(Geschäftsführender Vorstand: Prof. Dr. H. Hedrich) der Medizinischen Hochschule Hannover
und
Klinik für Anästhesiologie
der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf
Beteiligung der glyzinergen Neurotransmission an der Lidocain vermittelten spinalen Antinozizeption
bei neuropathischen Schmerzen der Ratte
INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung
des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin
(Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von Katrin Kollosche
aus München
Hannover 2006
Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. H. Hedrich
Institut für Versuchstierkunde der MHH Carl- Neuberg- Strasse 1
30625 Hannover
Dr. med. U. Muth-Selbach
Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf Klinik für Anästhesiologie
Moorenstrasse 5 40225 Düsseldorf
1. Gutachter: Prof. Dr. H. Hedrich
2. Gutachter: Priv.-Doz. Dr. rer.nat. M. Gernert
Tag der mündlichen Prüfung: 22. Mai 2006
Gefördert und unterstützt von der Tierversuchsanlage der Heinrich-Heine Universität Düsseldorf.
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung ... 1
2 Grundlagen ... 4
2.1 Neuropathischer Schmerz infolge peripherer Nervenläsion ... 4
2.2 Tiermodell für den neuropathischen Schmerz... 8
3 Methoden und Materialien ...12
3.1 Installation des intrathekalen Katheters...12
3.2 Induktion einer Neuropathie nach dem Bennett- Modell...14
3.3 Installation des zentralen Venenzuganges...15
3.4 Verhaltensbeobachtung und thermale Testung...16
3.5 Lageüberprüfung des intrathekalen Katheters post mortem...21
3.6 Auswertung und statistische Methoden...22
3.7 Verwendete Substanzen und deren Abkürzungen ...23
3.7.1 Lidocain...23
3.7.2 D-Serin...24
3.7.3 Strychnin ...25
3.7.4 CGP 78608 ...25
3.7.5 Natrium-Chlorid Lösung ...26
4 Ergebnisse ...27
4.1 Thermale Hyperalgesie nach Neuropathieinduktion...28
4.2 Lidocain-Dosisfindung und Blutkonzentration von 1% Lidocain in vivo bei der Ratte ...38
4.3 Einfluß der applizierten Pharmaka auf die induzierte Hyperalgesie ...40
5 Diskussion ...41
6 Zusammenfassung...51
7 Summary...53
8 Abbildungen und Tabellen ...55
9 Literaturverzeichnis ...70
10 Danksagung...79
1 Einleitung
„An unpleasant sensory and emotional experience associated with actual or potential damage, or described in terms of such damage.“
(Definition des Schmerzes; aus: Task Force on Taxonomy, International Association for the Study of Pain, 1979).
Heute ist die Behandlung chronischer, neuropathischer Schmerzen im klinischen und praktischen Alltag immer noch ein Problem, da sie trotz vieler Fortschritte in der Forschung häufig therapieresistent sind. Der neuropathische Schmerz hat im Klinikalltag einen sehr hohen Stellenwert, etwa 40% aller Patienten in Schmerzambulanzen und Schmerzkliniken leiden unter ihm.
Schmerz ist ein Bewußtseinsvorgang (HANDWERKER, 1999), der in vielen Teilen des zentralen Nervensystems verarbeitet wird.
Die komplexen Zusammenhänge des neuropathischen Schmerzes sind bis heute noch nicht genau geklärt (YAMAMOTO et. al.; 1991, SUGIMOTO et. al., 2000;
PARSONS, 2001, MUTH-SELBACH et al., 2004).
Die herkömlichen Therapien mit Opioiden (z. B. Fentanyl, Tramadol oder Morphin), nicht-steroidalen Antiphlogistika (NSAID`s, z.B. Acetylsalicylsäure oder Diclofenac), Antiepileptika oder anderen antiphlogistischen Therapeutika haben wegen der zum Teil sehr komplexen Nebenwirkungen (Gewöhnung, Suchtpotential, Schläfrigkeit oder systemische Nebenwirkungen als Beispiel, um nur einige zu erwähnen) ihre Grenzen im Einsatz am Patienten. Opioide sollen wegen ihrer vielfälltigen Nebenwirkungen nur im reduzierten Maße angewendet und durch verträglichere Medikamente ersetzt werden.
Daraus ergibt sich die Forderung nach neuen Therapiemöglichkeiten. Der innovative Gedanke der momentanen Schmerztherapieforschung ist eine selektive Blockade
von Teilen der schmerzweiterleitenden Elemente, zum Beispiel der N-methyl-D- aspatat- (NMDA-) und Strychnin-sensitiven, inhibitorische Glycinrezeptoren.
Die selektive Antagonisierung entfaltet ihre antihyperalgetische Wirkung ohne die vielfältigen systemischen Nebenwirkungen (zum Beispiel Schwindel, Husten, Tremor) bei den Patienten (PARSONS et al., 1997). Die Manipulation des Glycintransportes in Zusammenhang mit der extrazellulären Konzentration von Neurotransmittern und die genaue Funktionsweise der Rezeptoren sind ein guter Ansatzpunkt, um eine effektive und nebenwirkungsreduzierte Schmerztherapie durchzuführen (WHITEHEAD et al., 2004). In der Literatur wird Glycin eine inhibitorische (über strychnin-sensitive Glyzinrezeptoren) und eine exzitatorische (als Co-Agonist am NMDA-Rezeptor) Wirkungsweise im zentralen Nervensystem zugesprochen. Doch die genaue Wirkungsweise und die Frequenz der Aktivierung der einzelnen Rezeptortypen ist noch ungeklärt.
Die vorliegende Arbeit soll in vivo weitere Einblicke in die Funktionsweise der glycinergen Transmission am NMDA-Rezeptor erbringen.
BIELLA et al. haben 1993 in ihren Arbeiten an isolierten WDR-Neuronen („wide dynamic range neurons“) durch Iontophorese versucht darzustellen, wie bestimmte Agonisten und Antagonisten am NMDA-Rezeptor einzeln und in Kombination miteinander an der Signalübertragung bei chronischen Schmerzen beteiligt sind.
Aufbauend auf dieser Dissertation soll dieser Grundgedanke auf das lebende, in Ganzheit bestehende Tier übertragen werden.
Mit gezielter Antagonisierung und Agonisierung der Rezeptoren soll versucht werden, die Funktionsweise bei spinaler Schmerztransmission besser zu verstehen, um so Rückschlüsse für eine gezielte Schmerztherapie zu erhalten.
Wegen der Komplexität des NMDA-Rezeptors und dessen vielfältigen Aufgaben, würde eine Blockierung des ganzen Rezeptors viele Nebenwirkungen hervorrufen, wie zum Beispiel psychomimetische Effekte, Beeinträchtigung des Erinnerungsvermögens, Ataxie und Beeinträchtigung der motorischen Koordination (PARSONS, 2001).
Eine teilweise Hemmung des NMDA-Rezeptors durch pharmakologische Substanzen würde der Transmission des Schmerzes entgegenwirken und die oben genannten Nebenwirkungen reduzieren.
Ein weiteres Ziel der Arbeit ist es, zu untersuchen, ob die analgetische Wirkung eines niedrig dosierten, systemisch gegebenen Lidocains zu bestimmten Teilen über glycinerge Mechanismen vermittelt wird. Lidocain ist in der Klinik und in der Praxis ein bevorzugtes Medikament bei der neuropathischen Schmerztherapie (MARCHETTINI et al., 1992; SOTGIU et al., 1992), da es die verschiedenen Phasen des Schmerzes blockieren und dem Patienten so Erleichterung verschaffen kann.
Als Grundlage für diese Dissertation diente das Schmerzmodell, welches BENNETT und XIE 1987 etabliert haben. Es ist eine gute Möglichkeit am wachen, nicht fixierten und manipulierten Gesamtorganismus die Frage der Schmerzmodulation zu klären
2 Grundlagen
2.1 Neuropathischer Schmerz infolge peripherer Nervenläsion
Die Behandlung chronischer, neuropathischer Schmerzen ist im klinischen und praktischen Alltag immer noch ein Problem, da sie trotz vieler Fortschritte in der Forschung häufig therapieresistent sind.
Neuropathischer Schmerz:
Im Gegensatz zu einem Nozizeptorschmerz, bei dem nach einem Gewebstrauma periphere und zentrale neuronale Strukturen der Nozizeption und des Schmerzes intakt sind, kommt es bei neuropathischen Schmerzen zu einer Schädigung der reizaufnehmenden und –verarbeitenden Strukturen. Diese Schädigungen können sowohl reversibel sein als auch einen Chronifizierungsprozess durchlaufen, d. h. es kommt zu degenerativen Prozessen in den geschädigten Strukturen. Diesen Prozess nennt man zentrale Sensibilisierung (JONES et al., 2001).
Die Sensibilisierung ist ein Phänomen der Nozizeption. Anders als bei taktilen oder thermischen Reizen, die nach mehrmaliger Stimulation eine Gewöhnung oder Habituation nach sich ziehen, spricht man bei lang anhaltender Aktivierung von Nozizeptoren, z.B. bei Entzündung oder schweren Gewebstraumata, von einer synaptischen Sensibilisierung in Form des „wind-up-Phänomens“.
In diesem Zusammenhang sind WDR (wide dynamic range) Neurone von Bedeutung, die im zentralen Bereich des Rückenmarkes zu finden sind. Sie sind nicht spezifisch für eine Reizart sensibel, sondern haben einen weiten dynamischen Antwortbereich, in dem alle Arten von Reizen (Berührungen, Druck, Hitze) durch spezifische Entladungsfrequenzen codiert werden (BIELLA et al., 1992).
