Metabolismus-Studie zur Gewinnung toxikokinetischer Daten für die Beurteilung von Stoffaufnahmewegen am Beispiel von Enrofloxacin

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baua: Bericht

toxikokinetischer Daten für die

Beurteilung von Stoffaufnahmewegen

am Beispiel von Enrofloxacin

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Forschung Projekt F 2430

S. Schuchardt J. Hohlfeld P. Badorrek K. Blümlein B. Ellinghusen M. Müller T. Hansen A. Casper S. Gerling

Metabolismus-Studie zur Gewinnung toxikokinetischer Daten für die Beurteilung von Stoffaufnahmewegen am Beispiel von Enrofloxacin

1. Auflage 2019 Dortmund/Berlin/Dresden

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Beispiel von Enrofloxacin“ im Auftrag der Bundesanstalt für Arbeitsschutz und Arbeitsmedi- zin. Die Verantwortung für den Inhalt dieser Veröffentlichung liegt bei den Autorinnen und Autoren.

Autorinnen/Autoren: Dr. rer. nat. Sven Schuchardt Prof. Dr. med. Jens Hohlfeld Dr. med. Philipp Badorrek Dr. rer. nat. Katharina Blümlein Birthe Ellinghusen

Dr. rer. nat. Meike Müller Dr. med. vet. Tanja Hansen Anja Casper

Susanne Gerling

Fraunhofer-Institut für Toxikologie und Experimentelle Medizin (ITEM)

Nikolai-Fuchs-Straße 1, 30625 Hannover Fachliche Beratung: Dr. rer. nat. Roland Paul

Bundesanstalt für Arbeitsschutz und Arbeitsmedizin Titelfoto: artisteer/iStock.com

Umschlaggestaltung: Susanne Graul

Bundesanstalt für Arbeitsschutz und Arbeitsmedizin

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Für die Richtigkeit, Vollständigkeit und Aktualität der Inhalte über- nimmt die BAuA jedoch keine Gewähr.

Nachdruck und sonstige Wiedergabe sowie Veröffentlichung, auch auszugsweise, nur mit vorheriger Zustimmung der Bundesanstalt für Arbeitsschutz und Arbeitsmedizin.

doi:10.21934/baua:bericht20190131 (online) www.baua.de/dok/8813350

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Seite

Kurzreferat 4

Abstract 5

1 Einleitung und Zielsetzung 6

2 Studienplan und Validierung 8

2.1 Studienplan 8

2.2 Validierung der Analytik 15

3 Ergebnisse 18

3.1 Klinischer Teil der Studie 18

3.2 Messergebnisse Analytik 23

3.3 Auswertungsergebnisse Toxikokinetik 35

Abkürzungsverzeichnis 39

Abbildungsverzeichnis 40

Tabellenverzeichnis 41

Anhang 43

Anhang 1 Validierungsbericht: Bestimmung von Enrofloxacin und Ciprofloxacin

in Blutplasma (human) bei LC-MS/MS 43

Anhang 2 Standardarbeitsanweisung (SAA): Bestimmung von Enrofloxacin und Ciprofloxacin in der Applikationslösung und den dermalen

Wischproben mittels LC-MS/MS 76

Anhang 3 Standardarbeitsanweisung (SAA): Bestimmung von Enrofloxacin

und Ciprofloxacin in Urin und Plasma mittels LC-MS/MS 84

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Metabolismus-Studie zur Gewinnung toxikokineti- scher Daten für die Beurteilung von Stoffaufnahme- wegen am Beispiel von Enrofloxacin

Kurzreferat

Antibiotika, wie zum Beispiel Enrofloxacin, werden in der Tierhaltung zur Bekämpfung und Vorbeugung bakterieller Infektionen eingesetzt. Verabreicht werden sie zumeist über das Futter oder das Tränkwasser. Eine Vorstudie (Federal Institute for Occupati- onal Safety and Health (BAuA) project No. 2344; Title: „Pilotprojekt zur Erfassung der Antibiotikaexposition von Beschäftigten in der Tierhaltung mit Biomonitoringmetho- den“) konnte zeigen, dass bei der Untersuchung von Arbeitern in Tiermastbetrieben signifikante Konzentrationen des eingesetzten Antibiotikums in deren Urin nachge- wiesen werden konnten.

Um die Aufnahmewege besser zu verstehen, wurden im jetzt durchgeführten For- schungsprojekt sechs gesunde männliche Probanden beispielhaft mit Enrofloxacin exponiert. Die Konzentration des Antibiotikums entsprach in etwa der Umgebungs- konzentration, die in den Tiermastbetrieben in der o. g. Vorstudie gemessen werden konnte. Es wurden drei verschiedene Expositionsszenarien getestet: dermal, oral und inhalativ. Bei jedem der drei Szenarien wurden nach der Exposition zu vorgegebenen Zeitpunkten Blut- und Urinproben gesammelt und die Konzentration von Enrofloxacin und des Hauptmetaboliten Ciprofloxacin wurde mit Hilfe der zuvor validierten Analy- senmethoden bestimmt.

Es konnte gezeigt werden, dass die unterschiedlichen Aufnahmewege jeweils mit einer charakteristischen Pharmakokinetik verbunden waren, deren Interpretation an anderer Stelle erfolgen muss.

Aufgrund der vorliegenden Ergebnisse kann diese Studie die Grundlage bilden, um nach Antibiotikaanwendung in Tiermastbetrieben die Expositionsbelastung von Be- schäftigten besser zu beurteilen und Wege zu entwickeln, um die Antibiotikaexpositi- on in den Ställen zu minimieren.

Schlagwörter:

Humanexposition, Antibiotikabelastung in der Tierhaltung, Enrofloxacin, Ciprofloxacin, Biomonitoring, Toxikokinetik

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Can toxicokinetic data be used for the assessment of routes of uptake in occupational environments? – Case study with enrofloxacin

Abstract

Antibiotics like enrofloxacin are widely used in animal farming to treat and prevent bacterial infections. They are administered for example via food and water. A previous study (Federal Institute for Occupational Safety and Health (BAuA) project No. 2344;

Title: “Pilotprojekt zur Erfassung der Antibiotikaexposition von Beschäftigten in der Tierhaltung mit Biomonitoringmethoden”) in poultry farms has shown that yardmen show significant concentrations of administered antibiotics in their urine. It is currently unclear how poultry yardmen are exposed to the administered antibiotics. It could be via the oral, inhaled or even dermal route.

To investigate the route of administration further, in the current research project, car- ried out at Fraunhofer ITEM, 6 study subjects were exposed to enrofloxacin at a con- centration level representative for occupational exposure of yardmen at poultry farms.

As three uptake-routes (dermal, inhalation and oral) have been identified to be con- ceivable all three cases were investigated. After each administration blood and urine samples have been analysed by validated methods for enrofloxacin and its main me- tabolite ciprofloxacin at several time points. The objective of this exemplary study was to obtain information on the pharmacokinetics of the different uptake routes. In this study it was shown, that different exposure routes are characterized by different pharmacokinetics, whose interpretation have to be made elsewhere.

The conclusion is, that such studies could be used to obtain a better understanding of general routes of exposure in occupational environments. On the basis of the results mitigation strategies could be developed, reducing the risk of exposure.

