eingegrenzt. Er beschrieb Probiotika als Substanzen und Organismen, die zum Gleichgewicht der Darmflora beitragen. Die noch heute anerkannte Definition von FULLER (1989) besagt, dass Probiotika lebende Futterzusätze sind, die sich begünstigend auf das Gleichgewicht der intestinalen Mikroflora auswirken. Diese Definition verdeutlicht die Wichtigkeit lebender Zellen als essentielle Komponente eines effektiven Probiotikums.

OUWEHAND et al. (1999) definierten eine Reihe von Soll-Eigenschaften, die ein Probiotikum erfüllen muss, um als solches zu gelten. Dazu zählt vor allem die Resistenz gegen Säuren, Gallenflüssigkeit und Enzyme des Darmtraktes. Ohne diese Resistenz könnte während der Darmpassage die biologische Aktivität und Adhäsionsfähigkeit des Probiotikums nicht aufrechterhalten werden. Ein weiterer Punkt ist die Anwendungssicherheit, worunter eine Vermeidung der Schädigung des Darmepithels und eine eindeutige Identifizierung des probiotischen Stammes zu

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verstehen sind. Zusätzliche, nicht essentielle Eigenschaften können das Probiotikum für einen speziellen Einsatz besonders auszeichnen. Darunter fallen laut DUNNE et al. (1999) die Produktion antimikrobieller Substanzen sowie die Beeinflussung metabolischer Aktivitäten und des Immunsystems.

Der Begriff „Probiotikum“ steht heute für das fertige Produkt, wobei es sich bei den enthaltenen Mikroorganismen, die lebend oder lebensfähig sein müssen, um Bakterien oder Hefen handeln kann (HOLST u. BREVES 2005). Zur Herstellung von Probiotika für den Einsatz bei Mensch und Tier werden oft Stämme der Genera Aspergillus, Bacillus, Leuconostoc, Pediococcus, Saccharomyces und Streptococcus verwendet (SIMMERING u. BLAUT 2001). Eine große Rolle spielen hier Laktat- produzierende Laktobazillen und Bifidobakterien (FULLER 1989; SAUTER et al.

2006). Wenn sich nach der Geburt die Darmflora entwickelt, nehmen Laktobazillen- Populationen zu, während die Populationen anderer Mikroorganismen abnehmen (SMITH 1965). Darin ist der häufige Einsatz von Laktobazillen begründet. Ihre positiven Effekte werden seit Jahrzehnten diskutiert. Laktobazillen und Bifidobakterien sind resistent gegen Magensäure, Gallensalze und Pankreas- Enzyme, können sich an die intestinale Mucosa anheften und den Gastrointestinaltrakt besiedeln (ROLFE 2000). Sie gehören zur normalen Mikroflora.

Mehrere Stämme produzieren neben Laktat auch andere antimikrobielle Substanzen wie Hydrogenperoxide und Bakteriocine (ALVAREZ-OLMOS u. OBERHELMAN 2001). Laktobazillen konnten nachweislich die Ansiedlung von Salmonellen im Kropf von Hühnern vermindern (FULLER 1977), nicht jedoch in den Blinddärmen (ADLER u. DAMASSA 1980; WATKINS u. MILLER 1983).

Ein probiotisches Präparat kann einen oder mehrere Stämme von Mikroorganismen enthalten (FULLER 1989). Während einige Autoren keinen positiven Einfluss von Probiotika auf die Darmflora und die Futterverwertung (NETHERWOOD et al. 1999;

PALLIYAGURU et al. 2004) oder die Verhinderung einer klinischen Infektion mit Salmonellen (PRIYANKARAGE et al. 2004) feststellen konnten, beobachtete die Mehrzahl jedoch eine protektive Wirkung der eingesetzten Probiotika. Die potenzielle

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Wirkung dieser Stämme beinhaltete die Stimulierung des Immunsystems (ISOLAURI et al. 1995; HOLZAPFEL et al. 1998; KASPER 1998; OUWEHAND et al. 1999;

ROLFE 2000; YOUNG u. HUFFMAN 2003; OTTE u. PODOLSKY 2004), die Produktion antibakterieller Substanzen (CUMMINGS 1981; OUWEHAND et al. 1999;

EHRMANN et al. 2002), die Konkurrenz um Rezeptoren und Nährstoffe (GUPTA et al. 2000; ROLFE 2000; YOUNG u. HUFFMAN 2003), die Verminderung der Entstehung von Tumoren (MATSUZAKI et al. 1998; BRADY et al. 2000; ROLFE 2000), die Regulation intestinaler Enzymaktivitäten (GOLDIN et al. 1992; LING et al.

1994; PEDROSA et al. 1995; SPANHAAK et al. 1998) und die Synthese von Vitaminen (HOLZAPFEL et al. 1998). Die genauen Mechanismen sind allerdings nicht hinreichend bekannt, es wird jedoch angenommen, dass die direkte Konkurrenz um intestinale Bindungsstellen bzw. das Blockieren derselben für Salmonellen der wahrscheinlich wichtigste Mechanismus der Wirkung dieser Präparate darstellt (METHNER 2000). Laut SOERJADI et al. (1982) bildet die verabreichte Mikroflora eine mechanische Schutzschicht, die den Kontakt der Salmonellen mit der Darmwand unterbindet.

Ein häufiges Problem im Einsatz probiotischer Futterzusatzstoffe ist die oft nur transiente Kolonisation der Probiotika im Darm des Wirtes (JOHANNSON et al. 1993;

LINK-AMSTER et al. 1994; SPANHAAK et al. 1998). In neueren Studien konnte allerdings gezeigt werden, dass auch nach Absetzten des Probiotikums einige Stämme noch mehrere Wochen im Darm des Wirtes persistieren können. BARTH et al. (2009) wiesen noch 38 Tage nach Beendigung der Verabreichung des Probiotikums Mutaflor® (EcN) an Ferkel den Stamm in den Faeces der Tiere nach.

