Deutschen Nationalbibliografie;
detaillierte bibliografische Daten sind im Internet abrufbar über http://dnb.ddb.de
© 2019 by Verlag:
Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft Service GmbH, Gießen Printed in Germany
ISBN 978-3-86345-516-3 1. Auflage 2019
Verlag:
DVG Service GmbH Friedrichstraße 17 35392 Gießen Tel.: 0641/24466 info@dvg.de www.dvg.de
Tierärztliche Hochschule Hannover
Untersuchungen zu Effekten des Zusatzes einer Kombination verschiedener Monoglyceride zum
Mischfutter auf den Erfolg einer experimentellen Infektion mit Salmonella Typhimurium und auf die Translokation bei
Absetzferkeln
INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -
(Dr. med. vet.)
vorgelegt von Juhle-Marijke Buch
Freiburg
Hannover 2019
Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. C. Visscher Institut für Tierernährung
Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
1. Gutachter: Prof. Dr. C. Visscher
2. Gutachter: Prof. Dr. M. Wendt
Tag der mündlichen Prüfung: 04.11.2019
Meinen Eltern und
meinem Bruder
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung ______________________________________________________________ 1 2 Schrifttum _____________________________________________________________ 3 2.1 Salmonella spp. ______________________________________________________ 3 2.1.1 Taxonomie ________________________________________________________ 3 2.1.2 Aufnahme, Pathogenität und Virulenz __________________________________ 4 2.1.3 Tenazität und Epidemiologie _________________________________________ 6 2.2 Die Bedeutung von Salmonella-spp.-Infektionen beim Menschen _______________ 8 2.3 Salmonellen in der Lebensmittelkette _____________________________________ 9 2.4 Salmonella-spp.-Infektion beim Schwein _________________________________ 11 2.5 Infektionsrisiko auf Betriebsebene ______________________________________ 12 2.6 Maßnahmen zur Reduktion der Salmonellenprävalenz im Schweinebestand _____ 14 2.6.1 Rechtliche Regulations- und Kontrollsysteme ___________________________ 14 2.6.2 Diätetische Ansätze zur Reduktion von Salmonella spp. ___________________ 15 2.7 Diagnostik _________________________________________________________ 27 2.7.1 Kulturelle Anzucht ________________________________________________ 27 2.7.2 Serologische Verfahren _____________________________________________ 28 2.7.3 PCR ____________________________________________________________ 30 3 Material und Methoden _________________________________________________ 31 3.1 Aufbau des Versuchsvorhabens ________________________________________ 31 3.2 Infektionsversuche mit S. Typhimurium __________________________________ 32 3.2.1 Haltung _________________________________________________________ 32 3.2.2 Versuchstiere _____________________________________________________ 35 3.2.3 Futtermittel und Fütterung __________________________________________ 36 3.2.4 Experimentelle Infektion ____________________________________________ 45 3.2.5 Mikrobiologische Untersuchungen ____________________________________ 47 3.2.6 Serologische Untersuchungen ________________________________________ 55
3.2.7 Sektion __________________________________________________________ 56 3.3 Untersuchungen zum Verbleib von Monobutyrin im Magendarmtrakt __________ 57 3.3.1 Haltung _________________________________________________________ 57 3.3.2 Versuchstiere _____________________________________________________ 60 3.3.3 Futtermittel und Fütterung __________________________________________ 60 3.3.4 Entnahme und Verarbeitung der Chymusproben _________________________ 63 3.4 In-vitro-Untersuchung zur Nachweisrate von S. Typhimurium ________________ 65 3.4.1 Versuchstiere und -haltung __________________________________________ 66 3.4.2 Futtermittel und Fütterung __________________________________________ 67 3.4.3 Probenaufbereitung und mikrobiologische Untersuchung __________________ 67 3.5 Statistische Auswertung ______________________________________________ 69 4 Ergebnisse ____________________________________________________________ 71 4.1 Infektionsversuche mit S. Typhimurium __________________________________ 71 4.1.1 Eingesetzte Futtermittel _____________________________________________ 71 4.1.2 Zootechnische Parameter ___________________________________________ 71 4.1.3 Mikrobiologische Untersuchungen ____________________________________ 72 4.1.4 Weitere Untersuchungsparameter im Rahmen der Sektion _________________ 81 4.2 Untersuchungen zum Verbleib von Monobutyrin im Magendarmtrakt __________ 82 4.2.1 Eingesetzte Futtermittel _____________________________________________ 82 4.2.2 Zootechnische Parameter ___________________________________________ 83 4.2.3 Detektion des Monobutyrins im Chymus _______________________________ 84 4.3 In-vitro-Untersuchung zur Nachweisrate von S. Typhimurium ________________ 87 4.3.1 Eingesetztes Futtermittel ____________________________________________ 87 4.3.2 Zootechnische Parameter ___________________________________________ 87 4.3.3 Mikrobiologische Untersuchungen ____________________________________ 87 5 Diskussion ____________________________________________________________ 89 5.1 Kritik an der Methode ________________________________________________ 89 5.1.1 Versuchstiere und Haltung __________________________________________ 89 5.1.2 Futtermittel und Fütterung __________________________________________ 90
5.1.3 Experimentelle Infektion ____________________________________________ 91 5.1.4 Mikrobiologische Untersuchungen ____________________________________ 92 5.1.5 In-vitro-Untersuchungsansatz ________________________________________ 94 5.2 Diskussion der Ergebnisse ____________________________________________ 94 5.2.1 Ausbreitung der experimentellen Infektion ______________________________ 95 5.2.2 Ausscheidungsdauer und -intensität von Salmonella spp. unter dem Einfluss der Monoglycerid-Mischung __________________________________________________ 97 5.2.3 Translokation und Serokonversion von/mit Salmonellen __________________ 103 5.2.4 Leistungsparameter der Tiere _______________________________________ 108 5.2.5 Nachweisrate von S. Typhimurium nach Zugabe von Monoglyceriden unter In- vitro-Bedingungen ______________________________________________________ 111 5.2.6 Nachweis von Monobutyrin im Chymus ______________________________ 113 5.3 Schlussfolgerung ___________________________________________________ 115 6 Zusammenfassung _____________________________________________________ 118 7 Summary ____________________________________________________________ 121 8 Literaturverzeichnis ___________________________________________________ 124 9 Anhang ______________________________________________________________ 145 9.1 Tabellen __________________________________________________________ 145 9.2 Tabellenverzeichnis _________________________________________________ 171 9.3 Abbildungsverzeichnis ______________________________________________ 175 10 Danksagung __________________________________________________________ 176
Abkürzungsverzeichnis A
Abb. Abbildung AS Aminosäure
ATP Adenosintriphosphat
B
B. Bacillus
BfR Bundesinstitut für Risikobewertung BPW engl.: Buffered Peptone Water BS Brilliance-Salmonella
C
Ca Kalzium CD18 Integrin ß-2 Cl Chlorid
E
ELISA engl.: Enzyme-Linked Immunosorbend Assay
F
Fa. Firma
FAZ Ferkelaufzuchtfutter
G
GIT Gastrointestinaltrakt
H
H. Helicobacter
HACCP Hazard Analysis Critical Control Point HDP engl.: host defense peptide
K
K Kalium
KMZ Körpermassenzunahme KbE Kolonie bildende Einheiten
L
LPS Lipopolysaccharide
M
m männlich Mg Magnesium
MIC Minimale Hemmkonzentration MPN engl.: Most Propable Number
MSRV engl.> modified semisolid Rappaport-Vassiliadis
N
N Stickstoff Na Natrium NaCl Natriumchlorid
NMR Nuclear Magnetic Resonance
M
MG- Monoglycerid-
mMPN miniaturized Most Propable Number
O
OSA Objektträgerschnellagglutination
P
P Phosphor
PCR engl.: polymerase chain reaction
R
Ra Rohasche Rfa Rohfaser Rfe Rohfett
RKI Robert Koch-Institut RNA Ribonukleinsäure Rp Rohprotein
RV Rappaport-Vassiliadis
S
S. Salmonella
SCFA engl.: short chain fatty acid SPI-1 Salmonella Pathogenitätsinseln spp. species pluralis
ssp. Subspezies Staph. Staphylococcus
T
T3SS Typ-III Sekretionssysteme
TS Trockensubstanz
V
V. Vibrio VO Verordnung
W
w weiblich
WHO engl.: World health Organization
X
XLD Xylose-Lysin-Desoxycholat
Chemische Elemente und Maßeinheiten werden entsprechend der offiziellen Nomenklatur (IUPAC) abgekürzt. Weiterhin wurde darauf verzichtet, allgemein geläufige Abkürzungen wie „z. B.“ im Abkürzungsverzeichnis zu erwähnen.