Key words:

human exposure, occupational exposure to antibiotics in animal husbandries, enrofloxacin, ciprofloxacin, biomonitoring, toxicokinetics

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1 Einleitung und Zielsetzung

Antibiotika sind in der Tiermast weit verbreitet, um bakterielle Infektionen zu bekämp- fen und diesen vorzubeugen.

Der zunehmende Einsatz von Antibiotika in der Tierhaltung und Veterinärmedizin hat dazu geführt, dass auch die Belastung der Beschäftigten in diesem Umfeld als kritisch betrachtet werden muss. Das betrifft einerseits die Aufnahme der Antibiotika über den inhalativen, dermalen oder ggf. oralen Pfad, die zu einem vermehrten Auftreten von antibiotikaresistenten Keimen bei den Betroffenen führen kann. Andererseits betrifft dies auch die Aufnahme antibiotikaresistenter Bakterien selbst, die über den Stall- staub eingeatmet werden.

Was die Aufnahme der Antibiotika durch die Beschäftigung in der Tierhaltung betrifft, so fehlen gegenwärtig Informationen, um die Expositionsbelastung und die möglichen Aufnahmepfade sicher abschätzen zu können. Auch die Metaboliten der Wirkstoffe können ggf. noch antibiotisches Potential aufweisen und zur Problematik beitragen.

Aus diesem Grunde wurden in dieser klinischen Studie beispielhaft für das Antibioti- kum Enrofloxacin (ein Fluorchinolon, welches in der Tiermast weit verbreitet ist) toxi- kokinetische Messdaten aus Humanexpositionen generiert, um eine mögliche ge- sundheitliche Gefährdung für den Menschen durch Antibiotika und deren Metaboliten erkennen zu können.

Für das Antibiotikum Enrofloxacin und den zugehörigen Metaboliten Ciprofloxacin wurden in diesem Forschungsvorhaben bei sechs gesunden Männern die Eliminati- onskinetiken bei dermaler, inhalativer und oraler Aufnahme ermittelt. Die eingesetzte Dosis wurde in Anlehnung an die im oben genannten BAuA-Projekt F 2344 gemessenen Luftkonzentrationen gewählt und lag im subtherapeutischen Bereich (250 µg En- rofloxacin pro Applikationsart).

Ziel dieser jetzigen klinischen Studie war es, die Antibiotika-Belastung von in land- wirtschaftlichen Betrieben potenziell exponierten Beschäftigten zu untersuchen. Die Ergebnisse sollten dazu dienen, die Expositionsbelastungen besser beurteilen zu können und mögliche Gefährdungen zu erkennen. Empfehlungen zu geeigneten Schutzmaßnahmen sollten auf eine bessere Datenbasis gestellt werden.

Das Gesamtprojekt wurde in 4 Arbeitsphasen und zugehörige Arbeitspakete unter- teilt, welche graphisch in Abb. 1.1 dargestellt und im Einzelnen im Hauptteil dieses Berichts vorgestellt und beschrieben werden.

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Abb. 1.1 Übersicht über die Projektphasen

bericht

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2 Studienplan und Validierung

2.1 Studienplan

2.1.1 Studiendesign, Population und Studienmedikation

An dieser Studie haben sechs gesunde männliche Probanden teilgenommen.

2.1.1.1 Einschlusskriterien

• Männer im Alter von 18 bis 55 Jahren

• Freiwillige, die im Ermessen des Prüfarztes gesund waren (unter der Beurtei- lung von Anamnese, körperlicher Untersuchung, Laborergebnissen, EKG, Vitalzeichen und Lungenfunktion)

• Normale Lungenfunktion (FEV1 ≥ 80 % of predicted, FEV1/FVC ≥ 70 %) am Screening-Tag

• Nichtraucher (seit mindestens einem Jahr), nicht mehr als 5 PY in der Vorge- schichte

[PY = (Anzahl der Zigaretten pro Tag/20) x Anzahl an gerauchten Jahren]

• Körpergewicht: ≥ 50 kg, BMI: 20,0 bis 24,9 kg/m²

• Größe: 170 bis 195 cm 2.1.1.2 Ausschlusskriterien

• Signifikante Vorgeschichte oder aktuelle Anzeichen für kardiovaskuläre, respi- ratorische (z. B. Asthma, COPD (chronic obstructive pulmonary disease), Bronchiektasien, aktive Tuberkulose), hepatische, renale, gastrointestinale, endokrine, hämatologische, autoimmune oder neurologische Erkrankungen

• Hautläsionen im Bereich des Unterarms, der für die dermale Applikation ge- nutzt wurde (z. B. Dermographismus, Dermatitis oder Ekzeme)

• Einnahme von Begleitmedikation (hierbei eingeschlossen auch Vitaminpräpa- rate, Naturheilmittel und Nahrungsergänzungsmittel), die nach Ermessen des Prüfarztes einen Einfluss auf die Studienprozeduren hatte oder die Sicherheit des Studienteilnehmers beeinträchtigte

• Vorgeschichte einer allergischen Reaktion auf Enrofloxacin, Ciprofloxacin oder andere Fluorchinolone sowie weitere Medikamentenallergien oder andere Allergien, die nach Ermessen des Prüfarztes gegen eine Studienteilnahme sprachen

• Teilnahme an einer klinischen Prüfung mit Medikamententestung im Zeitraum von 30 Tagen (oder 5 Halbwertszeiten des getesteten Medikaments) vor der Studie

• Regelmäßiger Drogenmissbrauch oder positiver Drogentest am Screening- Tag, positiver Cotinintest (Nachweis auf Nikotinabbauprodukte) am Screening-

• Regelmäßiger Alkoholkonsum von mehr als 21 Units (Männer) bzw. 14 Units Tag (Frauen) pro Woche über einen Zeitraum von 6 Monaten.

Eine Unit entspricht 8 g Alkohol.

• Unterer oder oberer Atemwegsinfekt 4 Wochen vor dem Screening-Tag

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2.1.1.3 Studiendesign

Die Studie wurde monozentrisch am Fraunhofer ITEM durchgeführt. Es handelte sich um ein nicht-verblindetes Cross-over-Design. Jeder Studienteilnehmer hat in einem festgelegten Abstand alle drei Applikationsarten (dermal, inhalativ, oral) durchlaufen.

Ein Einschluss der Probanden, mit Vergabe einer fortlaufenden Probandennummer (beginnend mit 101) zur Kennzeichnung der Proben, erfolgte an Visite 2. Am Scree- ning-Tag (Visite 1) erhielten alle Teilnehmer eine Run-in-Nummer. Screening failures nach Visite 1 wurden ersetzt.

Die Übersicht über den Ablauf der Studie ist in der Tab. 2.1 (Prozedurenplan) dargestellt. Der Prozedurenplan beschreibt die einzelnen Visiten. Eine genaue Beschrei- bung der Abläufe folgt im anschließenden Abschnitt.

