Mechanismen der broncho-alveolären Entzündungsreaktion durch umweltübliche Feinstäube: Beeinflussung oxidativer Vergänge durch Metalle in Feinstäuben (PM 2,5) im Humanmodell

Aus der Abteilung Klinische Atemwegsforschung des Fraunhofer-Instituts für Toxikologie und Experimentelle Medizin Hannover (ITEM)

Mechanismen der broncho-alveolären Entzündungsreaktion durch umweltübliche Feinstäube: Beeinflussung oxidativer Vorgänge durch Metalle in Feinstäuben (PM

) im Humanmodell

Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin

vorgelegt von Andreas Herbrich aus Bremen

Hannover 2009

Angenommen vom Senat der Medizinischen Hochschule Hannover Am 15.06.2009

Gedruckt mit der Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover Präsident: Prof. Dr. med. Dieter Bitter-Suermann

Betreuer der Arbeit: Prof. Dr. med. Norbert Krug Referent: Prof. Dr. med. Thomas Tschernig Koreferent: Prof. Dr. med. Jens Jordan Tag der mündlichen Prüfung: 15.06.2009 Promotionsausschussmitglieder:

Prof. Dr. Hans-Heinrich Kreipe Prof. Dr. Sebastian Suerbaum Prof. Dr. Reinhard Brunkhorst

Für meine

Eltern

Inhaltsverzeichnis

1.Einleitung………..

1.1 Allgemein………

1.2 Definition……….

1.3 Verhalten und Ursprung von Partikeln………

1.4 Epidemiologische Daten……….

1.5 Feinstäube und Allergien……….

1.6 Bedeutung der Partikelgröße………...

1.7 Bedeutung der Partikeloberfläche und des Metallgehaltes..…………...

1.8 Wirkung der Partikel auf Zellebene……….

1.8.1 Zelluläre Quellen von oxidativen Potentialen………...

1.8.2 Direkte Partikelwirkung auf das oxidative Gleichgewicht………

1.8.3 Bedeutung des Stickstoffmonoxids am oxidativen Stress……….

1.9 Erfassen des oxidativen Stresses in vivo……….

1.9.1 Glutathion und andere Antioxidantien………...

1.9.2 8-Isoprostan: Marker der Lipidoxidation………...

1.9.3 Gesamt-Protein und LDH………..

1.10Grundlage der vorliegenden Studie……….

1.10.1Epidemiologische Daten der Untersuchungsgebiete (Hettstedt und Zerbst)………

1.10.2Tierversuchliche Daten zu Hettstedt und Zerbst………..

2.Zielsetzung und Fragestellung……….

3.Methoden………...

3.1 Stäube………...

3.1.1 Gewinnung der Stäube………

3.1.2 Aufbereitung der Stäube……….

3.2 Probanden………...

3.2.1 Ein- und Ausschlusskriterien……….

3.2.1.1 Ausschlusskriterien………

3.2.1.2 Einschlusskriterien……… ²⁷

3.2.2 Studienpopulation……….. ²⁷

3.2.3 Probandenrekrutierung……….. ²⁷

3.2.4 Voruntersuchungen………. ²⁸

3.2.4.1 Aufklärung über die Studie………... ²⁸

3.2.4.2 Anamnese und körperliche Untersuchung………. ²⁸

3.2.4.3 Bodypletysmograghie………. ²⁸

3.2.4.4 Pricktest………. ²⁸

3.2.4.5 Venöse Blutentnahme……….

3.2.4.6 Ruhe-EKG……… ²⁹

3.2.2.7 bronchiale Provokation mit Methacholin ……….. ²⁹

3.2.5 Kontrolle der Blutparameter (safety)……….

3.3 Bronchoskopie……….

3.3.1 Geräte……….

3.3.2 Probandenvorbereitung………..

3.3.3 Durchführung der Bronchoskopie Tag 1………

3.3.4 Durchführung der Bronchoskopie Tag 2………

3.3.5 Probandennachbetreuung……… …..

3.4 Aufarbeitung der BAL-Proben………

3.5 Zellzählung und Zelldifferenzierung………..

3.6 Methodik zur durchflusszytometrischen Differenzierung der Monozyten………...

3.7 Messungen der Sauerstoffradikalproduktion………...

3.7.1 Durchführung der Messungen………

3.8 Bestimmungen von Nitrat und Nitrit im BAL-Überstand………...

3.8.1 Messung von Nitrit……….

3.8.2 Messung von Nitrat……….

3.9 Messung der 8-Iso-PGF

-Werte……….

3.9.1 Qualitätskontrolle………

3.9.2 Regeneration der Immunoaffinitätskartuschen ……….

3.10Bestimmung von Laktatdehydrogenase (LDH) und Gesamt-Eiweiß in der BAL………..

3.11Bestimmung von GSH in der BAL……….

3.12Statistische Auswertung………..

4.Ergebnisse………. ⁴³

4.1 Ausschluß von Probanden………...

4.2 Toleranz der Bronchoskopie………

4.3 Klinische Parameter der 12 in die Ergebnisse eingegangenen Probanden………...

4.4 Recovery-Daten der broncho-alveolären Lavage………

4.5 Absolute BAL-Zellzahl………

4.6 Neutrophile Granulozyten: Absolute Zellzahlen und prozentualer Anteil………..

4.7 Makrophagen: Absolute Zellzahl und prozentualer Anteil………..

4.8 Lymphozyten: Absolute Zellzahl und prozentualer Anteil……….

4.9 Monozyten: Absolute Zellzahl und prozentualer Anteil………..

4.10Spontane Radikal-Generation……….

4.11Stimulierte Radikal-Generation………..

4.12Nitrit-Gehalt in der BAL……….

4.13Nitrat-Gehalt in der BAL………

4.148-Isoprostan-Werte……….

4.15Gesamt-Protein in der BAL………

4.16LDH in der BAL……….

4.17GSH und GSSH in der BAL-Flüssigkeit………

5.Diskussion………..

5.1 Einleitung………

5.2 Diskussion der Methoden………

5.2.1 Aufbereitung der Stäube……….

5.2.2 Segmentale Applikation mittels Bronchoskopie………

5.2.3 Durchflusszytometrische Zelldifferenzierung………

5.2.4 Detektion der Radikalproduktion von BAL-Zellen………

5.2.5 Bestimmungen von Nitrt und Nitrit………

5.2.6 Glutathion-Bestimmung……….

5.2.7 Bestimmung von 8-iso-PGF

5.3 Diskussion der Ergebnisse ……….

5.3.1 BAL-Gesamt-Protein und LDH………..

5.3.2 Gesamt-Zellzahl in der BAL…..

5.3.3 Neutrophile Granulozyten………..

5.3.4 Lymphozyten………..

5.3.5 Makrophagen………..

5.3.6 Monozyten………...

5.3.7 Radikalproduktion der BAL-Zellen………

5.3.8 Möglichkeiten zur Detektion von oxidativen Vorgängen an Folgeprodukten: Nitrat/Nitrit………..

5.3.9 GSH-Werte in der BAL………..

5.3.108-Isoprostan in der BAL………

6.Zusammenfassung...

7.Danksagung………...…

8.Literaturverzeichnis……….

I

9.Abkürzungsverzeichnis……… ………...

1. Einleitung 1

1. Einleitung

1.1 Allgemein

Die Lungen sind aufgrund ihrer ca. 100 qm großen Alveolaroberflächen (Lippert, 1996) das Organ des Menschen, mit dem er den größten Kontakt zur Umwelt hat. Schon aus diesem Grund ist es sehr wahrscheinlich, dass sich Änderungen in der Zusammensetzung der luftgetragenen Umweltbestandteile auch auf die Lungen und damit auf den Menschen auswirken.

Noxen, welche in der Atemluft vorliegen, sind sehr verschieden, so zum Beispiel Bakterien, Pilze, Viren sowie toxische Aerosole und Stäube.

Dass Staub die Gesundheit beeinträchtigen kann und auch tödliche Erkrankungen hervorruft, ist seit langem bekannt. So wird die Silikose bei Bergleuten bereits von Paracelsus im 16. Jh.

klinisch beschrieben.

Auch in neuster Zeit sind Stäube wieder in den Blickpunkt der Wissenschaft geraten. Seit den 80er Jahren wiesen epidemiologische Studien auf Zusammenhänge zwischen anthropogenen Stäuben, wie sie zum Beispiel bei Verbrennungsprozessen entstehen, und zahlreichen Erkrankungen hin.

Bei Staub handelt es sich nicht um eine homogene Zusammensetzung. Deshalb ist es notwendig, international gebräuchliche Definitionen für Staub und die darin vorkommenden Subklassen einzuführen. In diesem Zusammenhang werden Stäube nach ihrer Größe, beziehungsweise nach dem Durchmesser der darin vorkommenden Partikel, klassifiziert. Dies erscheint sinnvoll, da dieser hauptverantwortlich ist sowohl für die Möglichkeit des Transportes der Partikel durch die Luft als auch für die Ablagerung im Respirationstrakt.

Außerdem ist er mit der chemischen Zusammensetzung und dem Ursprung der Stäube assoziiert.

1. Einleitung 2 1.2 Definitionen

Als Schwebstaub bezeichnet man feste oder flüssige Schwebstoffe, die in Gasen suspendiert sind. Folgende Definitionen werden verwendet, wobei PM für particulate matter, also partikuläre Materie steht (Wichmann, 2003):

• Der Gesamtschwebstaub (Total Suspendet Particulates, TSP) umfasst bei der derzeitigen Messung mittels Beta-Absorption Partikel mit einem Durchmesser unter 15µm. Bei älteren gravimetrischen Messungen reichte der Partikeldurchmesser bis 35 µm.

