IPF PharmaCeuticals GmbH, An-Institut der Medizinischen Hochschule Hannover
Verifizierung der Glykosaminglykan (GAG)-Bindungsstelle des
CC-Chemokins CCL14 und funktionelle Charakterisierung einer defizienten Mutante
INAUGURAL-DISSERTATION Zur Erlangung des Grades eines Doktors
der Veterinärmedizin (Dr.med.vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von Sebastian Rieder aus Bremerhaven
Hannover 2006
Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. Bernd Otto
Prof. Dr. Dr. Wolf- Georg Forssmann
1. Gutachter: Prof. Dr. Bernd Otto
2. Gutachter: Prof. Dr. Hans-Joachim Schuberth
Tag der mündlichen Prüfung: 16.11.2006
Seite
1 EINLEITUNG UND ZIELSETZUNG 1
2 LITERATURÜBERSICHT
2.1 Chemokine 2
2.2 Chemokinrezeptoren: Übersicht, Rezeptoraffinität und Aktivierung 4
2.3 Struktur- und Aktivitätsbeziehung 7
2.4 Die Rolle von Chemokinen und Glykosaminoglykanen für die
Leukozytenmigration 9
2.5 Beispiele für die pathophysiologische Bedeutung der Chemokine
2.5.1 Allergische Erkrankungen 13
2.5.2 Virale Erkrankungen: AIDS 15
2.6 CCL14 und seine Derivate 16
2.7 Chemokine und therapeutische Ansätze 17
3 MATERIAL UND METHODEN
3.1 Chemokine 19
3.2 Bestimmung der Heparinbindungsaffinität 19
3.3 Blutspender 19
3.4 Zellisolation 19
3.4.1 Isolation von humanen Leukozyten 19
3.4.2 Aufbereitung von Monozyten 20
3.4.3 Aufbereitung von eosinophilen Granulozyten 21
3.5 Zellkultur 21
3.6 Chemotaxis 22
3.7 Rezeptorinternalisierung 23
3.8 Intrazelluläre Calciummobilisation 25
3.9 Statistische Auswertung 26
3.10 Materialien 27
4.1 Ergebnisse der Überprüfung der Heparinbindungsaffinität 31 4.2 Ergebnisse der intrazellulären Calciummobilisation 32 4.2.1 Calciummobilisation vermittelt durch CCR1 33 4.2.2 Calciummobilisation vermittelt durch CCR3 34 4.2.3 Calciummobilisation vermittelt durch CCR5 36
4.2.4 Calciummobilisation in PBMC 37
4.3 Rezeptorinternalisierung
4.3.1 Internalisierung des CCR1 38
4.3.2 Internalisierung des CCR3 39
4.3.3 Internalisierung des CCR5 40
4.3.4 Internalisierung des CCR1 bei Monozyten 41 4.3.5 Internalisierung des CCR3 bei Eosinophilen 43 4.4 Chemotaxis
4.4.1 Chemotaxisassay mit Monozyten 44
4.4.2 Chemotaxisassay mit Eosinophilen 46
5 DISKUSSION 47
6 ZUSAMMENFASSUNG 52
7 SUMMARY 54
8 LITERATURVERZEICHNIS 56
9 ERKLÄRUNG 67
10 Eigene Publikationen im Rahmen dieser Arbeit 68
11 DANKSAGUNG 69
A (Ala) Alanin
Abb. Abbildung
AOP Aminooxypentan
BSA Bovines Serumalbumin
°C Grad Celsius
[Ca2+]i intrazelluläres Calcium
CCL CC-Chemokinligand
CCR CC-Chemokinrezeptor
CD Cluster of Differentiation
CO2 Kohlenstoffdioxid
DAG Diacylglycerin
DP4 Dipeptidyl-Peptidase IV
EC50 Effektive Konzentration, bei der 50 % der maximalen Wirkung einsetzt
EDTA Ethylen Diamin Tetra-Acetat
FACS Fluorescence Activated Cell Sorter
FITC Fluoreszeinisothiocyanat
FLIPR Fluorometric Imaging Plate Reader Fluo-4-AM Fluo-4-Acetoxymethyl
g Gramm
g Erdbeschleunigung (Schleuderziffer)
G (Gly) Glycin
GAG Glykosaminoglykan
h Stunde
H (His) Histidin
HBSS Hanks balanced salt solution
HCl Salzsäure
HEPES N-2-Hydroxyethyl-Piperazin-N-Ethan-Sulfonsäure