Post mortem konnten in Jejunum, Ileum, Caecum und Colon der meisten Ferkel EcN nachgewiesen werden. In einer Studie von VAHJEN et al. (2007) besiedelten die Probiotika Ent. Faecium NCIMB10415 und Bacillus cereus var. toyoi CNCM I-1012 den Darm konventioneller Ferkel 56 Tage lang.

Der Einsatz von Probiotika kann sowohl prophylaktisch als auch therapeutisch sein.

Während beim Nutztier oft leistungssteigernde Effekte (Verbesserung der

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Futterverwertung oder der Gewichtszunahme) im Vordergrund stehen, geht es beim Menschen und Kleintier eher um eine Verbesserung der Gesundheit.

Nach Meinung der Befürworter des Probiotikaeinsatzes könnten diese Präparate die jahrelang eingesetzten Antibiotika ablösen. Diese wurden auch wegen ihrer wachstumsfördernden Wirkung appliziert. Aufgrund des vermehrten Auftretens multipler Resistenzen (WRAY u. DAVIES 2000) und unerwünschter Antibiotika- Rückstände in tierischen Produkten (JIN et al. 1997) wurde 2006 der Einsatz von Antibiotika als Wachstumsförderer verboten (VO_1831/2003).

Hintergrund der durchgeführten Untersuchungen sind Studien des Physiologischen Institutes der Tierärztlichen Hochschule Hannover, die Interaktionen zwischen Probiotika und der Darmmukosa von Schweinen aufzeigten. In einer Studie von SCHRÖDER et al. (2004) wurden die Effekte von Saccharomyces boulardii auf den Natrium- und Chlorid-Transport im Schweine-Jejunum unter basalen und stimulierten (sekretorischen) Bedingungen untersucht. Dazu wurde die konventionelle Ussing- Kammer-Methode verwendet, um elektrische Parameter (Kurzschlussstrom Isc, Gewebeleitfähigkeit Gt) und den Elektrolyttransport des isolierten intakten Jejunumepithels in Ab- und Anwesenheit von Theophyllin zu bestimmen.

Saccharomyces boulardii zeigte spezifische zeitabhängige Effekte auf den sekretorischen Response der Schweine-Jejunum-Mukosa, die sich während der acht-tägigen Behandlung entwickelten, aber unter weiterer Applikation verschwanden. Die Induktion der Sekretion durch Theophyllin erzielte nennenswerte Anstiege des basalen Jms von Na⁺ während der acht-tägigen Behandlung, wohingegen die Fluxraten in die andere Richtung gleich blieben. Theophyllin hemmt den Abbau von cAMP und cGMP. Oral verabreichter Saccharomyces boulardii beeinflusst relevante Funktionen der Mucosa des Schweine-Jejunums wie die Verminderung des sekretorischen Responses auf Theophyllin oder die Stimulation des Natrium-Glucose-Kotransportes. Diese Studie unterstützt das Konzept, dass Probiotika positive Effekte auf den Gastrointestinaltrakt haben. Zudem etablierten SCHRÖDER et al. (2006) ein Schweinemodell, in dem eine Vorbehandlung mit dem probiotischen Stamm E. coli strain Nissle 1917 (EcN) im Hinblick auf eine

(25)

Verhinderung der akuten sekretorischen Diarrhoe bewertet wurde. In diesem Modell wurden 10¹⁰ KbE des porcinen enterotoxischen E. coli Abbotstown (EcA) oral an Absatzferkel (d 21 post natum) verabreicht. 48 Stunden nach der Infektion wurden elektrophysiologische Parameter des isolierten intakten jejunalen Epithels in der Ussing-Kammer charakterisiert. In Einklang mit den klinischen Zeichen der Diarrhoe zeigten die Gewebe der infizierten Tiere einen Overshoot des sekretorischen Response nach Stimulation des cAMP-vermittelten second-messenger-Weges durch Forskolin, was eine höhere Erregbarkeit des Chlorid-Sekretions-Systems unter Infektionsbedingungen zeigte. Eine EcN-Vorbehandlung verhinderte vollständig das Auftreten von klinischen Symptomen sekretorischer Diarrhoe bei behandelten und infizierten Tieren. Zudem zeigten die Epithelien im Jejunum dieser Tiere keinen Overshoot des sekretorischen Response nach Stimulation mit Forskolin. Diese Studien zeigten zum ersten Mal die Effizienz von prophylaktischer EcN-Behandlung gegen den Effekt enterotoxischer EcA. Diese und andere Studien (WINCKLER et al.

1998; BREVES et al. 2000) konnten zeigen, dass elektrophysiologische Gewebeeigenschaften wie der Kurzschlussstrom (Isc) oder die Gewebeleitfähigkeit (Gt) durch die eingesetzten Probiotika (Saccharomyces boulardii und Bacillus cereus var. toyoi) unbeeinflusst blieben, wohingegen der sekretorische Response nach Theophyllin-Zugabe nach Saccharomyces boulardii-Gabe signifikant reduziert war.

Auch die parazelluläre Permeabilität war reduziert, repräsentiert durch niedrigere unidirektionale Mannit-Fluxraten.

1.5 Ziel dieser Studie

Ziel dieser Studie war die Etablierung eines Versuchsmodells zum Nachweis der Wirkung probiotischer Futterzusätze gegen eine experimentelle Infektion mit Salmonella enterica bei Broilern.

Dazu wurde erstmals ein Ansatz gewählt, bei dem alle im Tierversuch eingesetzten Probiotika zuvor in vitro auf ihre Hemmwirkung getestet wurden. So konnten in einem aufwendigen Screening-Verfahren die Stämme ausgewählt werden, die die stärkste Hemmwirkung gegen Salmonellen zeigten. Zudem wurden auch die

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Verarbeitungseigenschaften (pH-Stabilität, Temperaturempfindlichkeit u.a.) der probiotischen Stämme beachtet. Die auf diesem Wege vorselektierten probiotischen Stämme konnten folgend hinsichtlich ihres Einflusses auf die Integrität und Funktionalität des Darms bei mit Salmonella enterica infizierterten Broilern geprüft werden.