Bei der synaptischen Sensibilisierung werden repetitive Reize über C-Fasern in zentrale Bereiche geleitet und die überdimensionale postsynaptische Antwort über NMDA (N-methyl-D-aspatat)-Rezeptoren vermittelt. In diesem Stadium der Schmerzentwicklung kommt es durch erhöhtes, intrazelluläres Kalzium (einem
second messenger) zu einer veränderten Genexpression. Rezeptoren, Transmitter und Kanalproteine werden verändert exprimiert. Werden solche Veränderungen beobachtet, spricht man von einer zentralen Sensibilisierung (MANNION und WOOLF, 1999; EIDE et al., 2000).
Die Entstehung und Verarbeitung eines Schmerzes ist ein komplexer und zusammenhängender Ablauf. Das Schmerzsignal wird nach Einwirkung der Noxe zunächst in der Peripherie, dann im zentralen Nervensystem kodiert.
Der Reiz wird von freien sensorischen Nervenendigungen aufgenommen und in Form von Axonmembranpotentialen (nach Transduktion) weitergeleitet. Verschieden dicke (proportional der Leitungsgeschwindigkeit), primäre, afferente Nervenfasern (v.a. C-und A-Delta-Fasern) kodieren das Signal und übertragen es über die Hinterwurzel zum Tractus spinosus und zum Thalamus. Diese Signale werden im parietalen Cortex, im limbischen System, in bestimmten Hirnstammstrukturen und im Cerebellum weiter verarbeitet.
Durch die Änderung der Membranpotentiale in den betroffenen Gebieten beginnt eine Sekretion von kaskadenartig freigesetzten Neurotransmittern. Es sind Neuropeptide wie Calcitonin-Gen-related-peptide (CGRP), Substanz P (SP) oder exzitatorisch wirksame Aminosäuren, wie zum Beispiel Glutamat oder Aspartat, welche über AMPA- (Amino-OH-Methyl-Isoxazol-Propionsäure) und NMDA- (N- Methyl-D-Aspartat) Rezeptoren, beide aus der Klasse der Glutamat-Rezeptoren, die weiteren Reaktionen in den betroffenen Geweben kodieren (Handwerker et al., 1998;
STEGMANN et al., 2001).
Die Glycinrezeptoren:
NMDA-Rezeptoren spielen in der Transmission von Schmerzimpulsen eine wichtige Rolle (IKEDA et al., 2003), auch bei der zentralen Sensibilisierung und Entwicklung von chronischen Schmerzen steht dieser Rezeptor im Mittelpunkt der Schmerzverarbeitung (DUOBELL et al., 1999). In der Literatur wird er auch „non- strychnine-sensitive glycine receptor“ genannt (BREITINGER und BECKER; 2002).
Der NMDA-Rezeptor besteht aus mehreren Untereinheiten. Zunächst die Transmitterbindungsstelle, die kompetitiv Liganden bindet. Desweiteren eine
strychnin-unsensible Glycinbindungsstelle, die in der Literatur „Glycine-B site“
genannt wird. Die Polyamin- (NR2) und die Phencylidinbindungsstelle des Rezeptors liegen innerhalb des Kationenkanales und binden selektiv ihre kompatiblen Liganden (PARSONS, 2001).
Die Transmitterseite und „Glycine-B site“ benötigt obligatorisch extrazelluläres Glycin oder D-Serin als Co-Agonist, welches an der Glycin-Bindungsstelle (der NR1) des Rezeptors andockt und so den Rezeptor voll aktiviert.
Ein weiterer wichtiger Rezeptor in der Schmerzweiterleitung ist der strychnin- sensitive, inhibitorische Glycinrezeptor, der in Rückenmark und Hirnstamm lokalisiert ist (BREITINGER und BECKER, 2002). Er gehört zur Gruppe der Liganden- gesteuerten Ionenkanäle, die durch das Andocken von vier Liganden aktiviert werden. Es folgt so eine Öffnung der spannungsgesteuerten Kanäle, Chloridionen strömen in das Innere der Zelle und es kommt zur Hyperpolarisation, eine inhibitorische Wirkung im Schmerzverhalten ist festzustellen. Diese Reaktion kann durch Strychnin antagonisiert werden (WERMAN et al., 1967). Glycin wirkt als Ligand an diesem Rezeptor und ist einer der wichtigsten inhibitorischen Neurotransmitter (ARAGON und LOPEZ-CORCUERA, 2003).
Beide Rezeptortypen sind von der An- und Abwesenheit von Liganden und Kofaktoren, sowie von stabilen intrazellulären Verhältnissen abhängig.
Lidocain:
Lidocain ist ein in der humanen neuropathischen Schmerztherapie schon lang bewährtes und oft verwendetes Medikament (MAO und CHEN, 2000). Es reduziert in niedriger, nicht nervenblockierender Konzentration Hyperalgesie nach Gewebsverletzungen und Entzündungen, sowohl beim Tier (SOTGIU et al., 1992;
ABRAM und YAKSH, 1994) als auch beim Menschen (MARCHETTINI et al., 1992;
HOLTHUSEN et al., 2000).
Bei Lidocain wird eine zentrale wie periphere Wirkung vermutet. In der Peripherie wirkt Lidocain an den Natriumkanälen, blockiert diese und verhindert so reversibel die Weiterleitung der nervalen Aktionspotentiale (LÖSCHER et al., 1997;
SUGIMOTO et al., 2003).
In vorangegangenen Tierversuchen wurde die zentralnervöse, antinozizeptive Wirkung von niedrig dosiertem, systemisch appliziertem Lidocain bestätigt. Die genaue Wirkung ist bis heute nicht geklärt (FAN et al., 1995; HARA et al., 1995, SUGIMOTO et al., 2003). Ein möglicher Mechanismus könnte die Beeinflussung der glutamatergen Neurotransmission über NMDA-Rezeptoren sein. So hemmt Lidocain beispielsweise die NMDA- und Neurokinin-Rezeptor vermittelte postsynaptische Depolarisation (NAGY und WOLF, 1996), sowie die durch Glutamat evozierte Aktivität (BIELLA und SOTGIU; 1993) in den WDR-Neuronen.
BIELLA et al. haben in ihren Arbeiten an anästhesierten und paralysierten Ratten durch Iontophorese Glutamat, NMDA (es greift an exzitatorischen NMDA-Rezeptoren an) und Quisqualinsäure (QUIS, eine exzitatorische Substanz, die an NMDA- und nicht-NMDA-Rezeptoren angreift) an das Rückenmark der Ratte appliziert und die Wirkung der einzelenen Stoffe dokumentiert. Bei zusätzlicher Gabe von Lidocain hemmte das Lokalanästhetikum die Glutamatausschüttung (dies wurde durch Strychnin wieder antagonisiert) und es reduzierte die Exzitation von Quisqualin (auch diese Reaktion konnte durch Strychnin antagonisiert werden).
Auch SUGIMOTO et al. (2003) hat durch Genmutationen an Oozyten von Fröschen (Xenopus spp.) gezeigt, dass NMDA-Rezeptoren an der Translation von Nozizeption beteiligt sind, und dass Lidocain über diese glycinergen Rezeptoren seine reversible, analgetische Wirkung hat.
Weitere Studien lassen die Vermutung zu, dass Glycin eine Schlüsselrolle in der Entwicklung von chronischen, neuropathischen Schmerzen spielt (AHMADI et al., 2003; MUTH-SELBACH et al., 2004)
In der Phase des akuten wie chronischen Schmerzes kommt es zu dem sogenannten „spillover“. Bei diesem Phänomen führt eine hohe präsynaptische Aktivität zu einer erhöhten Freisetzung von Glycin aus inhibitorischen Neuronen (AHMADI et al., 2003). Diese erhöhte Glycinmenge aktiviert nicht nur die NMDA- Rezeptoren am synaptischen Spalt, sondern ebenfalls NMDA-Rezeptoren in entfernteren Geweben. Der „spillover“ ist somit ein Mechanismus der Signalverstärkung, der vermehrten Nozizeption und der spinalen Sensibilisierung.
Glycin ist so pronozizeptiv.
Um eine überschießende, exzitatorische Reaktion der afferenten und efferenten Axone zu vermeiden, gibt es Kontrollsubstanzen, welche die zentrale Schmerzschwelle regulieren. Substanzen wie Serotonin, Noradrenalin, Gamma- aminobuttersäure (GABA) und Glycin wirken inhibitorisch auf die exzitatorische Neurotransmitterfreisetzung, prä- wie postsynaptisch. GABAerge Interneurone üben eine tonische Inhibition im Hinterhorn aus. So existiert physiologisch ein negatives Feedback, welches die zentrale Schmerzschwelle reguliert.
Dementsprechend wirken Glycin oder GABA antihyperalgetisch, (ZIEGLGÄNSBERGER und HERZ, 1971) und GABA- oder Glycin-Antagonisten sensibilisierend (YAKSH, 1989; SIVILOTTI und WOOLF, 1994). Ein möglicher Ansatz der Schmerztherapie, sowie ebenfalls der Therapie von Schizophrenie und Epilepsie wäre die selektive Blockierung der Glycin-Bindungsstelle oder die Reduzierung der Glycinmenge im synaptischen Spalt (ARAGON und LOPEZ- CORCUERA, 2003). So könnte auch der „spillover“ (AHMADI et al., 2003) unterbrochen werden.
Die vorliegende Arbeit soll in vivo weitere Einblicke in die Funktionsweise der glycinergen Transmission am NMDA-Rezeptor erbringen.
Es soll untersucht werden, ob die Wirkung eines niedrig dosierten, systemisch gegebenen Lidocains wenigstens zu bestimmten Teilen über glycinerge Mechanismen vermittelt wird.
2.2 Tiermodell für den neuropathischen Schmerz
Um die Entstehung dieses Schmerzsyndromes besser nachvollziehen zu können, wurde in Tierexperimenten versucht, die zugrunde liegenden Mechanismen auf Tiere zu übertragen. Dabei haben sich drei Methoden zur Erzeugung von Nervenläsionen durchgesetzt, um bei Ratten neuropathisches Schmerzverhalten auszulösen.