HES Hydroxyethylstärke
HIV Humanes Immundefizienz-Virus
H2O Wasser
IL Interleukin
IP3 Inositoltriphosphat
K (Lys) Lysin
M Mol
(m)Ak (monoklonale) Antikörper
M (Met) Methionin
min Minuten
µl Mikroliter
ml Milliliter
µm Mikrometer
mm Millimeter
mM Millimol
n Anzahl der durchgeführten Versuche
N (Asp) Asparagin
NaCl Natriumchlorid
nm Nanometer
nM Nanomol
NNY Nonanoyl
PBMC Peripheral blood mononuclear cells (periphere mononukleäre Zellen des Blutes
PBS Phospate buffered saline (Phosphat gepufferte Salzlösung)
PE Phycoerythrin
PECAM Plättchen-Endothelzelladhäsionsmolekül PI3K Phosphatidylinositol-3-hydroxy-Kinase
PLC Phospholipase C
PKC Proteinkinase C
R Arginin
sec Sekunden
SEM Standard Error of the Mean (Standard Fehler des Durchschnitts)
vs. versus
W Watt
1 EINLEITUNG UND ZIELSETZUNG
Chemokine sind kleine Heparin-bindene Peptide, welche die Fähigkeit besitzen, chemotaktisch auf Leukozyten zu wirken. Sie werden von verschiedenen Zellen und Geweben konstitutiv oder nach Stimulation exprimiert bzw. produziert und nehmen so an der Homöostase des Immunsystems und an Entzündungen teil (BAGGIOLINI 2001). In der Blutbahn werden sie durch sogenannte Glykosaminoglykane (GAG) an das Endothel gebunden präsentiert, bilden so einen haptotaktischen, lokalen Konzentrationsgradienten und sorgen hiermit für die Extravasation und zielgerichtete Migration der Leukozyten (MIDDLETON et al. 2002). Chemokine und ihre Rezeptoren sind desweiteren in multiple pathologische Prozesse involviert. So fungiert CCR5 als Corezeptor für die zelluläre Aufnahme der HIV-Partikel (DENG et al. 1996) und CCR3 ist maßgeblich im allergischen Geschehen beteiligt (ELSNER et al. 2004).
Für einige Chemokine wurden spezifische Bindungsstellen der Glykosaminoglykane bereits identifiziert. Für die Chemokine CCL3, CCL4, CCL5 und CXCL12 ließ sich eine bestimmte Abfolge (Sequenz) von Aminosäuren, das sogenannte BBXB-Motiv (B= basische Aminosäure, X= beliebige andere Aminosäure), erkennen (KOOPMANN et al. 1999;
KOOPMANN u. KRANGEL 1997; PROUDFOOT et al. 2001; SADIR et al. 2001). Für einzelne Chemokine, z.B. CCL5, wurde in Tiermodellen gezeigt, dass durch die Applikation einer in dem BBXB-Motiv mutierten Substanz die Rekrutierung der Leukozyten verhindert werden kann (JOHNSON et al. 2004).
Ein Derivat des Chemokins CCL14(9-74), NNY-CCL14, besitzt, wie kürzlich in einem Modell für allergische Atemwegserkrankungen festgestellt wurde, die Fähigkeit, sowohl die Inflammation als auch die Hyperreagibilität der Atemwege signifikant zu reduzieren (FORSSMANN et al. 2004; GUPTA et al. 2006). Ziel dieser Arbeit ist die Bestätigung und Charakterisierung einer spezifischen GAG-Bindungsstelle für CCL14. Nachfolgend ist in biologischen Assays zu überprüfen, ob Mutationen in diesem Bereich zu einer Veränderung der biologischen Aktivität führen. Die Synthese von GAG-Bindungsstellen-defizienten Derivaten von NNY-CCL14 und deren ausführliche in vitro Charakterisierung sollten die Grundvoraussetzungen für das Verständnis einer möglichen besseren in vivo Wirksamkeit sein.