Tab. 2.1 Prozedurenplan

Prozeduren

Screening Behandlungstage Follow-up-

Anruf Visite 1 Visite 2 Visite 3 Visite 4

Bis 28 Tage vor Visite 2

Mindestens 7 Tage nach Visite 2

Mindestens 7 Tage nach Visite 3

3–7 Tage nach Visite 4 Aufklärung und

Einverständnis X

Demographische Daten X

Krankengeschichte X

Körperliche Untersuchung X X

Größe, Gewicht X

Blutdruck, Puls, Temperatur⁴ X X X X

EKG X

Lungenfunktion X

Uringewinnung/Blutentnahme für das Sicherheitslabor X Urin Drogen- und Cotinintest X Blutentnahmen für

Pharmakokinetik¹ X X X

Sammelurin für

Pharmakokinetik² X X X

Dermale Dosierung von

250 µg Enrofloxacin X

Inhalative Dosierung von 250 µg Enrofloxacin mittels

Ultraschallvernebelung X

Orale Dosierung von 250 µg

Enrofloxacin X

Aktivkohleblock vor

inhalativer Dosierung³ X

Erkundigung nach

Beschwerden und Verände- rungen der Krankengeschich- te und Begleitmedikation

X X X X

1 PK-Blutproben zu den Zeitpunkten pre-dosing und 5, 10, 15, 20, 30, 45 Minuten sowie 1, 1,5, 2, 3, 4, 6, 8, 12, 24 Stunden post-dosing

2PK-Proben aus Sammelurin in den Zeiträumen pre-dosing, 0–4, 4–8, 8–12, 12–24 Stunden

3Gastrointestinaler Aktivkohleblock, um eine orale Aufnahme des inhalativ applizierten Enrofloxacins zu verhindern

4 An Visite 2, 3 und 4 vor Dosierung

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2.1.1.4 Restriktionen

Alle Probanden wurden an der Screening-Visite darauf hingewiesen, dass sie 24 Stunden vor jeder Visite keinen Alkohol trinken dürfen und keinen anstrengenden Tätigkeiten nachgehen sollen. An allen Visiten sollten die Probanden ein leichtes Frühstück zu sich nehmen. Während der Visiten erhielten die Probanden ein norma- les Mittag- und Abendessen im Studienzentrum.

Alle Probanden wurden angewiesen, während der Studienvisiten mindestens 1,5 Liter Wasser verteilt auf 24 Stunden zu trinken, aber nicht mehr als 3 Liter. Eine Restriktion bezüglich der Trinkmenge, den Zeitraum vor den Visiten betreffend, gab es nicht.

Auch bezüglich bestimmter Nahrungsmittel gab es keine vorgegebenen Einschrän- kungen.

2.1.1.5 Sammlung von Blut-PK-Proben

Zu spezifischen Zeitpunkten (siehe Prozedurenplan) wurden Blutproben von den Pro- banden gewonnen, um pharmakokinetische Untersuchungen (PK-Proben) durchzu- führen. Hierfür wurde zu jedem Zeitpunkt jeweils ein etikettiertes 7,5-mL-K3^-EDTA- Röhrchen gefüllt, anschließend langsam gedreht und im Anschluss bei 4 °C und 2000 G für 15 Minuten zentrifugiert. Die Zentrifugation und anschließendes Abpipet- tieren sowie die Lagerung auf Trockeneis erfolgte bis spätestens 1 Stunde nach Ab- nahme der Proben.

Das so gewonnene Plasma wurde dann bei ca. −75 °C oder auf Trockeneis gelagert.

2.1.1.6 Sammelurin

Auch die Sammlung des Urins erfolgte zu vorgegebenen Zeitpunkten. Die Pre-Probe (vor der Applikation des Enrofloxacins) wurde als erstes gewonnen. Die Pre-Probe wurde in einem Standardurinbecher (Fassungsvermögen maximal 100 mL) gesammelt. Direkt vor der Applikation wurde der Proband gebeten seine Blase vollständig zu entleeren. Nun folgte die Sammlung des gesamten Urins in 3-L-Sammelbehältern über definierte Sammelzeiträume hinweg (0–4 h, 4–8 h, 8–12 h, 12–24 h). Auch die Sammelbehälter wurden etikettiert. Während des Tages und bis zum Zeitpunkt 12 h nach der Applikation wurde der Urin in Kühlboxen, die Kühlakkus enthielten, gelagert.

Im Anschluss erfolgte die endgültige Lagerung bei −20 °C.

2.1.1.7 Visite 1 (Screening-Tag)

An Visite 1 wurde nach ausführlicher Aufklärung von allen Studienteilnehmern die Einwilligungserklärung unterschrieben. Es folgte die Erfassung der medizinischen Vorgeschichte sowie demographischer Daten. Nach einer körperlichen Untersuchung und der Ermittlung von Größe und Gewicht wurden die Vitalzeichen (Blutdruck, Puls, Körpertemperatur) gemessen und es wurde ein EKG geschrieben sowie eine Lungen- funktionsmessung (Spirometrie) durchgeführt. Es folgte die Abnahme von Blut- und Urinproben für Sicherheitslaboruntersuchungen sowie ein Drogen- und Cotinintest im Urin. Die Probanden wurden auf die einzuhaltenden Restriktionen hingewiesen. Nach Vorliegen aller Ergebnisse konnten die Probanden in die Studie eingeschlossen werden.

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2.1.1.8 Visite 2 (dermale Applikation)

Nach Abfragen von Befindlichkeit sowie Messung der Vitalparameter erfolgte die Vergabe der Patientennummer (aufsteigend von 101 bis 106) zur Identifikation der Proben. Dann folgte die Abnahme der Blut- und Urinproben für die pharmakokineti- schen Untersuchungen vor dem Applizieren der Enrofloxacin-Lösung zu festgelegten Zeitpunkten wie im Prozedurenplan dargestellt. Der Urin vor Applikation wurde in einem Standardurinbecher (Füllmenge maximal 100 mL) gesammelt.

Für die Visite 2 (und auch Visite 3 und 4) wurden die Teilnehmer angewiesen, mindestens 1,5 Liter Wasser und nicht mehr als 3 Liter Wasser zu trinken bis zum Zeit- punkt 24 Stunden post applicationem und die Trinkmenge auf einem Formblatt zu dokumentieren. Abweichungen wurden auf diesem Formblatt erfasst und bei Abwei- chungen wurden die Probanden erneut auf die Begrenzung der Trinkmenge auf mindestens 1,5 Liter und möglichst nicht mehr als 3 Liter hingewiesen. Der Wassergehalt fester Nahrungsmittel wurde nicht erfasst und nicht berücksichtigt bei der Obergrenze der erlaubten Trinkmenge und ging nicht in die Betrachtung der Wasserbilanz ein. Die Blase sollte direkt vor der Applikation des Enrofloxacins noch einmal komplett entleert und der Urin verworfen werden.

Für die dermale Applikation wurden 0,5 mL Enrofloxacin in wässriger Lösung mit einer Konzentration von 500 µg/mL auf einer Fläche von 20 cm² auf einem Unterarm der Probanden verteilt und für 30 Minuten dort belassen. Um eine gleichmäßige Ver- teilung zu erreichen, wurde für die Auftragung ein 2 x 10 cm großer Gazestreifen auf die Haut aufgelegt und das Enrofloxacin nach einem vorher ausgetesteten Pipettier- Schema mit einer Eppendorfpipette (Multipette E3) in 50x10-µL-Tropfen aufgetragen (Abb. 2.1).