• Grobe Partikel umfassen den Größenbereich von 2,5 bis 100 µm. Im internationalen Schrifttum ist mittlerweile die Bezeichnung „grobe (coarse) Partikel“ für den Größenbereich von 2,5 bis 10 µm üblich.

• Inhalierbarer Schwebstaub umfasst Partikel unter 10 µm. Er wird im Folgenden als PM10-Partikel bezeichnet.

• Lungengängiger Schwebstaub umfasst Partikel unter 2,5 µm (PM_2,5). Er wird im folgenden als PM_2,5-Partikel bezeichnet.

• Die ultrafeinen Partikel (UF) umfassen Teilchen < 0,1 µm thermodynamischer Durchmesser.

1.3 Verhalten und Ursprung von Partikeln

Bei Partikeln handelt es sich nicht um statische Gebilde, sondern sie unterliegen einer ständigen Umwandlung. Ultrafeine koagulieren zu größeren, was auf ihre höhere Eigenbeweglichkeit zurückzuführen ist. Feine oder gröbere Partikel absorbieren ultrafeine an ihrer Oberfläche was als “savenging effect“ bezeichnet wird. Durch diese Mechanismen erklärt sich die kurze Lebensdauer von ultrafeinen Partikeln in der Luft. Sie beträgt in Abhängigkeit von thermischen Bedingungen und Höhe der Aerosolkonzentration nur Sekundenbruchteile bis wenige Stunden.

Ab einem Durchmesser von über 0,1µm sind Partikel relativ stabil und können sich bis zu mehreren Wochen in der Luft halten. Dabei sind sie imstande, Strecken von tausenden Kilometern zurückzulegen (Wichmann, 2003).

Betrachtet man die Größenverteilung der Partikel in der städtischen Außenluft, so findet man ein zwei- oder dreigipfeliges Muster. Die groben Partikel sind hauptsächlich natürlichen Ursprungs, wie geogene Mineralstäube, Bioaerosole und marine Aerosole. Die feinen Partikel

1. Einleitung 3 (PM_2,5) sind vor allem antrophogen verursacht. Sie entstehen bei Verbrennungsprozessen,

unter anderem auch in Fahrzeugmotoren. Die ultrafeinen Partikel (< 0,02 µm) werden bei der Kondensation gasförmiger Verbrennungsprodukte gebildet, gehen aber rasch durch die oben beschriebenen Mechanismen in feine Partikel (0,02-2,5 µm) über (Brändli O, 1996).

Durch menschliche Aktivität, insbesondere die Verwendung von fossilen Brennstoffen (Kohle und Erdöl für Heizung, Verkehr und Kraftwerke) und Zigarettenrauchen entstehen so bis zu 4 Millionen feine Russpartikel pro cm³ zusätzlich (Brändli O, 1996).

Für Deutschland ist davon auszugehen, dass ein Großteil der PM2,5 aus Dieselmotoremissionen stammen (Wichmann, 2003).

1.4 Epidemiologische Daten

Epidemiologische Untersuchungen seit den 80ern wiesen auf Zusammenhänge zwischen anthropogenen Stäuben und einem Anstieg der Mortalität hin.

Vor allem die Feinstäube (PM2,5) sind immer mehr in den Mittelpunkt des Interesses gelangt.

Zur Zeit stützt sich das Wissen hierüber auf wenige Großstudien.

In der Harvard Six Cities Studie wurde der Einfluss von verschiedenen Schadstoffen der Außenluft auf die Gesundheit von insgesamt 8000 Erwachsenen über einen Zeitraum von 16 Jahren in sechs US-Städten beobachtet. Es zeigte sich eine erhöhte Mortalität, die am engsten mit den Feinstäuben korrelierte (Dockery et al., 1993). In der am stärksten mit Stäuben der Klasse PM_2,5 belasteten Stadt lag die Mortalität 26% höher als in der Stadt mit der

niedrigsten PM_2,5-Konzentration.

Zu ähnlichen Ergebnissen kamen Pope et al.1995 in der American Cancer Society (ACS)- Studie, in der ca. 550 000 Erwachsene in 151 Städten für einen achtjährigen Zeitraum beobachtet wurden. Die Feinstäube (PM2,5) zeigten hier die stärkste Assoziation mit der Mortalität (Pope, III et al., 1995). In einer fortgeschriebenen Erweiterung der Studie wurde die Datenbasis deutlich verbreitert. So wurde der Beobachtungszeitraum auf 16 Jahre verdoppelt, die Zahl der ausgewerteten Todesfälle verdreifacht und vermehrt Außenluftdaten berücksichtigt. Für alle Todesursachen, kardiopulmonale Todesfälle und die Sterblichkeit an Lungenkrebs wurden statistisch signifikant erhöhte relative Risiken für PM2,5 gefunden (Pope, III et al., 2002).

Einen Zusammenhang für eine erhöhte kardiopulmonale Mortalität und der Belastung durch verkehrsabhängige Stäube konnte auch kürzlich von Hoek et al. in den Niederlanden gezeigt werden. In der „Netherlands Cohort Study on Diet and Cancer“ wurden 5000 Personen im

1. Einleitung 4 Alter von 55 bis 69 Jahren im Zeitraum 1986 bis 1994 beobachtet. Das Wohnen an einer stark

befahrenen Straße ging signifikant mit einer Erhöhung der kardiopulmonalen Sterblichkeit einher, aber nichtsignifikant mit einer erhöhten Gesamtsterblichkeit (Hoek et al., 2002). Es ist davon auszugehen, dass die Partikel, welche durch die am Straßenverkehr beteiligten Fahrzeuge erzeugt werden, zum aller größten Teil aus PM2,5-Partikeln bestehen. Letztere Untersuchung unterstreicht so noch einmal die Bedeutung der Feinstäube im Hinblick auf negative Gesundheitsfolgen.

1.5 Feinstäube und Allergien

Die oben genannten Studien zeigen einen Zusammenhang von erhöhter Feinstaubbelastung und der Mortalität. Allerdings lassen sich gesundheitliche Veränderungen auch schon zu Lebzeiten detektieren, die ebenfalls mit der Feinstaubbelastung korrelieren. So ist seit den 80er Jahren bekannt, dass komplexe Interaktionen zwischen Luftverschmutzung und allergischen Entzündungen existieren (Patton and Lopez, 2002). Auch gibt es Hinweise auf Verbindungen zwischen der Luftverschmutzung und dem Anstieg der Allergierate in den westlichen Industrienationen. Um die Zusammenhänge besser herauszuarbeiten, wurde die Strategie der Allergotoxikologie entwickelt. Hierin werden epidemiologische, klinische und toxikologische Untersuchungen und deren Ergebnisse miteinander verknüpft.

Eine Reihe von epidemiologischen Untersuchungen nach der Demokratisierung Osteuropas verglich die Allergieprävalenz zwischen Ost- und Westeuropa. Es fanden sich vermehrt allergisch respiratorische Erkrankungen in den westlichen Ländern.

Luftbelastungen mit Sulfat-Dioxyd (SO2) und erhöhtem TSP-Gehalt (total suspendet particles), wie sie in den osteuropäischen Ländern vorlagen, waren mit viralen und bakteriellen Entzündungen sowie Infektionen verbunden. Ein Anstieg der Allergien konnte für die erhöhten SO2 und TSP-Raten hingegen nicht verzeichnet werden.

Ganz anders bei den Noxen, die sich typischer Weise in der Luft der westeuropäischen Industrieländer finden. Hierbei handelt es sich um Nitrogenoxyd, Ozon und Feinstäube.

Es ließ sich hierfür sehr wohl eine positive Assoziation zum Allergietrend in den betroffenen Nationen zeigen (Ring et al., 2001).

Die Universität Utrecht veröffentlichte hierzu eine Studie an holländischen Schulkindern.

Diese untersuchte das Auftreten von Allergien und Atemwegserkrankungen bei Kindern, deren Schulen sich in unmittelbarer Nähe von Straßen mit hohem Verkehrsaufkommen

1. Einleitung 5 befanden. Es zeigte sich eine positive Korrelation von Schwerlastverkehr (Dieselmotoren =

hohe PM_2,5-Freisetzung) mit einer Zunahme der bronchialen Hyperreaktivität, sowie ein Anstieg positiver Haut-Prick-Teste für Umweltallergene (Janssen et al., 2003).

Es gibt verschiedene Ansätze zur Erklärung des Allergieanstieges unter der Luftverunreinigung der westlichen Welt. Einige gehen davon aus, dass es zu einer lokalen Entzündung am respiratorischen Epithel kommt. Die Alveolaroberfläche wird durch den oxidativen Stress der Noxe selbst oder der bei der Entzündung beteiligten Zellreihen geschädigt. Hierdurch soll es zu einer Membranstörung kommen. Dieses würde verschiedenen Stoffen die Penetration bzw. den Kontakt mit immunologisch kompetenten Zellen erleichtern. Dadurch könnte es zu einer allergenisierenden Wirkung und zur Ausbildung einer Allergie kommen.

Neuere Studien stellten die besondere Bedeutung der PM2,5-Stäube bei der Beeinflussung des Immunsystems heraus. Als ein Teil der „Central European Study on Air Quality and Respiratory Health“ (CESAR) wurden in 17 Orten Blut- und Serumproben von Schulkindern gesammelt. Die IgG-Konzentration und die Zahl der Lymphozyten im Serum stiegen mit der PM-Belastung an. Diese Beziehung war am stärksten und statistisch signifikant für PM_2,5, aber schwach und nichtsignifikant für die groben Partikel PM_2,5-10 (Leonardi et al., 2000).