Bei den im Folgenden erläuterten Schmerzmodellen (STEGMANN et al., 2001) werden die physiologisch unterschiedlichen Leitungsgeschwindigkeiten der
Nervenfasern berücksichtigt, die durch die unterschiedlichen Durchmesser bedingt sind.
Die in dieser Arbeit im Vordergrund stehende Transmission von thermischen und schmerzhaften Reizen wird vor allem über langsam leitende marklose C-Fasern (Leitungsgeschwindigkeit 0,5-2 m/s) und über schwach myelinisierte A-Delta- Afferenzen (Leitungsgeschwindigkeit 10-30 m/s) geleitet.
Schnelleitende A-Beta-Afferenzen haben eine Leitungsgeschwindigkeit von 25-70 m/s und kodieren über niederschwellige Mechanorezeptoren vor allem Berührungsreize. Die schnell leitenden Fasern spielen eine wichtige Rolle bei der synaptischen Reorganisation im zentralen Nervensystem infolge Degeneration primär afferenter C-Nozizeptoren.
Zunächst sei die SNL (Spinal Nerve Ligation, KIM und CHUNG, 1992) genannt, ein Verfahren, bei dem die spinalen Nervenwurzeln vom fünften und sechsten Lendenwirbel durchschnitten werden und der proximale Stumpf der Wurzel ligiert wird. Als Folge degenerieren alle beteiligten Fasertypen, Allodynie und Hyperalgesie entwickeln sich in wenigen Stunden.
Das PNL (Partial Nerve Ligation, SELTZER und DUBNER, 1990) ist ein weiteres Schmerzmodell, bei dem der Nervus ischiadicus durchstochen und ligiert wird. Mit der Ligatur wird der Durchmesser des Nervs auf die Hälfte reduziert. Auch hier entwickeln sich Allodynie und Hyperalgesie in wenigen Stunden.
Das CCI-Modell (Chronic Constriction Injury, BENNETT und XIE, 1988) ist im Falle dieser Arbeit die Methode der Wahl, um an einem Tiermodell die Auswirkungen von Medikamenten bei neuropathischen Schmerzen näher zu beleuchten.
Bei dieser Methode bleiben die für die Arbeit interessanten langsamen C- Nervenfasern intakt, sie sind für die Beurteilung der Nozizeption nach Medikation der einzelnen Tiere essentiell. Durch vier lockere Ligaturen um den Nervus ischiadicus kommt es durch eine langsame Ödem-bedingte Einschnürung zur völligen
Degeneration der A-Beta- und A-Delta-Fasern. Es folgen morphologische Veränderungen in dem betroffenen Gebiet, der endoneurale Druck steigt an.
Der Durchmesser des Nervs wird durch die einzelnen Knoten zwar nur minimal verkleinert, doch durch diese Verkleinerung des Durchmessers kann es zu ektopischer Impulsweiterleitung kommen, die vom veränderten Nervengewebe selber ausgeht. Die Spontanaktivität nimmt zu.
Abbildung 1: Schematische Darstellung der CCI-Operation.
Diese beschriebenen Vorgänge bleiben nicht lokal auf den verletzten Nerv beschränkt, es kommt zu einer Ausbreitung über die Afferenzen zum dorsalen Wurzelganglion, sowie zum ipsilateralen Dorsalhorn der ligierten Seite, wenn weitere nozizeptive Stimuli folgen („wind up“; ABRAM et al., 1994; SUGIMOTO et al., 2003).
Die genaue Art und Weise der Ausbreitung ist noch nicht geklärt.
Bei Patienten, die unter chronisch neuropathischen Schmerzen leiden, kann man folgende Schmerzzustände beobachten:
Berührt man zum Beispiel Patienten an betroffenen Gliedmassen, kann diese sonst nicht schmerzhafte Berührung als sehr schmerzhaft empfunden werden. Diesen Zustand nennt man Allodynie. Sie entsteht in Folge einer Chronifizierung, es kommt nach dem Untergang nozizeptiver Neurone zur Umorganisation synaptischer Strukturen im Hinterhorn. Noch intakte Afferenzen bilden so ein neues Netzwerk mit
L5 L4
L6
N. ischiadicus Ligaturen
•vier lockere Ligaturen um N. ischiadicus
• Ausbildung eines Ödems
• Degeneration von v.a. myelinisierten Fasern
• stabile thermale Hyperalgesie für 21 Tage
zentralen nozizeptiven Neuronen, bei dem es zu Fehlverschaltungen kommt (STEGMANN et al., 2001). Patienten können ebenso eine gesteigerte Empfindlichkeit auf primär schmerzhafte Stimuli auf einem oder mehreren Hautgebieten zeigen, dies nennt man Hyperalgesie. Man kann zwischen primärer und sekundärer Hyperalgesie unterscheiden. Bei der primären Hyperalgesie ist das Schmerzempfinden am Reiz- oder Verletzungsort lokalisiert, es beruht auf periphere Mechanismen (WEIS et al., 1995). Die Reizschwelle ist für die Nozizeption reduziert.
Bei der sekundären Hyperalgesie wird die gesteigerte Schmerzempfindlichkeit gegenüber mechanischen Reizen in der Umgebung des Reiz- oder Verletzungsortes empfunden (TREEDE, 1999).
Bleibt die zentrale Sensibilisierung länger bestehen, d. h. wird der Schmerz beim Patienten chronisch, werden die vermittelnden C-Fasern verlängert aktiviert. Es kommt zu einer Sensibilisierung der zentralen Synapsen. Es resultiert eine Zunahme der Spontanaktivität, Neurone geben eine veränderte Reizantwort und es vergrössern sich die rezeptiven Felder der versorgenden Neurone. Die vom Patienten empfundene Schwelle gegenüber schmerzhaften Stimuli wird herabgesetzt und es entwickelt sich eine Hyperalgesie.
Allodynie und Hyperalgesie in Form einer Schwellenerniedrigung der thermischen Reizschwelle konnten auch bei den Versuchstieren beobachtet werden, nachdem bei ihnen eines der Schmerzmodelle etabliert worden war (PARSONS et al., 1998;
SUGUMOTO et al., 2000; WHITEHEAD et al., 2004).
Dieses Verhalten ist Grundlage der standarisierten Schmerzmessung der vorliegenden Arbeit.
3 Methoden und Materialien
3.1 Installation des intrathekalen Katheters
Männliche Wistarraten (Tac:WIST; Wistar Hannover, GALAS) mit einem Lebendgewicht von 360-380 g wurden mit 60 mg/kg Pentobarbital (Narcoren®) intraperitoneal narkotisiert. Diese Tiere entsprachen dem SPF-Status (spezifisch pathogen frei) und wurden gemäß FELASA auf endo- und ektoparasitären Befall untersucht, waren Virusantikörpertiterfrei und waren frei von bestimmten Bakterien.
In dieser Arbeit wurde Pentobarbital verwendet, da diese Substanz keinen messbaren Einfluss auf die Entwicklung der Neuropathie hat (MUTH-SELBACH et al., 2004).
Ketamin, welches wie Pentobarbital zu der Gruppe der Barbiturat gehört, ist ein NMDA-Rezeptor-Antagonist. Es hat aber, wie Opioide zum Beispiel, durch seine Wirkungsweise Einfluss auf die Entwicklung der induzierten Neuropathie und verändert so die zu messende Schmerzschwelle. Nach Ketaminanwendungen wird häufig Katalepsie dokumentiert, da dieses Injektionsnarkotikum das limbische System zum Beispiel erregt (LÖSCHER et al., 1997).
Die nachfolgende Operation wurde unter Einhaltung steriler Kautelen durchgeführt.
Während der Operation wurde die Körpertemperatur der Tiere durch eine Wärmematte konstant auf 38,5°C Körperinnentemperatur gehalten, um eine Hypothermie zu vermeiden.
In Seitenlage wurde mit Hilfe des Flexorreflexes an den Hinterextremitäten die ausreichende Narkosetiefe getestet.
Zur Fixierung des Tieres in Bauchlage diente ein Stereotakt.
Zunächst wurde der Nackenbereich der Tiere geschoren, rasiert und desinfiziert.
Nach Präparation des Operationsfeldes am Nacken durch einen Hautschnitt und Durchstechen der Membrana atlantooccipitalis war der Duralraum frei einsehbar.
Nun wurde ein 13 cm langer Polyäthylen-Schlauch mit einem Innendurchmesser von 0,28 mm und einem Außendurchmesser von 0,61mm (SX 01, Firma Hartenstein) von
cranial nach caudal langsam bis zur rostralen Lumbalsschwellung im Duralraum vorgeschoben. Vor der Operation wurde am Katheter eine farbliche Markierung auf der Höhe von acht Zentimeter gemacht. Der Katheter wurde soweit vorgeschoben, bis die farbliche Markierung auf Höhe der Membrana atlantaoccipitalis zum Liegen kam.
Abbildung 2: Schematische Darstellung der Lage des intratheklen Katheters.
An dieser Stelle der Operation erfolgte keine Lagekontrolle des Katheters durch zum Beispiel Röntgenaufnahmen, da dies einen zu hohen technischen Aufwand dargestellt hätte. Desweiteren war es dem Operateur nach kurzer Einarbeitungszeit möglich, die it-Katheterisierung sicher und reproduzierbar durchzuführen.
Die weiter unten im Text dargestellte Sektion der verwendeten Tiere diente der Kontrolle, so konnte die Unversehrtheit des Rückenmarkes kontrolliert werden.
Um ein Herausziehen des Katheters durch das Tier selber zu verhindern, wurde dieser mit einem Dentalkleber am Schädel des Tieres befestigt.
Es folgte eine Muskelnaht durch Einzelhefte und fortlaufende Hautnaht mit 3-0 Vicryl®-Faden. Eine thermische Versiegelung mit Hilfe eines Feuerzeuges und eines Nadelhalters verschloss das herausragende Ende des Katheters. Um in den folgenden Versuchen die Medikamente durch den Kathetet zu applizieren, wurde das versiegelte Ende mit einem Scherenschlag geöffnet und nach der Applikation erneut thermisch versiegelt. So wurde das Eindringen von Einstreu und Dreck in den Katheter, und somit in das Rückenmark verhindert.