Nach der Einwirkzeit von 30 Minuten wurde das Mull-Material mit einer Pinzette von der Haut entfernt und in einen 100-mL-Erlenmeyerkolben überführt. Im Anschluss wurde die behandelte Haut mit feuchten (400 µL Wasser je Zellette) Zelletten (2 x 5 cm) abgewischt, um etwaige Wirkstoff-Rückstände von der Haut zu entfernen.

Insgesamt wurde die behandelte Haut 3x mit je einer Zellette abgewischt. Mull- Material und Zelletten-Tupfer wurden je Proband in mit Stopfen verschlossenen 100- mL-Erlenmeyerkolben aufbewahrt und analysiert.

Die weitere PK-Probennahme erfolgte ebenfalls wie im Prozedurenplan dargestellt.

Die Urinmenge wurde zu den spezifischen Zeitpunkten erfasst und auf einem Form- blatt dokumentiert.

12 Stunden nach der letzten PK-Probennahme wurden die Studienteilnehmer entlas- sen und angewiesen, ihren Urin auch zuhause bis zum Zeitpunkt 24 Stunden post applicationem weiter zu sammeln und sich möglichst an die vorgegebene Trinkmenge zu halten. Am nächsten Morgen wurden die Urinproben eingesammelt und die letzte PK-Blutentnahme erfolgte zum Zeitpunkt 24 Stunden post applicationem.

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Abb. 2.1 Dermale Applikation in der Praxis (Nachstellung mit Lebensmittelfarbe).

Oben: Pipettier-Schema für die dermale Applikation; Mitte: 5 min nach der Applikation über Mull-Material. Unten: Haut nach 30 min Applikationsdauer 2.1.1.9 Visite 3 (inhalative Applikation)

Wie an Visite 2 erfolgten zunächst die Messung der Vitalparameter und das Befragen des Befindens. Auch der Ablauf der Blut- und Urinentnahmeprozeduren sowie das Dokumentieren von Trink- und Urinmengen für die Analyse der PK-Proben entspra- chen dem Vorgehen bei Visite 2.

15 Minuten vor Beginn der Inhalation der Enrofloxacin-Lösung tranken alle Stu- dienteilnehmer 400 mL Ultracarbone-Lösung. Hierbei handelte es sich um eine medizinische Aktivkohlelösung, die die Aufnahme von Enrofloxacin über den oralen Weg verhindern sollte. Die Ultracarbone-Lösung wurde zu der erfassten Trinkmenge bei allen Probanden addiert, aber nicht auf die maximal erlaubte Trinkmenge angerechnet.

Die Inhalation des Enrofloxacins erfolgte mit Hilfe des Pariboys, einer mechanischen Inhalationshilfe, die mit Hilfe von Druckluft Flüssigkeiten in Tröpfchenform vernebelt.

5 mL wässrige Enrofloxacin-Lösung mit einer Konzentration von 50 µg/mL wurden inhaliert. Start- und Stoppzeit der Inhalation wurden dokumentiert, da die Dauer der Inhalation unter anderem vom Atemzugvolumen der Probanden abhängig war. Der weitere Ablauf des Tages entsprach der Visite 2.

2.1.1.10 Visite 4 (orale Applikation)

An Visite 4 wurden die Teilnehmer aufgefordert, 20 mL wässrige Enrofloxacin-Lösung mit einer Konzentration von 12,5 µg/mL zu trinken und anschließend 250 mL Wasser zu trinken, um Reste der Lösung aus der Mundhöhle und dem Speiseröhrentrakt zu

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entfernen. Der weitere Ablauf des Tages entsprach bis zum Zeitpunkt 12 Stunden post applicationem der Visite 2 und 3 (mit Ausnahme der Ultracarbone-Gabe).

24 Stunden post applicationem erfolgte die letzte Blutentnahme in dieser Studie, die Probanden wurden körperlich untersucht und konnten anschließend das Haus verlas- sen.

2.1.1.11 Visite 5 (Follow-up-Telefonanruf)

Visite 5 diente der Abfrage nach dem Befinden. Anschließend war die Studie been- det.

2.1.1.12 Studienmedikation: Enrofloxacin

Bei dem eingesetzten Enrofloxacin handelte es sich um „Baytril® 100 mg/mL Lösung zum Eingeben für Hühner, Puten und Kaninchen“. Die Lagerung erfolgte nach Anga- be des Herstellers in einem nur für Studienpersonal zugänglichen Prüfpräparateraum.

Die Lösung wurde tagesfrisch für jede einzelne Visite nach einem festgelegten Pipet- tierschema verdünnt, um die Konzentrationen für die drei unterschiedlichen Applikati- onsarten zu erhalten (dermal: 0,5 mL mit einer Konzentration von 500 µg/mL; inhalativ: 5 mL mit einer Konzentration von 50 µg/mL; oral: 20 mL mit einer Konzentration 12,5 µg/mL). Die Verdünnung erfolgte im Vier-Augen-Prinzip unter sterilen Bedingun- gen durch Mitarbeiter der Abteilung Biomarkeranalytik und -entwicklung. Direkt nach dem Ansatz wurden die Lösungen verwendet, eine Rückstellprobe wurde jeweils zur späteren Analytik aufbewahrt.

2.1.1.13 Aktivkohleblock

An Visite 3 (inhalative Applikation) sollten die Probanden nach Prüfplan 400 mL Ak- tivkohlelösung und anschließend 250 mL klares Wasser trinken, um Rückstände aus Mundhöhle und Speiseröhrentrakt zu entfernen. Bei der Aktivkohle wurde das Pro- dukt „Ultracarbon®“ eingesetzt. 50 g Kohle wurden mit 400 mL Trinkwasser gelöst und dem Probanden direkt nach Ansatz zum Trinken gegeben. Die Lagerung erfolgte nach Angabe des Herstellers in einem nur für Studienpersonal zugänglichen Prüfprä- parateraum.

2.1.1.14 Begleitmedikation

Während der gesamten Studie war nur Paracetamol als mildes Analgetikum bei Schmerzen erlaubt. Weitere Medikamente waren nur nach Rücksprache mit dem Studienarzt erlaubt und mussten dokumentiert werden.

2.1.2 Studienprozeduren

2.1.2.1 Sicherheits- und Screeninguntersuchungen

Alle Untersuchungen wurden von qualifiziertem und geschultem Personal am Fraun- hofer ITEM durchgeführt.

Vitalzeichen, Größe/Gewicht, medizinische Vorgeschichte und körperliche Untersu- chung:

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Blutdruck und Herzfrequenz wurden in sitzender Position am linken Arm gemessen, nach spezifischer SOP des Studienzentrums. Auch die anderen genannten Untersu- chungen wurden nach spezifischen SOPs des Studienzentrums durchgeführt.

Spirometrie:

Eine komplette Spirometrie wurde nach den aktuellen ATS/ERS-Vorgaben am Scree- ning-Tag durchgeführt nach spezifischer SOP des Studienzentrums. Als Referenz- werte wurden die Normalwerte nach der Global Lung Initiative (GLI, Quanjer 2012) verwendet.

Elektrokardiogramm:

Ein EKG wurde nach spezifischer SOP des Studienzentrums am Screening-Tag durchgeführt.

Urin-Drogen- und Cotinintest:

Urin-Drogen- und Cotinintest wurden nach spezifischer SOP des Studienzentrums am Screening-Tag durchgeführt.