1.6 Bedeutung der Partikelgröße

Es existieren verschiedene Modellvorstellungen um die besondere Bedeutung der PM_2,5- Staubfraktion zu erklären.

Ein Ansatz sieht den Grund hierfür vor allem in der Größe der Staubpartikel selbst. Partikel mit einem Durchmesser von mehr als 2,5µm werden zum überwiegenden Teil im Nasenrachenraum abgeschieden und gelangen erst gar nicht in die Lungenperipherie. Partikel von weniger als 2,5µm werden hingegen nicht mehr so effektiv aus der Atemluft gefiltert. So können sie über die tieferen Lungenabschnitte bis in die Alveolen gelangen. Dass es sich hierbei nicht nur um theoretische Modelle handelt, konnte in verschiedenen Experimenten, welche das Depositionsverhalten von Partikeln im menschlichen Respirationstrakt untersuchten, gezeigt werden (Heyder, 1982).

In den unterschiedlichen Abschnitten der Atemwege besitzt der Körper verschiedene Reinigungs- und Schutzmechanismen. So spielt im oberen Bereich vor allem der mukoziliäre

1. Einleitung 6 Transport die Hauptrolle. Die mittlere Verweildauer für Partikel in diesem Bereich beträgt

dadurch nur etwa 1-3 Tage. In den tieferen Regionen der Lunge ist die Verweildauer wesentlich höher und kann sogar Jahre dauern. Hier ist es die Phagozytose durch freiwandernde Alveolarmakrophagen, die für die Beseitigung der Partikel verantwortlich ist.

Dieser Mechanismus eliminiert aber nur ca. ein Drittel der unlöslichen Partikel aus dem Alveolarbereich. Der überwiegende Teil wird interstitiell, subpleural oder im lymphatischen System des Thorax retiniert (Kreyling et al., 1990). Die verlängerte Verweildauer bedeutet auch eine größere mögliche Schädigung des respiratorischen Epithels.

Bei Patienten mit Atemwegsobstruktion ist die Partikeldeposition wegen der stärkeren Turbulenz des Luftstromes zudem in den zentralen Atemwegen noch größer als bei Gesunden (Chong SK and Lewars GA, 1988). Auch Kinder deponieren einen deutlich höheren Anteil, zumindest für Partikel zwischen 1 und 3 µm, als gesunde Erwachsene (Ostro et al., 1993).

1.7 Bedeutung der Partikeloberfläche und des Metallgehaltes

Ein anderer wichtiger Punkt scheint in der Oberfläche bzw. der Oberflächenbeschaffenheit der Partikel zu liegen. Vergleicht man die Oberfläche von PM_2,5-Partikel mit Partikeln größeren Durchmessers, so haben die PM_2,5 bei gleicher Masse eine vielfach größere Oberfläche. Somit ergibt sich sowohl eine größere Reaktionsfläche zwischen Partikel und Lungenepithel als auch zwischen Partikel und an deren Oberfläche befindlichen Luftschadstoffen. Hierbei ist im Besonderen an Oxydantien, Karzinogene oder andere chemische Verbindungen zu denken, die über die Partikel in den Bronchialbaum eingetragen werden.

Dass dies detektierbare Auswirkungen hat, konnte 2002 von Pozzi et al. gezeigt werden.

Es ließ sich nachweisen, dass nicht die Partikelgröße für die inflammatorische Antwort verantwortlich ist, sondern die an der Oberfläche absorbierten „Verunreinigungen“. Hierzu wurde die Interleukinantwort (TNFα, Arachnoidonsäure) einer Zellreihe, die einmal mit PM2,5

aus Rom und ein anderes Mal mit Kohlenstaub („carbon black“) der gleichen Größe inkubierte, gemessen.

Es fanden sich signifikant höhere Interleukinwerte für die städtischen Stäube. Verantwortlich gemacht wurden hierfür sich auf der Oberfläche der urbanen Partikel befindliche absorbierte Elemente wie zum Beispiel Natrium, Magnesium, aber auch eine Reihe von Metallen wie Eisen, Zink und Blei (Pozzi et al., 2003).

Schon früher wurde der Verdacht geäußert, Metalle spielten eine wichtige Rolle bei der pro- entzündlichen Aktivität von Stäuben.

1. Einleitung 7 Dass der Metallgehalt von Stäuben sich inflammatorisch auswirkt, belegte Costa 1997 an

Ratten (Costa and Dreher, 1997). Den Tieren wurde zum einen gleiche Staubmenge, zum anderen gleicher Metallgehalt bei unterschiedlicher Staubmenge tracheal appliziert. Gleiche Metallmenge löste auch immer gleiche Inflammationsstärke aus.

Ein Versuch, welcher die Auswirkungen der Feinstäube und deren Beeinflussbarkeit durch Metallchelatoren in Ratten untersuchte, kam zu dem Schluss, dass die Entzündungsaktivität nicht durch Chelatoren verändert wird (Brown et al., 2000). Andere Versuche ergaben Gegenteiliges. So konnte Jimenez das Entzündungspotential unter Verwendung von Metallchelatoren signifikant senken (Jimenez et al., 2000).

Dies lässt zumindest die Frage aufkommen ob alle Metalle die Lunge in gleicher Weise beeinflussen.

Versuche mit Mäusen stellten eine besondere Bedeutung für Zink heraus (Prieditis and Adamson, 2002).

Ob und wie die oben genannten tierversuchlichen Ergebnisse auf den Menschen zu übertragen sind, ist im Moment schwer zu beantworten, da sehr wenige kontrolliert klinische Studien am Menschen zur Verfügung stehen. So existiert lediglich eine amerikanische Untersuchung aus dem Utah-Valley. Hierbei wurde als Hauptquelle für die PM-Belastung eine Stahlhütte ausgemacht. Diese hatte eine streikbedingte Betriebspause von 13 Monaten.

Epidemiologische Untersuchungen zeigten einen Rückgang der respiratorischen Erkrankungen bei der Bevölkerung für den Zeitraum der Arbeitsniederlegung. Zu nennen sind unter Anderem Bronchitis, Asthma, Pneumonien und die damit verbundenen Krankenhausaufenthalte, sowie die täglichen Sterbezahlen für maligne und nicht-maligne Atemwegserkrankungen.

Nach Beendigung des Arbeitskampfes und dem damit verbundenen Wiederbetrieb der Stahlhütte zeigte sich ein gegenläufiger Trend.

Parallel zu der epidemiologischen Erfassung wurden vor, während und nach dem Streik Staubproben gewonnen. Analysen der wasserlöslichen Filterextrakte zeigten einen Rückgang des Staub-Metallgehaltes für die Zeit des Werkschlusses. In weiteren Versuchen war dies mit geringeren oxidativen Schäden an humanen Epithelzellen in vitro verbunden, verglichen mit den Stäuben aus der Betriebsphase des Stahlwerkes. Die Zytokinproduktion der Zellen war für den Zeitraum vor und nach dem Streik erhöht.

Auch die Auswirkungen im menschlichen Respirationstrakt wurden näher untersucht.

Hierzu wurden 500µg der Stäube, gelöst in 10 ml NaCl, je einem gesunden, nichtrauchenden Probanden (n=24) über eine Brochoskopie instilliert. 20 ml NaCl-Lösung wurden als

1. Einleitung 8 Vergleich ebenfalls appliziert. Nach 24 Stunden wurden die entsprechenden Lungen-

Segmente über eine Bronchoalveoläre-Lavage (BAL) gespült und die dabei gewonnen Zellen und Proteine analysiert.

Die Lavagen aus den Probanden, welche die Stäube aus den Jahren der arbeitenden Hütte erhalten hatten, zeigten mehr Entzündungszeichen. So lagen bei ihnen die Werte für Albumin, Protein und Fibronectin signifikant höher als in der Gruppe aus der Zeit der Werksschließung.

Gleiches galt für die Anzahl an Neutrophilen in der BAL, ebenso für TNFα und Interleukin-8.

Inflammation im tiefen humanen Respirationstrakt nach Exposition von wasserlöslichen Staubfilterextrakten korrelieren folglich mit dem Metallgehalt und oxidativen Potential

der Stäube. Dies stützt die These, dass der biologische Effekt von PM mit dem Metallgehalt assoziiert sein kann (Ghio and Devlin, 2001).

1.8 Wirkung der Partikel auf Zellebene

Die epidemiologischen Daten zu gesundheitlichen Auswirkungen von Stäuben, und Feinstäuben im Besonderen, sind eingangs bereits dargestellt worden.

Welche Partikeleigenschaften die Gesundheitseffekte verursachen, wird zur Zeit intensiv diskutiert. Ebenso kann zur Zeit noch kein einheitlicher biologischer Mechanismus für die negativen gesundheitlichen Auswirkungen verantwortlich gemacht werden.

Das Augenmerk richtet sich aber vermehrt auf die oxidativen Vorgänge, die durch die Feinstäube in der Lunge hervorgerufen werden. So verursachen die Partikel eine Immunreaktion, die zu einer Generierung von oxidativen Potentialen auf zellulärer Ebene führt. Die Feinstäube werden von den Alveolar-Makrophagen als körperfremde Materialien erkannt und phagozytiert. Dabei setzen sie eine Reihe von pro-inflammatorischen Mediatoren, aber auch reaktive Sauerstoffverbindungen (reactiv oxygen species, ROS) frei.

Diese Vorgänge sind Teil der physiologischen Reaktion zu Aufrechterhaltung der körpereigenen Homöostase, andererseits kann eine unverhältnismäßige Zunahme der Mediatoren zu einer Schädigung von gesundem Gewebe führen. Bei einer derartigen Zunahme spricht man auch von oxidativem Stress.