An diese Operation schloß sich die Nervenläsion nach dem Bennett- Modell (CCI) an.
3.2 Induktion einer Neuropathie nach dem Bennett- Modell
Diese Operationstechnik wird in der Literatur mit CCI (chronic constriction injury) abgekürzt, und wurde 1988 von BENNETT und XIE als chronisches Schmerzmodell etabliert.
Das Tier wurde in Seitenlage gebracht. Als anatomischer Anhaltspunkt diente das Tuber ischiadicum. Durch einen distal davon gelegten craniocaudalen Hautschnitt von zwei Zentimeter Länge wurde die darunter liegende Muskulatur freigelegt. Es folgte eine stumpfe Präparation der Muskelfazien des Musculus biceps femoris, bis der darunter liegende Nervus ischiadicus auf Höhe der Trifurkation sichtbar war.
Nach dieser Mobilisation des Nerven wurden mit Hilfe einer gebogenen Pinzette vier ca. zwei cm lange Stücke eines 3-0 Catgut®- Fadens um den Nervus ischiadicus geschlungen und dieser von proximal nach distal in einem Abstand je ein bis zwei mm vier mal ligiert. Während des Ligierens zeigte ein kurzes Zucken der Pfote an, dass der gewünschte Grad der Nervenkonstriktion erreicht war. Die Muskulatur wurde mit einem Einzelheft adaptiert, die Haut durch eine fortlaufende Naht mit einem 3-0 Vicryl® verschlossen.
Nach der Operation erholten sich die Tiere in Einzelkäfigen (Makrolonkäfige des Typ III R). Als Einstreu wurde Holzgranulat verwendet. Futter und Wasser stand allen Tieren ad libitum zur Verfügung.
Alle Tiere wurden bei konstanter Raumtemperatur von 22 °C +/- 2 °C, einer relativen Luftfeuchtigkeit von 55 % +/- 5 % und unter künstlicher Beleuchtung mit 320 lux von 6- 18 h in einem separaten Raum gehalten.
Lockere Ligaturen rufen ein intraneurales Ödem hervor, das zu einer Selbststrangulierung des Nerven führt. BENNETT und XIE, (1988) prägten hierfür den feststehenden Begriff des „Chronic constriction injury“- Modells.
Tiere mit einer solchen peripheren Nervenschädigung entwickeln neben einer mechanischen Allodynie auch eine thermische und mechanische Hyperalgesie.
An dem ligierten Bein zeigten die Tiere eine leichte Flexion der Gliedmasse, auch die einzelnen Zehen wurden leicht gekrümmt gehalten. Ein häufiges Belecken der betroffenen Pfote wurde ebenfalls beobachtet.
3.3 Installation des zentralen Venenzuganges
Zehn Tage nach den unter 3.2 beschriebenen Operationen erfolgte ein erneuter Eingriff bei den gleichen Tieren, wieder unter Narkose mit Pentobarbital (Narcoren®, 60 mg/ kg) intraperitoneal.
Der Hautschnitt war ca. zwei cm lang und reichte von der Mitte des Halses bis zum Anfang des Sternums. Mit einer Metzenbaum-Schere wurde die Glandula parotis stumpf von dem darunter liegenden Gewebe frei präpariert und mit Hilfe eines Wundspreitzers nach cranial verlagert.
Durch die stumpfe Trennung ließ sich die Vena jugularis gut darstellen. Das Gefäss wurde auf einer Länge von ca. acht mm mit Hilfe von mikrochirurgischen Instrumenten vorsichtig mobilisiert. Nach Mobilisation der Vene wurden zwei ca.
zwölf Zentimeter lange Fäden (3-0 Vicryl®) unter der Vene entlang geführt; einer so weit wie möglich cranial, der andere so weit wie möglich caudal des mobilisierten Stückes der Vena jugularis.
Der Venenkatheter mit einem Innendurchmesser von 1,5 mm bestand aus Polyethylen (Firma Hartstein, Deutschland), war ca. acht cm lang und hatte auf einer Höhe von drei cm eine Markierung mit Dentalkleber. Er wurde vom Versuchsdurchführenden selber hergestellt.
Nach dem Einführen des selbst gebauten Katheters in die Vene fixierte der caudale Faden den künstlichen Zugang durch einen chirugischen Knoten an dem restlichen Gefäss, um so ein Herausrutschen des Katheters zu verhindern.
Das freie Ende des Zuganges wurde mit Hilfe einer Venenverweilkanüle (Vasocan Braunüle, Firma Braun, Deutschland) subcutan zur Nackenmitte geführt, dort die Haut des Tieres durchstochen und der Katheter durch die Braunüle nach aussen geschoben. Es folgte ein reversibler Verschluss des Ein- bzw. Ausganges.
Die Glandula parotis wurde mit einem Einzelheft in die ursprüngliche Lage verbracht, die Haut wurde mit demselben Faden (3-0 Vicryl®) verschlossen.
3.4 Verhaltensbeobachtung und thermale Testung
Die Verhaltensversuche wurden tiergerecht durchgeführt. Die Versuche waren von der Regierung des Landes NRW mit der Tierversuchsnummer AZ 23.05-230-3- 20100 genehmigt.
Die Verhaltenstests wurden in dem Raum durchgeführt, in dem die Ratten gehalten wurden und der ihnen vertraut war. Die Ratten wurden zufällig den verschiedenen Versuchsansätzen mit je sechs Tieren zugeteilt.
Alle getesteten Substanzen wurden zwischen dem 6. und 10. postoperativen Tag appliziert, da innerhalb dieses Zeitfensters die Reaktionen der Tiere auf die experimentell provozierte Neuropathie am stärksten ausgeprägt sein sollten (BENNETT und XIE, 1988; ATTAL et al.; 1990; JASIM et al., 1998).
Abbildung 3: Allgemeiner Zeitablauf von Versuchsbeginn bis Versuchsende bzw. Euthanasie der Tiere (Tag 0 bis Tag 10 post op).
Tag 0 Tag 1 Tag 6 Tag 7 Tag 8 Tag 10
Thermale Nullwert- bestimmung vor CCI
CCI Operation und intrathekaler Katheter
Thermale Nullwert- bestimmung nach CCI
Intravenöser Katheter Versuch und anschl.
Euthanasie
Die thermale Stimulation wurde bei den Versuchen mit Hilfe einer „Hotplate“
(Plantartest, Firma Ugo Basile; Italien) durchgeführt. Dies ist eine etablierte Methode zur Dokumentation von veränderter thermaler Wahrnehmung von Versuchstieren in Folge von chronischen Schmerzmodellen (SIMPSON et al., 1996).
Nach Abschluss der Verhaltensversuche schloss sich die Euthanasie der Tiere durch eine intravenös verabreichte Überdosis von Pentobarbital an.
Durch eine Injektion von Methylenblau in den noch im Tier liegenden Katheter und eine anschliesende Laminektomie kontrollierte man die ordnungsgemäße Lage desselben. Desweiteren wurden in der Sektion die morphologischen Veränderungen am Nervus ischiadicus begutachtet. Dort wurde das sogenannte
„Perlschnurphänomen“ dokumentiert, welches durch das intraneurale Ödem und die Strangulierung des Nervs durch die gesetzten Ligaturen hervorgerufen wurde.
Es wurden nur die Daten der Tiere verwendet, die nach der CCI-Operation eine Schwellenverschiebung in der thermalen Empfindlichkeit zeigten, die keinerlei Einschränkungen im Allgemeinbefinden zeigten, und die ein „Perlschnurphänomen“
ausbildeten.
Für die thermale Testung wurden die verwendeten Tiere in randomisierten und verblindeten Gruppen wie folgt aufgeteilt:
Tabelle 1: Einteilung der Versuchsgruppen für die thermische Testung
Gruppe Intravenöse Applikation (iv)
Intrathekale Applikation (it)
A NaCl-Lösung NaCl-Lösung
B Lidocain 1% NaCl-Lösung
C NaCl-Lösung D-Serin
D Lidocain 1% D-Serin
E NaCl-Lösung Strychnin
F Lidocain 1% Strychnin
G NaCl-Lösung CGP 78608
H Lidocain 1% CGP 78608
I Lidocain 2% NaCl-Lösung
J Lidocain 2% D-Serin
Gruppengröße n=6.
Tabelle 2: Übersicht der Dosierungen der applizierten Substanzen
Verwendete Substanz Dosierung und Menge Applikationsart NaCl-Lösung 0,35 ml, 0,9%, isoton intravenös
Lidocain 1% Bolus: 0,35 ml, 10mg/kg Infusion: 180 µg/kg/min
intravenös
Lidocain 2% Infusion: 180 µg/kg/min intravenös
D-Serin 100 µg/10 µl NaCl intrathekal
Strychnin 3 µg/10 µl NaCl intrathekal
CGP 78608 100 pmol/ 10µl NaCl intrathekal
Bei der im Rahmen dieser Dissertationsschrift verwendeten Versuchsapparatur handelte es sich um einen Plantartest® der Firma Ugo Basile, Italien (siehe Abbildung 18, Kapitel 8).
Unter dem Aufbau der Apparatur befand sich eine Lichtquelle, die halogeniertes Licht durch ein Linsensystem zum Boden des darüber liegenden Aufbaues schickte. Das Licht produzierte eine ansteigende Temperatur von 15 ° bis auf 30° Celsius, je nach Dauer der einzelnen Testung. Je länger das Tier seine Pfote auf dem Kontakt der Wärmelampe sitzen liess, desto wärmer wurde die applizierte Temperatur an der fokussierten Hintergliedmaße. Hob das Tier die Pfote an, wurde der Kontakt der Lampe unterbrochen, die gemessene Zeit bleibt auf der digitalen Anzeige der Messapparatur stehen.