Blutentnahme für Sicherheitslabor:

Am Screening-Tag wurde eine Blutentnahme nach spezifischer SOP des Studien- zentrums durchgeführt und das Ergebnis wurde von einem Studienarzt befundet.

Folgende in Tab. 2.2 dargestellte Parameter wurden untersucht:

Tab. 2.2 Parameter Sicherheitslabor

Hämatologie Hämoglobin, Hämatokrit, Erythrozyten, MCV, MCH, Leukozyten, Differen- tialblutbild, Thrombozyten

Klinische Chemie Gesamtbilirubin, Alkalische Phosphatase, ALT, AST, γ-GT, LDH, Harnstoff, Kreatinin, Glukose, Gesamtprotein, Kalium, Natrium

Urinuntersuchung Teststreifen: spezifisches Gewicht, Leukozyten, Nitrit, pH, Protein, Glukose, Ketone, Urobilinogen, Bilirubin, Blut, Hämoglobin

Mikroskopie, wenn Teststreifen positive ist für Leukozyten, Nitrit, Protein oder Blut

Serologie HIV-I- und HIV-II-Antikörper, HBsAg und HCV-Ab

2.1.2.2 Unerwünschtes Ereignis (Adverse event)

Ein unerwünschtes Ereignis (AE) ist definiert als jedes unerwünschte medizinische Ereignis, einschließlich einer Exazerbation einer bereits bestehenden Erkrankung, bei einem Patienten, der an einer klinischen Untersuchung teilnimmt und ein pharmazeutisches Produkt erhalten hat. Das Ereignis muss nicht unbedingt in einem kausalen Zusammenhang mit dieser Behandlung stehen.

Ein schwerwiegendes unerwünschtes Ereignis (SAE) ist definiert als jedes uner- wünschte Ereignis, das zum Tod führt, lebensbedrohlich ist, einen Krankenhausauf- enthalt oder eine Verlängerung der bestehenden Hospitalisation erfordert, zu einer anhaltenden oder erheblichen Behinderung oder Unfähigkeit führt oder eine angebo- rene Anomalie oder einen Geburtsfehler darstellt.

Eine unerwünschte Arzneimittelwirkung (ADR) ist definiert als Reaktion auf ein pharmazeutisches Produkt, die schädlich und unbeabsichtigt ist und die bei Dosen auftritt, die normalerweise beim Menschen zur Prophylaxe, Diagnose oder Therapie von Krankheiten oder zur Veränderung der physiologischen Funktion verwendet werden.

Der Ausdruck "Reaktion auf ein pharmazeutisches Produkt" bedeutet, dass ein kau-

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saler Zusammenhang zwischen dem Medikament und einem unerwünschten Ereignis zumindest eine annehmbare Möglichkeit ist.

Eine vermutete unerwartete schwere Nebenwirkung (SUSAR) ist eine Nebenwirkung, deren Art oder Schwere nicht mit den geltenden Produktinformationen vereinbar ist (z. B. Prüferinformation für ein nicht zugelassenes Prüfpräparat oder Packungsbeila- ge/Zusammenfassung der Produkteigenschaften für ein zugelassenes Produkt).

Alle unerwünschten Ereignisse, schwerwiegende und nicht-schwerwiegende, wurden vollständig dokumentiert und gemäß studienzentrumsspezifischer SOP verwaltet. Für jedes unerwünschte Ereignis wurden der Beginn, die Dauer, die Intensität, die erfor- derliche Behandlung und das Ergebnis berichtet.

Befragungen zu unerwünschten Ereignissen fanden bei jedem Besuch vor der Durch- führung der Prozeduren und auch vor der Entlassung aus dem Studienzentrum statt.

Die Probanden sollten AEs zu jedem Zeitpunkt des Auftretens oder einer Änderung des AEs melden. Das Follow-up der laufenden AEs wurde bis zur Auflösung beibe- halten oder angemessen charakterisiert.

Alle Probanden erhielten eine Notfall-Kontakttelefonnummer zu einem Studienarzt, der 24 Stunden am Tag erreichbar war.

2.2 Validierung der Analytik

2.2.1 Zielsetzung

Im Rahmen des Projekts „Metabolismus-Studie zur Gewinnung toxikokinetischer Da- ten für die Beurteilung von Stoffaufnahmewegen am Beispiel von Enrofloxacin“ wurde eine für Urin schon validierte Multi-Analyt-Methode zur Bestimmung der Antibiotika Enrofloxacin sowie dessen Hauptmetaboliten Ciprofloxacin mittels LC-MS/MS in Urin und Blut aufgesetzt.

2.2.2 Ergebnisse Validierung Urin

Die Validierung der Methoden zur Bestimmung von Enrofloxacin und Ciprofloxacin wurde schon im Rahmen des BAuA-Projekts „Pilotprojekt zur Erfassung der Antibio- tikaexposition von Beschäftigten in der Tierhaltung mit Biomonitoringmethoden – Validierung der Antibiotika-Analytik“ durchgeführt. Die dort validierte Methode kommt hier auf den gleichen Geräten zur erneuten Anwendung. Die Bestimmungsgrenze (BG) wurde aktuell mit 100 ng/L Urin bestimmt. Es wird daher auf den zugehörigen Validierungsbericht Seite 188 verwiesen.

2.2.3 Ergebnisse Validierung Blut (Plasma)

Die für Urin-Matrix aufgesetzte und validierte LC-MS/MS-Methode wurde auf An- wendbarkeit für humane Blutplasma-Proben getestet, entsprechend adaptiert und im Anschluss validiert. Die Validierung wurde in Anlehnung an die Richtlinie für die Vali- dierung bioanalytischer Methoden der Europäischen Arzneimittelagentur (engl. Euro- pean Medicine Agency, EMA) durchgeführt. Vorgehensweise sowie die Validierungs- ergebnisse sind im Validierungsbericht detailliert dargestellt (Anhang 1). Die Ergeb- nisse der Validierung sind für Enrofloxacin in Tab. 2.3 aufgeführt und für Ciprofloxacin in Tab. 2.4.

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Tab. 2.3 Enrofloxacin: Validierungsparamater und Ergebnisse Theoretische Bestimmungsgrenze (BG):

(in Signal-Rauschverhältnis)¹ 0,04 ng/mL bzw. 0,08 ng/2 mL Plasma (bezogen auf den Quantifier)

Praktische Bestimmungsgrenze:

(kleinster Kalibrierstandard) 0,25 ng/mL bzw. 0,5 ng/2 mL (bezogen auf den Quantifier)

Wiederfindung: Entfällt, da alle Standards wie die Proben aufgearbeitet wurden

Richtigkeit (in Serie): 0,5 ng/mL Plasma: 95,2–109 % 7,5 ng/mL/Plasma: 91,2–106 % 15 ng/mL Plasma: 103–106 %

(n = 5 je Konzentrationsstufe pro Tag;

an 4 Tagen ermittelt)

Präzision (in Serie): 0,5 ng/mL Plasma: 11,4–15,8 % 7,5 ng/mL/Plasma: 4,6–12,8 % 15 ng/mL Plasma: 2,1– 5,5 %

Richtigkeit (Tag-zu-Tag): 100 bis 105 % im Konzentrationsbereich von 0,5–15 ng/mL (n = 59 über 4 Tage) Präzision (Tag-zu-Tag): relative Standardabweichung zwischen