2 LITERATURÜBERSICHT
2.1 Chemokine
Chemokine sind kleine chemotaktische, Heparin-bindende Peptide. Die Forschungsarbeiten über Chemokine begannen mit der Entdeckung von Interleukin-8 (IL-8) im Jahre 1987 durch YOSHIMURA et al. (1987), SCHRÖDER et al. (1987) und WALZ et al. (1987). Während die erstgenannten Autoren genauere Daten über die Biochemie lieferten, wurde der Nachweis der chemotaktischer Aktivität von YOSHIMURA et al. (1987) erbracht. IL-8 ist ein niedermolekulares Peptid, welches die Fähigkeit besitzt, chemotaktisch auf Entzündungszellen zu wirken (YOSHIMURA et al. 1987, SCHRÖDER et al. 1987, WALZ et al. 1987). Aufgrund dieser Tatsache wurde dieses und die nachfolgend entdeckten
„chemotaktischen Cytokine“ zusammengefasst als Chemokine bezeichnet (BAGGIOLINI 2001). Sie besitzen ein Molekulargewicht von 7-13 kDa und sind damit bedeutend kleiner als Cytokine (BAGGIOLINI et al. 1994; BAGGIOLINI et al. 1997). Bis heute sind ca. 50 Chemokine entdeckt worden (MURPHY et al. 2000). Sie können in homöostatische und inflammatorische Chemokine unterteilt werden. Chemokine nehmen eine entscheidende Rolle in der Homöostase des Immunsystems ein und werden hier konstitutiv in definierten Regionen, z.B. in Lymphknoten, exprimiert. Sie sind an der Entwicklung und Reifung der Leukozyten, ihrer Rekrutierung und Aktivierung beteiligt. Im Entzündungsgeschehen sind sie für den Schutz des Wirtes verantwortlich. In diesem Fall werden sie von einer Vielzahl von Zellen, hierunter immigrierenden Leukozyten sowie verschiedenen Gewebszellen, nach Stimulation mit Cytokinen oder auch bakteriellen Toxinen produziert und sezerniert (BAGGIOLINI 2001). Sie sind zudem auch von besonderer Bedeutung in pathologischen Geschehen, wie beispielsweise allergischen, autoimmunen, viralen und metabolischen Erkrankungen (CHARO u. RANSOHOFF 2006).
Fast alle Chemokine haben ein Grundgerüst von vier Cysteinresten mit zwei Disulfidbrücken in einer konservierten Position. Entsprechend der Anordnung der beiden N-terminal gelegenen Cysteine werden Chemokine in zwei große Subfamilien unterteilt. Bei CXC(α)- Chemokinen, zu denen u.a. CXCL8 zu zählen ist, sind diese zwei Cysteinreste durch eine weitere Aminosäure getrennt. Wenn bei den Chemokinen diese Aminosäure (X) fehlt, werden sie der Subfamilie der CC(β)-Chemokine, z.B. CCL14 und CCL11, zugeordnet. Ausnahmen von dieser Einteilung, da sie sich keiner der genannten Subfamilien zuordnen lassen, sind
XCL1 und CX3CL1. XCL1 besitzt insgesamt nur zwei Cysteinreste und wird deshalb als C- Chemokin bezeichnet (KENNEDY et al. 1995). Im Fall von CX3CL1 werden die zwei ersten Cysteine durch jeweils drei Aminosäuren getrennt (BAGGIOLINI 2001; BAZAN et al. 1997).
Innerhalb der Chemokinsubfamilien weisen Chemokine eine hohe Aminosäuresequenzhomologie von 20-70% auf, welche wahrscheinlich darauf zurückzuführen ist, dass der Großteil der CC-Chemokine auf dem Gen 17q11.2 und der Großteil der CXC-Chemokine auf dem Gen 4q12-20 lokalisiert ist (MODI u. CHEN 1998;
NARUSE et al. 1996).