Methodisch wurde zum einen der Einfluss der Probiotika auf bakteriologische Parameter untersucht. So sollte durch qualitative und quantitative bakteriologische Untersuchungen eine eventuelle Reduktion des Auftretens der Salmonellen bei den Broilern festgestellt werden.

Der andere wesentliche Teil dieser Studie beschäftigt sich mit elektro- und transportphysiologischen Untersuchungen. Neben der Gewebeleitfähigkeit und dem

Kurzschlussstrom bzw. dem Anstieg desselben nach Zugabe von Forskolin (= sekretorischer Response) wurden unidirektionale Mannit-Fluxraten ermittelt.

Die Gewebeleitfähigkeit Gt [mS·cm^-2] zeigt in ihrem Verlauf während der Versuchsphase den Widerstand des Gewebes auf und weist so auf die Integrität desselben hin.

Der sekretorische Response gibt in seiner Ausprägung Hinweise auf die Stärke der Aktivierung des Chlorid-Sekretions-Systems, das maßgeblich an der Entstehung von Durchfallerkrankungen beteiligt ist.

Unidirektionale Fluxraten wurden mittels ³H-markiertem Mannit ermittelt, das aufgrund seiner Molekülgröße parazellulär transportiert wird. Die so gewonnenen Werte geben wertvolle Hinweise auf eine Beteiligung des parazellulären Transportweges bei Salmonelleninfektionen und eventuelle Änderungen nach Fütterung von probiotischen Futterzusatzstoffen.

Die Kombination dieser Methoden trug zur Entwicklung eines geeigneten Modells zur Untersuchung des Einflusses probiotischer Futterzusatzstoffe auf Infektionen mit Salmonella enterica bei.

(27)

Diese Arbeit basiert auf der Hypothese, dass Salmonelleninfektionen, auch wenn sie keine Krankheitsanzeichen auslösen, die oben genannten Parameter verändern und so den Organismus beeinflussen. Der Einsatz von Probiotika soll die Küken vor einer Infektion mit Salmonellen schützen, indem die natürliche Darmbarriere gestärkt wird.

(28)

2 Material und Methoden 2.1 Versuchsaufbau

2.1.1 Gruppeneinteilung

Zur Etablierung der Methoden und des Versuchsablaufes wurden die ersten beiden der insgesamt fünf Versuchsreihen ohne den Einsatz probiotischer Futterzusätze durchgeführt. Die Küken wurden am Einstallungstag willkürlich in die Gruppen aufgeteilt. In der ersten Versuchsreihe wurde ein Drittel der Tiere mit Salmonella Enteritidis infiziert, ein Drittel zusätzlich mit der TAD Salmonella vac E-Vakzine geimpft und ein Drittel diente als Kontrolle. Der eingesetzte Impfstoff wird bereits in der Praxis erfolgreich verwendet und so war der Einsatz dieser drei Gruppen zur Etablierung gut geeignet. In der zweiten Versuchsreihe wurde Buttersäure-Glycerid einer der drei Gruppen über das Futter verabreicht, die zusätzlich mit Salmonella Enteritidis infiziert wurde. Eine weitere Gruppe wurde lediglich infiziert und Gruppe drei diente als Kontrolle. Sie erhielt weder den Infektions- noch den Impfstamm.

Tab. 1 Gruppeneinteilung

VR Gruppe 1 Gruppe 2 Gruppe 3 Gruppe 4

1 Infektion Impfung + Infektion Kontrolle 2 Buttersäure-Glycerid +

Infektion Infektion Kontrolle

3 Kontrolle Infektion P1 + Infektion P2 + Infektion 4 P3 + Infektion P4 + Infektion Infektion

5 P3 + Infektion P5 + Infektion Infektion

P1-P5: Probiotikum 1-5

In der dritten Versuchsreihe wurden erstmals Probiotika eingesetzt (P1 in Gruppe 3 und P2 in Gruppe 4). Die jeweiligen Gruppen wurden zusätzlich mit Salmonella

(29)

Enteritidis infiziert. Gruppe 2 wurde lediglich infiziert, Gruppe 1 diente als Kontrolle. In dieser Versuchsreihe wurden vier verschiedene Gruppen eingesetzt, da Ergebnisse innerhalb einer Versuchsreihe sich besser vergleichen lassen als zwischen einzelnen Versuchsreihen.

Da die Kontrollgruppen in den ersten drei Versuchsreihen konstante Ergebnisse erzielten, wurden in den letzten beiden Versuchsreihen keine Kontrollgruppen eingesetzt. So konnte die Tierzahl erhöht werden und gleichzeitig war es möglich, zwei Probiotika in derselben Versuchsreihe zu untersuchen.

In der dritten Versuchsreihe wurden die Probiotika P3 und P4 sowie eine Infektions- Gruppe untersucht, nachdem alle Tiere mit Salmonella Enteritidis infiziert worden waren. Das Probiotikum P3 wurde auch in der fünften Versuchsreihe getestet, allerdings wurden die Tiere dieser Versuchsreihe mit Salmonella Infantis, und nicht wie in den anderen Versuchsreihen mit Salmonella Enteritidis, infiziert.

Bei allen in den Versuchsreihen 3-5 eingesetzten Probiotika handelt es sich um Laktobazillen bzw. bei P5 um Bacillus cereus var. toyoi.

Die Probiotika wurden in Konzentrationen zwischen 0,1 und 2,0 g pro kg Futter verabreicht (siehe Tabelle 2). Bei dem in der zweiten Versuchsreihe eingesetzten Buttersäure-Glycerid handelt es sich um ein Gemisch aus Mono-, Di- und Triglyceriden (65% Buttersäure, 35% Silica). Die Probiotika wurden in unterschiedlichen Konzentrationen im Futter eingesetzt, um die Dosisabhängigkeit einer möglichen „protektiven“ Wirkung des probiotischen Stammes zu prüfen.