4 und 14 % im Konzentrationsbereich von 0,5–15 ng/mL (n = 59 über 4 Tage) Präzision des LC-MS/MS Systems: relative Standardabweichung zwischen

1,6 und 1,8 % im Konzentrationsbereich von 0,5–15 ng/mL (n = 6)

Stabilität im Extrakt bei −20°C: Mindestens 31 Tage Stabilität in der Matrix bei −80°C: Mindestens 28 Tage

1 𝐵𝐵𝐵𝐵 =^𝑥𝑥_𝑥𝑥^𝐵𝐵

𝑘𝑘∙ 𝑦𝑦𝑘𝑘; xB – Grundrauschen + 10x STABW; xk – Analyt-Signalhöhe im kleinsten Kalibrierstan- dard; yk – Analytkonzentration des kleinsten Kalibrierstandards

(18)

Tab. 2.4 Ciprofloxacin: Validierungsparamater und Ergebnisse Theoretische Bestimmungsgrenze (BG):

(in Signal-Rauschverhältnis)² 0,2 ng/mL bzw. 0,4 ng/2 mL Plasma (bezogen auf den Quantifier)

Praktische Bestimmungsgrenze:

(kleinster Kalibrierstandard) 0,25 ng/mL bzw. 0,5 ng/2 mL (bezogen auf den Quantifier)

Wiederfindung: Entfällt, da alle Standards wie die Proben aufgearbeitet wurden

Richtigkeit (in Serie): 0,5 ng/mL Plasma: 92,2–112 % 7,5 ng/mL/Plasma: 92,0–113 % 15 ng/mL Plasma: 102–116 %

Präzision (in Serie): 0,5 ng/mL Plasma: 5,9–13,0 % 7,5 ng/mL/Plasma: 2,7–11,6 % 15 ng/mL Plasma: 1,0–4,2 %

Richtigkeit (Tag-zu-Tag): 103 bis 111 % im Konzentrationsbereich von 0,5–15 ng/mL (n = 59 über 4 Tage) Präzision (Tag-zu-Tag): relative Standardabweichung zwischen

5 und 13 % im Konzentrationsbereich von 0,5–15 ng/mL (n = 59 über 4 Tage) Präzision des LC-MS/MS Systems: relative Standardabweichung zwischen

1,1 und 2 % im Konzentrationsbereich von 0,5–15 ng/mL (n = 6)

Stabilität im Extrakt bei −20°C: Mindestens 31 Tage Stabilität in der Matrix bei −80°C: Mindestens 28 Tage

2 𝐵𝐵𝐵𝐵 =^𝑥𝑥_𝑥𝑥^𝐵𝐵

𝑘𝑘∙ 𝑦𝑦𝑘𝑘; xB – Grundrauschen + 10x STABW; xk – Analyt-Signalhöhe im kleinsten Kalibrierstan- dard; yk – Analytkonzentration des kleinsten Kalibrierstandards

(19)

3 Ergebnisse

3.1 Klinischer Teil der Studie

3.1.1 Probandendemographics

In die Studie wurden 6 Probanden eingeschlossen. Alle Probanden haben die Ein- schlusskriterien erfüllt, die Ausschlusskriterien nicht erfüllt und die Studie bis zum En- de durchlaufen. 2 der 6 Probanden haben sich teilweise nicht an die vorgegebene Menge der maximal erlaubten 3 Liter Wasser in 24 Stunden gehalten. Die Probanden wurden entsprechend nachgeschult und die Abweichungen wurden dokumentiert.

Zwei Probanden erlitten ein unerwünschtes Ereignis. In Tab. 3.1 sind die Probanden- demographics an der Screening-Visite (Visite 1) zusammengefasst. Alle Probanden haben die Einschlusskriterien bezüglich Alter, Gewicht, Größe, und BMI erfüllt.

Tab. 3.1 Probandendemographics Visite 1

Variable Alter [Jahre]

Mittelwert ±SD Min–Max Median N

33 [14,2]

19–51 27 6 Körpergewicht [kg]

77,5 [6,9]

69–89 77 6 Körpergröße [cm]

187 [4,4]

183–195 188 6 BMI [kg/m²]

22 [1,0]

20,6-23,4 22,2 6

In der nachfolgenden Tab. 3.2 sind die Durchschnittswerte der Vitalparameter (systolischer und diastolischer Blutdruck, Herzfrequenz, Körpertemperatur) sowie der Lun- genfunktionsparameter FEV1 und FEV1/FVC und der durchschnittliche Blut- Kreatininwert im Blut aller 6 Probanden am Screening-Tag (Visite 1) aufgeführt. Der Kreatininwert im Blut lag bei allen Patienten im Normalbereich. Alle Probanden hatten eine normale Lungenfunktion. Fünf von sechs Probanden hatten eine Herzfrequenz von unter 60 Schlägen pro Minute. Da es sich um junge, gesunde, sportliche Proban- den handelte, wurden diese Werte als klinisch nicht signifikant bewertet. Der Blut- druck war bei allen Probanden normwertig.

(20)

Tab. 3.2 Durchschnittswerte Vitalzeichen, Lungenfunktionsdaten und Kreatininwerte an Visite 1 (Probanden 1–6)

Variable

Systolischer Blutdruck [mmHg]

123 [10,6]

110–136 123 6 Diastolischer Blutdruck [mmHg]

Mittelwert ±SD Min–Max Median n

70 [8,6]

59–80 71 6

Herzfrequenz [BPM]

52,3 [5,4]

45–60 51,5 Körpertemperatur [°C] 6

36,3 [0,7]

35,4–37,3 36,3 FEV1 [L] 6

4,90 [0,8]

3,89–6,07 4,96 FEV1 [L] % (B/S) 6

100,1 [11,2]

84,4–110,1 103,5 FEV1/FVC % 6

81,6 [5,4]

74,2–89,6 81,9 Kreatinin [mg/dl] 6

0,82 [0,09]

0,67–0,95 0,82 6

Abweichungen der am Screening-Tag erfassten weiteren Laborparameter (Blutunter- suchung und Urinuntersuchung) waren bei keinem Probanden klinisch signifikant. Die durchgeführten Drogen- und Cotininteste waren negativ, alle EKG-Befunde unauffällig ebenso wie die körperliche Untersuchung.

3.1.2 Begleitmedikation

Keiner der Probanden hat während der Studienteilnahme nicht-erlaubte Begleitmedi- kation eingenommen.

(21)

3.1.3 Behandlungs-Compliance

Die Behandlungs-Compliance betrug 100 %. Alle Applikationen (dermal, inhalativ, oral) des Enrofloxacins wurden unter Aufsicht des Studienpersonals durchgeführt und die jeweils vorgeschriebene Methode wurde eingehalten.

3.1.4 Trink- und Urinmenge an Studienvisite 2, 3 und 4

In Tab. 3.3 sind für jeden Probanden (bezeichnet mit der Patientennummer 101–106) die Trinkmenge über 24 Stunden sowie die Urinmengen zu den festgelegten Sam- melperioden an den einzelnen Visiten (2–4) aufgelistet. In der Spalte „Bemerkungen“

wurden Abweichungen dokumentiert. Proband 101 hat an Visite 1 eine Tasse Kaffee getrunken, er wurde diesbezüglich nachgeschult, dass nur Wasser erlaubt ist wäh- rend der Studienvisiten. Die Aktivkohlelösung an Visite 3 wurde nicht auf die maximal erlaubten 3 Liter Wasser angerechnet.