Durch die Neuentdeckung einer Vielzahl von Chemokinen und der Tatsache, dass einzelne Chemokine oft mit mehreren Namen bezeichnet wurden, einigte man sich 1996 auf eine neue Nomenklatur, welche auf der obengenannten Einteilung in Subfamilien basierte. Hinter die strukturcharakterisierenden Akronyme CC bzw. CXC wird ein L, bezeichnend für „Ligand“, gesetzt, gefolgt von der Nummer des für dieses Chemokin bezeichnenden Gens. Diese Nummern entsprechen den bereits vor längerer Zeit für die „small secreted cytokines“ (SCY) codierten Gene und deren chronologisch zugeordnete Zahlen. (z.B. IL-8 CXCL8) (ZLOTNIK u. YOSHIE 2001). Die unterschiedliche Struktur der Chemokine hat auch Auswirkungen auf die Aktivierung der Zellen. So aktivieren CXC-Chemokine hauptsächlich neutrophile Granulozyten und Lymphozyten, während CC-Chemokine besonders Monozyten, eosinophile Granulozyten und auch Lymphozyten ansprechen. Dieses verdeutlicht, dass CXC- Chemokine vornehmlich in der akuten Phase einer Entzündung und CC-Chemokine eher bei chronischen Erkrankungen involviert sind.
2.2 Chemokinrezeptoren: Übersicht, Rezeptoraffinität und Aktivierung
Die Wirkung der Chemokine entfaltet sich über die Bindung an ihre Rezeptoren. Allen Chemokinrezeptoren gemeinsam ist ihre Struktur. Sie sind Gi-Protein gekoppelt und bestehen aus 7 transmembranären Helices, welche durch drei intra- und drei extrazelluläre Rezeptorschleifen (Loops) verbunden sind (BAGGIOLINI 1998). Die Bezeichnung der Chemokinrezeptoren entspricht, wie die der Chemokine, den strukturbezeichnenden Akronymen. Somit werden sie als CXC, CC, XC, CX3C, gefolgt von einem R und einer Nummer bezeichnet. Bis heute sind 6 CXC und 10 CC Rezeptoren sowie jeweils ein XC und CX3C Rezeptor entdeckt worden (MURPHY 2002).
Frühere Theorien besagten, dass CC-Chemokine nur CC-Rezeptoren und CXC-Chemokine nur CXC-Rezeptoren aktivieren könnten. Später wurde jedoch offensichtlich, dass gewisse CC-Chemokine durchaus CXC-Rezeptoren binden können. In diesem Fall besitzen sie anscheinend eine antagonistische Aktivität (ELSNER et al. 2004). Prinzipiell lässt die Anzahl der Chemokine verglichen mit der Anzahl ihrer Rezeptoren erkennen, dass verschiedene Chemokinrezeptoren durch mehrere Liganden aktiviert werden können, wenn auch bei unterschiedlicher Affinität (BAGGIOLINI 1998). Ergänzend hierzu ist zu erwähnen, dass verschiedene Leukozyten in der Regel verschiedene Chemokinrezeptoren exprimieren. So tragen Neutrophile vornehmlich CXCR1, CXCR2, CXCR4 auf ihrer Oberfläche, Monozyten CCR1, CCR2, CCR5 und CXCR4, Eosinophile CCR1 und CCR3 und Basophile CCR1, CCR2 und CCR3 (BAGGIOLINI 2001). Die Expression von Chemokinrezeptoren auf der Oberfläche von Th2-Lymphozyten ist von der jeweiligen Stimulation abhängig (BAGGIOLINI 2001; LOETSCHER et al. 1996; RABIN et al. 1999). Somit ist auf keinem der unterschiedlichen Leukozyten die gleiche Kombination an Chemokinrezeptoren vorhanden. Einige Rezeptoren werden auf verschiedenen Leukozyten gleichzeitig exprimiert und immer durch andere Rezeptoren ergänzt. Dieses verdeutlicht die Komplexität und die Feinregulation, welche durch die Chemokine im Immunsystem ermöglicht wird (BAGGIOLINI 2001).