Die sich anschliessende intravenöse Dauerinfusion von Lidocain während der Versuche wurde über eine Pumpe der Firma CMA (Microdialyse Pump Type 8713®) gewährleistet, es wurde eine Infusionsrate von sechs µl pro Minute gewählt.
Die verwendeten Tiere bewegten sich während der gesamten Zeit frei in dem Käfig, der Boden war eben und die Tiere hatten alle vier Gliedmaßen gleichmässig auf dem Plexiglasboden aufliegen (siehe Abbildung 19, Kapitel 8).
Das Tier zeigte durch Wegziehen der jeweiligen Pfote, wann die individuelle Schmerzgrenze erreicht war. Das Wegziehen der Hintergliedmaße unterbrach den Kontakt der Licht- und Wärmequelle, die Zeit wurde angehalten. Das Gerät schaltete darüber hinaus nach einer Hitzeapplikation von 20 Sekunden ab, um einen Gewebeschaden zu vermeiden.
Die Latenzzeiten, mit denen die rechte und linke Hinterpfote der Hitzeeinwirkung entzogen wurden, wurden jeweils drei Mal innerhalb von zehn Minuten unabhängig voneinander gemessen und anschliessend die Werte für die jeweilige Pfote gemittelt.
Nur Ratten, die eine Erniedrigung der thermischen Reizschwelle nach der CCI- Intervention zeigten, wurden in die Messung einbezogen. Die Erniedrigung der thermischen Reizschwelle wurde durch den Vergleich der Latenzzeit vor und nach der CCI-Operation festgestellt. Waren die Zeitwerte nach der Operation im Vergleich zu den Werten vor der Operation bei den einzelnen Tieren erniedrigt, so hatte sich eine chronische Neuropathie bei diesen ausgebildet.
Zur Testung: vor der ersten Operation saß jeweils ein Tier in einer Abteilung des Plexiglas-Aufbaues und jedes Tier hatte eine Gewöhnungsphase von ca. 30 Minuten.
Die Wärmequelle wurde unter der zu testenden Gliedmaße positioniert, mit dem Mittelpunkt auf dem hinteren Teil der Pfote; die Messung begann.
Bei den Versuchen mit 1% Lidocain wurde zuerst der „prä Op-Wert“ bestimmt, es folgte die CCI-Operation. Nach entsprechender Rekonvaleszenzphase wurde am Tag der Testung der „prä-Bolus-Wert“ ermittelt. Nun folgte die intrathekale Applikation der jeweiligen Substanz. Die gelösten Substanzen, mit einem Gesamtvolumen von zehn µl, applizierte man mit einer Mikroliterspritze mit stumpfer Spitze in den intrathekalen Katheter, und so an die Lumbalschwellung im Rückenmarkskanal.
Nach zwei Minuten wurde der Lidocainbolus über eine Zeitdauer von drei Minuten per Hand intravenös vom Untersuchenden appliziert. Nach insgesamt zehn Minuten wurde der „post-Bolus-Wert“ gemessen.
Im weiteren Versuchsablauf wurden nach 10, 20, 30, 40 und 50 Minuten jeweils ein Mittelwert ermittelt.
Abbildung 4: Versuchsablauf mit Lidocain 1% 8-10 Tage nach der CCI- Operation
Min. 0 Min. 5 Min. 7 Min. 20 Min. 30 Min. 50
Prä-Boluswert Intrathekale Applikation
Lidocain-Bolus
Erfassung der Messwerte im 10 min. Abstand
Min. 40 Min. 10
Post-Boluswert
Bei den Versuchen mit 2% Lidocain wurde die Messung variiert, da bei diesem Versuchsansatz die verlängerte analgetische Wirkung des Lidocains im Zentrum der Fragestellung stand.
Wie oben erklärt, wurde ein „prä OP“-, ein „prä Bolus“- und ein „post Bolus“ Wert für die jeweiligen Tiere ermittelt, dann folgte die intrathekale Applikation von D-Serin und nach zehn Minuten begann die Messung der Schmerzschwellen.
Abbildung 5: Versuchsablauf mit Lidocain 2% 8-10 Tage nach der CCI- Operation.
Nach den Messungen verblieben die Tiere in ihren Einzelkäfigen (siehe Abbildung 20, Kapitel 8).
3.5 Lageüberprüfung des intrathekalen Katheters post mortem
Um die korrekte Lage des intrathekalen Katheters zu überprüfen, folgte die Sektion der Tiere, welche die Testreihe durchlaufen hatten.
Die Ratten wurden entweder durch eine intraperitoneale oder intravenöse Injektion mit Pentobarbital schmerzfrei euthanasiert (Eutha 77®, Firma Essex).
Der intrathekale Katheter wurde mit ca. 30 µl einer Metylen- Blau Lösung gespült.
Min. 0 Min. 5 Min. 8 Min. 20 Min. 30 Min. 50
Prä-Boluswert
Lidocain-Bolus 2%
Post-Bolus Erfassung der Messwerte im 10 min. Abstand
Min. 40 Min. 11
Intrathekale Applikation
Ein ca. acht cm langer Hautschnitt auf dem Rücken des Tier legte die darunter liegende Wirbelsäule frei.
Mit einem Scherenschlag wurde auf Höhe des dritten und vierten Lendenwirbels die Wirbelsäule durchtrennt. Im cranialen Verlauf der Wirbelsäule führte man eine Laminektomie durch, so dass das darunter liegende Rückenmark sichtbar wurde.
Anhand der ausgetretenen blauen Flüssigkeit konnte beurteilt werden, ob der Katheter optimal lag und so im Versuch applizierte Substanzen ihren Zielort an der Lumbalschwellung wirklich erreicht hatten.
3.6 Auswertung und statistische Methoden
Die Gruppendaten wurden als Mittelwert ± Standardfehler (sem) dargestellt.
Latenzen beim Wegziehen der Pfoten als Reaktion auf einen Hitzereiz wurden einer Varianzanalyse unterzogen. Diese Varianzanalyse wurde mit SAS (SAS= Statistical Analysis Software) erstellt. Es handelte sich um einen RM (= repeated measurement) ANOVA (Analysis of Variance) Test, gefolgt von Bonferroni post hoc Test.
P ≤ 0,05 wurde als signifikant angenommen.
Es wurden neun Vergleiche zu sechs Zeitpunkten von der Kontrollgruppe gemacht.
Weiter wurden vier Vergleiche zu sechs Zeitpunkten gemacht, um die nur mit Lidocain infundierten Tiere mit den Tieren zu vergleichen, die Lidocain plus D-Serin, Strychnin oder CGP 78608 bekommen hatten.
In den Versuchen mit 2% Lidocain (360µg/kg/min) unter der späteren D-Seringabe wurden drei Vergleiche zu sechs Zeitpunkten gemacht.
3.7 Verwendete Substanzen und deren Abkürzungen
3.7.1 Lidocain
Lidocain ist ein in der Praxis sehr häufig verwendetes Lokalanästhetikum vom Amidtyp.
Es senkt reversibel die Permeabilität der spannungsgesteuerten Natriumkanäle an Nervenfasern. Dadurch wird eine Weiterleitung der Aktionspotentiale verhindert und die Reizfortleitung unterbrochen.
Die systemische Wirkung ist dosisabhängig. Je nach Konzentration kann es zentral sedativ und antikonvulsiv wirken. Bei höheren Konzentrationen folgen motorische Stimulation, Erbrechen, Tremor, klonische Krämpfe bis zur zentralen Atemlähmung.
Die lokalanästhetische Wirkung steigt proportional mit der Toxizität (W.LÖSCHER, S.R. UNGEMACH, R. KROKER, 1997).
Eine niedrig dosierte systemische Lidocaingabe, die noch nicht die Natriumkanäle blockiert, kann dosisabhängig zu einer Analgesie bei neuropathischen Schmerzen führen (BIELLA et al., 1993). Der genaue Mechanismus ist zur Zeit noch nicht geklärt, aber es scheint, dass unter anderem spontane Impulse der verletzten Nerven blockiert werden.
Da diese Analgesie auch bei polysynaptischen Reflexbögen reproduzierbar ist, ist anzunehmen, dass Lidocain eine zentralnervöse inhibitorische Wirkung am Rückenmark selber hat. Dieser Vorgang kann vor allem schon bei niedrigen Plasmakonzentrationen nachgewiesen werden, was den Vorteil hat, dass die sonst dokumentierten Nebenwirkungen des systemisch gegebenen Lidocains (Schwindel, Husten, Tinnitus, Tremor) vernachlässigt werden können (ABRAM et al., 1994).
Da die genaue Wirkung des Lidocains noch nicht genau geklärt ist, werden in der Literatur zwei Ansätze dazu diskutiert.
Es wird davon ausgegangen, dass Lidocain durch Bindung an den NMDA-Rezeptor die postsynaptische Depolarisation (NAGY und WOOLF, 1995) und damit die weitere Neurotransmission am Rezeptor hemmt und antihyperalgetisch wirkt.
Die Wirkung von Lidocain an postsynaptischen, inhibitorischen Neuronen wird über Strychnin-sensitive Glycinrezeptoren kodiert, die eigentlich von Glycin als inhibitorischer Transmitter aktiviert werden. Es wird aber vermutet, dass Lidocain oder seine Metaboliten dies ebenfalls können und so antihyperalgetisch wirken (NAGY und WOOLF, 1995).
In den Versuchen wurde ein- und zwei- prozentiges Lidocain der Firma Braun, Deutschland verwendet. Bei dem 1% Lidocain wurde eine Dosierung von 10 mg/kg in drei Minuten als Bolus appliziert, es folgte eine Dauerinfusion von 180µg/kg/min in einer Stunde. Beim 2% Lidocain waren es nach Bolusgabe 360µg/kg/min in der Stunde.