Die entstehenden reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), die sich durch ein hohes Reaktionspotential auszeichnen, oxidieren eine Reihe von Biomolekülen und können der Zelle so einen nicht unwesentlichen Schaden zufügen.

Aus mehreren Gründen sind reaktive Sauerstoffmetabolite zellpathogen. Sie können DNA- Strangbrüche induzieren, Onkogene aktivieren oder Enzyme sowie Proteine inaktivieren. Ein anderer wichtiger Aspekt in der zellschädigenden Wirkung von Oxidantien ist ihre Reaktivität

1. Einleitung 9 gegenüber den Fettsäuren in Biomembranen. Bei diesem als Lipidoxidation beschriebenen

Vorgang kann es zu einer völligen Zerstörung der Membranen von Zellen oder Zellorganellen kommen (Buhl et al., 1994).

Neben den ROS werden außerdem reaktive Stickstoffverbindungen (reactive nitrogen species RNS) als Ursache für oxidativen Stress verantwortlich gemacht.

Im aeroben Organismus exsistiert eine Reihe von Mechanismen um sich vor den oxidierenden Valenzen zu schützen.

Hierzu findet sich ein fein abgestimmtes intra- und extrazelluläres System aus Antioxidatien, welches die oxidativen Vorgänge neutralisieren soll. Zu diesen Antioxidantien sind Enzyme wie die Superoxid-Dismutase (SOD) und die Katalase zu zählen. Als nichtenzymatische Antioxidantien liegen unter anderem Glutathion (GSH), Vitamin A, C und E sowie Methionin vor.

Normalerweise herrscht unter gesunden Bedingungen ein Gleichgewicht zwischen Oxidantien und Antioxidantien. Wenn das körpereigene antioxidative System allerdings nur ungenügenden Schutz bietet, können ROS und RNS zu Schädigungen führen.

Eine Reihe an Erkrankungen ist auf eine Störung dieses Gleichgewichtes durch eine Zunahme an Oxidantien oder eine Verringerung von Antioxidantien zurückzuführen. Hier seien das ARDS (adult respiratory distress syndrome), die idiopathische Lungenfibrose (IPF) oder die zystische Fibrose (Mukoviszidose) beispielhaft genannt (Gutteridge et al., 1994),(Cantin et al., 1989a).

1.8.1 Zelluläre Quellen von oxidativen Potentialen

Nicht nur unter pathologischen Bedingungen kann es zu einer Zunahme an oxidativen Potentialen in den Atemwegen kommen. Auch zur Infektabwehr setzt der Körper die hochreaktiven oxidativen Metabolite ein. So lässt sich bei der Infektabwehr nicht nur eine gesteigerte Gesamt-Zellzahl in der Lunge, sondern auch eine gesteigerte Oxidantienbelastung beobachten. Makrophagen und Granulozyten sind Quellen dieser vermehrten Oxidantienfreisetzung, da sie diese nach Aktivierung in größerem Maße generieren. Durch diesen Mechanismus sollen körperfremde Stoffe oder Mikroorganismen geschädigt werden.

Eines der wichtigsten Radikale ist das Superoxidanion (O2-

). Als enzymatische Quellen für O2-

kommen die NADPH-Oxidase (vor allem in neutrophilen Granulozyten), die Xanthin- Dehydrogenase-Oxidase (in Endothelzellen des Instestinums) oder die Indolamin- Dioxygenase (hohe Enzymaktivität in der Lunge) in Frage.

1. Einleitung 10 Eine besondere Bedeutung kommt dem Superoxidanion auch im Zusammenhang mit der

Sauerstoffradikalbildung nach Staubexposition zu.

Es konnte in verschiedenen Studien gezeigt werden, dass Phagozyten und hier im Besonderen die Makrophagen nach Aufnahme von Staubpartikeln eine gesteigerte Oxidantienfreisetzung zeigten (Hoidal et al., 1981;Rom et al., 1991). Alveoläre Makrophagen werden durch eine Staubexposition und anschließender Phagozytose zur Sauerstoffradikalbildung angeregt.

Hierbei werden von den exponierten Zellen zwei- bis dreimal mehr reaktive Sauerstoffmetabolite gebildet als von nicht exponierten Zellen. Bei den hierbei gebildeten Radikalen sind vor allem Superoxidanionen (O2-

) und Wasserstoffperoxid (H2O2) zu nennen, die darüber hinaus auch als Ausgangsstoffe für weitaus toxischere Oxydantien dienen. So zum Beispiel für das Hydroxylradikal (OH^.), welches ein hohes zelltoxisches Potential besitzt.

Aus der Zunahme an Oxidantien kann ein Ungleichgewicht resultieren, wenn es nicht auch zu einem kompensatorischen Anstieg in den Antioxidantien kommt. Dieses Ungleichgewicht zu Gunsten der Oxidantien wird auch als oxidativer Stress bezeichnet.

Somit wirken sich die Partikel indirekt auf das oxidativ/antioxidative Gleichgewicht in der Lunge aus, da ihre Phagozytose eine Generierung von Oxidantien in den Zellen des Immunsystems hervorruft.

1.8.2 Direkte Partikelwirkung auf das oxidative Gleichgewicht

Ein Ungleichgewicht zwischen den Oxidantien und Antioxidantien kann auch durch den Eintrag von zusätzlichen oxidierenden Substanzen induziert werden, genauso wie durch Stoffe, die die Bildung von Oxidantien katalysieren. Als Quelle eines erhöhten Oxidatieneintrages in die Lunge kommen außer Gasen vor allem Partikel in Frage. Hier im Besonderen solche Partikel mit Durchmessern, die eine Lungengängigkeit bis in die Alveolen ermöglichen. Somit also Partikel der Gruppe PM2,5 und kleiner.

1. Einleitung 11 In der Abbildung sind modellhaft die Auswirkungen von oxidativ wirksamen Partikeln

dargestellt.

Abbildung 1: Modell der partikelvermittelten Inflammation

Wie oben bereits dargestellt sind die PM2,5–Stäube besonders durch ihre Herkunft und ihre Zusammensetzung interessant. Da sie vor allem bei Verbrennungprozessen entstehen, tragen sie an ihrer Oberfläche eine große Anzahl an oxidativ wirksamen Metallen. Diese Metalle scheinen für die hohe oxidative Aktivität der Feinstäube verantwortlich zu sein.

Durch die von verschiedenen Metallen vermittelte Katalyse entsteht über das eingangs erwähnte Superoxidanion (O2-

) vermehrt das hochtoxische Hydroxylradikal. Besonders Eisen und Kupfer sowie Zink scheinen hier eine große Rolle zu spielen. (Shi et al., 2003a).

Die folgenden Formeln zeigen eine solche Katalyse für das Metall Eisen (Fe) O₂^- + Fe³⁺ → O₂ + Fe2+

(1) O₂^- + [2Fe²⁺ – 2 Fe³⁺ – 4S] + 2H⁺ → H₂O₂ + Fe²⁺ + [ 2 Fe³⁺ – 4S] (2) Fe²⁺ + H₂O₂ → Fe³⁺ + OH^- + OH^. (3)

Redoxrektion zur Bildung der Hydroxylradikals (OH^.)

Reaktion (1) wird als Haber-Weiss-Reaktion bezeichnet, Reaktion (3) ist als Fetonreaktion bekannt.

Oxidativer Stress

Partikel (u.a. Metale)

Entzündung Lungenzellen

Makrophagen, Monocyten, epitheliale Zellen

NFκB, AP-1

Superoxide-anion, Hydrogen-peroxide Lungen-

Epithel- Flüssigkeit

1. Einleitung 12 Die Entstehung von Hydroxylradikal kann verschiedene Auswirkungen auf die Homöostase

der Lunge haben. Einerseits kann es zu Schäden an Makromolekülen, z.B. DNA, kommen.

Andererseits führt OH^. zu einer Störung des Redoxgleichgewichtes in der Zelle, was wiederum erhöhte Transkriptionsfaktoren (NF-κB, AP-1) zu Folge haben kann. Dies zieht eine verstärkte Inflammation nach sich (Jimenez et al., 2000;Timblin et al., 1998).

So wirken die Stäube direkt auf das oxidativ/antioxidative Gleichgewicht in der Lunge, indem sie oxidativ aktive Substanzen in die tiefen Lungenabschnitte transportieren und darüber hinaus deren vermehrte Bildung katalysieren.

1.8.3 Bedeutung des Stickstoffmonoxids am oxidativen Stress

Bei dem Nitrat wie auch bei dem Nitrit handelt es sich um Reaktionsprodukte des Stickstoffmonoxids (NO), wie sie im Rahmen von oxidativem Stress in der menschlichen Lunge vorkommen. Man spricht auch von reaktiven Stickstoffverbindungen oder von reactive nitrogen species (RNS).

Es sind sehr zahlreiche Aufgaben von NO beschrieben worden. So ist das Stickstoffmonoxid ein wichtiger endogener Vasodilatator, aber es erfüllt auch Funktionen als zentraler oder peripherer Neurotransmitter. Ebenso dient es zur Abwehr von Bakterien und Tumorzellen.

Die Bildung von NO erfolgt aus der Aminosäure L-Arginin über eine sogenannte NO- Synthase (NOS). Von dieser NO-Synthase sind drei Isoformen beschrieben. Sie wurden nach ihrem Hauptexpressionsort oder ihrem Charakter (induziert, nichtinduziert) benannt: endothel cell-NOS (ecNOS = NOS-1), brain-NOS (bNOS = NOS-3) und als induzierbare Form (iNOS

= NOS-2).