(30)

Tab. 2 Verwendete Futterzusätze

VR Probiotikum Stamm

Konzentration im Futter

[g·kg^-1]

1 - - -

2 Buttersäure-Glycerid 1,5

3 P1 Lactobacillus delbrueckii spp. indicus 2,0 P2 Lactobacillus delbrueckii spp. indicus 0,5 4 P3 Lactobacillus delbrueckii spp. indicus 0,5

P4 Lactobacillus sp. 0,5

5 P3 Lactobacillus delbrueckii spp. indicus 0,5

P5 Bacillus cereus var. toyoi 0,1

VR = Versuchsreihe

(31)

2.1.2 Versuchsablauf

Die Dauer der Versuchsreihen betrug jeweils 29 Tage, wobei die Küken am 1.

Lebenstag willkürlich in die Gruppen eingeteilt und eingestallt wurden.

Am ersten Lebenstag wurde eine Sammelkotprobe entnommen (siehe Kapitel 2.4.1.1).

Bis auf die Kontrollgruppen wurden alle Gruppen am 13. Lebenstag mit Salmonellen infiziert (= Challenge) (siehe Kapitel 2.3).

Kloakale Tupferproben wurden vor und zwei, fünf und acht Tage nach der Infektion von je 10 Tieren pro Gruppe entnommen (siehe Kapitel 2.4.1.2).

d1 Einstallung

d 13 Challenge d 6 Tupferproben

d 15 Tupferproben d 18 Tupferproben

d 21 Tupferproben

d 19 Bakteriologische Untersuchung

d 18-29 elektrophysiologische Versuche + Histologie

Abb. 1: Versuchsablauf d=Tag

(32)

Am 19. Lebenstag fand eine quantitative bakteriologische Untersuchung von je 15 Tieren pro Gruppe statt (siehe Kapitel 2.4.2).

Für die Histologie und zum Einspannen in die Ussingkammern wurden an den Lebenstagen 18, 20, 21, 22, 25, 26, 27, 28 und 29 Proben von je einem Tier pro Gruppe entnommen (siehe Kapitel 2.5 und 2.6).

Von jedem Tier wurde bei Einstallung und vor dem Töten das Gewicht ermittelt. In der ersten, zweiten und vierten Versuchsreihe wurden die Futterzusätze ab dem ersten Lebenstag gefüttert, in der dritten und fünften Versuchsreihe ab dem 7.

Lebenstag.

2.2 Versuchstiere

2.2.1 Herkunft, Haltung und Fütterung

Die Ross-Mastküken aller Versuchsreihen stammten aus der BWE-Brüterei Weser- Ems und wurden am ersten Lebenstag eingestallt. Sie stammten von geimpften Elterntieren, die gemäß EG (VO_2160/2003) und EG (VO_1003/2005) auf Salmonellen überwacht wurden. Zum Schlupfzeitpunkt waren die Ergebnisse der Eigenkontrollen der Brüterei und der amtlichen Untersuchungen negativ.

Die Tiere wurden auf perforierten Gummimatten mit einer Besatzdichte von durchschnittlich 12 kg·m^-2 gehalten. Sie erhielten Futter und Wasser ad libitum.

Die Küken wurden in Gruppen von 25–35 Tieren gehalten. Eine Einzelhaltung wurde aus Platz- und tierschutzrechtlichen Gründen nicht gewählt. Die Besatzdichte betrug bei einer Stallgröße von 0,85–1,7 m² zu keiner Zeit mehr als 15 kg Lebendmasse pro m².

Bei konventionell gehaltenen Broilern handelt es sich sowohl um männliche als auch um weibliche Tiere. Daher wurden in diesen Versuchsreihen die Tiere vor der Einstallung nicht nach Geschlecht getrennt, sondern willkürlich in die Gruppen eingeteilt, um der Praxis der Mastgeflügelhaltung so nahe wie möglich zu kommen.

Der Tierversuch wurde vom Niedersächsischen Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit genehmigt.

(33)

Die Zusammensetzung des Grundfutters ist in Tabelle 3 aufgeführt. Sie war in allen Versuchsreihen gleich.

Tab. 3 Futterrezeptur [g/kg]

Mais 382

Weizen 220

Sojaex 220

Hamlet Protein (Sojakonz.) 80

Sojaöl 60

Futterkalk ks. 5

Futterkalk ps. 18

Viehsalz 1

Lysin HCl 0,7

DL-Methionin 2,8

L-Threonin 0,5

Vormischung 10

2.2.2 Temperatur- und Lichtregime

Die Tiere wurden bei einer Lichtperiode von 14 Stunden und einer Dunkelphase von zehn Stunden gehalten. Die Temperatur wurde von anfänglichen 34°C schrittweise alle zwei Tage um circa 1°C erniedrigt und in den letzten Tagen bei 21°C gehalten.

2.2.3 Kennzeichnung

Am ersten Lebenstag wurden alle Küken mit nummerierten Flügelmarken (Brutmaschinen Janeschitz GmbH, Hammelbrug) gekennzeichnet, die in die Flügelspannhaut des linken Flügels eingezogen wurden.

2.2.4 Töten der Tiere

Die Broiler wurden nach Betäubung durch Blutentzug getötet.

(34)

2.3 Infektion

2.3.1 Herstellung der Challenge-Kultur

Zur Herstellung der Vorkultur wurden 2 BPLS-Platten (BPLS-Agar (mod.) + NA- Säure (100mg/l), Firma Oxoid, Wesel) mit dem Salmonella-Stamm SE 285/93 (Versuchsreihen 1-4), bzw. SI 5295/04 (Versuchsreihe 5) beimpft und bei 37°C 24 Stunden bebrütet.

Danach wurden von einer der Platten 5-6 Kolonien in 2 Reagenzgläser mit je 10ml Tryptosephosphat-Puffer überführt und 6 Stunden bei 37°C zur Herstellung der Hauptkultur bebrütet.

Der Inhalt jedes Reagenzglases wurde daraufhin in einen Kolben mit 100 ml Tryptosephosphat-Puffer gegeben und auf einem Horizontalschüttler bei 60 rpm und 37°C 24 Stunden bebrütet.

Für die nachfolgende Keimzahlbestimmung wurde eine dekadische Verdünnungsreihe bis 10^-9 aus einem Kolben der Hauptkultur angefertigt. Um die Verdünnungsstufe 10^-1 zu erhalten, wurden von der Hauptkultur 1ml entnommen und zu 9ml PBS (phosphate buffered saline) gegeben und mittels eines Reagenzglasschüttlers (Vortex Genie 2, Scientific Industries) gemischt.