3.7.2 D-Serin
D-Serin ist ein endogener Neurotransmitter, der unter anderem von Astrozyten synthetisiert wird. Es ist obligatorischer Co-Agonist an exzitatorischen NMDA- Rezeptoren. Als Agonist fungiert das Glutamat.
In Astrozyten wird L-Serin gespeichert, ein Isomer des späteren D-Serin. Durch das zelleigene Enzym Serin-Racemase entsteht durch Katalyse D-Serin.
Nach einem Schmerzimpuls wird am präsynaptischen Spalt durch die eingehenden Impulse Glutamat in den synaptischen Spalt frei gegeben. Glutamat ist ein Salz der körpereigenen Glutaminsäure, das an der Übertragung von Schmerzimpulsen massgeblich beteiligt ist. Es muss an den Rezeptoren ebenfalls vorhanden sein, sonst ist es Glycin nicht möglich, am NMDA-Rezeptor zu binden.
Durch den Glutamatanstieg wird das fertige D-Serin aus den Astrozyten ausgeschleusst und es diffundiert zum NMDA-Rezeptor.
D-Serin ist potenter als Glycin, welches als Co-Agonist am NMDA-Rezeptor die Signalübertragung vermittelt. Beide Substanzen, Glycin und D-Serin, binden mit gleich hoher Affinität am zu aktivierenden Rezeptor (MOTHET et al., 2000). Beide binden am Glycin B Teil des NMDA-Rezeptors (NONG et al., 2003) und haben so eine exzitatorische Wirkungsweise.
Die Chemikalie wurde von der Firma Sigma (Deisenhofen, Deutschland) bezogen.
Es wurden 100µg D-Serin gelöst in zehn µl NaCl intrathekal appliziert.
3.7.3 Strychnin
Strychnin ist ein pflanzliches Gift der Strychnos nux-vomica. Es ist eine toxische Substanz, die am postsynaptischen, inhibitorischen Strychnin-sensitiven Glycinrezeptor angreift und so eine zunächst inhibitorische, dann exzitatorische Wirkungsweise hat.
Dosisabhängig antagonisiert es die inhibitorische Wirkung von Lidocain und es fördert die Ausschüttung von Glutamat am präsynaptischen Spalt, was eine exzitatorische Reaktion nach sich zieht (BIELLA et al., 1993).
Bei Anwesenheit von Strychnin in Rezeptornähe antagonisiert es die glycinerge Aktivität, stört die Koordination der Rezeptoraktivierung, beeinträchtigt die Formation der Synapsen und deren Erhaltung (BREITINDER und BECKER, 2002).
In früheren Anwendungen wurde Strychnin als Rückenmarkskonvulsivum bezeichnet, Dosisabhängig kommt es zur Blockierung hemmender Neuronen, was sich klinisch in Form von erhöhter Reflexbereitschaft bis zu Streckkrämpfen zeigt. Es droht Erstickungsgefahr.
Strychnin wurde von der Firma Sigma (Deisenhofen, Deutschland) bezogen.
Es wurden 3µg Strychnin in 10 µl NaCl gelöst und intrathekal appliziert.
3.7.4 CGP 78608
CGP 78608 ([(1S)-1-[[7-Bromo-1,2,3,4-Tetrahydo-2,3-Dioxo-5Quinoxalinyl) Methyl]
Ethyl] Phosphonat) ist ein potenter und selektiver NMDA-Antagonist, welcher mit einer hohen Affinität an der Glycin-B site des Rezeptors angreift. Bei systemischer Gabe in vivo wirkt er antikonvulsiv, in dem er die stimulierenden Effekte am NMDA- Rezeptor im ZNS verhindert (HILGIER et al., 2004).
Diese Substanz wurde von Novartis Pharma AG, Deutschland, bezogen.
Eine 100pmol Lösung wurde verwendet.
3.7.5 Natrium-Chlorid Lösung
Physiologische Kochsalzlösung wurde in dieser Versuchsreihe in den Kontrollgruppen verwendet. Es wurde intravenös und intrathekal appliziert.
Diese Lösung wurde bei der Firma Braun, Deutschland, bezogen.
Alle oben aufgeführten Chemikalien wurden in 0,9% NaCl–Lösung gelöst und bei 20 C° Raumtemperatur aufbewahrt. Am Tag der Testung wurden die einzelnen Substanzen frisch gelöst und sofort verabreicht.
4 Ergebnisse
Eines der Tiere zeigte am folgenden Tag nach der Operation eine stärkere Flexion der linken Hinterpfote als die anderen untersuchten Tiere. Am fünften Tage nach der Operation war bei diesem Tier eine ausgeprägte Form der Automutilation festzustellen: alle Zehen der linken Pfote waren bis auf den Mittelknochen abgefressen. Dieses Tier wurde umgehend euthanasiert.
Bei Versuchsbeginn bekam das zu testende Tier einen 0,35 ml Bolus von entweder ein- oder zwei- prozentigem Lidocain über eine Zeit von drei Minuten, das entsprach einer Wirkstoffmenge von 10mg pro Kilogramm Körpermasse. Bei der Infusion über eine Stunde Versuchsablauf wurde eine Lidocainmenge von 6µl per Dauerperfusor intravenös appliziert. Diese Menge entsprach 180 µg Wirkstoff bei 1% Lidocain oder 360 µg bei 2% Lidocain pro Kilogramm Körpermasse und Stunde.
In den Versuchen mit 1% Lidocain zeigte sich das Wirkmaximum von Lidocain unmittelbar nach Applikation des Bolus, um innerhalb von zehn bis zwanzig Minuten wieder auf das Ausgangsniveau abzusinken. Da in dieser Arbeit in vivo die Effekte verschiedener Agonisten und Antagonisten an der Glycin-sensitiven Seite des NMDA-Rezeptors auf die Analgesie durch intravenös appliziertes Lidocain untersucht werden sollte, beschränkt sich die statistische Analyse auf den Zeitpunkt dieses Wirkmaximums, der weitere Zeitverlauf wird nur deskriptiv erwähnt.
Die verschiedenen Untersuchungsgruppen wurden mittels ANOVA (Analysis of variances) verglichen, gefolgt von einem Bonferroni post hoc Test. P ≤ 0,05 wurde als signifikant angenommen.
Im Einzelnen wurde der Effekt jedes einzelnen Pharmakons (Lidocain intravenös, D- Serin, Strychnin, CGP jeweils intrathekal, mit NaCl-Applikation iv und it) im Vergleich zur Kontrollgruppe (NaCl Lösung iv und it appliziert) statistisch untersucht.
Angelehnt an die Fragestellung dieser Arbeit, ob die durch Lidocain induzierte Analgesie durch it applizierte Pharmaka antagonisiert werden kann, wurde die Ko-
Applikation von D-Serin, Strychnin und CGP mit Lidocain im Vergleich zur reinen Lidocain iv-Applikation statistisch untersucht.
Daraus folgt eine Untersuchung mit vier Vergleichen zu einem Zeitpunkt und drei Vergleichen zu einem Zeitpunkt.
Bei der Testung mit 2% Lidocain, welches eine verlängerte analgetische Wirkung hat, sollte die Wirkung von D-Serin im Versuchsverlauf untersucht werden. Die Gruppen wurden mittels RM ANOVA (repeated measurement anova) und folgendem Bonferroni post hoc-Test verglichen. Die Gruppe Lidocain iv + NaCl it wurde mit der Gruppe Lidocain iv + D-Serin it, sowie mit der Gruppe NaCl iv + Nacl it verglichen, es wurden so zwei Vergleiche zu vier Zeitpunkten gezogen.
4.1 Thermale Hyperalgesie nach Neuropathieinduktion
Bei dem Vergleich der verschiedenen Gruppen kam es bei allen Tieren zu einer thermalen Schwellenverschiebung im Vergleich der rechten zur linken Hintergliedmaße: alle verwendeten Tiere entwickelten eine signifikante thermale Hyperalgesie an der linken Pfote nach der CCI-Operation.
An der rechten Pfote kam es zu keiner signifikanten Verschiebung in der thermischen Empfindlichkeit, aber der prä-Bolus Wert vor jeglicher Manipulation lag bei allen Tieren höher als nach der CCI-Operation.
Tabelle 3: Zusammenfassende Darstellung der einzelnen iv und it applizierten Substanzen in ihrer Auswirkung auf das thermale Schmerzverhalten an der linken,operierten Hintergliedmaße. Bewertung zum post Bolus-Wert.
Linkes Bein
Intravenös
NaCl Lidocain 1% Lidocain 2%
NaCl +/- ++ +
D-Serin - + -
Strychnin - + n.d.
Intrathekal
CGP 78608 ++ + n.d.
+/-: keinerlei Schwellenverschiebung dokumentiert.
+: im Vergleich zu NaCl eine schwache Analgesie dokumentiert (Schwellemerhöhung).
++: im Vergleich zu NaCl eine stärkere Analgesie dokumentiert.
-: im Vergleich zu NaCl eine gering Hyperalgesie dokumentiert.
(Schwellenerniedrigung).
--: im Vergleich zu NaCl eine starke Hyperalgesie dokumentiert (Schwellenerniedrigung).
n.d.: nicht durchgeführt.
Tabelle 4: Zusammenfassende Darstellung der einzelnen iv und it applizierten Substanzen in ihrer Auswirkung auf das thermale Schmerzverhalten an der rechten, nicht operierten Hintergliedmaße.
Rechtes Bein
Intravenös
NaCl Lidocain 1% Lidocain 2%
NaCl +/- ++ +
D-Serin - + -
Strychnin - + n.d.
Intrathekal
CGP 78608 ++ + n.d.
+/-: keinerlei Schwellenverschiebung dokumentiert.
+: im Vergleich zu NaCl eine schwache Analgesie dokumentiert (Schwellemerhöhung).
++: im Vergleich zu NaCl eine stärkere Analgesie dokumentiert.
-: im Vergleich zu NaCl eine gering Hyperalgesie dokumentiert.