Die Aufgaben und Funktionsweisen der ecNOS und der bNOS sind in der gängigen Literatur bereits eingehend beschrieben worden. Ihnen kommt vor allem unter physiologischen Bedingungen eine Reihe von wichtigen Aufgaben zu. Anders verhält es sich bei der iNOS, die unter physiologischen Bedingungen in geringem Maße anzutreffen ist (Guo and Erzurum, 1998).

Ihre Bildung wird durch Endotoxin und verschiedenste Zytokine wie das Interleukin-1 oder das TNF-α induziert. 4-12 Stunden nach Auftreten des Stimulus kommt es zu einem Anstieg der NO-Syntheserate. Dieses „verzögerte“ Ansprechen ist dadurch zu erklären, dass es sich um einen Induktionsprozess handelt. Hierbei wird nach Stimulation via Transkription neuer mRNA und Proteinbiosynthese das Enzym gebildet.

1. Einleitung 13 Es existiert eine Reihe an Faktoren, welche die Induktion von iNOS hemmen können.

Derartige Faktoren sind Glukokortikoide oder auch das Thrombin. Allerdings haben diese Substanzen nach erfolgter Induktion keinerlei Einfluss mehr auf die NO-Syntheserate.

Ein Nachweis der iNOS ist für viele Zellen des menschlichen Körpers gelungen. So zu Beispiel für Hepatozyten, Fibroblasten aber auch in Makrophagen und neutrophilen Granulozyten. Eine der größten Aktivitäten der NOS-2 ist allerdings in der Lunge beobachtet worden (Dweik et al., 1998).

Im Rahmen von entzündlichen Erkrankungen des Respirationstraktes wie Asthma oder dem adult respiratory distress syndrome (ARDS) lassen sich erhöhte Expressionen von NOS-2 im respiratorischen Epithel und den inflammatorischen Zellen nachweisen. Verbunden damit ist auch ein Anstieg der NO-Synthese. Im diesem Anstieg vermutet man eine unspezifische Abwehrreaktion gegen bakterielle und virale Infektionen.

Ob auch nach Instillation von umweltüblichen Konzentrationen von PM2.5 Stickoxide vermehrt freigesetzt werden und somit im staubvermittelten Entzündungsgeschehen in der Lunge pathogene Auswirkungen haben, ist dagegen nicht bekannt. Besonders interessant ist daher die Frage, ob es nach Staubbelastung zu einem staubvermittelten und NO-induzierten Entzündungsgeschehen kommt. Eine derartige Inflammation stände im engen Zusammenhang mit oxidativen Metaboliten wie dem Superoxid aus aktivierten Entzündungszellen. NO reagiert hierbei zu Nitrat oder Nitrit sowie zu Peroxynitrit (ONOO^-). Der für Letzteres verantwortliche Mechanismus ist eine Reaktion zwischen dem Stickstoffmonoxid (NO) und dem Superoxid. Das dabei entstehende Molekül ist stark oxidierend und nitrierend, weist allerdings nur eine sehr kurze Halbwertzeit auf. Zum Einen isomerisiert es schnell zu Nitrat und zum Anderen reagiert es stark mit zellulären Molekülen (Michael Exner, 2003).

Um eine Beteiligung von NO an der Entzündungsreaktion zu detektieren kann eine indirekte Messung des Stickstoffmonoxides angewandt werden. Hierbei werden die stabilen Produkte Nitrat und Nitrit bestimmt mit denen NO in einem Verhältnis von 1:1 steht. Eine Zunahme einer dieser Substanzen in der BAL ließe auf ein Ansteigen von NO in der Lunge schließen.

1.9 Erfassen des oxidativen Stresses in vivo

Bei der Erfassung von oxidativen Stress in vivo muss man sich vor Augen halten, dass es sich bei den reaktiven Molekülen, die diesen auslösen, um sehr kurzlebige Substanzen handelt.

Somit ist es fast aussichtslos zu versuchen die Radikale zu bestimmen. Um dennoch Aussagen

1. Einleitung 14 über Vorhandensein oxidativer Potentiale treffen zu können, muss man Moleküle

heranziehen, die sich bei oxidativen Stress in vermehrtem Maße bilden. Derartige Stoffe sollten sich durch eine gewisse Stabilität gegenüber weiteren Reaktionen und Spezifität bezüglich der oxidativen Genese auszeichnen.

Als sicherste Marker für oxidativen Stress gelten die Hochregulierung von antioxidativen Enzymen, wie z.B. die Superoxid-Dismutase (SOD) oder nicht-enzymatischer Antioxidantien wie das Glutathion (GSH).

1.9.1 Glutathion und andere Antioxidantien

In der Zelle steht eine Reihe von Stoffen zum Schutz gegen oxidierende Einflüsse zur Verfügung. Diese auch als Antioxidantien bezeichnete Substanzen bestehen zum Einen aus Enzymen wie der Katalase, der Superoxid-Dismutase und zum Anderen aus nicht enzymatischen Antioxidantien wie dem Glutathion (GSH), Vitamin A, C, E und dem Methionin, um nur einige zu nennen.

Antioxidantien schützen die wegen ihrer Barrierefunktion und Gasaustausches wichtigen bronchoepithelialen Zellen auch vor staub-induzierten, reaktiven Sauerstoffmetaboliten wie dem Hydroxylradikal (OH^.).

Das Glutathionsystem stellt einen der wichtigsten antioxidativen Schutzmechanismen in der Lungenepithelzelle dar (Meister and Anderson, 1983). Glutathion (GSH) ist ein von der γ- GCS (γ-Glutamyl-Synthetase) und Glutathion-Synthetase gebildetes ubiquitäres Tri-peptit (Meister and Anderson, 1983), bildet ein intra- und extrazelluläres Antioxidans gegen oxidativen und nitrogenen Stress.

So spielt es eine zentrale Rolle bei der Reduktion von H2O2. Hierbei dient reduziertes Glutathion (GSH) als Elektron-Donor. Das in dieser Reaktion gebildete Glutathion-Disulfid (GSSG) wird wiederum über die Glutathion-Reduktase zu GSH reduziert, welche NADPH als Elektronen-Donor verwendet (Deneke and Fanburg, 1989). In gesunden Zellen findet sich ein hohes GSH:GSSG-Verhältnis, wodurch eine Reduzierung von H2O2 durch das Glutathion- System gewährleistet wird.

Eine Verschiebung in diesem Gleichgewicht zwischen GSH und GSSG kann zu Aktivierung von proinflammatorischen Zytokinen und Transkriptionsfaktoren wie dem NF-KB nach sich ziehen. So kommt dem GSH:GSSG-Verhältniss eine wichtige Rolle der inflammatorischen Antwort der Lunge zu (Rahman and MacNee, 2000b).

1. Einleitung 15 Bei einer Reihe von Erkrankungen konnten bisher verringerte GSH-Werte im alveolären

Oberflächenfilm gezeigt werden. So finden sich bei Patienten mit idiopathischer Lungenfibrose (Cantin et al., 1989b), cystischer Fibrose (Roum et al., 1993) aber auch bei ARDS (Bunnell and Pacht, 1993) verminderte GSH-Werte.

Im Gegensatz hierzu finden sich allerdings auch Erkrankungen mit erhöhten GSH-Werten. So ist das GSH und seine oxidierte Form, das GSSG, bei Personen mit mildem Asthma erhöht (Smith et al., 1993). Auch bei chronischen Rauchern findet sich ein Anstieg von GSH, aber nicht bei akuten Rauchern (Cantin et al., 1987;Morrison et al., 1999).

Neben den Auswirkungen in den Antioxidantien lassen sich auch Veränderungen an Biomolekülen zur Erfassung von negativen Auswirkungen oxidativer Vorgänge bestimmen.

Derartige Biomoleküle stellen die Isoprostane dar.

1.9.2 8-Isoprostan: Marker der Lipidoxidation

Wie schon beschrieben, kommt es durch verschiedenste Vorgänge zu unkontrollierten Oxidationen von Biomolekülen. Der dabei entstehende Schaden trifft alle große Klassen von Biomolekülen: Zucker, Proteine wie auch die Lipide.

Eine Möglichkeit um derartige Schäden zu detektieren ist das Erfassen von stabilen Endprodukten solch destruktiver Vorgänge. Diese Endprodukte werden auch als „biomarkers of oxidative stress status = BOSS“ bezeichnet (Pryor, 1999a). Isoprostane stellen eine solche Gruppe von BOSS dar.

Hierbei handelt es sich um Regio- und Stereoisomere der Prostaglandine (Samuelsson, 1983).

Sie entstehen bei der radikalischen Peroxydation der Arachidonsäure. Isoprostane konnten bislang in allen untersuchten Geweben nachgewiesen werden (Morrow and Roberts, 1997).

Eine besondere Gruppe stellen die F2-Isoprostane dar. Sie entstehen durch Endozyklisierung der Arachnidonsäure über freie Radikale.

Folgende Eigenschaften machen diese Isoprostane zu geeigneten Parametern der Erfassung des oxidativen Stresses in vivo: Sie sind in biologischen Flüssigkeiten stabil (Morrow et al., 1990), sind spezifische Produkte der Lipidoxidation (Guido et al., 1993) und darüber hinaus ist ihre Bildung unabhängig von den mit der Nahrung aufgenommenen Lipiden (Richelle et al., 1999).

Ausführliche Darstellungen der F2-Isoprostane finden sich bei L. Jackson Roberts und Domenico Pratico (Roberts and Morrow, 2000;Pratico, 1999).