Dementsprechend wurden auch die weiteren Verdünnungsstufen hergestellt. Die Verdünnungsstufen 10^-7, 10^-8 und 10^-9 wurden daraufhin ausgespatelt und über Nacht bei 37°C bebrütet.

(35)

Zur Berechnung des gewogenen arithmetischen Mittelwertes wurde die Formel nach PICHARDT (1998) angewandt:

X gew: gewogenes arithmetisches Mittel Summe x: Summe aller KbE aller Platten

n1: Plattenanzahl der niedrigsten Konzentration n2: Plattenanzahl der nächsthöheren Konzentration w1: Gewicht der niedrigsten Verdünnung

w2: Gewicht der nächsthöheren Verdünnung d: Faktor der niedrigsten Verdünnung

Je nach Konzentration erhielten die Tiere je 10⁹KbE in 1-2 ml Suspension.

Mit dem in der fünften Versuchsreihe eingesetzten Salmonella Infantis-Stamm (SI 5295/04) wurde in gleicher Weise verfahren.

2.3.2 Verabreichung der Challenge-Kultur

Die zu infizierenden Tiere erhielten die Challenge-Kultur über eine gebogene Knopfkanüle mit aufgesetzter steriler 1ml-Spritze direkt in den Kropf.

In den Kontrollgruppen erhielt jedes Tier 1ml des unbeimpften Kulturmediums (Tryptosephosphat-Puffer).

2.3.3 Impfung

Die Tiere der Impfgruppe wurden am ersten Lebenstag mit der TAD Salmonella vac E- Vakzine geimpft. Sie erhielten eine Impfdosis von 10⁸ KbE mittels Kropfinstillation.

gew

x n1w1 + n2w2 +

x d

gew

∑

n1w1 + n2w2 + …

= x d X

(36)

2.4 Bakteriologische Untersuchung

2.4.1 Qualitative bakteriologische Untersuchungen 2.4.1.1 Sammelkotprobe

Jeweils am 1. Lebenstag wurde in jeder Versuchsreihe beim Einstallen eine Sammelkotprobe aus den Kisten der Brüterei entnommen. Das Material wurde in Tetrathionat-Lösung (Oxoid, Wesel) 24 Stunden bei 37°C bebrütet und folgend auf BPLS-Nährböden (BPLS-Agar (mod.) + NA-Säure (100mg·l^-1), Firma Oxoid, Wesel) ausgestrichen, die wiederum 24 Stunden bei 37°C bebrütet wurden. So konnte eine qualitative Auswertung erfolgen, die mittels Agglutinationstest mit O9-Antiserum (Sifin Enteroclon Anti-Salmonella O9, SIFIN Institut für Immunpräparate und Nährmedien GmbH, Berlin) abgesichert wurde.

2.4.1.2 Tupferproben

Die kloakalen Tupferproben wurden von zehn willkürlich ausgewählten Tieren je Gruppe an vier verschiedenen Zeitpunkten genommen. Die erste Probennahme fand sechs Tage vor der Infektion, die weiteren drei Probennahmen am zweiten, fünften und achten Tag nach der Infektion statt (siehe Abbildung 1).

Die Tupfer wurden direkt in Tetrathionat-Lösung (Oxoid, Wesel) 24 Stunden bei 37°C bebrütet und folgend auf BPLS-Agar (BPLS-Agar (mod.) + NA-Säure (100mg/l), Oxoid, Wesel) weitere 24 Stunden bei der gleichen Temperatur inkubiert.

Zur Absicherung der qualitativen Ergebnisse fand ein Agglutinationstest mit O9- Antiserum (Sifin Enteroclon Anti-Salmonella O9, SIFIN Institut für Immunpräparate und Nährmedien GmbH, Berlin) statt.

2.4.2 Quantitative bakteriologische Untersuchung

Zum Zweck einer quantitativen bakteriologischen Untersuchung wurden am sechsten Tag nach der Infektion Lebern und Caeca von 7 - 15 Tieren pro Gruppe entnommen.

(37)

In den Versuchsreihen 4 und 5 konnten aufgrund der höheren Tierzahl pro Gruppe 15 Tiere zur quantitativen bakteriologischen Untersuchung herangezogen werden, in den Versuchsreihen 1-3 wurden 7-10 Tiere pro Gruppe untersucht.

Nach der Organentnahme wurden 1g Lebergewebe und eine ebenso große Caecuminhaltprobe genommen. Hierzu wurde die Blinddarmingesta in ein steriles 12ml-PS-Röhrchen (greiner bio-one, Frickenhausen) eingewogen und 1:10 mit PBS (phosphate buffered saline, OMNICHEM, Bremen) verdünnt.

Diese Probe des Caecuminhaltes wurde nach gründlichem Durchmischen (Vortex- Genie 2, Scientific Industries) weitere vier Male 1:10 verdünnt und durch das Aufbringen von je 0,1 ml auf zwei BPLS-Platten (BPLS-Agar (mod.) + NA-Säure (100mg·l^-1), Oxoid, Wesel) entstanden die Verdünnungsstufen 10^-4, 10^-5 und 10^-6. Diese wurden bei 37°C 24 Stunden bebrütet.

1 g Caecuminhalt 9 g PBS

0,5 ml

4,5 ml PBS

0,5 ml 0,5 ml

0,1 ml 0,1 ml

4,5 ml PBS 0,5 ml

0,1 ml

Doppelansatz

Abb. 2 Bakteriologische Untersuchung Caecuminhalt Schematische Darstellung des Untersuchungsganges

(38)

Je 0,1 ml der 1:2 mit PBS verdünnten und im Ultra-Turrax (IKA® - Werke GmbH &

Co.KG, Staufen) homogenisierten Leberprobe wurden auf zwei BPLS-Platten ausgestrichen und bei 37°C 24 Stunden bebrütet.