(Schwellenerniedrigung).
--: im Vergleich zu NaCl eine starke Hyperalgesie dokumentiert (Schwellenerniedrigung).
n.d.: nicht durchgeführt.
Thermische Schwellenverschiebung an der rechten Hinterpfote (kontralateral zur CCI-Operation); Lidocain 1% iv und D-Serin it, Abbildung 6:
An der rechten, nicht operierten Gliedmaße hatte Lidocain 1% iv + NaCl it den höchsten post Bolus Wert, nach zehn Minuten fiel die Schwelle auf 13,4 ± 0,6 Sekunden, um sich nach 20 Minuten mit den anderen Kurvenverläufen bei Reaktionszeiten zwischen 10 und 11 Sekunden einzupendeln. Bei zusätzlicher Gabe von D-Serin it war die Wirkung von Lidocain 1% bei einem post Bolus Wert von 13,5
± 0,5 Sekunden schwächer, nach 30 Minuten war der prä Bolus Wert erreicht.
Die Tiere, bei denen NaCl iv und NaCl it appliziert wurde, dienten als Kontrollgruppe.
Die Kurve verlief gleichbleibend flach, ohne einen nennenswerten An- oder Abstieg nach Applikation des Bolus.
Der Kurve der Gruppe NaCl iv + D-Serin it hatte einen post Bolus Wert (9,5 ± 0,6 Sekunden), der minimal unter dem prä Bolus Wert (11,9 ± 0,3 Sekunden) lag, die Kurve stieg im Versuchsverlauf wieder auf Werte um zehn Sekunden an.
Thermische Schwellenverschiebung an der linken Hinterpfote (mit CCI-Operation);
Lidocain 1% iv und D-Serin it, Abbildung 7:
An der linken Gliedmaße war ein ähnlicher Verlauf der Schwellenverschiebung zu beobachten in Bezug auf den post Bolus Wert. Die Schwellenwerte lagen höher als an der rechten Pfote, die einzelnen Tiergruppen zeigten bei ausschließlicher 1%
Lidocaingabe den höchsten post Bolus Wert (18,8 ± 1,2 Sekunden), was einem Wirkmaximum entspricht, kehrte aber im weitern Zeitverlauf wieder auf den Ausgangswert von 12,8 ± 1,1 Sekunden zurück.
Diesem Kurvenverlauf folgte die Gruppe Lidocain 1% iv + D-Serin it (13 ± 9 Sekunden) und NaCl iv + NaCl it (10,3 ± 0,2 Sekunden). NaCl iv + D-Serin it hatte den geringsten Schwellenwert mit 9,1 ± 0,6 Sekunden post Bolus.
Die thermale Schwelle verschob sich bei 1% Lidocain iv + NaCl it am rechten, nicht operierten Bein vor dem Bolus von 11,3 ± 0,4, auf 16,6 ± 01,2 Sekunden, hatte hier das Wirkungsmaximum und kehrte nach 30 Minuten wieder auf den Ausgangswert von 11,2 ± 0,7 Sekunden zurück.
Zur Signifikanz:
Im Vergleich NaCl iv + NaCl it versus Lidocain 1% iv + NaCl it waren linke wie rechte Pfote im Wirkmaximum signifikant unterschiedlich (p < 0,01, n = 6) mit einem Wirkmaximum links 10,3 ± 0,2 versus 18,8 ± 1,2 Sekunden und rechts 11,3 ± 0,6 versus 16,6 ± 1,2 Sekunden.
Beim Vergleich NaCl iv + NaCl it versus D-Serin waren die Schwellenverschiebungen weder links noch rechts signifikant, links 10,3 ± 0,2 versus 9,1 ± 0,6 Sekunden, rechts11,3 ± 0,6 versus 9,5 ± 0,6 Sekunden. Beide Kurvenverläufe zeigten sowohl links als auch rechts nach 30 Minuten einen abfallenden Verlauf, um nach 50 Minuten auf den Ausgangswert zurückzukehren.
Thermische Schwellenverschiebung an der rechten Hinterpfote (kontralateral zur CCI-Operation); Lidocain 1% iv und Strychnin it, Abbildung 8:
An der rechten, nicht operierten Pfote hatte die Gruppe Lidocain 1% iv + NaCl it den höchsten post Bolus Wert (16,6 ± 1,2 Sekunden), fiel aber nach 30 Minuten Versuchsdauer auf Werte um zehn bis elf Sekunden ab. Lidocain 1% iv + Strychnin it hatte den zweit höchsten post Bolus Wert (12,6 ± 0,8 Sekunden), erreichte nach 30 Minuten seinen tiefsten Wert bei 9,3 ± 0,4 Sekunden, und stieg bis 50 Minuten nach Versuchsbeginn auf den prä Bolus Wert an.
Die Kontrollgruppe NaCl iv + NaCl it hatte einen gleichbleibenden Kurvenverlauf, wie oben erwähnt. Die Tiere mit NaCl iv und Strychnin it zeigten eine deutlich herabgesetzte thermale Schwelle, alle Werte lagen deutlich unter denen der anderen Gruppen und hatten nach Versuchsende den prä Bolus Wert nicht wieder erreicht.
Thermische Schwellenverschiebung an der linken Hinterpfote (mit CCI-Operation), Lidocain 1% iv und Strychnin it, Abbildung 9:
An der linken Pfote fiel erneut auf, dass die reine 1% Lidocaingruppe die höchsten thermalen Schwellen nach dem Bolus hatte. Die Gruppen Lidocain 1% iv + Strychnin it und die NaCl-Kontrollgruppe hatten eine ähnlichen Verlauf mit Werten, die eng zusammen lagen, der Kurvenverlauf war ohne grosse Schwankungen.
Die Gruppe NaCl iv + Strychnin it dagegen hatte post Bolus eine deutliche Schwellenerniedrigung mit einem Wert von 5,8 ± 0,2 Sekunden und verblieb bis Versuchsende auf diesem niedrigen Niveau.
Zur Signifikanz:
Bei den Gruppen NaCl iv + NaCl it versus Strychnin kam es an der rechten Pfote zu einer nicht signifikanten Verschiebung post Bolus, 11,3 ± 0,6 versus 9,0 ± 0,8 Sekunden. An der linken Hintergliedmaße verlief der Kurvenverlauf signifikant, 10,3 ± 0,2 versus 5,8 ± 0,2 Sekunden bei p< 0,05 und n = 6.
Die Verlaufskurve des Strychnins dokumentierte links wie rechts eine starke Schwellenverschiebung unter den Ausgangswert, und dieser erreichte nach 50 Minuten Versuchsverlauf nicht wieder den Wert vor Bolusgabe.
Thermische Schwellenverschiebung an der rechten Hinterpfote (kontralateral zur CCI-Operation), Lidocain 1% iv und CGP 78608 it, Abbildung 10:
An der rechten Pfote hatte Lidocain 1% iv + NaCl it das Wirkmaximum bei 16,6 ± 1,2 Sekunden und hatte nach Versuchsdauer 10,5 ± 0,5 Sekunden das Wirkminimum.
Die Kontrollgruppe hatte einen gleichbleibenden flachen Verlauf, wie oben erwähnt.
NaCl iv + CGP 78608 it hat im Vergleich zu Lidocain 1% iv + CGP 78608 it einen höheren post Bolus Wert (15,5 ±0,6 Sekunden). Die Wirkung des Pharmakons hielt im Versuchsverlauf länger an als bei den anderen Gruppen, fiel aber nach 30 Minuten auf prä Bolus- Werte ab.
Die thermalen Schwellenwerte der Gruppe mit Lidocain 1% iv + CGP 78608 it hatte bei Minute 10 ihr Wirkmaximum, bei Minute 30 war das Ausgangsniveau wieder erreicht. Lidocain 1% iv + NaCl it hatte das höchste Wirkungsmaximum, gefolgt von NaCl iv + CGP 78608 it. Lidocain 1% iv + CGP 78608 it hatte im Vergleich mit den erwähnten Gruppen einen deutlich niedrigeren post Bolus Wert.
Thermische Schwellenverschiebung an der linken Hinterpfote (mit CCI-Operation);
Lidocain 1% iv und CGP 78608 it, Abbildung 11:
An der linken Pfote stellten sich die Verläufe der Werte der verschiedenen Gruppe ähnlich dar: sie hatten alle, mit Ausnahmen der Kontrollgruppe, ein
Wirkungsmaximum nach der Bolusgabe und im Verlauf des Versuches sanken die thermalen Schwellenwerte auf prä Bolus Werte.
Lidocain 1% iv + NaCl it hatte das höchste Wirkungsmaximum, gefolgt von NaCl iv + CGP 78608 it. Lidocain 1% iv + CGP 78608 it hatte also im Vergleich mit den erwähnten Gruppen einen deutlich niedrigeren post Bolus Wert.
Die Kontrollgruppe hatte das geringste Wirkungsmaximum und einen gleichbleibenden Kurvenverlauf.
Zur Signifikanz:
Bei dem Vergleich NaCl iv + NaCl it versus CGP 78608 it waren die Werte signifikant, rechte Pfote p< 0,01, linke Pfote p< 0,05 bei n =6. Post Bolus hatten beide Werte ihr Wirkmaximum rechts 11,3 ± 0,6 versus 15,5 ± 0,6, links 10,3 ± 0,2 versus 13,8 ± 1,2 Sekunden. Der Kurvenverlauf des CGP 78608 lag während der gesamten Versuchsdauer über dem des NaCl, beide näherten sich bei 50 Minuten dem prä Bolus Wert wieder an.
Thermische Schwellenverschiebung an der rechten Hinterpfote (kontralateral zur CCI-Operation); Lidocain 2% iv und D-Serin it, Abbildung 12:
Bei den Versuchen mit 2% Lidocain wurde das D-Serin nach dem Lidocain- Bolus appliziert und so die Wirkung der applizierten Pharmaka zehn Minuten nach der Bolusgabe untersucht.