1 1 Einleitung
Salmonellen zählen nach wie vor weltweit zu den bedeutendsten bakteriellen Zoonoseerregern bei Mensch und Tier (SELBITZ et al. 2015a). Die Übertragung auf den Menschen erfolgt durch den Verzehr kontaminierter Lebensmittel, neben Eiern und Geflügelfleisch kommt insbesondere dem Schweinefleisch eine Rolle als Vektor zu (RKI 2018). Während die Zahl der gemeldeten, lebensmittelassoziierten Salmonellosefälle auf EU- Ebene in den letzten fünf Jahre konstant blieb (2017: 93.583 Fälle), stieg die Zahl in Deutschland im Jahr 2017 im Vergleich zum Vorjahr um 10 % auf 14.269 Fälle an, womit der leicht abnehmende Trend der letzten Jahre unterbrochen wurde (EFSA u. ECDC 2018; RKI 2018). Im Jahr 2018 sanken die Zahlen wieder um 5,2 % auf 13.529 Fälle, blieben jedoch weiterhin über dem Niveau von 2016 (RKI 2019). Vor diesem Hintergrund besteht nach wie vor eine gewisse Dringlichkeit, Lösungsansätze für eine Reduktion der Salmonellenprävalenz in Schweinebeständen zu entwickeln, die damit entlang der Produktionskette einhergehende Gefahr einer Kontamination Lebensmittel tierischer Herkunft zu minimieren und letztendlich eine Optimierung der Lebensmittelsicherheit zu erreichen.
Bei der Vielfalt an potenziellen Ansätzen zur Reduktion der Salmonellenbelastung auf Ebene der Primärproduktion kommt auch nutritiven Konzepten eine Bedeutung zu: Die Zugabe organischer Säuren zu Futter oder Trinkwasser (PAPENBROCK 2004; NEU 2007) und eine gröbere Futterstruktur (MIKKELSEN et al. 2004; PAPENBROCK 2004; VISSCHER 2006;
NEU 2007) haben sich bereits im Praxisalltag etabliert. Fettsäuren und deren Derivate stehen seit einigen Jahren auch im Blickpunkt des Interesses: Untersuchungen zu Effekten verschiedener antimikrobieller Lipide lassen diese als erfolgversprechende Ergänzung der Salmonellenbekämpfung im pre-harvest-Bereich erahnen (KABARA et al. 1972;
THORMAR u. HILMARSSON 2007; KOVANDA et al. 2019).
Die vorliegende Studie untersuchte die Wirkung der nach VO (EU) Nr. 68/2013 als
„Einzelfuttermittel“ aufgeführten, veresterten Form von Fettsäuren, den Monoglyceriden. Im Mittelpunkt der tierexperimentellen Arbeit stand dabei vornehmlich der Einsatz von Buttersäure und dem daraus veresterten Monobutyrin.
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Für eine genaue Beurteilung der eingesetzten Monoglycerid-Mischung war dieses Dissertationsvorhaben in zwei Infektionsversuche, zwei Fütterungsversuche sowie einen In- vitro-Ansatz untergliedert. Dabei standen folgende Fragestellungen im Zentrum der Arbeit:
Infektionsversuche
Welche Effekte ergeben sich beim Zusatz von Monoglyceriden in einer Menge von 5 g/kg Mischfutter auf die Ausbreitung einer experimentellen Salmonelleninfektion innerhalb einer Gruppe von Absetzferkeln?
Welche Effekte ergeben sich auf die Höhe und Dauer der Salmonellenausscheidung der einzelnen Tiere?
Wie häufig findet eine Translokation der Salmonellen in den Tierkörper statt?
Fütterungsversuche
In welchem Darmabschnitt sind die Monoglyceride noch nachweisbar?
Welche Effekte ergeben sich auf die Leistungsparameter abgesetzter Ferkel?
In-vitro-Ansatz
Wie hoch ist die Nachweisrate von S. Typhimurium in frischem Caecumchymus nach der Zugabe der Monoglyceride in unterschiedlicher Dosierung?
Die gewonnenen Erkenntnisse dieser Untersuchungen sollen einen Beitrag für die Ausarbeitung möglicher Konzepte zur Salmonellenreduktion auf Ebene der Primärproduktion leisten.
3 2 Schrifttum
2.1 Salmonella spp.
2.1.1 Taxonomie
Salmonellen sind gramnegative, fakultativ anaerobe Stäbchenbakterien der Familie Enterobacteriaceae. Wie alle Vertreter der Enterobacteriaceae gehören Salmonella spp. zu den oxidasenegativen, glukosefermentativen und nitratreduzierenden Bakterien (BISPING u.
AMTSBERG 1988). Das Genus besteht aus lediglich zwei Spezies, S. enterica und S. bongori. S. enterica wiederum kann in die sechs Subspezies S. enterica ssp. enterica, S. enterica ssp. salamae, S. enterica ssp. arizonae, S. enterica ssp. diarizonae, S. enterica ssp. houtenae und S. enterica ssp. indica unterteilt werden (SELBITZ et al. 2015a). Die weitere Einteilung der Spezies und Subspezies in ihre Serovare erfolgt anhand des international verbindlichen White-Kauffmann-Le-Minor-Schemas, welches die Salmonellen nach ihren O- und H-Antigenen einordnet (SELBITZ et al. 2015a).
Bereits 1934 wurde das erste Kauffmann-White-Schema publiziert, in welchem 44 unterschiedliche Serovare der Spezies Salmonella aufgelistet wurden, 1989 waren bereits 2.267, und heute sind über 2.550 Serovare bekannt (GRIMONT u. WEILL 2007). Das WHO Collaborating Centre for Reference and Research on Salmonella (WHOCC-Salm) ist für die laufende Aktualisierung des Schemas verantwortlich. Über die Jahre gab es verschiedene Ansätze für die Namensfindung der einzelnen Serovare, z. B. die Benennung nach klinischen Gesichtspunkten (S. Parathypi, S. Cholerasuis) oder nach geographischen Bezeichnungen jener Region, in welcher der Stamm eines Serovars zum ersten Mal auftauchte (z. B.
S. London, S. Panama) (GRIMONT u. WEILL 2007). Letztendlich wurden nur für Serovare der bedeutendsten Subspezies „enterica“, mit über 1.500 bekannten Serovaren, weitere Namen vergeben. Der Anfangsbuchstabe des Serovars ist hierbei immer ein Großbuchstabe (GRIMONT u. WEILL 2007).
Weiterhin zu unterscheiden sind Salmonellen anhand ihrer Wirtsspezifität. Es können drei Hauptformen im Hinblick auf die Adaptation verschiedener Salmonellen-Serovare an bestimmte Wirte differenziert werden:
o wirtsspezifisch o wirtsadaptiert
4 o wirtsunspezifisch.
Bei den wirtsspezifischen Serovaren handelt es sich um Salmonellen, die fast ausschließlich mit einem Wirt assoziiert sind, wohingegen wirtsadaptierte vorwiegend bei einer Spezies vorkommen, jedoch unter Umständen auch in anderen Wirten zu Erkrankungen führen können (UZZAU et al. 2000). Wirtsunspezifische Serovare sind in der Lage, in einem breiten Wirtsspektrum systemische Erkrankungen auszulösen (UZZAU et al. 2000). In den meisten Ländern sind ca. 20 - 30 wirtsunspezifische Serovare für fast alle beim Menschen gemeldeten Salmonellosen verantwortlich (BAUERFEIND et al. 2013). Beispiele der einzelnen Gruppen sind Tabelle 1 zu entnehmen.
Tabelle 1: Beispiele für die Einteilung des Wirtsspektrums verschiedener Salmonellen-Serotypen, nach UZZAU et al. (2000), modifiziert nach BUCH (2019
)
Serotyp Natürlicher Wirt
wirtsunspezifische Serotypen
Typhimurium diverse
Enteritidis diverse
Livingstone diverse
wirtsadaptierte Serotypen
Cholerasuis Schwein
Dublin Rind
wirtsspezifische Serotypen
Typhi Mensch
Paratyphi A Mensch
Paratyphi C Mensch
Sendai Mensch
Abortusovis Schafe
Gallinarum Geflügel
Typhisuis Schwein
Abortusequi Pferd
2.1.2 Aufnahme, Pathogenität und Virulenz
Im Hinblick darauf, dass es sich bei, bereits in Tabelle 1 genannten, Salmonellenspezies um pathogene Arten handelt, müssen alle isolierten Serovare grundsätzlich solange als potenzielle Zoonoseerreger angesehen werden, bis sie sich nach entsprechender Überprüfung als avirulent für den Menschen oder bestimmte Tierarten herausstellen (SELBITZ et al. 2015a). Eine Aufnahme des Erregers kann sowohl oral als auch aerogen erfolgen (PROUX et al. 2001).
Um den Darmtrakt des Wirtes auf oralem Weg zu erreichen, müssen die Salmonellen in der
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Lage sein, auch in einem extrem sauren Milieu zu überleben, beginnend mit einem äußerst niedrigen pH-Wert im Bereich des Magens (BEARSON et al. 1997). Die sogenannte „acid- tolerance-response“, mit der die Salmonellen auf eine starke Abweichung in den unteren pH- Bereich reagieren, kann in zwei Phasen unterteilt werden: Ab einem pH-Wert von 6 wird das erste Stadium („pre-acid-shock“) erreicht und spezielle Homöostase-Systeme aktiviert, welche das Zytoplasma in Zeiten massiven pH-Wert-Abfalls alkalischer werden lassen. Das zweite Stadium („post-acid-shock“) wird ab einem pH-Wert von unter 4,5 angeregt und beinhaltet die Ausschüttung von ca. 50 „acid-shock-proteins“ (ASP), die vermutlich dabei helfen, molekulare Schäden zu verhindern und zu reparieren (BEARSON et al. 1997).