1. Einleitung 16 Von den F₂-Isoprostane sind vier Regioisomere möglich. Das davon als bestes

charakterisiertes Isoprostan gilt das 8-iso-PGF_2α (Roberts and Morrow, 1997a). Synonyme sind 8-epi-PGF_2α; iPF_2α-III; IPF_2α-IV und 15-F2t-IsoP (Taber et al., 1997).

Ein weiterer Vorteil des 8-iso-PGF_2α liegt darin das es nicht enzymatisch gebildet wird, sondern nur über die Peroxydation der Arachnidonsäure entsteht und somit ein spezifisches Produkt der Lipidoxidation darstellt (Roberts and Morrow, 1997b).

Hingewiesen sei hier aber auch auf Versuche, die eine geringe Bildung von 8-iso-PGF_2α auch über die Cyclooxygenase in vitro beschreiben (Pratico et al., 1995).

In der Literatur finden sich neben der Bedeutung des 8-iso-PGF_2α als Biomarker des oxydativen Stresses ebenfalls Hinweise auf andere biologische Aktivitäten. So ist in vitro eine vasokonstriktive Wirkung beschrieben worden (Takahashi et al., 1992). Es finden sich auch Berichte über bronchokonstriktorische Eigenschaften in vitro (Kang et al., 1993). In vivo- Untersuchungen sind in diesen Punkten allerdings widersprüchlich.

Das 8-iso-PGF2α ist somit ein geeigneter Marker der Lipidoxydation. Darüber hinaus hat sich die massenspektrometrische Bestimmung der Prostagalandine als eine präzise und etablierte Methode erwiesen (Wendelborn et al., 1990).

1.9.3 Gesamt-Protein und LDH

Bekannt ist, dass inhalierte Partikel im Rahmen eines inflammatorischen Geschehens eine Erhöhung der Lungenepithel-permeabilität hervorrufen können (Seaton et al., 1995). Um eine derartige Zunahme der Durchlässigkeit abzuschätzen kann das Gesamt-Protein in der BAL bestimmt werden. In Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass diese Technik vergleichbare Resultate liefert wie eine Messung der Permeabilität mit Hilfe von Jod-125 markiertem BSA (Bovines Serum Albumin) (Li et al., 1994).

Ein weiterer Marker zur Detektion von Zellschäden stellt die Laktatdehydrogenase (LDH) dar. Hierbei handelt es sich um ein Enzym der Glykolyse, das in nahezu allen Geweben vorkommt und bei Zelluntergang zu einem signifikanten Ansteigen von LDH führt. So kommt es bei Zell- und Gewebeschädigungen zu einem Anstieg der LDH. Das stellt somit einen guten Parameter zur Abschätzung von staubvermittelten Epithelschädigenden dar.

Dieses würde mit einem Anstieg der LDH in der BAL einhergehen.

1. Einleitung 17 1.10 Grundlage der vorliegenden Studie

Eine besondere Schwierigkeit bei der Beurteilung der toxikologischen Instillationsexperimenten ist, dass es sich hierbei um Kurzzeitstudien handelt. Es bleibt somit immer die Frage, ob und wie sich die verwendeten Staub-Konzentrationen bei Dauerexpositionen, wie sie sich in der Umwelt finden, auswirken.

Für mehr Klarheit müssen Instillationen mit Stäuben durchgeführt werden, die aus Regionen stammen, deren Staubbelastungen und die damit verbundenen negativen Gesundheitsfolgen bekannt sind. Besonders auch im Hinblick auf eine mögliche Beteiligung der Stäube an der Allergieentstehung.

Grundlage hierfür bietet eine epidemiologische Studie, welche Anfang der 90er in Gebieten Sachsens startete. Es handelte sich hierbei um einen Vergleich zweier stark durch Industrievorkommen (v.a. chemische Industrie und Kohlekraftwerke, sowie Schwermetallindustrie) mit Luftschadstoffen belasteten Gebiete (Bitterfeld und Hettstedt) und einem minder belasteten, ländlichen Gebiet (Zerbst).

1.10.1 Epidemiologische Daten der Untersuchungsgebiete Hettstedt und Zerbst

Es wurden Gesundheitsdaten von ca. 2500 Schulkindern (5-14 Jahre) aus den entsprechenden Orten gesammelt und die Ergebnisse mit der Luftbelastung ins Verhältnis gesetzt. Dieses Studienprotokoll führte man 1992-1993, 1995-1996, 1998-1999 entsprechend durch.

Gesundheitliche Wirkungen wurden in erster Linie im Hinblick auf den Respirationstrakt erfasst. Unter anderem die Lungenfunktionen, IgE-Serumspiegel und ein Haut-Prick-Test der Kinder. Es gingen auch Diagnosen zu Atemwegskrankheiten und Symptomhäufigkeiten in die Studienauswertung mit ein. Ebenfalls soziodemographische Daten zu den Wohnverhältnissen und der häuslichen Umgebung der Kinder.

Der erste Untersuchungsdurchgang (1992-1993) zeigte für die stark belasteten Gebiete eine höhere Prävalenz für nicht allergische respiratorische Erkrankungen wie Bronchitits oder Pneumonien verglichen mit der minderbelasteten Region Zerbst. Ebenfalls fanden sich bei den Kindern aus Hettstedt (belastetes Gebiet) häufiger Allergien mit erhöhten Serum-IgE- Spiegeln (Heinrich et al., 2002).

Durch den Untergang zahlreicher Industriezweige in der ehemaligen DDR nach der Wiedervereinigung verbesserte sich die Luftqualität der entsprechenden Gebiete rasch. So zeigte sich bald kein Unterschied mehr in Bezug auf die Gesamt-Staubmasse zwischen den

1. Einleitung 18 Gebieten. Allerdings bestanden noch qualitative Unterschiede in der Staubzusammensetzung.

Vor allem im Schwermetallgehalt der Stäube fanden sich Differenzen.

Erwartungsgemäß gingen mit der Gesamt-Staubbelastung auch die Atemwegserkrankungen zurück. Vor allem die Bronchitis und die nicht allergischen respiratorischen Erkrankungen waren hiervon betroffen (Heinrich et al., 1999).

Bei den allergischen Erkrankungen konnte ein solcher Trend leider nicht verzeichnet werden.

Hingegen zeigten sich eine Häufung von allergischen Erkrankungen sowie eine signifikante Zunahme für Asthma und Neurodermitis. Dies ging mit einer Zunahme der bronchialen Hyperreaktivität einher (Frye et al., 2001). Ebenso fand sich ein Hang zu stärkeren Reaktionen gegenüber den Allergenen (RAST > 17,5 kU/l) (Heinrich et al., 2002). Letzteres galt für beide Gebiete, wobei sich in Hettstedt immer noch eine höhere Allergieneigung gegenüber Zerbst fand.

Hieraus könnte sich schließen lassen, dass die Allergieprävalenz in dieser Region unabhängig von der Staubmenge durch die Staubzusammensetzung beeinflusst wird.

1.10.2 Tierversuchliche Daten zu Hettstedt und Zerbst

Dass Unterschiede in der inflammatorischen Potenz der Stäube existieren, konnte im Tiermodell gezeigt werden. Hierbei wurden Balb/c-Mäusen 100µg PM_2,5-Stäube aus Hettstedt und Zerbst oropharyngeal instilliert. Nach 18h wurden die Lungen der Tiere lavagiert.

Als Marker für eine erhöhte Epithelpermeabilität bzw. einer vermehrten lysozymalen Enzymabgabe fanden BAL-Protein-Gehalt und NAG (N-acetyl-β-D-Glucosidase) Verwendung. Für Hettstedt zeigten sich hier signifikant höhere Werte verglichen mit Zerbst.

Auch für die proinflammatorischen Cytokine IL-1β und IL-6 war dieser Trend zu verzeichnen. Hierbei fanden sich für Hettstedt zweifach höhere Werte als für Zerbst.

Allerdings konnten keine signifikanten Unterschiede erreicht werden (Gavett et al., 2003).

Eine Erweiterung der Studie sollte die Beteiligung der Stäube aus Hettstedt und Zerbst an der Allergieentstehung zeigen.

Gavett und Gilmour versuchten hierbei zwei Fragen zu beantworten. Einerseits, ob die epidemiologischen Daten zur Allergieprevalenz im Tiermodell nachzuvollziehen sind, und andererseits, ob sich die Zusammensetzung der PM2,5-Stäube als kausaler Faktor zum Unterschied der Allergiehäufigkeit der Gebiete Hettstedt/Zerbst heranziehen lässt.

Hierzu wurden PM2,5-Aliquots von Stäuben aus Hettstedt und Zerbst (Sammelperiode 1999),

1. Einleitung 19 sowie von Leerfiltern Ovalbumin (OVA) allergiesierten Balb/c-Mäusen oropharyngeal

instilliert. Die verwendetet Staubdosis lag bei jeweils 50 µg. Das geschah entweder zwei Stunden vor der Sensibilisierung gegen OVA oder 2h vor der Allergenprovokation mit OVA.

Dies Vorgehen diente zur Differenzierung, ob die Stäube wirklich die Allergieprävalenz erhöhen oder nur eine Exazerbation der allergischen Antwort bei empfindlichen Individuen hervorrufen.

Bestimmte Parameter waren unter anderem LDH, NAG und Zelldifferenzierung aus BAL- Flüssigkeit. Aber auch OVA-spezifisches IgE, Lungen-Funktion und Metacholintest bei den Tieren.

Mäuse, die zwei Stunden vor der Allergenprovokation Staub aus Hettstedt erhalten hatten, zeigten einen signifikanten Anstieg der allergischen Antwort. Ebenso waren bei diesen Mäusen die bronchiale Hyperreaktivität und die BAL-Zellzahlen erhöht.