Zusätzlich kommen verschiedenen Rezeptoren essentielle Bedeutungen in pathologischen Erkrankungen zu. So gelangte insbesondere CCR5 als Corezeptor für die HIV-Infektion zu höchstem Interesse. CCR3, ein prominenter Rezeptor auf Eosinophilen, Mastzellen,
Basophilen und Th2-Lymphozyten, ist im allergischen Geschehen hervorzuheben (ELSNER et al. 2004).
Nach der Aktivierung der Chemokinrezeptoren wird, gemäß der Grundprinzipien der Gi- Protein gekoppelten Rezeptoren, GTP zunächst zu GDP umstrukturiert und dissoziiert zu einer α- und einer βγ-Untereinheit. Die βγ-Untereinheit vermittelt die Signaltransduktion über die Aktivierung von zwei Enzymen, zum einen über die Phospholipase C (PLCβ2 und -β3) und zum anderen über die Phosphatidylinositol-3-OH-Kinase (PI3Kγ). Die Phospholipase Cβ teilt Phosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphat, wodurch zwei neue „second-messenger“
entstehen, Inositol-tri(1,4,5)-phosphat (IP3) und Diacylglycerin (DAG). IP3 induziert die Freisetzung von intrazellulärem Calcium, während DAG die Proteinkinase C (PKC) aktiviert.
Die PI3Kγ erzeugt Phosphatdylinositol-(3,4,5)-trisphosphat und initiiert die Aktivierung der Proteinkinase B. Am Ende dieser Signalübertragung steht die Vereinigung der α- und β- Untereinheit des GTP (THELEN 2001). Durch diese Reaktionskaskade entfaltet sich die funktionelle Wirkung der Chemokine, die im folgenden Absatz zusammengefasst ist.
Nach einer erfolgreichen Rezeptoraktivierung werden beispielsweise die Freisetzung von Proteasen, Peroxydasen, Histamin, bioaktiven Lipiden und radikalen Sauerstoffspezies aus intrazellulären Speichern, sowie die Aktinpolymerisation induziert (BAGGIOLINI 2001).
Tabelle 1. Chemokinrezeptoren. Verteilung auf Leukozyten und ihre Liganden nach Elsner et al, 2004, MURPHY et al. 2000 und MURPHY 2002 bezogen auf humane Chemokinrezeptoren und humane Chemokine.
Rezeptor Zelluläre Verteilung Ligand
CXCR1 Neutrophile, T-Zellen, Monozyten, Makrophagen, dendritische Zellen
CXCL1, CXCL6, CXCL8
CXCR2 Neutrophile, T-Zellen, Monozyten, Makrophagen, dendritische Zellen
CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8
CXCR3 Neutrophile, T-(Th1)Lymphozyten, B-Lymphozyten, dendritische Zellen
CXCL9, CXCL10, CXCL11 Antagonisten: CCL11
CXCR4 Neutrophile, T- und B-Lymphozyten, Monozyten, Makrophagen,
dendritische Zellen, NK-Zellen
CXCL12
CXCR5 T- und B-Lymphozyten, Monozyten, Makrophagen
CXCL13
CXCR6 T-Lymphozyten und dendritische Zellen
CXCL16 CCR1 Monozyten, Makrophagen,
dendritische Zellen, T-Zellen, B- Zellen, Eosinophile, Basophile, Neutrophile
CCL2, CCL3, CCL5, CCL7, CCL8, CCL14, CCL15, CCL16, CCL23
CCR2 Monozyten, Makrophagen, unreife dendritische Zellen, NK-Zellen, Basophile
CCL2, CCL7, CCL8, CCL12, CCL13, CCL16 Antagonisten: CCL11, CCL26
CCR3 Eosinophile, Basophile, Mastzellen, T-Zellen (Th2)
CCL5, CCL7, CCL8, CCL11, CCL13, CCL14(9-74), CCL15, CCL24, CCL26, CCL28
Antagonisten : CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL18 CCR4 T-Zellen, Basophile, unreife
dendritische Zellen
CCL17, CCL22