Im Darmtrakt werden folgende Mechanismen als grundlegende Virulenzfaktoren beschrieben (SELBITZ et al. 2015a): Die Adhäsion an Darmepithelzellen als initialen Pathogeneseschritt, die Invasion in absorptive Epithelzellen und spezialisierte M-Zellen, den fakultativ intrazellulären Parasitismus der Salmonellen sowie die Bildung von Endo-, Zyto- und Enterotoxinen.
Die Adhäsion stellt den ersten Kontakt zwischen Wirt und Salmonelle dar, der zu Biofilm- Bildung und weiteren Prozessen führen kann, denen letztendlich ein Eindringen in die Wirtszelle und die systemische Verbreitung folgen (WAGNER u. HENSEL 2011).
JONES et al. (1994) stellten im Modellversuch mit abgebundenem Mäusedarm ausschließlich eine Invasion der – u. a. für die Aufnahme von Antigenen zuständigen – M-Zellen des Follikel-assoziierten Epithels innerhalb der ersten 30 Minuten fest.
Darüber hinaus wurde beobachtet, dass die M-Zellen innerhalb von 60 Minuten zerstört und in das Lumen des Darms abgegeben wurden, was wiederum die Integrität der Darmwand beeinträchtigte und ein weiteres Eindringen von Salmonellen in umliegende Enterozyten ermöglichte. Typ-III-Sekretionssysteme (T3SS) ermöglichen die Injektion spezifischer Virulenz-Proteine in die Wirtszellen, welche dann in den natürlichen Signalweg der Zelle eingreifen können. Die Virulenz-Proteine können z. B. durch Umstrukturierung des Cytoskeletts der Wirtszelle eine Aufnahme der Bakterien in die Zelle forcieren (CIRILLO et al. 1998). Für die Kodierung der T3SS sind die chromosomalen Pathogenitätsinseln SPI-1 zuständig. Diese SPI-1 stellen neben weiteren chromosomalen Genen und Virulenzplasmiden die genetische Basis der Virulenz von Salmonellen dar (SELBITZ et al. 2015a). Nach Aufnahme und Eindringen in das Darmepithel sind die Bakterien schließlich in der Lage, über
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den Blut- und Lymphkreislauf systemisch Organe wie Leber und Niere zu erreichen (KÖHLER et al. 2007).
Für die Verteilung der Salmonellen im Körperkreislauf werden verschiedene Modelle beschrieben. CD18-exprimierende Phagozyten können S. Typhimurium aufnehmen und anschließend vom Darm in Blutkreislauf, Leber oder Niere verteilen (KÖHLER et al. 2007).
Nur durch ihre Eigenschaft als fakultativ intrazelluläre Pathogene sind Salmonellen in der Lage, in den phagozytischen Zellen des Retikulohistiozytären Systems zu überleben (FIELDS et al. 1986). In In-vitro-Studien zeigten Salmonellen mit einer 83 Tn10 Mutation, die eine verminderte Überlebensfähigkeit in Makrophagen verursacht, eine verringerte Virulenz im Vergleich zu ihrem Elternstamm. Das Überleben in Makrophagen erscheint demnach eine dringende Notwendigkeit für das Virulenzgeschehen der Salmonellen darzustellen (FIELDS et al. 1986). Es wird zum anderen davon ausgegangen, dass auch CD 8-positive dendritische Zellen S. Typhimurium aufnehmen und durch die Darmschleimhaut in Leber oder Niere ausstreuen können (KÖHLER et al. 2007).
2.1.3 Tenazität und Epidemiologie
In den meisten Fällen stellen Schweine ein asymptomatisches Reservoir für Salmonellen dar, welche vor allem im Darm, den Tonsillen und dem darmassoziierten Immunsystem (GALT) zu finden sind (WOOD et al. 1989). Auch der menschliche Darm stellt ein natürliches Habitat für Salmonella spp. dar (SELBITZ et al. 2015a). Salmonellen haben eine hohe Tenazität, welche ihnen ein wochen- bis monatelanges Überleben in der Umwelt ermöglicht (SELBITZ et al. 2015a). In Einstreu, Gülle und Erde können sie – abhängig von Temperatur und Austrocknungsgrad – bis zu mehrere hundert Tage überleben, unter geeigneten Bedingungen in trockenem Material oder tiefgefrorenem Fleisch sogar bis zu mehreren Jahren (MEYER et al. 2004). Auch das relativ anspruchslose Wachstum der Salmonellen fördert ihre Persistenz in der Umwelt, wobei sich ihre Vermehrungsgeschwindigkeit in der Generationszeit widerspiegelt. In Untersuchungen von MUSCHKOWITZ (1998) bezüglich der Beziehung der Generationszeit ausgewählter Enterobacteriacea (u. a. S. Typhimurium und S. Enteritidis) zu verschiedenen Temperaturen sowie pH-Werten, wurden optimale Vermehrungsbedingungen bei einer Temperatur von 35° C bis 37° C und pH-Werten zwischen 6 und 7,3 beobachtet.
Eine gravierende Verlangsamung des Wachstums konnte ab einer Temperatur von unter 15° C oder einem pH-Wert unter 5 festgestellt werden. Salmonellen sind unter diesen
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Bedingungen, wenn auch mit deutlich längeren Generationszeiten, weiterhin vermehrungsfähig (MUSCHKOWITZ 1998). Bei ihren Untersuchungen zur Charakterisierung verschiedener Kälte-Schock-Proteine von S. Enteritidis beobachteten JEFFREYS et al. (1998) ab einer Temperatur von 5° C ein Absterben der Salmonellen in signifikanter Anzahl.
Für die Erfassung des gesamten Ausmaßes der Umweltkontamination muss bedacht werden, dass Salmonellen unter bestimmten Bedingungen in einem nicht-kultivierbaren und somit schwer nachweisbaren Zustand vorliegen können („viable but not culturable“- VBNC) (SELBITZ et al. 2015a). Insbesondere Stress kann Salmonellen in diesen Zustand versetzen, in welchem sie weiterhin lebensfähig und mit intakter Virulenz verbleiben (RAMAMURTHY et al. 2014). In Untersuchungen von GUPTE et al. (2003) konnten bereits morphologische Veränderungen hin zu einer kokkoiden Form bei S. Typhimurium beobachtet werden: unter extremen Bedingungen (5° C, starker Nährstoffmangel) wechselten die Salmonellen in den VBNC-Zustand über, behielten ihre strukturelle Integrität aber dennoch bei. Durch Erhöhung der Temperatur sowie Nährstoffzusatz waren sie nach etwa 10 h wieder kultivierbar und somit vermehrbar. Unabhängig von den Umweltbedingungen stellt der VBNC-Zustand durch die fehlende Möglichkeit der Anzucht und einer möglicherweise damit einhergehenden unentdeckten Kontamination von Lebensmitteln ein hohes Risiko für die öffentliche Gesundheit und Lebensmittelsicherheit dar (RAMAMURTHY et al. 2014).
BLAHA (1993) teilt die für Mensch und Tier wesentlichen Salmonellen anhand ihres Ausbreitungsverhaltens in drei Gruppen ein:
o epidemisch vorkommende, speziesadaptierte Serovare wie z. B. S. Cholerasuis beim Schwein
o sporadisch vorkommende, nicht speziesadaptierte Serovare, z. B. S. Agona und S.
Infantis
o endemisch vorkommende, nicht speziesadaptierte Serovare wie S. Typhimurium und S. Enteritidis.
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2.2 Die Bedeutung von Salmonella-spp.-Infektionen beim Menschen
Die Salmonellose des Menschen, ausgelöst durch sog. Enteritissalmonellen, wird als eine der bedeutendsten Infektionen des Gastrointestinaltrakts angesehen (TSCHÄPE u.
BOCKEMÜHL 2002).
Gemeinhin können zwei Krankheitsbilder der Salmonellose unterschieden werden: Die Salmonellenserovare S. Typhi und S. Paratyphi führen zu einer schweren, zyklischen Allgemeinerkrankung mit Durchfall und Fieber und können zusätzlich Organschäden an Darm, Herz, Niere, Leber und Galle verursachen. Alle anderen der Gattung S. enterica angehörigen Serovare (nicht typhoidale Enteritissalmonellen) rufen zum größten Teil eine akute Gastroenteritis, geprägt durch starken Durchfall, Fieber, Erbrechen, Mattigkeit sowie z. T. abdominale Krämpfe, hervor (ADRIAN 2012). Bei letzterem besitzen vor allem S.
Enteritidis und S. Typhimurium die größte klinische Bedeutung (RKI 2018). Die infektiöse Dosis wird beim Menschen mit 1 x 10⁵ - 1 x 106 KbE angegeben (KRÄMER u. PRANGE 2017b).
Bei den durch Lebensmittel verursachten Enteritiden des Menschen stehen Salmonellen als zweithäufigste bakterielle Ursache im Fokus. Die größte Rolle bei der Übertragung spielen hierbei Ei- und Fleischprodukte (RKI 2018). Untersuchungen in den Niederlanden zeigten, dass bei Erwachsenen, im städtischen Raum sowie im Frühjahr/Sommer Geflügel- assoziierte Reservoire für Salmonellen (Eier, Hühnerfleisch) eine größere Gefahr darstellen, während bei Kindern, im dörflichen Raum und in den Herbst-/Wintermonaten Schweine und Rinder das größere Risiko als Salmonellenreservoir darstellen (MUGHINI-GRAS et al.