Abb. 3 Bakteriologische Untersuchung Leber Schematische Darstellung des Untersuchungsganges

Folgend konnte aus den gezählten Kolonien auf den Nährböden die Zahl der koloniebildenden Einheiten (KbE) pro ml errechnet werden. Auch hier wurde wie bei der Herstellung der Challenge-Kultur die Formel zur Berechnung des gewogenen arithmetischen Mittelwertes nach PICHARDT (1998) angewandt.

1 g Leber 1 g PBS

0,1 ml

Doppelansatz

(39)

2.5 Epithel-physiologische Untersuchungen

2.5.1 Aufbau der Ussing-Kammer

Die Versuche in der Ussing-Kammer wurden in Anlehnung an das von Hans Ussing (1949) entwickelte Prinzip durchgeführt. Dabei wurden die 12 einzelnen Kammern über Agarbrücken und Ag/AgCl-Bezugselektroden (Mettler Toledo Prozessanalytik GmbH, Gießen) mit zwei mikrocomputergesteuerten Voltage/Current Clamps (Wissenschaftliche Geräte, Dipl.-Ing. Mußler, Aachen; www.Kmsci.de) verbunden (siehe Abb. 4).

Epithel .

mV

µEq

serosale Seite mukosale Seite

Abb. 4 Schematischer Aufbau der Versuchsapparatur

(40)

Die Agarbrücken zur Registrierung der Potentialdifferenz wurden hergestellt, indem Agar in einer Krebs-Henseleit-Lösung (Tab. 3) ohne Zusatz von Glucose und Mannit (Osmolarität: 270 mosm/l) aufgekocht und mit einer Spritze mit stumpfer Kanüle in Kunststoffschläuche gefüllt wurde.

Tab. 4 Zusammensetzung der Krebs-Henseleit-Lösung für die Agarbrücken

NaCl 6,638 g

KCl 0,403 g

CaCl2 * 2 H2O 0,176 g MgCl2 * 6 H2O 0,244 g HCl (1 mol/l) 0,2 ml NaH2PO4 * H2O 0,083 g Na2HPO4 * 2 H2O 0,427 g

NaHCO3 1,764 g

Aqua dest. ad 1000 ml

(41)

2.5.2 Pufferlösungen

Die Zusammensetzung der Pufferlösungen ist in Tabelle 5 dargestellt. Die serosale unterscheidet sich von der mukosalen Pufferlösung insofern als sie zusätzlich 10 mmol/l Glucose (Fa. Merck KGaA, Darmstadt) und 6 mmol/l Na-gluconat (Fa. Merck KGaA, Darmstadt), dafür aber nur 7 mmol/l Hepes (Fa. Serva GmbH, Heidelberg) (im Gegensatz zu 20 mmol/l mukosal) und kein NaOH enthält.

Den Pufferlösungen wurde 10^-5 mol/l Indomethacin zugesetzt, um die endogene Prostaglandinsynthese zu hemmen und die spontane Chloridsekretion zu minimieren.

Tab. 5Pufferzusammensetzung Ussing-Kammer-Versuche mukosal [mmol/l] serosal [mmol/l]

NaCl 113,6 113,6

KCl 5,4 5,4

1n HCl 0,2 0,2

MgCl2 * 6 H2O 1,2 1,2

CaCl2 * 2 H2O 1,2 1,2

NaHCO3 21,0 21,0

Na2HPO4 * 2 H2O 1,5 1,5

Glucose (wasserfrei) - 10,0

Mannit 2,0 2,0

Hepes 20,0 7,0

Na-gluconat - 6,0

1n NaOH 6,0 -

(Fa. Merck KGaA, Darmstadt)

(42)

A

B C

D

2.5.3 Gewinnung der Proben

Unmittelbar nach dem Töten der Tiere durch Blutentzug wurden die Caeca entnommen und in eisgekühlter, zuvor mit Carbogen begaster serosaler Pufferlösung bis zum Einspannen kurze Zeit aufbewahrt.

Abb. 5 Einteilung der Blinddarmabschnitte

A: Kammer 1, B: Kammer 2, C: Kammer 3, D: Kammer 4

Pro Tier wurden 4 Caeacumabschnitte eingespannt (Kammer 1-4, bzw. 5-8 und 9- 12).

Um während des gesamten Vorgangs und während des Einspannens eine einwandfreie Zuordnung der Darmabschnitte zu gewährleisten, waren sowohl alle Gefäße als auch die verwendeten Klemmen mit beschriftetem Klebeband gekennzeichnet.

Aus dem restlichen Probenmaterial wurden die Proben für die histologischen Untersuchungen entnommen (siehe Kapitel 2.6).

2.5.4 Präparation und Einspannen der Darmabschnitte

Für die Messungen wurden ungefähr 2 cm lange Darmsegmente aus den Caeca der Hühner mesenterial aufgeschnitten und unter ständiger Befeuchtung mit serosalem Inkubationspuffer eingespannt, indem zwischen die beiden Hälften der aus Plexiglas gefertigten Kammern die präparierten Darmepithelien eingesetzt wurden. So bildete die linke Hälfte die serosale Seite (Blutseite), die rechte Hälfte die mukosale Seite (Darmlumenseite). Es wurden Kammern mit einer offenen Fläche von 1,13 cm²

(43)

verwendet. Die Kammern wurden mit je 2 Silikon-Dichtringen versehen, die zusätzlich zur Vermeidung von Randdruckstellen dienten.