Proband 103 hat während der Sammelperiode 4–8 h 0 mL Urin abgegeben, deswe- gen konnte aus dieser Probe keine Analytik durchgeführt werden.

Im Mittel tranken die Probanden 3169 mL im Zeitraum 0–24 Stunden. An Visite 3 wurde zu den vorgegebenen 3 Litern die 400 mL Ultracarbone-Lösung hinzugerech- net. Die produzierte Urinmenge lag im Mittel bei 2990 mL im Zeitraum 0–24 Stunden.

Diese Menge liegt im Mittel 169 mL über der vorgegebenen maximalen Menge von 3 Litern. Proband 101 liegt mit allen Werten im Rahmen. Proband 102 zeigt außer der zusätzlichen Ultracarbone-Lösung an Visite 3 keine Abweichungen. Proband 103 hat an allen Visiten mehr als die vorgegebenen 3 Liter getrunken, obwohl auch er bei jeder Visite auf die Restriktionen hingewiesen und geschult wurde. Proband 104 hat an Visite 4 mehr getrunken als 3 Liter. Er wurde ebenfalls erneut geschult bezüglich der Restriktionen. Proband 105 und Proband 106 zeigen keine Abweichungen außer der zusätzlichen 400 mL Ultracarbone-Lösung an Visite 3.

Diese leichten Abweichungen hatten aus wissenschaftlicher Sicht keinen Einfluss auf die Berechnung der PK-Werte.

Auffällig war, dass Proband 101 und Proband 105 an allen 3 Applikationstagen eine negative Bilanz bei der Differenz aus Trinkmenge und Urinmenge zeigten. Bei den anderen 4 Probanden war die Bilanz bis auf eine Ausnahme immer null bzw. positiv.

(22)

Tab. 3.3 Trink- und Urinmenge Visite 2 bis 4

Patienten-

Nr. Visite Sammel- periode [h]

Urin [mL] Trink- menge [mL]

Summe Urin/24h [mL]

Differenz Trinkmenge

− Urin

Bemerkung

101 2 0–4 700

2700 3120 −420

inkl. 1 Tasse Kaffee mit Milch, 200 mL

(Nachschulung erfolgt)

101 2 4–8 810

101 2 8–12 910

101 2 12–24 700

101 3 0–4 800

2900 3600 −700 inkl. 400 mL Ultracarbo- ne-Lösung

101 3 4–8 650

101 3 8–12 950

101 3 12–24 1200

101 4 0–4 650

3000 3270 −270

101 4 4–8 850

101 4 8–12 1000

101 4 12–24 770

102 2 0–4 500

3000 3600 −600

102 2 4–8 900

102 2 8–12 500

102 2 12–24 1700

102 3 0–4 1250

3400 3400 0 inkl. 400 mL Ultracarbo- ne-Lösung

102 3 4–8 350

102 3 8–12 550

102 3 12–24 1250

102 4 0–4 500

3000 2700 300

102 4 4–8 400

102 4 8–12 700

102 4 12–24 1100

103 2 0–4 580

3500 3140 360

103 2 4–8 800

103 2 8–12 410

103 2 12–24 1350

103 3 0–4 300

3900 2905 995

inkl. 400 mL Ultracarbo- ne-Lösung, Zeitpunkt 4–

8 h: keine Urinprodukti- on, daher keine Probe gesammelt

103 3 4–8 0

103 3 8–12 820

103 3 12–24 1785

103 4 0–4 375

4250 3235 1015 inkl. 250 mL Leitungs- wasser nach Dosing

103 4 4–8 280

103 4 8–12 880

103 4 12–24 1700

104 2 0–4 300

2500 2150 350

104 2 4–8 400

104 2 8–12 550

104 2 12–24 900

104 3 0–4 350

104 3 4–8 280

104 3 8–12 1100

104 3 12–24 800

104 4 0–4 650

3200 2800 400 inkl. 1 Glas Wasser zusätzlich

104 4 4–8 200

104 4 8–12 750

104 4 12–24 1200

105 2 0–4 1300

3000 3150 −150

105 2 4–8 600

105 2 8–12 450

105 2 12–24 800

(23)

Patienten-

Nr. Visite Sammel- periode [h]

Urin [mL] Trink- menge [mL]

Summe Urin/24h [mL]

Differenz Trinkmenge

− Urin

Bemerkung

105 3 0–4 1540

3400 3990 −590 inkl. 400 mL Ultracarbo- ne-Lösung

105 3 4–8 950

105 3 8–12 850

105 3 12–24 650

105 4 0–4 1400

3000 3480 −480

105 4 4–8 580

105 4 8–12 1150

105 4 12–24 350

106 2 0–4 850

3000 2350 650

106 2 4–8 700

106 2 8–12 100

106 2 12–24 700

106 3 0–4 800

106 3 4–8 220

106 3 8–12 650

106 3 12–24 700

106 4 0–4 350

3000 2030 970

106 4 4–8 500

106 4 8–12 800

106 4 12–24 380

Min 0 2500 2030 −700

Max 1785 4250 3990 1030

Mittelwert 748 3169 2990 179

Stabw 383 419 549 604

MEDIAN 700 3000 3130 325

3.1.5 Sicherheitsparameter an Visite 2, 3 und 4

Alle Studienprozeduren wurden von allen sechs Studienteilnehmern sehr gut vertra- gen. Die an Visite 2, 3 und 4 gemessenen Vitalzeichen zeigten keine signifikanten Veränderungen zu den Untersuchungen am Screening-Tag (siehe Tab. 3.4). Die kör- perliche Untersuchung am Ende von Visite 4 war bei allen Probanden unauffällig.

(24)

Tab. 3.4 Durchschnittswerte Vitalzeichen Visite 2, 3, 4 (alle sechs Probanden)

Variable

Systolischer Blutdruck [mmHg]

126 [10,1]

104–143 127,5 Diastolischer Blutdruck [mmHg] 6

67 [9,5]

57–90 67 6 Herzfrequenz [BPM]

59 [6,4]

44–70 60 6 Körpertemperatur [°C]

36,1 [0,4]

35,2–36,6 36,2 6

3.1.6 Unerwünschte Ereignisse (AE)

Während der gesamten Studie trat bei zwei Probanden jeweils ein adverse event (AE) auf.

Der Proband mit der Run-in-Nummer 3 hatte während der Studie einen Zeckenbiss.

Das AE war mild, ist abgeschlossen und steht nicht in Zusammenhang mit den Studi- enprozeduren.

Der Proband mit der Run-in-Nummer 4 klagte am Tag nach der inhalativen Applikati- on des Enrofloxacins über sehr leichtes Nasenbluten beim Schnäuzen. Das AE war mild, ist abgeschlossen und steht Möglicherweise in Zusammenhang mit den Studi- enprozeduren.

3.1.7 Bewertung des klinischen Teils

Fasst man die Ergebnisse des klinischen Teils dieses Forschungsvorhabens zusam- men, kann man sagen, dass alle Studienprozeduren sehr gut verträglich waren und sich die eingesetzten Methoden zur Applikation des Enrofloxacins als gut durchführ- bar dargestellt haben.