2014). Darüber hinaus wurden spezifische Risikofaktoren der einzelnen Reservoire identifiziert: Der Verzehr ungekochten Fleisches oder ungekochter Eier stellen eine Hauptquelle für die Infektion mit Salmonella spp. dar (MUGHINI-GRAS et al. 2014).
Schon CÔTÉ et al. (2004) konnte eine signifikant höhere Kontamination der Schlachtkörper bei Tieren aus klinisch mit Salmonellose betroffenen Herden im Vergleich zu Herden ohne Salmonellose-Vorgeschichte feststellen (9,21 ± 5,96 % bzw. 3,77 ± 3,62 %).
Eine weitere, wenn auch bedeutend geringere Ansteckungsgefahr liegt im direkten Kontakt mit infizierten Nutztieren wie z. B. Schweinen und Kühen, wobei es sich hierbei vor allem um ein berufsbedingtes Risiko („Landwirt“) handelt (HOELZER et al. 2011).
9 2.3 Salmonellen in der Lebensmittelkette
Die im Jahr 2017 an das Robert-Koch-Institut übermittelten Fallzahlen einer lebensmittelbedingten Salmonellose in Deutschland (14.269 Fälle) zeigten im Vergleich zum Vorjahr eine Zunahme um 10 % (12.962 Fälle 2016), womit sich der abnehmende Trend der letzten Jahren erstmals nicht weiter fortgesetzt hat (RKI 2018). Die 2018 wieder leicht gesunkenen Fallzahlen von 13.529 blieben dennoch über den gemeldeten Infektionen im Jahr 2016 (RKI 2019). Darüber hinaus sind die Zahlen im Allgemeinen vermutlich noch zu gering angesetzt, da davon ausgegangen werden muss, dass eine Vielzahl der diagnostizierten Salmonellosen nicht weiter bezüglich ihres „Ursprungs“ untersucht und dokumentiert werden und somit trotz hoher Wahrscheinlichkeit einer lebensmittelassoziierten Infektion nicht als solche in den Fallzahlen auftauchen (RKI 2018).
Die Zahl der in der EU gemeldeten Salmonelleninfektionen im Zeitraum von 2014 bis 2016 zeigte ebenfalls einen Anstieg um 3 % (BÄURLE 2018). Das RKI listet in seinem jährlich erscheinenden infektionsepidemiologischen Jahrbuch meldepflichtiger Krankheiten tierische Produkte als häufigste Quelle für lebensmittelbedingte Ausbrüche von Salmonellose auf (RKI 2018). Fleisch und Fleischprodukte stehen an zweiter Stelle nach Ei und Eiprodukten.
Die Kontamination der Lebensmittel kann bereits zum Zeitpunkt der Gewinnung („Primärproduktion“) oder aber während Ver- und Bearbeitung sowie der Zubereitung der Lebensmittel durch Kreuzkontaminationen oder fäkale Verunreinigungen entstehen (BAUERFEIND et al. 2013).
Die primäre Kontamination von Schweinefleisch entsteht durch Translokation der Salmonellen bei infizierten Schweinen aus dem Darm in die umliegenden Organe. BERG (1995) nennt drei Hauptursachen für die Translokation von Bakterien aus dem Darm:
o hohe bakterielle Besiedelung des Darmtraktes, o eine geschwächte Immunabwehr des Wirtes und
o eine erhöhte Darmpermeabilität oder geschädigte Schleimhautbarriere.
In einem ersten Stadium kommt es vorrangig zur Translokation der Bakterien in die Lymphknoten des Mesenteriums, worauf eine Besiedelung von Organen wie Leber oder Milz und letzten Endes des Blutkreislaufs folgen kann (BERG 1995).
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Stress der Tiere kurz vor der Schlachtung, wie er z. B. beim Transport entsteht, kann die immunologischen Abwehrmechanismen herabsetzen und damit eine vermehrte Translokation der Salmonellen in den Tierkörper forcieren (SEIDLER et al. 2001).
Sekundäre Kontaminationen wiederum entstehen hauptsächlich bei den verschiedenen Prozessen der Lebensmittelgewinnung (SINELL 2004). Untersuchungen haben gezeigt, dass der Schlachtprozess an sich eine der bedeutendsten Kontaminationsquellen für Schlachtkörper mit Salmonellen darstellt, insbesondere dann, wenn kontaminierte vor unkontaminierten Herden in der Schlachtreihenfolge stehen (SWANENBURG et al. 2001; EVERS 2004). Eine Verhinderung der Kontamination kann jedoch durch konsequente Trennung einzelner Herden bei der Schlachtung, insbesondere betroffener von nicht betroffenen, erreicht werden (SWANENBURG et al. 2001; EVERS 2004).
Auf Ebene der Lebensmittelproduktion stellt ein HACCP-Konzept (Hazard Analysis Critical Control Point) das präventive Qualitätswerkzeug und vorbeugende Sicherheitssystem dar, dass die Herstellung gesundheitlich unbedenklicher Lebensmittel gewährleisten und sicherstellen soll (KRÄMER u. PRANGE 2017a). Hierbei sind alle Ebenen der Lebensmittelkette, von der Urproduktion bis zum Endverbraucher, inbegriffen (KRÄMER u.
PRANGE 2017a). Das Konzept soll dabei helfen, anhand definierter „Critical Control Points“
Gefahren (z. B. Salmonellenkontaminationen) frühzeitig erkennen und somit verhindern zu können (BAUMANN 2012).
Trotz aller Kontaminationsrisiken im Bereich der Primärproduktion und der Lebensmittelverarbeitung ist dennoch nicht zu vernachlässigen, dass ein grundlegender Mangel an Hygiene im Bereich der häuslichen Lebensmittelhandhabung einen entscheidenden Teil zur Entstehung von Lebensmittelvergiftungen beiträgt (WALKER et al. 2003). Durch die Fähigkeit der Salmonellen zur Vermehrung in wasserhaltigen, nährstoffreichen Matrizes ab einer Temperatur von 7 ° C kann insbesondere mangelnde Küchenhygiene (Unterbrechung der Kühlkette, unzureichende Erhitzung, Warmhaltevorrichtungen) zu einem kritischen Anstieg der Keimzahl innerhalb weniger Stunden führen (BAUERFEIND et al. 2013).
Die Manifestation einer Lebensmittelvergiftung hängt neben einer stattgefundenen Kontamination noch von einer Reihe weiterer Aspekte ab: Die Invasivität des Erregers bestimmt u. a. die Ausbreitung der Mikroorganismen im Gewebe, die Fähigkeit zur Bildung von Endo-, Zyto- und Enterotoxinen führt zur Toxizität. Überlebens- und
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Vermehrungsfähigkeit der Bakterien im Lebensmittel spielen ebenfalls eine entscheidende Rolle (KRÄMER u. PRANGE 2017b).
2.4 Salmonella-spp.-Infektion beim Schwein
Die Salmonellose beim Schwein, ausgelöst durch ein breites Spektrum verschiedener Salmonella-Serovare, führt zu unterschiedlich starken Symptomen, die von Durchfall und reduzierter Futteraufnahme bis hin zur Septikämie reichen (FEDORKA-CRAY 1997).
Entsprechend ihrer Auswirkungen kann die Salmonelleninfektion des Schweines in zwei Kategorien unterteilt werden: einerseits die seltenere, zu manifester klinischer Erkrankung führende Salmonellose durch vornehmlich wirtsangepassten Serovare wie S. Cholerasuis und S. Typhisuis, aber auch durch das wirtsunspezifische Serovar Typhimurium; andererseits die lebensmittelhygienisch bedeutsame, häufig nur zu symptomlosen Ausscheidern führende Infektion, an der eine Vielfalt von Serotypen beteiligt sein kann (WALDMANN u. PLONAIT 2004). Grundsätzlich gelten alle fieberhaften Erkrankungen des Schweins mit Zyanosen an Rüsselscheibe, Ohrmuschel oder Bauchdecke als salmonellenverdächtig (SELBITZ et al.
2015a).
Die klinische Salmonellose tritt in der Regel vereinzelt auf und betrifft vor allem junge Schweine, wobei aber auch ältere Tiere betroffen sein können. Die Ansteckung erfolgt zumeist oral, bis zum Auftreten erster Symptome in Form von Fieber und Mattigkeit vergehen etwa 24 h – 48 h (WALDMANN u. PLONAIT 2004). Der durch eine Enterokolitis ausgelöste, typische Durchfall zeigt sich vor allem bei Infektionen mit S. Typhimurium, wohingegen die septikämische Salmonellose mit möglichen plötzlichen Todesfällen S.
Choleraesuis zugeordnet werden kann (REED et al. 1986; WALDMANN u. PLONAIT 2004).
Das pathologische Bild einer S.-Cholerasuis-Infektion zeichnet sich durch großflächige Nekrosen sowie ulzerative Läsionen der Darmschleimhaut aus (REED et al. 1986). Der Erreger kann darüber hinaus in Blutphagozyten persistieren, ohne dabei im Darm nachweisbar zu sein (SELBITZ et al. 2015a). Eine S.-Typhimurium-Infektion wird hingegen von dem Bild unterschiedlich ausgeprägter Darmentzündung geprägt (REED et al. 1986).