CCR5 Monozyten, Makrophagen, dendritische Zellen, NK-Zellen, T(h1)-Zellen, Thymozyten
CCL3, CCL4, CCL5, CCL8 , CCL11, CCL14(9-74), CCL16, CCL26
CCR6 Monozyten, Makrophagen, dendritische Zellen, T-Zellen, B- Zellen
CCL20
CCR7 dendritische Zellen, T-Zellen, B-Zelle CCL19, CCL21 CCR8 Monozyten, T-Zellen, B-Zellen,
Neutrophile, Thymozyten
CCL1, CCL4, CCL17
CCR9 T-Zellen, Thymozyten CCL25,
CCR10 T-Zellen, Melanozyten, Langerhanszellen
CCL27, CCL28
XCR1 T-Lymphozyten XCL1
CX3CR1 Neutrophile, Monozyten, NK-Zellen, T-Lymphozyten
CX3CL1
2.3 Struktur- und Aktivitätsbeziehung
Die Primärstruktur der Chemokine besteht in der Regel aus 70-130 Aminosäuren einschließlich 4 Cysteinresten, wobei jeweils zwei Cysteine durch eine Disulfidbrücke verbunden sind (Cys1Cys3, Cys2Cys4) (BAGGIOLINI et al. 1994; BAGGIOLINI et al.
1997). Bezogen auf die Sekundär- und Tertiärstruktur zeigen Chemokine eine bemerkenswerte Ähnlichkeit untereinander. Beginnend am N-terminalen Ende weisen sie eine flexible, ungeordnete Region auf, an welche sich das CC- bzw. CXC-Motiv anschließt. Diese repräsentiert den N-Terminus. Nachfolgend befindet sich der N-Loop, welcher gemeinsam mit dem N-Terminus auch als N-terminale Region bezeichnet wird. Das dreisträngige, antiparallele β-Faltblatt und die COOH-terminal lokalisierte α-Helix bilden die stabile Kernregion des Chemokins (SKELTON et al. 1995). Die Bedeutung der verschiedenen Abschnitte ist vor allem für die Entwicklung von agonistischen und antagonistischen Modifikationen und somit für Studien der Arzneimittelforschung von Bedeutung, wie sich mit der Etablierung des Zweistufenmodells zeigte (LOETSCHER u. CLARK-LEWIS 2001).
In zahlreichen Mutationsstudien mit Chemokinen während der 90er Jahre stellte sich heraus, welche Abschnitte für die Rezeptorerkennung und -bindung jeweils eine besondere Rolle spielen könnten. Diese Experimente bildeten die Grundlage für das daraufhin etablierte Zweistufenmodell, in dem die initiale, spezifische und hochaffine Bindung, der „recognition step“, über den N-Loop vermittelt wird. Hiernach ist es dem Rezeptor möglich, sich nach dem Chemokin auszurichten. Die eigentliche Aktivierung erfolgt über die flexible Region des Chemokins, dem N-Terminus, welcher sich aufgrund der starren Tertiärstruktur des Chemokins nun optimal nach dem Rezeptor ausrichten kann (CRUMP et al. 1997;
HARTLEY u. OFFORD 2005; PAKIANATHAN et al. 1997; WELLS et al. 1996; ZHANG et al. 1994). Aus diesem Grund wurden Modifikationen vornehmlich in diesem Bereich durchgeführt. Mutationen des N-Terminus führten, wie zunächst erwartet, zu der Entstehung von Antagonisten, da die Chemokine immer noch hochaffin binden können, aber die Aktivierung ausbleibt und die Chemokinrezeptoren somit blockiert werden. Später stellte sich jedoch heraus, dass die Bindung tatsächlich bestehen bleibt, aber nicht genau vorherzusagen ist, in welcher Aktivitätsbeziehung sich das modifizierte Chemokin zum Chemokinrezeptor verhält. So führten die Modifikationen zu der Identifizierung und Entdeckung von
HARTLEY u. OFFORD 2005; PROUDFOOT et al. 1999; SABBE et al. 2001; YANG et al.