Abb. 6 Aufspannen des Darmgewebes auf die serosale Hälfte der Ussing-Kammer

In den in dieser Studie durchgeführten Untersuchungen wurde Caecumgewebe von Hühnern in die Ussing-Kammern eingespannt. Im Allgemeinen wird Darmwandgewebe vor dem Einspannen „gestrippt“. Darunter versteht man das Ablösen der Tunica mucosa (=Mucosa) von den übrigen Gewebeschichten. Dies geschieht, indem das Darmstück mit der Tunica serosa nach unten auf ein mit eisgekühltem serosalen Puffer befeuchtetes PVC-Brett gelegt wird und die Tunica mucosa mit Hilfe eines 0,2 mm starken, etwa 5 cm breiten Blechs eingeritzt und von der Tela submucosa abgeschoben wird. Nach Sichtkontrolle auf beschädigte Bereiche wird dann die Mucosa eingespannt. In dieser Studie war es nicht möglich, die Mucosa abzutrennen, ohne massive Gewebeschäden zu verursachen. Dadurch wären die Ermittlung der elektrophysiologischen Parameter sowie der Mannit- Fluxraten nicht möglich gewesen. Die Caecumwand der Broiler, die zu diesem Zeitpunkt zwischen zwei und drei Wochen alt waren, war zu dünn und instabil, um

„gestrippt“ zu werden und daher wurde die gesamte Darmwand eingespannt. Dies mag durch den größeren Widerstand zu einer etwas geringeren Gewebeleitfähigkeit geführt haben, als sie bei gestripptem Material aufgetreten wäre. Da aber alle Gewebeproben „ungestrippt“ eingespannt wurden, sind eventuell auftretende

(44)

Unterschiede nicht auf diese Abweichung in der konventionellen Methode zurückzuführen. An Magenepithelien von Ratten haben BAJKA et al. (2003) gezeigt, dass das „Strippen“ keinen signifikanten Einfluss auf die Gewebeleitfähigkeit und die Permeabilität des Epithels hat.

Die 12 Kammern waren an ein aus zwei doppelwandigen Glassäulen bestehendes Gasliftsystem angeschlossen. Durch ein 37°C warmes Wasserbad wurde der äußere Kreislauf auf einer konstanten Temperatur gehalten. Im inneren Kreislauf wurden durch eine ständige Carbogen-Begasung (95% Sauerstoff, 5% Kohlendioxid) die Sauerstoffversorgung des Gewebes sowie ein konstanter pH-Wert und eine gleichmäßige Umwälzung der jeweils 10 ml Inkubationslösung gewährleistet.

Der pH-Wert der Inkubationspuffer stellte sich nach 20minütiger Carbogenbegasung bei 37°C auf pH 7,4 ein. Die Osmolarität lag bei 300 mosmol/l.

2.5.5 Eich- und Messperiode

In der Eichperiode wurden Lösungsmittelwiderstand und Potentialdifferenz ermittelt, ohne dass ein Epithel eingespannt war.

Nach Einspannen des Epithels wurden die Ussing-Kammern mit der voltage clamp- Steuereinheit verbunden. Damit konnten die elektrophysiologischen Gewebeparameter (Elektrische Gewebeleitfähigkeit Gt und Kurzschlussstrom Isc) kontinuierlich registriert werden.

Der Kurzschlussstrom wird in Ionenäquivalent als Ladungstransfer pro Zeit und Gewebefläche [µEq·h^-1·cm^-2] angegeben. Er gilt als Parameter für den elektrogenen Nettoladungstransport über das Epithel, die Gewebeleitfähigkeit Gt [mS·cm^-2] als Parameter für die Ionendurchlässigkeit desselben.

Die Potentialdifferenz PDt zwischen der mukosalen und serosalen Gewebeseite wurde über zwei gewebenahe KCl-Agar-Gel-Brücken (Polyethylen-Schlauch, Agar 3%ig in mukosalem Inkubationspuffer) im Kammerlumen und über Ag-AgCl-

(45)

angebrachte NaCl-Agar-Brücken im 60-Sekunden-Intervall einen kurzen bipolaren Strompuls von 100µA ein. Mittels Ohm’schem Gesetz konnte aus der gemessenen Potentialdifferenz der Gewebewiderstand ermittelt werden, dessen reziproker Wert der Gewebeleitfähigkeit Gt [mS·cm^-2] entspricht.

Der große Durchmesser der Agarbrücken gewährleistete eine gleichmäßige Stromapplikation, durch die die Potentialdifferenz mittels des „Klemmstromes“ (Isc) auf 0mV „geklemmt“ werden konnte. Der elektrische Gradient über dem Epithel, bestehend aus elektrogenen Ionenbewegungen, wurde durch diesen Strom kompensiert. Durch den Fluss eines positiven Ionenstroms von der mukosalen zur serosalen Seite erhält der Kurzschlussstrom ein positives Vorzeichen, was einer Kationenresorption und/oder Anionensekretion entspricht.

Nach 95 Minuten Versuchsdauer wurde serosal in alle Kammern 10^-5 mol/l Forskolin gelöst in 2µl Dimethyl-Sulfoxid (DMSO) hinzugegeben. In Vorversuchen hatte sich gezeigt, dass DMSO allein zu keinerlei Änderungen des Kurzschlussstroms führt.

Abb. 7 Strukturformel des Diterpentans Forskolin

Forskolin stimuliert als Aktivator der Adenylatzyklase (SEAMON et al. 1981) die cAMP-vermittelte Chloridsekretion, wodurch es bei vitalem Gewebe zu einem Anstieg des Kurzschlussstroms kommt (BROWN et al. 1990; HEMPE 2007). Der durch Forskolin verursachte Anstieg des Kurzschlussstroms gibt demnach Hinweise auf die

(46)

Stärke der Aktivierung des Chloridionensystems. Die Erfassung dieses Parameters konnte zur Untersuchung des Einflusses von Salmonellen auf transportphysiologische Parameter genutzt werden.

2.5.6 Bestimmung der unidirektionalen Fluxraten

Als radioaktive Markersubstanz zur Bestimmung der unidirektionalen Fluxraten über das in die Ussing-Kammern eingepannte Gewebe wurde1,85x10⁵ Bq (5µCi) Tritium- Mannit eingesetzt. Mannit wird unter anderem aufgrund seiner Molekülgröße rein parazellulär transportiert (FAVUS u. ANGEID-BACKMAN 1984).