12 2.5 Infektionsrisiko auf Betriebsebene
Für die umfassende Betrachtung des Salmonellenrisikos in der Nutztierhaltung müssen alle Aspekte einer Salmonella spp.-Infektion berücksichtigt werden. Hierzu zählt der vertikale Eintrag (Einstallung von bereits im Aufzuchtbetrieb infizierten Jungtieren), der horizontale Eintrag (Einschleppung von „außen“), das Zirkulieren der Salmonellen im Bestand (Kontamination der Umwelt durch infizierte Tiere, Ansteckung ohne direkten Kontakt mit infizierten Tieren möglich) sowie der über Produktionszyklen weitergegebene „Salmonellen- Hospitalismus“ (residuale Keime aus dem vorherigen Durchgang, die nicht durch Reinigung und Desinfektion beseitigt werden können, führen zu Infektionen im nächsten Durchgang) (BLAHA 2008).
Vertikaler Eintrag
Der Zukauf asymptomatischer Carrier wird in einigen Studien als Haupteintragsquelle von Salmonellen in den Bestand identifiziert (VISSCHER 2006; HOELZER et al. 2011). Bei wirtsangepassten Serovaren stellt dieser Weg sogar fast den ausschließlichen Mechanismus der Einschleppung dar (BLAHA 1993).
Das Problem liegt vornehmlich darin, dass ein verbindliches Monitoringprogramm entlang der Kette, dass die Ferkelerzeugung impliziert und damit den Status entlang der Produktionskette lückenlos dokumentiert, nicht existiert und nach wie vor Faktoren wie Preis oder züchterische Vorteile eine viel entscheidendere Rolle bei der Auswahl geeigneter Ferkel für die Mast spielen (KUMP u. LÖHREN 2015).
Zirkulation
Latent infizierte Carrier, welche auf Grund ihrer fehlenden klinischen Symptome häufig nicht rechtzeitig erkannt werden, stellen eine bedeutende Quelle für Neuansteckungen dar.
Insbesondere Belastungssituationen wie sozialer Stress innerhalb der Gruppe, z. B. hervorgerufen durch Umgruppierungen, können dazu führen, dass Salmonellen erneut massiv ausgeschieden werden (CALLAWAY et al. 2006). Durch die z. T. erhebliche Erregerausscheidung mit dem Kot besteht damit eine erhöhte Gefahr der Ansteckung weiterer Schweine des Bestandes (MEYER et al. 2004). Auch der Transport zum Schlachthof kann ein erhöhtes Stressrisiko für Schweine darstellen; verschiedene Untersuchungen zeigen eine erhöhte Ausscheidung von Salmonellen direkt nach dem Transport (ISAACSON et al. 1999;
MARG et al. 2001).
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Da Salmonellen zu den Erreger zählen, die keine ausreichende oder in manchen Fällen nur sehr kurze Immunität im Wirt erzeugen, kann es darüber hinaus zu einer Reinfektion früher bereits infizierter Tiere kommen (SELBITZ et al. 2015c). Insbesondere der Betriebshygiene wird demnach eine besondere Bedeutung beigemessen (MEYER et al. 2004).
Horizontaler Eintrag
Bei der Gefahr durch horizontal eingetragene Salmonellen spielen Futtermittel eine Rolle, wenn auch eher untergeordnet. Das BfR spricht in seinem jährlich erscheinenden Bericht über Zoonoseerreger in Deutschland im Besonderen von Öl-Extraktionsschroten als potenziell kontaminierte pflanzliche Futtermittel. Im Jahr 2015 konnten bei 5,0 % der Öl- Extraktionsschrote Salmonellen nachgewiesen werden, wobei 18,6 % davon auf Sojabohnen zurückzuführen waren (HARTUNG et al. 2018). Die eiweißreichen Futtermittel bieten vor allem bei mangelhaften hygienischen Bedingungen ausgezeichnete Vermehrungsbedingungen (ADLER et al. 2011). Nicht weiter spezifizierte Mischfuttermittel für Schweine wiesen lediglich mit einer Nachweisrate von 1,9 % Salmonellen auf (HARTUNG et al. 2018)
Zusätzliche Faktoren
HOTES und KRIETER (2008) ermittelten anhand von 1.836 Blutproben aus 32 unterschiedlichen Betrieben weitere bedeutende Risikofaktoren für eine erhöhte Prävalenz von Salmonellen in Schweinemastbetrieben. Hierbei spielte insbesondere die räumliche Nähe zu benachbarten Schweinebeständen eine große Rolle. Die Chance auf positive Salmonellennachweise erwies sich als fast viermal so hoch, wenn sich weitere schweinehaltende Betriebe in einem Umkreis von 2 km befanden. Im Gegenzug dazu ergab eine konsequente und gewissenhafte Stallhygiene mit Einsatz von Schutzkleidung für bestandsfremde Personen und gelegentlicher Reinigung der Futtermittelleitungen eine deutlich geringere Wahrscheinlichkeit positiver Befunde.
In Betrieben mit regelmäßiger Gabe von Antibiotika ergaben die Blutproben eine fünfmal höhere Wahrscheinlichkeit für positive Salmonellennachweise im Vergleich zu Betrieben, die überhaupt keine Antibiotika in der Mast einsetzten (HOTES u. KRIETER 2008). Eine mangelnde Dosierung von Antibiotika ermittelten bereits FUNK et al. (2007) durch die Gabe von Chlortetrazyklin in subtherapeutischer Dosis in einer experimentellen Studie als Grund für einen Anstieg der Salmonellenausscheidung bei Mastschweinen.
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2.6 Maßnahmen zur Reduktion der Salmonellenprävalenz im Schweinebestand 2.6.1 Rechtliche Regulations- und Kontrollsysteme
Die Überwachung und Bekämpfung von Salmonelleninfektionen sowohl im Bestand als auch im Bereich der Lebensmittelsicherheit ist in verschiedenen Gesetzestexten festgelegt. Auf europäischer Ebene sind in der VO (EG) Nr. 2160/2003 Gemeinschaftsziele zur Senkung der Prävalenz von Salmonellen und anderen Zoonoseerregern, die durch Lebensmittel übertragen werden können, festgesetzt. Die Ziele und Bekämpfungsprogramme erstrecken sich hierbei von der Primärproduktion bis hin zur Verarbeitung und Herstellung von Lebensmitteln tierischen Ursprungs und der Futtermittelherstellung. Es bestehen darüber hinaus spezifische Hygienevorschriften für Lebensmittel tierischen Ursprungs, die in der VO (EG) Nr. 853/2004 geregelt sind und insbesondere für den Großhandel und die Weitergabe tierischer Lebensmittel gelten. Für die Sicherheit des Verbrauchers legt die VO (EG) Nr. 2073/2005 mikrobiologische Kriterien für Lebensmittel fest. Die Anforderung für Salmonellen liegt, je nach Lebensmittelkategorie, bei keinem Nachweis von Salmonellen in 10 g, bzw. 25 g. Die Richtlinie 2003/99/EG zur Überwachung von Zoonosen und Zoonoseerregern zählt außerdem die Salmonellose zu den überwachungspflichtigen Zoonosen. Auf nationaler Ebene führt die Verordnung über meldepflichtige Tierkrankheiten (TKrMeldpflVO) seit 2004 die Salmonellose beim Schwein als meldepflichtige Krankheit auf, was bedeutet, dass beim Auftreten einer Salmonellose oder dem direkten Erregernachweis im Bestand dies der zuständigen Behörde zu melden ist. Das Infektionsschutzgesetz (IfSG) regelt einzelne Zuständigkeiten, Maßnahmen, Bekämpfungen und den Umgang mit Infektionskrankheiten wie der Salmonellose beim Menschen.
Mit Einführung des Salmonellenmonitoring-Programms, eingegliedert in die Schweine- Salmonellen-Verordnung (SchwSalmV) 2007, wird jeder Mastbetrieb mit mehr als 50 Mastplätzen anhand seines Salmonellenstatus pro Quartal in Kategorie I bis III eingestuft. Hierzu werden – aufgeschlüsselt nach einem Stichprobenumfang – die Antikörper- Titer der Schweine der letzten zwölf Monate durch Fleischsaftproben im Rahmen der Schlachtung oder, nach Absprache, durch Blutproben in den letzten 14 Tagen vor der Schlachtung erhoben und damit der prozentuale Anteil positiver Proben je Betrieb ermittelt (Kategorie I = ≤ 20 %; KategorieII = 20 % – 40 %; Kategorie III = > 40 %). Die Entnahme von Blutproben im Betrieb zur Untersuchung der AK-Titer ist dabei laut Schweine-
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Salmonellen-VO erlaubt, wird jedoch von QS im „Leitfaden Salmonellenmonitoring Schwein“ nicht als ausschließliche Beprobungsform anerkannt. Maßnahmen müssen ab einer Einstufung in die Kategorie III ergriffen werden, der Landwirt ist dann verpflichtet, Ursachen für den Eintrag der Salmonellen in den Betrieb zu ermitteln sowie geeignete Maßnahmen zur Verminderung der Salmonellenprävalenz auf unter 40 % zu ergreifen. Die zentrale Salmonellendatenbank speichert die Stammdaten aller am Monitoring beteiligten Landwirte, Schlachtbetriebe, Tierärzte und Labore, sodass tagesaktuell Beprobungspläne, Begleitdaten und Untersuchungsergebnisse vorliegen. Angegliedert ist die Datenbank an die
„Qualitätssicherung“ (Qualitätssicherung im Leitfaden Salmonellenmonitoring Schwein), in welchem die grundlegenden Vorschriften und Durchführungen der Schweine-Salmonellen- VO aufgeführt werden.