1999).
Eine Ausnahme von diesem etablierten Modell ist CCL11, da die für die Rezeptoraktivierung und -bindung verantwortlichen Abschnitte sowohl auf dem N-Loop, als auch auf dem N- Terminus verteilt sind (MAYER u. STONE 2001).
Die Bedeutung der COOH-terminal lokalisierten α-Helix wurde nicht in diesem Ausmaß erforscht. Für das CXC-Chemokin CXCL8 konnte jedoch gezeigt werden, dass die Entfernung von Teilen sowie der kompletten α-Helix zu keinem Verlust seiner Aktivität führte (CLARK-LEWIS et al. 1991). Dahingegen verlor das CC-Chemokin CCL15 bei gleichem Eingriff seine Aktivität, was wahrscheinlich auf die darauf anschließende fehlende Ausbildung der β-Faltblattstruktur zurückzuführen ist. Dieses lässt vermuten, dass die α- Helix bei CC-Chemokinen, nicht aber bei CXC-Chemokinen für die Tertiärstruktur in Lösungen von Bedeutung ist (ESCHER et al. 1999). Innerhalb der C-terminalen Region befindet sich bei einigen Chemokinen, beispielsweise CXCL4, CXCL8, CXCL12 und CCL2, ein zweites Bindungsmotiv. Hier binden Glykosaminoglykane (GAG). Diese sauren Makromoleküle binden die Chemokine und präsentieren sie den im Blutstrom zirkulierenden Leukozyten (MIDDLETON et al. 2002). Zudem scheint die Bindung an Proteoglykane von einer Oligomerisation abhängig zu sein (HARTLEY u. OFFORD 2005; PROUDFOOT et al.
2003).
Abbildung 1. Dreidimensionale Struktur von CXCL12 nach nuklearer Magnet Resonanz Analyse (BAGGIOLINI 2001, CRUMP et al. 1997).
Dieses Modell veranschaulicht die Tertiärstruktur des CXCL12. An die ungeordnete flexible N-terminale Region schließt sich die Kernregionen des Chemokins, das dreisträngige, antiparallele β-Faltblatt (violett) und die COOH-terminale α-Helix (grün) an. Auch der C- terminale Rest ist beweglich. In gelb sind die Disulfidbrücken, welche jeweils die beiden Cysteinreste in konservierter Position verbinden, dargestellt.
2.4 Die Rolle von Chemokinen und Glykosaminoglykanen für die Leukozytenmigration
Die Mobilisierung von Leukozyten zu Infektionsherden ist eine der wichtigsten Funktionen der angeborenen Immunität. Die Extravasation wird grundsätzlich in vier Phasen unterteilt (nach JANEWAY et al (2002); s.a. Abb.2 nach MIDDLETON et al. 2002):
1. Rolling
In der ersten Phase entfernen sich die Leukozyten aus dem zentralen Blutstrom durch die von verschiedenen Entzündungsmediatoren induzierte Vasodilatation. Die Leukozyten erhalten so kurzen Kontakt mit dem Endothel. Auf den Endothelzellen werden je nach der Aktivierung durch verschiedene Cytokine und andere Faktoren (Leukotrien B4, Histamin, LPS, C5a), z.B. P- und E-Selektine exprimiert. Diese gehen mit den entsprechenden Kohlenhydratliganden der Leukozyten reversible Bindungen ein. Da diese Bindungen den Scherkräften des Blutstroms nicht standhalten können, bewegen sich die Zellen langsam entlang der Gefäßwand, weshalb dieses Ereignis auch als „Rolling“ bezeichnet wird.