Lidocain 1% iv + NaCl it hatte mit 13,4 ±0,6 Sekunden das höchste Wirkmaximum, gefolgt von Lidocain 2% iv + NaCl it (13,1 ±0,4 Sekunden), doch die Schwellenwerterhöhung blieb im Versuchsverlauf bei 2% Lidocain länger bestehen als bei Lidocain 1%.
2% Lidocain iv + D-Serin it hatte mit 9,5 ± 0,3 Sekunden die grösste Schwellenerniedrigung, die sich bis Versuchsende an den prä Bolus Wert wieder annäherte (10,7 ± 0,2 Sekunden). Die Kontrollgruppe hatte kein Wirkmaximum, die Kurve verlief gleichbleibend flach.
Auffallend war bei den ersten Gruppen (Lidocain 1% iv + NaCl it und Lidocain 2% + Nacl it) eine Schwellenerhöhung nach zehn Minuten, bei den anderen Gruppen (Lidocain 2% + D-Serin it und NaCl iv + NaCl it) eine thermische
Schwellenerniedrigung. Alle vier Gruppen näherten sich im weiteren Kurvenverlauf wieder ihren postoperativen Ausgangswerten an.
Thermische Schwellenverschiebung an der linken Hinterpfote (mit CCI-Operation);
Lidocain 2% iv und D-Serin it, Abbildung 13:
Auffallend war, dass im Gegensatz zur rechten Hinterpfote die Schwellenerhöhung des Lidocain 1% iv + NaCl it links höher ausfiel als Lidocain 2% iv + NaCl it. Nach zehn Minuten hatte das Lidocain 1% eine Schwelle mit 13,8 ± 0,5 Sekunden, Lidocain 2% dagegen 12,6 ± 0,5 Sekunden. Diese Schwellenverteilung blieb bis Versuchsende bestehen, der jeweilige prä Bolus Wert wurde nicht wieder erreicht.
2% Lidocain iv + D-Serin hatte im Vergleich zum prä Bolus Wert von 9,8 ±0,2 Sekunden eine Schwellenerniedrigung auf 9,0 ± 0,2 Sekunden nach zehn Minuten Versuchsablauf. Die antagonisierende Wirkung des D-Serin ließ während des Versuches nach und der prä Bolus Wert war nach 40 Minuten erreicht.
Die Kontrollgruppe hatte, wie oben erwähnt, einen flachen Verlauf.
Zur Signifikanz:
In der Versuchsreihe wurde die unterschiedliche Konzentration (1% und 2%) des Lidocains in Bezug auf das veränderte Schmerzverhalten genauer betrachtet.
Allgemein war festzustellen, dass eine Gabe von Lidocain 2% iv + NaCl it im Vergleich zu Lidocain 1% iv + NaCl it zu einer länger erhöhten thermischen Schwelle geführt hatte. Diese erhöhten Schwellen konnten durch eine Gabe von D-Serin intrathekal antagonisiert werden, welches durch signifikant unterschiedliche Kurvenverläufe deutlich wurde.
Die berechneten Signifikanzen wurden in Tabelle 6 im Anhang dargestellt.
Nach zehn Minuten waren alle gemessenen Werte an der linken und rechten Pfote mit p< 0,01 bei n = 6 signifikant unterschiedlich. Lidocain 2 % iv + NaCl it versus NaCl iv + NaCl it rechts 13,1 ± 0,4 versus 10,5 ±0,2 Sekunden, links 12,6 ± 0,5 versus 9,7 ± 0,3 Sekunden.
Lidocain 2% iv + NaCl it versus Lidocain 2% iv + D-Serin it zeigten rechts ein Wirkmaximum von 13,1 ± 0,4 versus 9,5 ± 0,3, links 12,6 ± 0,5 versus 9,0 ± 0,2 Sekunden, im weiteren Verlauf zeigte sich, dass die Kurve von Lidocain 2% iv + D- Serin im weiteren Versuchsverlauf Richtung Ausgangswert strebte.
Nach 20 Minuten waren bei beiden Gruppen erneut die Werte der linken und rechten Pfote signifikant unterschiedlich mit p < 0,01 bei n = 6. Rechte Pfote Lidocain 2% iv + NaCl it versus NaCl iv + NaCl it mit 13,1 ± 0,5 versus 10,7 ± 0,3 Sekunden, linke Pfote 12,3 ± 0,4 versus 9,2 ± 0,4 Sekunden. Im weiteren Vergleich rechte Pfote Lidocain 2% iv + NaCl it versus Lidocain 2% iv + D-Serin it mit 13,1 ± 0,5 versus 10,7
± 0,1 Sekunden, linke Pfote 12,3 ± 0,4 versus 9,2 ± 0,2 Sekunden.
Nach 30 Minuten waren an der rechten Pfote bei beiden zu vergleichenden Gruppen die Schwellenverschiebungen mit p < 0,05 bei n = 6 signifikant: Lidocain 2% iv + NaCl it versus NaCl iv + NaCl it mit 13,3 ± 0,4 versus 10,9 ± 0,3 Sekunden, Lidocain 2% iv + NaCl it versus Lidocain 2% iv + D-Serin it mit 13,3 ± 0,4 versus 11,0 ± 0,2 Sekunden. An der linken Pfote waren bei der Kontrollgruppe Lidocain 2% iv + NaCl it versus NaCl iv + NaCl it die Daten mit 12,1 ± 0,3 versus 9,6± 0,3 Sekunden signifikant unterschiedlich, bei p< 0,05 mit n = 6, und näherten sich im Versuchsverlauf dem Ausgangswert wieder an.
Bei der Gruppe Lidocain 2% iv + NaCl it versus Lidocain 2% iv + D-Serin it mit 12,1 ± 0,3 versus 9,7 ± 0,3 Sekunden war bei p< 0,01 mit n= 6 der Vergleich der Schmerzschwelle signifikant unterschiedlich.
Nach 40 Minuten Versuchsablauf hatten beide Gruppen an der rechten und linken Pfote den Ausgangswert wieder erreicht.
Der analgetische Effekt von Lidocain 1% war an der linken, operierten Gliedmaße stärker und länger ausgebildet, als an der rechten, nicht operierten Gliedmaße. Bei den Tieren, die nur 1% Lidocain erhielten erfolgte fünf Minuten nach dem Beginn der Lidocaininfusion an der linken, operierten Pfote das Wegziehen der Pfote nach 18,8
±1,2 sec. (rechte, nicht operierte Pfote 16,6 ±1,2 sec.). Bei der Kontrollgruppe wurde nach 10,3 ±0,2 sec. die linke Pfote, und nach 11,3 ± 0,6 sec. die rechte Pfote weggezogen (p ≤ 0,01. n= 6).
Die thermale Latenzzeit bis zum Wegziehen der Pfote bei den 1% Lidocaintieren kehrte an der linken Pfote nach 50 Minuten, an der rechten Pfote nach 20 Minuten auf den Ausgangswert vor der intravenösen Infusion zurück (Abbildung 1-8).
Die zusätzliche Gabe von D-Serin (100µg/ Ratte) reduzierte an der linken Pfote die Lidocain-vermittelte Antinozizeption nach fünf Minuten ab der 1% Lidocaininfusion.
An der rechten Pfote konnte trotz D-Serin kein signifikanter Unterschied im Schmerzempfinden festgestellt werden (13,3 ±0,9 sec. vs. 18,8 ±1,2 sec. an der linken Pfote und 13,5 ≤0,6 sec. vs. 16,6 ±1,2 sec. an der rechten Pfote, 1% Lidocain plus D-Serin vs. 1% Lidocain allein, p≤ 0,05 und nicht signifikant, n=6). An beiden Hintergliedmaßen war der Effekt von D-Serin nur geringfügig zu erkennen. Die Latenzzeit zehn Minuten nach Beginn der 1% Lidocaininfusion lag bei 12,9 ±1 sec.
(linkes Bein) und 11,9 ±0,4 sec. (rechtes Bein) bei Tieren, die D-Serin plus 1%
Lidocain bekamen. Bei Tieren, die nur 1% Lidocain erhielten war links eine Latenzzeit von 13,8 ±0,5 sec., und rechts eine Latenzzeit von 13,4 ±0,6 sec. zu messen. Im gesamten Versuchsablauf (bis 50 Minuten nach 1% Infusionsbeginn) konnte kein signifikanter Unterschied festgestellt werden zwischen den Tieren, die einerseits D-Serin plus Lidocain, andererseits nur 1% Lidocain bekamen.
Jedoch konnte bei den Versuchen mit 2% Lidocain (10 mg/kg 1% Lidocain in drei Minuten, nach fünf Minuten Beginn der Dauerinfusion mit 360 mg/kg/Stunde, nach fünf Minuten 100µg D-Serin intrathekal) dokumentiert werden, dass die lidocain- vermittelte Antinozizeption durch D-Serin an linker und rechter Hinterpfote reduziert wurde (Abbildung 6 u. 7). Zehn Minuten nach 2% Lidocaininfusion lag die thermale Latenzzeit bei der Gruppe D-Serin plus Lidocain links bei 9,3 ±0,4 sec. und rechts bei p≤ 0,05 10,3 ±0,7 sec. Bei der Gruppe, die nur 2% Lidocain erhielt waren links Werte von 12,4 ±0,5 sec., und rechts von 13,4 ±0,4 sec. (p≤ 0,05, n=6) zu messen. D-Serin hatte weder einen pro- noch einen antinozizeptiven Effekt, wenn es allein appliziert wurde.
Bei intrathekaler Applikation von Strychnin (3 µg/ Ratte) wurde bei der 1%
Lidocaininfusion die antinozizeptive Wirkung des Lokalanästhetikums an der linken, wie rechten Pfote aufgehoben, es wirkte deutlich stärker und länger pronozizeptiv als D-Serin (Abbildung 2 und 4). Fünf Minuten nach Beginn der 1% Lidocain Infusion