2.6.2 Diätetische Ansätze zur Reduktion von Salmonella spp.
Während rechtliche Regularien alle Stufen der Produktionskette im Umgang mit Salmonellen umfassen, zielt die Tierernährung darauf ab, eine Reduktion der Salmonellenprävalenz auf Ebene der Primärproduktion zu erreichen um damit einen Eintrag von Salmonellen in die Lebensmittelkette zu verhindern. Im Folgenden werden einige der aktuell im Fokus stehenden Möglichkeiten und Untersuchungen zur Reduktion der Salmonellenprävalenz auf Ebene der Tierernährung erläutert.
2.6.2.1 Der Einsatz antimikrobieller Lipide
Seit Jahrzenten sind die potenziell positiven Effekte von Fettsäuren und deren Derivaten hinsichtlich Darmgesundheit und der Reduktion pathogener Mikroorganismen Gegenstand zahlreicher Untersuchungen (KABARA et al. 1972; ROEDIGER 1990; ISAACSON et al.
1999; WÄCHTERSHÄUSER u. STEIN 2000; GANTOIS et al. 2006; THORMAR u.
HILMARSSON 2007; SCHULTHESS et al. 2019).
Obwohl die genauen Mechanismen der Wirkung dieser Substanzen nach wie vor nicht vollständig geklärt sind, konnten einige Vorgänge bereits nachvollzogen werden.
Insbesondere die Destabilisierung der bakteriellen Zellmembran, durch die eine Vielzahl direkt und indirekt hemmender Einflüsse auf pathogene Mikroorganismen erreicht werden kann, spielt eine entscheidende Rolle (YOON et al. 2018): GREENWAY und DYKE (1979) beobachteten in den Anfängen der Untersuchungen zu bakteriziden Effekten von Fettsäuren bereits eine erhöhte Durchlässigkeit der Bakterienmembran von S. aureus, nachdem diese mit
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Linolsäure behandelt wurde. Die veränderte Permeabilität kann vermutlich eine zusätzlich beobachtete Synthesehemmung verschiedener Makromoleküle und eine damit verminderte Sauerstoffaufnahme betroffener Zellen erklären (GREENWAY u. DYKE 1979). Die erhöhte Permeabilität der bakteriellen Zellmembran als einer der grundlegenden Mechanismen der bakteriziden Wirkung wird auch in jüngerer Literatur beschrieben, wobei zusätzlich der Hemmung membranassoziierter Enzyme und einem damit einhergehenden Verlust der Integrität der bakteriellen Zellmembran eine wichtige Rolle zugesprochen wird (YOON et al.
2018). Die Hemmung der Glycosyltransferase, einerseits durch eine Mischung freier Fettsäuren (KURIHARA et al. 1999) und andererseits spezifisch durch den Einsatz von Ölsäure (WON et al. 2007), wurde in unterschiedlichen Studien nachgewiesen und verhinderte in letzter Konsequenz das weitere Wachstum der Bakterien.
ZHENG et al. (2005) postulieren überdies einen Einfluss von Fettsäuren auf die bakterielle Biosynthese: Mit dem Einsatz von Linolsäure wurde die bakterielle Enoyl-Acyl-Carrier- Protein-Reduktase des Testkeims S. aureus gehemmt, die als wichtiges Enzym am Prozess der Fettsäuren-Elongation von Bakterien beteiligt ist. Da Fettsäuren einen Vorläufer wichtigen Zellmaterials von Bakterien darstellen, wird dadurch wiederum das Bakterium in seinem Wachstum gehemmt (YOON et al. 2018).
Im Hinblick auf gramnegative Erreger wie Salmonella spp. wurde besonders der Effekt eines niedrigen pH-Wertes (≤ 5,5) als entscheidender Faktor der mikrobiellen Wirkung von Fettsäuren und deren Derivaten ermittelt. GOEPFERT und HICKS (1968) untersuchten bereits in den 1960iger Jahren, inwieweit sich variierende pH-Werte des Mediums, Dosierungen und Inkubationszeiten von Ameisen-, Essig-, Propion- und Buttersäure auf die Reduktion von S. Typhimurium auswirken. Das Absenken des pH-Wertes auf 5, ebenso wie eine länger gewählte Inkubationszeit (48 h im Vergleich zu 8 h, 12 h, 24 h) führte zu einer Reduktion der Salmonellen auf unter 10 (Propionsäure) bzw. 0 (Ameisen-, Essig- und Buttersäure) Salmonellen/ml. SCHLIEVERT und PETERSON (2012) beobachteten in ihren In-vitro-Studien mit Monolaurin ebenfalls, dass nach Absenken des pH-Wertes auf 5 eine Reduktion von E. coli um etwa 9 log-Stufen erreicht werden konnte, während bei einem pH- Wert von 7 keinerlei Reduktion der gramnegativen Bakterien zu erkennen war.
Ein niedriger pH-Wert führt zu einer höheren Anzahl undissoziiert vorliegender Moleküle, die in die Bakterienzelle eindringen können, was wiederum als einer der Hauptgründe für die bakterizide Wirkung von Fettsäuren in einem Milieu mit niedrigem pH-Wert angesehen wird
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(GOEPFERT u. HICKS 1968; FUKUSHI et al. 2003; SKŘIVANOVÁ et al. 2006).
SCHLIEVERT und PETERSON (2012) postulieren darüber hinaus eine pH-Wert abhängige, herabgesetzte Integrität der Lipopolysaccharide in der Zellwand gramnegativer Bakterien, ausgelöst durch die Protonierung der bakteriellen Zellmembran in saurem Milieu und einer damit einhergehenden Abstoßung von Calcium und Magnesiumionen, die unter normalen Bedingungen zur Aufrechterhaltung der LPS beitragen.
Buttersäure
Fettsäuren aus der chemischen Raffination, mit Glycerin verestert oder deren Mono-, Di- und Triglyceride sind in der VO (EU) Nr. 68/2013 als „Einzelfuttermittel“ aufgeführt und müssen allgemeine Anforderungen der VO (EG) Nr. 767/2009 erfüllen sowie entsprechend bezeichnet sein.
Es handelt sich bei Fettsäuren um unverzweigte Carbonsäuren aus unterschiedlich langen Kohlenstoffketten, die an einem Ende eine Carboxyl-Gruppe (–COOH) tragen (HORN 2009).
Mit ihren sowohl hydrophoben (Kohlenwasserstoffatome) als auch hydrophilen (Carboxylgruppe) Anteilen zählen sie zu den amphiphilen Molekülen (YOON et al. 2018).
Die Buttersäure besitzt vier Kohlenstoffatome und liegt – wie alle Fettsäuren – bei einem physiologischen pH-Wert im lebenden Organismus dissoziiert (–COO-) als Butyrat vor (HORN 2009).
Abbildung 1: Dissoziation von Buttersäure zu Butyrat
Fettsäuren stellen z. B. in der Milch und den Schleimhäuten natürlich vorkommende Verbindungen dar, denen bei der Reduktion pathogener Mikroorganismen im Darm eine wichtige Bedeutung zukommt (ISAACS et al. 1995; THORMAR u. HILMARSSON 2007).
Sie bieten damit eine beachtliche Alternative im Bereich antimikrobieller Zusatzstoffe.
Tabelle 2 gibt einen kurzen Überblick verschiedener Studien, die im Anschluss näher erläutert werden.
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Tabelle 2: Postulierte Effekte der Buttersäure und ihres Salzes Buttersäure/
Butyrat Beobachtete Effekte Autor
Darmgesundheit Butyrat
- Förderung der Durchblutung
- Erhöhte Aufnahme von Flüssigkeit und Elektrolyten
TOPPING u. CLIFTON (2001)
Butyrat - Hauptenergiequelle für die Epithelzellen des Colons
WÄCHTERHÄUSER u.
STEIN (2000), HAMER et al. (2008) Butyrat - Entzündungshemmung
- Erhöhte Zellproliferation
WÄCHTERHÄUSER u.
STEIN (2000) Butyrat - Förderung epithelialer Integrität verstärkte
Abwehrmechanismen im Dickdarm
KANAUCHI et al. (1999), YAN u. AJUWON (2017) Butyrat
- Reduktion LPS-verursachter Schädigungen des Darmepithels
- Herabgesetzte Permeabilität der tight- junctions
YAN u. AJUWON (2017) in vitro
Butyrat
- Reduzierte Invasionsrate/unterdrückte Expression einzelner Invasionsgene von Salmonella spp.
GANTOIS et al. (2006), LAWHON et al. (2002)
Butyrat - Erhöhte Genexpression antimikrobieller
Peptide (HDPs) SUNKARA et al. (2011)
Butyrat
- Vermehrte Differenzierung von
Makrophagen mit starken antimikrobiellen Eigenschaften
SCHULTHESS et al. 2019 Butter-
säure
- Eingriff in die Enzym- und Genregulation
von Bakterien SUN et al. (1998)
In vivo
Butyrat
- Reduktion caecaler Salmonellen- Kolonisation an den ersten Tagen p. inf.
bei Hühnern
VAN IMMERSEEL et al.