Solches konnte weder für die Zerbst-Aliquots noch die Kontrollfilteraliquots gezeigt werden.

Bei Gabe der Stäube zwei Stunden vor der Sensibilisierung gegen OVA wurde kein Anstieg der allergischen Reaktion im Respirationstrakt der Tiere beobachtet. Allerdings war ein erhöhtes spezifisches OVA-IgE für die Hettstedt-Mäuse zu verzeichnen. Dies ging aber nicht mit einer erhöhten allergischen Reaktion nach OVA-Provokation einher.

So zeigte die Studie, dass der Metallgehalt von PM_2,5-Stäuben die allergische Atemwegsreaktion in vorher sensibilisierten Mäusen beeinflusst und mit stärkeren Reaktionen verbunden ist. Des Weiteren, dass PM_2,5-Stäube mit einem hohen Metallgehalt einen signifikanten Anstieg von Parametern allergischer Atemwegserkrankungen in Mäusen auslösen, verglichen mit PM_2,5-Stäuben, die einen geringeren Gehalt an Metallen aufweisen (Gavett et al., 2003).

Somit kann festgestellt werden, dass in vivo reaktive Sauerstoff- und Stickstoffmetabolite auf zweierlei Wegen freigesetzt werden. Zum Einen durch die aktivierten Phagozyten und deren Enzymsysteme, welche die Oxidantien produzieren, und zum Anderen durch die oben angesprochene chemische Reaktionen in Verbindung mit metallhaltigen Stäuben.

Ob eine Instillation von metallhaltigen Feinstäuben der Größe PM2,5 aus Hettstedt und Zerbst, in umweltüblichen Konzentrationen zu einer vermehrten Bildung von oxidativ wirksamen Metaboliten führt, ist ebenso wenig bekannt wie die Auswirkung auf die NO-Synthese. Zur Beantwortung dieser Fragen sollen die Entzündungszellen, deren Fähigkeit zur Radikalproduktion genauso wie die Folgeprodukte oxidativer Vorgänge nach Staubinstillation bestimmt werden. Etwaige Unterschiede der Stäube in ihrem oxidativ-entzündlichen

1. Einleitung 20 Verhalten könnten als Erklärungsansatz für die epidemiologisch gefundenen

unterschiedlichen gesundheitlichen Auswirkungen der Stäube dienen.

2. Zielsetzung und Fragestellung 21

2. Zielsetzung und Fragestellung

Wie in der Einleitung dargestellt, ist in den letzten Jahren die Auswirkung der Feinstäube an der pulmonalen Morbidität auf breiter Basis diskutiert worden. Es findet sich eine große Anzahl von Arbeiten, die sich diesem Themenkomplex auf tierexperimenteller oder in-vitro versuchlicher Ebene nähern. Es konnte schon gezeigt werden, dass nicht die Staubmasse für die inflammatorische Antwort verantwortlich ist. Vielmehr scheint es auf gewisse Einzelkomponenten anzukommen. Im Besonderen sind hier die Metalle zu nennen.

Leider liegen zurzeit nur wenige Untersuchungen vor, die Ergebnisse auf allen drei Ebenen:

in-vitro, Tierversuch und klinische Untersuchungen am Menschen vorgelegt haben. So existiert nur eine weitere Studie aus den USA. In der angesprochenen Arbeit sind metallhaltige Stäube aus dem Utha-Valley verwendet worden, einem Gebiet das sich durch hohe Staubemissionen durch ein ortsansässiges Stahlwerk auszeichnete. Staubproben in Verbindung mit epidemiologischen Daten der Bevölkerung bildeten die Grundlage dieser Studie. Für Europa findet sich zurzeit keine ähnliche Studie.

Eine Grundlage hierfür bieten aber die in der Einleitung besprochen Untersuchungen zu den gesundheitlichen Auswirkungen der Stäube im Raum Hettstedt und Zerbst.

In der vorliegenden Arbeit ist es die Aufgabe, die im Tiermodel gemachten Beobachtungen an gesunden Probanden nachzuvollziehen. Sie ist Teil eines Gesamtprojektes, welches die Auswirkungen von Feinstäuben auf das Immunsystem näher beleuchten soll.

Ziele der Studie

1.) Lassen sich 24 Stunden nach Instillation von 100 µg Feinstäuben in Lungensegmente gesunder Probanden Entzündungsvorgänge detektieren und sind die Ergebnisse mit denen im Tiermodell vergleichbar?

2.) Bestehen Unterschiede in der proinflammatorischen Potenz der verschiedenen Stäube aus Hettstedt und Zerbst? Wenn dieses zutrifft, können dann bestimmte Fraktionen in den Stäuben gezeigt werden, die besonderen Anteil an der Entzündungsreaktion haben?

Es soll versucht werden, die oben genannten Fragen zu beantworten. Dazu sollen bei gesunden Probanden über eine Bronchoskopie jeweils 100 µg Feinpartikel (PM_2,5) aus Hettstedt und Zerbst sowie 10 ml NaCl-Lösung als Kontrolle in drei verschiedene Lungensegmente instilliert werden. Nach 24 Stunden sollen die entsprechenden Lungensegmente während einer zweiten Bronchoskopie lavagiert werden. Dies dient dazu,

2. Zielsetzung und Fragestellung 22 das Auftreten einer broncho-pulmonalen Entzündung durch die Stäube zu untersuchen und

mögliche pathophysiologische Schädigungsmechanismen zu detektieren. Ein wichtiger Punkt der Studie ist die Verwendung von Staubmengen, wie sie in Deutschland unter natürlichen Bedingungen in umweltbelasteten Gebieten bei einem Erwachsenen in einem Lungenlappen deponiert werden.

Um eine Beeinträchtigung der Lunge durch die Stäube aufzuzeigen werden verschiedenste Parameter herangezogen, die Hinweise auf eine entzündlich veränderte Lunge geben können.

So wird das Gesamt-Eiweiß in der BAL bestimmt, ebenso das LDH, welches einen guten Marker für eine Zellschädigung darstellt. Gesamt-Eiweiß und LDH sollen ebenfalls anzeigen, ob die Staubauswirkung zu Schrankenstörungen der alveolären Zelloberfläche führen. Auch werden Zelldifferenzierungen durchgeführt um inflamatorische Veränderungen aufzuzeigen.

Um sich ein noch differenzierteres Bild der zellulären Vorgänge zu verschaffen, finden durchflusszytometrische Untersuchungen Verwendung.

Das Hauptaugenmerk dieser Arbeit liegt auf Veränderungen, wie sie durch oxidative Vorgänge hervorgerufen werden. Ein Auftreten dieser Reaktionen ist einerseits durch die Aktivität von Entzündungszellen denkbar, andererseits durch direkte Wirkung der Metall- Ionen aus den Stäuben. Auch hier sollen mögliche Unterschiede der Stäube aufgezeigt und Erklärungsansätze gefunden werden.

Um die Radikalproduktion der Entzündungszelle darzustellen, soll die Bildung von O₂- Radikalen an nativen wie an stimulierten BAL-Zellen gemessen werden. Nitrat- und Nitrit- Messungen finden nach Umsetzung zu NO statt (s.u.). 8-Isoprostan, ein Derivat der Arachnoidonsäure, soll die Auswirkungen von Oxidationen an Fettsäuren veranschaulichen.

Als ein weiterer Parameter zur Detektion der oxidativen Vorgänge soll das GSH (reduziertes Gluthation) in Zusammenarbeit mit dem Institut für umweltmedizinische Forschung (IUF) der Universität Düsseldorf bestimmt werden.

3. Methoden 23

3. Methoden

3.1 Stäube

3.1.1 Gewinnung der Stäube

Die Gewinnung der Stäube erfolgte in Kooperation mit dem GSF-Forschungsinstitut für Umwelt und Gesundheit in Neuherberg. Mitarbeiter dieser Einrichtung führten die Sammlung der Staubproben in den oben beschriebenen Gebieten in Sachsen-Anhalt, Hettstedt und Zerbst durch.

Die Sammelperiode erstreckte sich vom 08.01.2002 bis zum 18.06.2002. Hierbei wurden die Stäube mit einem Graseby Andersen Dichotomous Sampler Series 240 mit Teflonmembran (37 mm Durchmesser, Porengröße 2µm) gesammelt. Zur weiter gehenden Beschreibung der Sammelmethodik siehe (Heinrich and Pitz , 2003).

3.1.2 Aufbereitung der Stäube

Eine Aufbereitung und Analyse der gesammelten Staubproben wurde in Zusammenarbeit des Institutes für Umweltmedizinische Forschung (IUF) Düsseldorf durchgeführt. Die in der Sammelvorrichtung (Graseby Andersen Dichotomous Sampler Series 240) befindlichen Filter wurden durch einen Mitarbeiter des IUF in je zwei gleich große Teile (Part A und B) geteilt.

Part A diente im Weiteren zur Bestimmung der oxidativen Aktivität der Stäube, nachdem diese vom Filter durch ein zehnminütiges Ultraschallbad in pyrogenfreiem Wasser abgelöst wurden. Die Stäube in Part B eines Filters wurden ebenfalls durch Ultraschall abgelöst. Um gleiche Endkonzentrationen an Stäuben im Eluat zu erreichen (200 µg/ml), verwendete man, orientierend an den Netto-Gewichten der Filter, 4 bis 12 ml pyrogenfreies Wasser zum ablösen.