3.2 Messergebnisse Analytik

3.2.1 Applikationsmengen

Die Applikationslösungen wurden vor der Verwendung auf ihre tatsächlichen Enroflo- xacingehalte für die dermale, orale und inhalative Applikation untersucht (Tab. 3.5).

Bei der dermalen Applikation wurde zusätzlich die nach der Expositionsdauer ge- sammelte Applikationslösung (Wischprobe) auf ihren Enrofloxacingehalt untersucht.

(25)

Tab. 3.5 Enrofloxacingehalte der verwendeten Applikationslösungen der Probanden (P1–P6) für die dermale, orale und inhalative Exposition

Probanden ID P1 P2 P3 P4 P5 P6

Anwendung Dermale Applikation

Enrofloxacin

Ist-Konzentration [µg/mL] 431 309 454 454 454 425 Enrofloxacin

Soll-Konzentration [µg/mL] 500

Enrofloxacin Wischprobe [µg] 61,4 90,4 66,3 111 99,4 58,6 Enrofloxacin Aufgenommene

Menge* [µg] 154 64,1 161 116 128 154

Anwendung Orale Applikation

Enrofloxacin

Ist-Konzentration [µg/mL] 10,1 15,8 12,3 12,3 12,3 18,1 Enrofloxacin

Soll-Konzentration [µg/mL] 12,5

Anwendung Inhalative Applikation

Enrofloxacin

Ist-Konzentration [µg/mL] 45,2 48,3 44,9 44,9 44,9 47,9 Enrofloxacin

Soll-Konzentration [µg/mL] 50,0

* berechnet; nicht experimentell bestimmt

3.2.2 Analytik Ergebnisse Urin

Zu den geplanten Sammelzeitpunkten wurden von den sechs Probanden (P1–P6³ – die Endziffer entspricht der fortlaufenden Nummer, die an Visite 2 vergeben wurde) die in Tab. 3.6 zusammengestellten Urinmengen erhalten. Die zugehörigen Krea- tininwerte zur Normierung sind in Tab. 3.7 angegeben. Die Tab. 3.8 gibt die absolute Enrofloxacin-Menge und die Tab. 3.9 die Konzentration von Enrofloxacin in µg/L an.

In der Tab. 3.10 und in der Tab. 3.11 sind die gleichen Angaben für den Metaboliten Ciprofloxacin gegeben.

3 In der Analytik wurde anstatt der dreistelligen Probanden-Nummer eine einstellige Nummer (P1–P6) vergeben, welche identisch mit der jeweilig letzten Ziffer der in der Klinik vergebenen Probanden- Nummer ist.

(26)

Um die Validität der Daten zu gewährleisten wurden QC-Standards in die Proben- Sequenz integriert. Bei der Analyse der Urin-Proben erfolgte keine strikte Abtrennung nach Probanden und/oder Applikation. Die Konzentration der QC-Standards (nomina- le Konzentration: 5; 20; 25; 50; 100 bzw. 400 ng/0,1 L Urin) wurde den Analyt- Konzentrationen in den Real-Proben angepasst. In Summe wurden 26 QC-Standards in den Proben-Sequenzen integriert, wobei die mittlere Richtigkeit für Enrofloxacin bei 98 ±12 % lag und Ciprofloxacin bei 98 ±10 %.

Von den insgesamt für die Analytik zur Verfügung stehenden 89 Urin-Proben, über- bzw. unterschritten 7 den von der WHO empfohlenen Kreatinin-Bereich von 0,3–

3 g/L⁴. Die vergleichsweise hohen Kreatinin-Werte in den Pre-dose-Proben werden mit den frühen Morgenstunden, in denen der Pre-dose-Urin gesammelt wurde, und die damit geringe Menge an zugeführter Flüssigkeit erklärt. Das Gesamt-Ergebnis wird dadurch nicht beeinflusst.

Tab. 3.6 Absolute Urinmengen [mL] der Probanden (P1–P6) für die dermale, orale und inhalative Exposition zum jeweiligen Beprobungszeitpunkt

Sammel- zeitpunkt

Menge Urin [mL]

P 1 P 2 P 3 P 4 P 5 P 6

Dermale Applikation

pre-dose 10 50 50 75 70 40

0–4 h 700 500 580 300 1300 850

4–8 h 810 900 800 400 600 700

8–12 h 910 500 410 550 450 100

12–24 h 700 1700 1350 900 800 700

Gesamt 3130 3650 3190 2225 3220 2390

Orale Applikation

pre-dose 30 40 30 40 90 80

0–4 h 650 500 375 650 1400 350

4–8 h 850 400 280 200 580 500

8–12 h 1000 700 880 750 1150 800

12–24 h 775 1100 1700 1200 350 380

Gesamt 3305 2740 3265 2840 3570 2110

Inhalative Applikation

pre-dose 35 28 35 30 75 50

0–4 h 800 1250 300 350 1540 800

4–8 h 650 350 k.P. 280 950 220

8–12 h 950 550 820 1100 850 650

12–24 h 1200 1250 1785 800 650 700

Gesamt 3635 3428 2940 2560 4065 2420

k.P. keine Probe vorhanden

4 Empfohlen für Biomonitoring im arbeitsmedizinischen Bereich.

(27)

Tab. 3.7 Kreatiningehalte [g/L] der Probanden (P1–P6) für die dermale, orale und inhalative Exposition zum jeweiligen Beprobungszeitpunkt.

Werte, die unter- bzw. oberhalb des von der WHO empfohlenen Bereichs von 0,3–3,0 g/L liegen, sind in der Tabelle rot hervorgehoben.

Sammel- zeitpunkt

Kreatinin-Gehalt [g/L]

P 1 P 2 P 3 P 4 P 5 P 6

Dermale Applikation

pre-dose 2,8 1,7 2,6 1,8 0,9 3,2

0–4 h 0,6 0,6 0,7 1,1 0,3 1,0

4–8 h 0,3 0,3 0,3 0,4 0,5 0,3

8–12 h 0,4 0,7 0,5 0,8 0,6 0,8

12–24 h 1,0 0,5 0,7 1,0 1,2 1,2

MW 1,0 0,8 1,0 1,0 0,7 1,3

Orale Applikation

pre-dose 2,3 1,5 3,9 2,9 0,4 1,1

0–4 h 0,3 0,6 0,9 0,4 0,1 1,3

4–8 h 0,5 0,7 1,3 1,3 0,7 0,6

8–12 h 0,3 0,4 0,4 0,4 0,2 0,4

12–24 h 0,7 0,7 0,5 0,5 1,3 2,0

MW 0,8 0,8 1,4 1,1 0,5 1,1

Inhalative Applikation

pre-dose 1,6 2,0 3,7 3,7 0,6 1,6

0–4 h 0,2 0,3 1,2 1,0 0,3 0,6

4–8 h 0,6 0,8 k.P. 1,0 0,3 0,9

8–12 h 0,3 0,7 0,8 0,3 0,5 0,3

12–24 h 0,7 0,6 0,5 0,9 1,0 0,8

MW 0,7 0,9 1,5 1,4 0,6 0,8

k.P. keine Probe vorhanden