(2005),
COX et al. (1994)
Butyrat stellt zusammen mit Propionat und Acetat einen entscheidenden Teil der, in der Digesta des Dickdarms gebildeten, kurzkettigen Fettsäuren dar. Die Entstehung erfolgt durch die Dickdarmflora, hauptsächlich aus dem Abbau von Kohlenhydraten (insbesondere Nicht- Stärke-Polysaccharide) durch fermentativarbeitende Bakterien (TOPPING u. CLIFTON 2001). Die höchsten Konzentrationen solcher kurzkettiger Fettsäuren (SCFAs) herrschen im proximalen Colon, wo sie von lokalen Enterozyten genutzt und durch die Darmwand mittels aktiven und passiven Transportmechanismen in den Blutkreislauf gelangen können (TAN et
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al. 2014). Insbesondere Butyrat wird im Hinblick auf die Darmgesundheit eine Menge positiver Eigenschaften zugeschrieben:
Schätzungen zufolge deckt es zusammen mit weiteren kurzkettigen Fettsäuren bei Wiederkäuern bis zu 70 % des gesamten kalorischen Energiebedarfs im Pansen, bei verschiedenen anderen Pflanzen- und Allesfressern 20 % - 30 % im Dünn- und Dickdarm (BERGMAN 1990). Darüber hinaus wird die Durchblutung des Colons stimuliert und die Aufnahme von Flüssigkeit und Elektrolyten gefördert (TOPPING u. CLIFTON 2001).
N-Butyrat stellt für die Epithelzellen des Colons mehr Kohlenstoff zur Oxidation zur Verfügung als es Glukose oder Glutamin aus dem Gefäßsystem können (ROEDIGER 1990).
Eine angemessene Versorgung der Zellen mit den notwendigen Nährstoffen kann die Wundheilung im Darmtrakt anregen, die Kollagensynthese fördern und entzündungshemmende Wirkung entfalten (WÄCHTERSHÄUSER u. STEIN 2000; HAMER et al. 2008). Zudem wird die Zellproliferation besonders im Dickdarm durch Butyrat angeregt, die epitheliale Integrität gefördert und dickdarmassoziierte Abwehrmechanismen verstärkt (KANAUCHI et al. 1999; WÄCHTERSHÄUSER u. STEIN 2000). Auch das Vormagensystem bei Wiederkäuern profitiert von einer höheren Konzentration an Butyrat und Propionat, so kann die Papillenlänge vor allem durch Butyrat nachweislich erheblich gesteigert werden, ein Phänomen, das z. T. auf eine erhöhte Mitoserate der Zellen zurückzuführen ist (MENTSCHEL et al. 2001).
Ein Mangel an SCFAs, z. B. durch anhaltende Hungerzustände, kann im Umkehrschluss zu Atrophie der Dickdarmschleimhaut und – auf lange Sicht – vermutlich zu ulzerativer Colitis und anderen entzündlichen Geschehen führen (ROEDIGER 1990; WÄCHTERSHÄUSER u.
STEIN 2000). In Ussing-Kammern wurden am isolierten Meerschweinchen-Dickdarm die Konsequenzen einer fehlenden Synthese von Butyrat dargestellt: Schon nach 150 Minuten konnte eine starke Apoptose der Colonozyten beobachtet werden, ein Umstand, der durch die ebenfalls erhöhte Expression an Bax-Proteinen, welche in ihrer Funktion als Co-Faktoren des Tumorsupressor-Proteins p53 die Apoptose-Einleitung beschleunigen, noch verstärkt wurde (HASS et al. 1997). Zusammengefasst bedeutet das: Die Anwesenheit von Butyrat kann einerseits die unerwünschte Apoptose funktionstüchtiger Colon-Zellen mindern, gleichzeitig aber auch die Apoptoserate unerwünschter kanzerogener Zellen stimulieren und deren Wachstum hemmen (HASS et al. 1997; CLAUS et al. 2003; SCHARLAU et al. 2009).
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Auch für die intakte Funktion der Darmbarriere und die (Un-)Durchlässigkeit der tight- junctions im Falle einer durch LPS hervorgerufenen Entzündung im Bereich des Darmepithels spielt Butyrat eine wichtige Rolle. Untersuchungen zeigen, dass Butyrat dosisabhängig zu einer Reduzierung besagter Schädigungen führt, die Permeabilität der tight-junctions herabsetzt und gleichzeitig zu einer Steigerung der mRNA-Expression und der Häufigkeit spezifischer tight-junction-Proteine verhilft sowie die intrazelluläre ATP-Konzentration beeinflussen kann und somit vor einem Erregereintritt schützt (YAN u. AJUWON 2017).
Außerhalb des Darms kann Butyrat durch Einfluss auf die unspezifische Immunreaktion zur wirtseigenen Abwehr pathogener Erreger beitragen: Bei Hühnern wurde die fördernde Wirkung von Butyrat auf verschiedene antimikrobielle Peptide (HDPs) in Makrophagen, primären Monozyten und Knochenmarkszellen ermittelt. Ein Zusatz von 0,1 % Butyrat zum Futter konnte eine signifikante Erhöhung der HDP-Gen-Expression im Magendarmtrakt von Hühnern auslösen und damit die antibakterielle Aktivität der Monozyten gegen S. Enteritidis steigern (SUNKARA et al. 2011).
Neben einer positiven Beeinflussung der Darmgesundheit und einer damit einhergehenden erhöhten Abwehrkraft gegen Pathogene sind ebenso Mechanismen der direkten Interaktion von Butyrat mit Bakterien bekannt. Bereits SUN et al. (1998) postulierte, dass bei der Überschreitung einer bestimmten Konzentration undissoziierter Buttersäure in einem Medium die Diffusion der Buttersäure in die Zelle durch drei Szenarien zustande kommt: die Ansäuerung des Cytoplasmas, die Entkopplung der protonenmotorischen Kraft, welche die ATP-Synthese aufgrund der Protonenbildung durch die Buttersäure-Reionisierung in der Zelle antreibt und zu guter Letzt die nicht weiter bekannten, toxischen Effekte der Buttersäure auf Enzyme und Genregulation der Bakterien (SUN et al. 1998). Dabei darf jedoch nicht außer Acht gelassen werden, dass Bakterien sich durch unterschiedliche Säuretoleranzen auszeichnen und somit einige Arten in der Lage sind, der Ansäuerung ihres Zytoplasmas entgegenzuwirken (VAN IMMERSEEL et al. 2006; LIANOU et al. 2017).
GANTOIS et al. (2006) konnten den Effekt von Butyrat auf die Invasionsrate von Salmonellen in Epithelzellen (untersucht an HeLa-Zellen), d. h. ein Einwirken des Butyrats auf einen der initialen Pathogenese-Schritte von Salmonella spp. nachweisen. Hierbei wurde die Invasionsrate der Salmonellen in die HeLa-Zellen sowie die SPI-l Expression einzelner Bakterien gemessen, wobei sich beide Parameter nach vierstündiger Inkubation in einem
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Medium mit Butyrat als am effektivsten erwiesen. Auffällig war zudem die Herabregulation verschiedener Gene (n = 49) von S. Typhimurium, von denen etwa die Hälfte mit der Expression der SPI-l in Verbindung gebracht werden konnten (GANTOIS et al. 2006).
Zu ähnlichen Erkenntnissen gelangten schon LAWHON et al. (2002): Ihre Untersuchungen am Mäusedarm mit unterschiedlichen S. Typhimurium-Isolaten (ein Wildtyp, ein Stamm mit mutiertem, unterdrücktem BarA-Gen) zielten darauf ab, die Rolle der Sensor Kinase BarA im Virulenzgeschehen der Salmonellen zu ermitteln. Unter der Annahme, dass die Sensor Kinase BarA in vitro für die Expression der SPI-1-Gene bei Salmonellen vonnöten ist, sich in vivo aber keine Abhängigkeit der Salmonelleninvasion von besagter BarA zeigte, legt die Vermutung nahe, dass andere Effekte im Gastrointestinaltrakt dafür sorgen, BarA zu ersetzen.
Es stellte sich heraus, dass das physiologisch im Darmtrakt vorkommende Acetat die BarA- Mutation unterdrücken und somit die Expression der Invasionsgene vorantreiben konnte, wohingegen Propionat und Butyrat die Expression der Salmonellen-Invasionsgene unterdrückten (LAWHON et al. 2002).
Die antimikrobielle Wirkung von Fettsäuren und die damit einhergehende Reduktion pathogener Mikroorganismen kann insbesondere in vivo durch verschiedene Faktoren maßgeblich beeinflusst werden.
Einen bedeutsamen Einfluss besitzt die Darreichungsform der jeweiligen Fettsäure bzw. des Salzes entsprechender Fettsäuren: Untersuchungen von VAN IMMERSEEL et al. (2005) zeigen, dass Buttersäure in ummantelter Form bei Hühnern zu einer deutlichen Reduktion caecaler Salmonellen-Kolonisation, zumindest in den ersten Tagen nach Infektion, führen kann und auf lange Sicht eine verminderte Ausscheidung von Salmonellen begünstigt. Die pulverisierte Form hingegen konnte zu keiner messbaren Reduktion der Salmonellen beitragen (ummantelt: 4/25 positive Salmonellennachweise mit > 1 x 106 KbE/g; Pulver:
12/25 positive Salmonellennachweise mit > 1 x 106 KbE/g).