In die zwölf Kammern wurden „ungestrippte“ Darmwandstücke von drei Tieren eingespannt, wobei jeweils zwei Kammern pro Tier zur Bestimmung der unidirektionalen Fluxraten von serosal nach mukosal (Jsm) und zwei Kammern zur Bestimmung der unidirektionalen Fluxraten von mukosal nach serosal (Jms) eingesetzt wurden. In Anlehnung daran erfolgte die Zugabe der Markersubstanz bei den ms-Kammern in die mukosale und bei den sm-Kammern in die serosale Kammerhälfte. Im Abstand von 10 Minuten wurden insgesamt 11 Proben von der jeweils nicht radioaktiv markierten Seite entnommen. Anschließend wurden alle Proben mit 4,5 ml Szintillisationsflüssigkeit (Luma Safe Plus, Canberra Packard GmbH, Dreieich) gemischt. Daraufhin konnten im Flüssigkeitsszintillisationszähler (Tri-Carb 2500, Canberra Packard GmbH, Dreieich) die Zerfälle pro Minute (dpm) gezählt werden. Jede Probe wurde 10 Minuten lang gemessen.

(47)

Die Berechnung der unidirektionalen Fluxraten Jms und Jsm erfolgte in Anlehnung an die Formel von SCHULTZ et al. (1964):

J = Fluxrate [µmol·cm^-2·h^-1]

dpmn = Zerfälle pro Minute in der Probe n [dpm]

dpmn-1 = Zerfälle pro Minute in der Probe n-1 [dpm]

Vs = Volumen der Pufferlösung in der Säule [ml]

Vp = Volumen der entnommenen Probenlösung („kalte Seite) [ml]

Mi = Konzentration des unmarkierten Mannits in der Pufferlösung [mmol/l]

dpmH = Zerfälle pro Minute extrapoliert auf 0,5 ml Aliquot von der „heißen Seite“

(Mittelwert aus den heißen Proben 1 und 2) [dpm]

t = Zeitintervall zwischen Probe n-1 und Probe n [h]

A = serosale Fläche des transportierenden Epithels [cm²]

2.5.7 Auswertung elektrophysiologischer Parameter

Aus den erhobenen Daten (6-Sekunden-Werte) wurden pro Tier (4 Kammern) arithmetische Mittelwerte errechnet, aus denen arithmetische Gruppenmittelwerte bestimmt werden konnten. Durch das Übereinanderlegen der Kurven konnten für jeden erfassten Messpunkt ein Mittelwert aus allen Kammern bzw. allen Tieren errechnet werden.

Alle Ergebnisse sind folglich, wenn nicht anders vermerkt, als arithmetischer Mittelwert (MW) ± Standardabweichung (SD) angegeben, wobei die Grundgesamtheit n der Zahl der Tiere entspricht.

Als gemeinsame Zeitachse der übereinander gelagerten Kurven wurde die Zeitachse einer zufällig ausgewählten Kammer benutzt.

J = (dpmⁿ - V^s - V^p

V^s x dpm^n-1) x ( V^s x Mⁱ

dpm^Hx t x A ) J = (dpmⁿ - V^s - V^p

V^s x dpm^n-1) x ( V^s x Mⁱ

dpm^Hx t x A )

(48)

2.6 Histologische Untersuchung

2.6.1 Probenentnahme

Während der Präparation der Darmabschnitte zum Einspannen in die Ussing- Kammern wurden pro Tier zwei 1 cm lange Caecumabschnitte in Formalin (4 %ig) eingelegt.

2.6.2 Präparation der Darmabschnitte

Die in Formalin fixierten Darmabschnitte wurden in Paraffin eingebettet und zu Blöcken verarbeitet. In jedem Block befanden sich 2 aufrechtstehende, ca 0,4 cm breite Ringe, so dass das Darmgewebe quer geschnitten wurde.

2.6.3 Anfertigung der Schnitte

Mit einem Rotationsmikrotom wurden 2 µm dicke Schnitte des Darmes angefertigt.

2.6.4 Entparaffinierung

Zur Entparaffinierung wurde eine absteigende Alkoholreihe angewendet:

1. 5 min Xylol

2. 5 min Xylol/Ethanol 96% (50:50) 3. 2 min 96%iges Ethanol

4. 2 min 90%iges Ethanol 5. 2 min 80%iges Ethanol 6. 2 min 70%iges Ethanol 7. 2 min 40%iges Ethanol 8. Spülen mit Aqua dest.

Direkt anschließend folgte die Hämalaun-Eosin (HE) Färbung.

(49)

2.6.5 HE-Färbung

Nach der Entparaffinierung wurden die Schnitte mit der Hämalaun-Eosin-Färbung gefärbt:

1. 4 min Hämalaun

2. 10 min Bläuen in Leitungswasser 3. 30 sec 1%ige Eosinlösung 4. 10 sec 50%iges Ethanol 5. 10 sec 70%iges Ethanol 6. 10 sec 96%iges Ethanol 7. 10 sec 100%iges Ethanol 8. 10 sec 100%iges Isopropanol 9. 10 min 100%iges Xylol

10. 10 min 100%iges Xylol

Nach dem Färben konnten die Schnitte eingedeckt und mikroskopiert werden.

2.6.6 Statistische Auswertung

Alle Tests erfolgte mit Hilfe des Statistik-Programms GraphPad Prism 4 (www.graphpad.com). Die statistische Analyse beinhaltete die Evaluation von arithmetischen Mittelwerten (MW) und Standardabweichung (SD) bzw.

Standardfehler (SEM). Beim Vergleich der Gruppen wurde der ANOVA-Test (one- way analysis of varience) mit dem Bonferroni’s Multiple Comparison Post-Test verwendet. Ein p-Wert <0,05 wurde als signifikant angenommen.

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3 Ergebnisse

3.1 Gewichtsentwicklung

Die Gewichtsentwicklung der Tiere in den einzelnen Versuchsreihen ist in den Abbildungen 8-12 dokumentiert.

0 200 400 600 800 1000 1200

Tag 1 Tag 20/21 Tag 28/29

Gewicht [g] .

Infektion Impfung + Infektion Kontrolle Abb. 8 Gewichtsentwicklung 1. VR

In der ersten Versuchsreihe wogen die Küken bei der Einstallung am ersten Lebenstag in allen Gruppen ca. 41g und erreichten bis zur 4. Lebenswoche (Tag 28/29) eine Lebensmasse von ca. 1100g.