Die Eluate wurden auf ihren Endotoxingehalt ebenfalls im IUF überprüft. Hierzu fand die quantitative Kinetik nach der Limulus Amebocyte Lysate Methode Verwendung (Kinitic- QCL, Bio Whittaker). Eine ausführliche Beschreibung dieser Methodik findet sich bei Heinrich et al.(Heinrich and Pitz , 2003). Es wurden Staubproben ausgewählt, die einen sehr geringen Endotoxingehalt aufwiesen, nur diese zog man zur weiteren Versuchsdurchführung heran. Ein derartiges Vorgehen sollte verhindern, dass die Ergebnisse der späteren Staubinstillationen von einem LPS-Effekt beeinflusst bzw. überlagert würden. Bei den Staubfraktionen, die diese Bedingungen erfüllten, handelte es sich um die Sammelwochen 1, 6 und 8-11 (siehe auch Diagramm 1).

3. Methoden 24 Endotoxingehalt der Filtereluate

Diagramm 1: Endotoxingehalt der Filtereluate in EU/mg PM2.5 in den verschiedenen Sammelwochen aus den Gebieten Hettstedt und Zerbst. Mit einem Punkt sind die Ergebnisse der LPS-Analyse für Hettstedt aufgetragen und mit einem Dreieck die Daten für Zerbst. Markiert sind die ausgewählten Sammelwochen für die Instillationsversuche.

( : Hettstedt; ∆ : Zerbst )

Da in dieser Arbeit Fragestellungen in Hinblick auf Auswirkungen von oxidativen Vorgängen auf das Immunsystem in der Lunge beantwortet werden sollten, wurden die Staubproben der einzelnen Sammelwochen einer Analyse des oxidativen Potentials unterzogen. Zur Analyse diente eine erst kürzlich durch das IUF vorgestellte, sehr sensible Methodik. Hierbei wird das oxidative Potential der Stäube über ihre jeweilige Hydroxyl-Radikalproduktion -gemessen durch die elektronische paramagnetische Resonanz (EPR)- bestimmt. Genauere Beschreibungen zur Methode finden sich bei Tingming Shi (Shi et al., 2003a). Die Untersuchungen wurden im IUF Düsseldorf durchgeführt und die Daten dann an das Fraunhofer-Institut übermittelt.

Aus folgenden Gründen war die Messung des oxidativen Potentials wichtig. Einerseits konnte so ein Unterschied der beiden Stäube aus Hettstedt und Zerbst dokumentiert, andererseits auch die Grundlage dafür gelegt werden, dass Differenzen in den Ergebnissen der Instillationsversuche auf Unterschiede im oxidativen Potential zurückzuführen sind.

Die Daten aus der Analyse des oxidativen Potentials sind in der untenstehenden Graphik aufgeführt.

3. Methoden 25

Oxidatives Potential der Staubproben

Diagramm 2: Dargestellt sind die Ergebnisse aus der Analyse des oxidativen Potentials der Stäube bezogen auf die Sammelwochen ( : Hettstedt; ∆: Zerbst). Zur Analyse wurde das elektronische paramagnetische Resonanz- Signal (EPR-Signal) herangezogen. Markiert sind die ausgewählten Sammelwochen für die Instillationsversuche. Beschreibung der Methode siehe oben.

Die Stäube der betreffenden Sammelwochen wurden einer Metallanalyse mittels induktiver plasmagekoppelter Massenspektrometrie (ICP-MS,ELEMENT 2, Finnigan MAT, Bremen, Germany) unterzogen. Die Ergebnisse der im RIVM (Rijksinstituut voor Volksgezondheid, Bilthoven, Niederlande) durchgeführten Untersuchungen sind in der unten stehenden Tabelle zusammengefasst.

3. Methoden 26

Metallanalysewerte der gepoolten Staubproben:

Metall

Hettstedt (µg/l)

Zerbst (µg/l)

Ratio Hettstedt/Zerbst

Cadmium (Cd) 0,4 ± 0,2 0,2 ± 0,2 1,8

Blei (Pb) 7,8 ± 1,0 7,0 ± 1,9 1,1

Vanadium (V) 9,0 ± 3,0 7,4 ± 2,6 1,2

Crohm (Cr) 3,4 ± 1,6 2,2 ± 0,2 1,6

Eisen (Fe) 93,9 ± 36,4 83,1 ± 42,8 1,3 Nickel (Ni) 17,2 ± 6,7 7,2 ± 3,6 2,4 Kupfer (Cu) 123,6 ± 53,4 35,6 ± 10,3 3,5 Zink (Zn) 691,7 ± 601,2 148,3 ± 36,6 4,7

Tabelle 1:Metallkonzentration in µg/l in den gesammelten PM2.5-Suspension von Hettstedt und Zerbst gemessen mittels ICP-MS

Im Anschluß an die Metallanalyse wurden die Stäube der betreffenden Sammelwochen gepoolt. Von jeder gepoolten Fraktion, also jeweils von Hettstedt und Zerbst, wurden 15 Proben mit einem Volumen von je 2 ml und einem Staubgehalt von 50 µg/ml aliquotiert.

Diese Proben wurden bis zum Tag der Bronchoskopie bei -80°C eingefroren und vor der Instillation mit 8 ml steriler 0,9% NaCl-Lösung auf ein Gesamtvolumen von 10 ml verdünnt, so dass sich eine PM_2,5 -Endkonzentration von 100 µg/10 ml NaCl ergab.

3. Methoden 27 3.2 Probanden

3.2.1 Ein- und Ausschlusskriterien

Nachstehend sind die Ein- und Ausschlusskriterien aufgeführt, welche die Probanden erfüllen mussten bzw. die eine Teilnahme an der Studie verhinderten.

3.2.1.1 Ausschlusskriterien:

• Allergien (anamnestisch, positiver Pricktest, erhöhtes Serum-IgE ≥ 100 IU/ml)

• Klinisch relevante, abnorme Laborparameter

• Pathologische Lungenfunktion (einschließlich positivem Metacholintest)

• Erkrankungen, welche die Untersuchungen beeinflussen könnten oder bei denen eine Bronchoskopie nicht durchgeführt werden sollte

• Atemwegsinfekte in den letzten 4 Wochen vor der Bronchoskopie

• Teilnahme an einer anderen klinischen Studie innerhalb der letzten 4 Wochen vor der Bronchoskopie

• Alkohol- oder Drogenmissbrauch innerhalb der letzten 5 Jahre

3.2.1.2 Einschlusskriterien:

• Alter 18-45 Jahre

• Bei weiblichen Probanden Nutzung von Antikonzeptiva und ein negativer Schwangerschaftstest im Urin (jeweils gemessen vor den Bronchoskopien)

• Nichtraucher (länger als 5 Jahre, weniger als 5 Packungsjahren)

3.2.2 Studienpopulation

Einschluss in die Studie, nach Erfüllung der oben beschrieben Voruntersuchungen, fanden 12 Probanden (n = 12). 8 weiblich, 4 männlich. Mittleres Alter 27 ± 2,5 Jahre.

3.2.3 Probandenrekrutierung

Die Rekrutierung der Probanden erfolgte über die Patienten- und Probandendatenbank des Fraunhofer-Instituts, sowie über Aushänge und Zeitungsanzeigen.

Nach einem telephonischen Erstkontakt, bei dem mit Hilfe eines standardisierten Fragenbogens der Gesundheitszustand erfasst wurde, konnten geeignete Probanden zur Vorstellung in das Fraunhofer-Institut eingeladen werden.

3. Methoden 28 3.2.4 Voruntersuchungen

3.2.4.1 Aufklärung über die Studie

Die Erläuterung der Studie und die Aufklärung über die mit der Studie verbundenen Risiken übernahm der Studienarzt. Alle in dieser Studie vorgenommenen Untersuchungen waren von der Ethik-Kommission der Medizinischen Hochschule Hannover genehmigt worden.

Sein Einverständnis dokumentierte der Proband mit seiner Unterschrift auf dem Aufklärungsbogen.

3.2.4.2 Anamnese und körperliche Untersuchung

Die Erhebung der Anamnese und die körperliche Untersuchung dienten zum Ausschluss von Erkrankungen oder Risiken, die mit der Studie nicht vereinbar waren.

So wurde unter anderem nach Heuschnupfen und Asthma in der Vorgeschichte gefragt, ebenso nach Operationen, Drogenmissbrauch oder Allergien. Außerdem waren Vorerkrankungen und Medikamentengebrauch relevant.

Bei der körperlichen Untersuchung wurden unter anderem Größe, Gewicht, Blutdruck, Herzfrequenz und ein Auskultationsbefund erhoben.

3.2.4.3 Bodyplethysmographie

Zum Ausschluss von restriktiven oder obstruktiven Atemwegserkrankungen wurde bei allen Probanden eine Bodyplethysmographie (Bodyplethysmograph: Firma Jaeger; Höchberg;

Germany) durchgeführt. Es wurden unter anderem durch Messung die Einsekundenkapazität (FEV₁), das thorakale Gasvolumen (TGV), die funktionale Residualkapazität (FRC), die totale Lungenkapazität (TLC) und das Residualvolumen (RV) bestimmt.

Eine vollständige Untersuchung ohne Hinweise auf pathologische Veränderung der Lungenparameter war ein Einschlusskriterium für die Studie.

3.2.4.4 Pricktest

Hierbei wurden die folgenden Allergene (ALK Scherax GmbH, Hamburg, Germany und Allergopharma KG, Reinbeck, Germany) verwendet: Gräsermischung, Knäuelgras, Roggen, Frühblüher-Mix, Spitzwegerich, Beifuß, D.pteronyssinus, D.fariae, Hundehaare, Katzenhaare, Feder-Mix, Alternaria alternata und Cladosporium Herbarum. Es dienten als Negativ- Kontrolle 0,9 % NaCl-Lösung und als Positiv-Kontrolle Histamin 1%.