Mit besonderem Fokus auf unterschiedlichen Konzentrationen der Buttersäure als entscheidender Faktor der Effektivität konnten NAMKUNG et al. (2011) bei In-vitro- Versuchen eine Buttersäure-Konzentration ab 1.500 mg/kg als effektivste Dosis zur Reduktion von S. Typhimurium mit einer Hemmung der Salmonellen um mehr als 90 % erzielen.
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Auch über Fettsäuren, die auf Grund ihrer Kettenlänge nicht mehr als kurzkettige Fettsäuren (> C6) bezeichnet werden, sind antibakterielle Eigenschaften bekannt. So zeichnen sich z. B.
Fettsäuren, ebenso wie deren Derivate, mit zwölf Kohlenstoffatomen durch eine besonders hohe Wirksamkeit gegen verschiedene Mikroorganismen aus (KABARA 1984;
SUN et al. 2003). In einigen Studien erwiesen sich ungesättigte Fettsäuren bisher als potenter in ihrer Wirkung gegen Bakterien als gesättigte, die Wirksamkeit ungesättigter Fettsäuren scheint zudem mit der Anzahl ihrer Doppelbindungen zu steigen (KABARA 1984; SUN et al.
2003). Gesättigte Fettsäuren besitzen keine Doppelbindungen zwischen den einzelnen C- Atomen, wohingegen ungesättigte Fettsäuren sich durch mindestens eine Doppelbindung auszeichnen. Auch Linolensäure, eine dreifach ungesättigte Fettsäure mit 18 C-Atomen, bewies in verschiedenen Untersuchungen eine hohe antibakterielle Effektivität, insbesondere gegen grampositive Erreger wie Helicobacter pylori, Staphylococcus aureus und Bacillus cereus (KABARA et al. 1973; LEE et al. 2002; SUN et al. 2003). Die verschiedenen Ergebnisse legen die Vermutung nahe, dass ein kritischer Punkt der antimikrobiellen Eigenschaften bei gesättigten Fettsäuren im Bereich von zwölf und bei ungesättigten Fettsäuren im Bereich von 18 C-Atomen erreicht wird.
Monoglyceride
Monoglyceride stellen veresterte Verbindungen einer Fettsäure mit dem dreiwertigen Alkohol Glycerin dar. Man kann sie unterteilen in 1-, 2- (und 3-) Monoglyceride, wobei die zu Beginn stehende Zahl jenes C-Atom des Alkohols Glycerin bezeichnet, an dem die Esterbindung mit der Fettsäure eingegangen wurde. Es handelt sich bei der Entstehung der Esterbindung um eine Gleichgewichtsreaktion, die in beide Richtungen ablaufen kann (DOENECKE et al.
2005).
Abbildung 2: Reaktion von Glycerin und Buttersäure zu 1-Monobutyrin
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Durch ihre Esterbindung gehören die Monoglyceride, im Gegensatz zu Fettsäuren, zu den hydrolysierbaren Lipiden, d. h. sie sind unter Wasseraufnahme spaltbar (KIRCHGEßNER et al. 2011). Sie zählen darüber hinaus zu den nichtionischen Molekülen mit neutraler elektrischer Ladung und einem lediglich gewissen Grad an Polarität, da sie im Vergleich zu Fettsäuren unter relevanten pH-Bedingungen keine ionisierbare funktionelle Gruppe aufweisen (YOON et al. 2018). Sie entstehen im Rahmen der Verdauung von Triglyceriden, die den Hauptbestandteil der Nahrungslipide ausmachen (KIRCHGEßNER et al. 2011).
Bereits in den vorderen Abschnitten des Magendarmtraktes sorgen linguale, gastrale und pankreatische Lipasen für eine Hydrolyse der Triglyceride zu Diglyceriden, Monoglyceriden und Fettsäuren (SHIAU 1981). Die sn-Konfigurationen an erster und dritter Stelle der Esterbindung von Triglyceriden werden hierbei bevorzugt aufgebrochen, sodass hauptsächlich 2-Monoglyceride entstehen (BRACCO 1994; HONDA et al. 2017). Zwingende Voraussetzung für die Wirkung der Lipasen ist die Anwesenheit von Colipasen ebenso wie von konjugierten Gallensäuren, die als Detergentien eine Emulgierung der Triglyceride im wässrigen Umfeld bewirken. Über die damit hervorgerufene Oberflächenvergrößerung wird die Wirkung der Lipasen verstärkt (VON ENGELHARDT et al. 2015). Die Bildung sogenannter Micellen im Zusammenschluss mit konjugierten Gallensäuren führt schließlich zur Aufnahme von Fettsäuren und Monoglyceriden in die Zellen der Darmschleimhaut (KAYDEN et al. 1967).
Es liegen bereits zahlreiche Untersuchungen vor, die die bakterizide Wirkung von Monoglyceriden belegen, wobei sich viele der Studien auf grampositive Bakterien konzentrieren. Schon in den Pionier-Studien von KABARA et al. (1972) konnten für die Monoglyceridform der Laurinsäure (1-Monolaurin) minimale Hemmkonzentrationen (MIC) für Streptokokken der Gruppe A von 0,045 µmol/ml im Vergleich zur Laurinsäure mit 0,124 µmol/ml verzeichnet werden. Vergleichende Ergebnisse mit gramnegativen Bakterien wurden nicht dokumentiert (KABARA et al. 1972).
LEE et al. (2002) konnten in ihren vergleichenden Untersuchungen mit Linolensäure und deren veresterter Form erst durch die Zugabe der entsprechenden Monoglyceride eine signifikante Reduktion grampositiver Bakterien (u. a. B. cereus, Staph. aureus) beobachten.
Damit übereinstimmende Ergebnisse erlangten auch SUN et al. (2003): Die zusätzliche Gabe von Monoglyceriden (u. a. Monolaurin, Monocaprylin, Monocaprin) zu den korrespondierenden Fettsäuren erzielte eine summierte Reduktion von H. pylori.
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Grundsätzlich scheint die Kombination verschiedener Fettsäuren untereinander oder zusammen mit Monoglyceriden zu größerem Erfolg zu führen (SUN et al. 2003)
In Untersuchungen mit gramnegativen Bakterien wurde in vitro durch die Zugabe verschiedener mittelkettiger Monoglyceride (Monolaurin, Monocaprin, Monocaprylin) eine 100 - 10.000-fache Reduktion lebender Zellen von S. Typhi, Shigella sonnei, enterotoxinbildenden E. coli und Vibrio cholerae erreicht. Lediglich Laurinsäure (C12) zeigte ähnlich hohe Reduktionsraten (PETSCHOW et al. 1998). Bei anschließenden In vivo- Versuchen mit Mäusen konnten diese Resultate jedoch nur z. T. bestätigt werden. Zwar konnte die Anzahl der V.-cholerae-Bakterien im Darmchymus bei einer Konzentration von 2,5 mg Monoglyceride/ml um mehr als das Tausendfache reduziert werden, entsprechende Effekte blieben dagegen bei einer Infektion der Mäuse mit E. coli aus. Genauso wenig konnte die Anzahl lebender V. cholerae und enterotoxinbildender E. coli im Gewebe des Caecums und Ileums reduziert werden, unabhängig davon, zu welchem Zeitpunkt vor oder nach experimenteller Infektion die Monoglyceride dem Futter zugesetzt worden waren (PETSCHOW et al. 1998). In aktuellen Studien zeigten sich die veresterten Derivate der kurzkettigen Fettsäuren Valeriansäure und Buttersäure als besonders effektiv in ihren antibakteriellen Eigenschaften, insbesondere gegen gramnegative Erreger wie S.
Typhimurium (KOVANDA et al. 2019). Versuche mit Broilern bewiesen in vivo, dass bei einer Supplementierung von Monocaprin zu Trinkwasser und Futter (je 0,24 %) die Campylobacter-Zahlen in Kloakentupfern experimentell infizierter, 24 Tage alter Tiere besonders in den ersten zwei Tagen signifikant reduziert werden konnten. Eine Gabe des Monocaprins über drei Tage vor der Schlachtung konnte die Campylobacter-Zahlen in den Kloakentupfern ebenfalls signifikant verringern (HILMARSSON et al. 2006). Auch THORMAR et al. (2006) beobachteten eine starke Aktivität des Monocaprins bei der Abtötung von Campylobacter, in vitro konnte eine Reduktion der Campylobacter-Zahlen um
≥ 6,8 log-Stufen erreicht werden. Salmonella spp. und E. coli hingegen zeigten in den Versuchen erst bei einer pH-Absenkung auf unter 5 eine erfolgreiche Verringerung um ≥ 7 (Salmonella) bzw. ≥ 6,7 (E. coli) log-Stufen (THORMAR et al. 2006). Diese Aussagen decken sich mit den früheren Beobachtungen von BERGSSON et al. (2002), bei denen ebenfalls in neutralem pH-Bereich keine signifikante Reduktion von S. Typhimurium oder E.
coli zu erkennen waren. Ergebnisse einer Studie von NAMKUNG et al. (2011) zeigten wiederum, dass Monobutyrin konzentrationsabhängig eine gesteigerte Effektivität gegen S.