2. Adhäsion
Im zweiten Schritt binden die Leukozyten mit ihren spezifischen Leukozytenintegrinen, LFA-1 und Mac-1, an Adhäsionsmoleküle der Endothelzellen, ICAMs (interzelluläre Adhäsionsmoleküle). Die zusätzliche Bindung an Chemokine wie CXCL8 resultiert in einer Konformationsänderung der Leukozytenintegrine, wodurch sich die Adhäsion erhöht und der Leukozyt sich an eine Endothelzelle heftet.
3. Diapedese
In der dritten Phase, welche auch als Diapedese bezeichnet wird, durchwandern die Entzündungszellen nach einer Bindung an PECAMs (Plättchen- Endothelzelladhäsionsmoleküle) und einer Zerstörung der Basalmembran mit Hilfe von proteolytischen Enzymen das Endothel.
4. Migration
Im vierten und letzten Schritt wandern die Leukozyten entlang eines Konzentrationsgradienten durch das Gewebe zum Zielort der Entzündungsreaktion
Abbildung 2. Subzelluläre Vorgänge während einer Extravasation, die durch Chemokine induziert ist.
Nach MIDDLETON et al. 2002
(A) Nicht entzündetes Gewebe (B) Entzündetes Gewebe
Chemokine werden von extravaskulären Zellen freigesetzt und die Endothelzelloberfläche legt sich in Falten. Chemokine werden von der abluminalen Seite nach luminal transportiert und an GAGs gebunden luminal präsentiert. Dieses ist auch direkt nach einer Produktion in Endothelzellen möglich.
(C) Die Chemokinkonzentration an der luminalen Endothelfläche steigt, um die Chemokinrezeptoren der Leukozyten binden und aktivieren zu können. Hierdurch wird auch die Integrin vermittelte Adhäsion induziert.
(D) Die Leukozytenmigration erfolgt variabel trans- oder parazellulär.
Die Rolle der Chemokine in der Leukozytenmigration ist vornehmlich an die Bildung eines lokalen Konzentrationsgradienten geknüpft. Dieser induziert die gerichtete Wanderung der Leukozyten in Lösungen, die transendotheliale Migration und die zielgerichtete Chemotaxis im Gewebe. Es wird davon ausgegangen, dass Chemokine an Endothelzellen fixiert die Extravasation bewirken, da sie in vivo ansonsten den Scherkräften des Blutstroms nicht standhalten können und weggewaschen werden. Desweiteren kommt es auf diese Weise zu einer lokalen Konzentrationserhöhung, einem haptotaktischen Konzentrationsgradienten.
Endothelzellen besitzen die Fähigkeit, Chemokine zu produzieren. Diese werden direkt im Anschluss an ihre Synthese luminal auf den Endothelzellmembranen gebunden. Allerdings werden die meisten Chemokine im Gewebe produziert und durch eine abluminal-luminale Transcytose an die Oberfläche der Endothelzellen transportiert. Dieser Weg wurde mit Hilfe von elektronenmikroskopischen Untersuchungen nachgewiesen Im Anschluss an eine subkutane Chemokinapplikation werden die Chemokine von Endothelzellen aufgenommen und anschließend luminal gerichtet den zirkulierenden Leukozyten präsentiert. Die luminal gerichtete Chemokinpräsentation erfolgt in gebundener Form. Chemokine sind hier durch Glykosaminoglykane (GAG), hauptsächlich Heparinsulfat (50-90 %), fixiert.
Glykosaminoglykane können aufgrund ihrer starken negativen Ladung die basischen Chemokine (Ausnahmen: CCL3 und CCL4) gut binden. Durch die Bindung dieser fixierten Chemokine an ihre Rezeptoren wird die nachfolgende Adhäsion durch eine verstärkte Bindung an die Integrine induziert und die Zellen zur Diapedese stimuliert (MIDDLETON et al. 2002).
Chemokine besitzen unterschiedliche Affinitäten zu Heparin (CCL5 > CCL2 > CXCL8 >
CCL3). Für CCL5 und CXCL8 konnte ebenfalls eine Selektivität in Bezug auf die verschiedenen Glykosaminoglykane herausgestellt werden. Die stärkste Affinität erwies sich zu Heparin (KUSCHERT et al. 1999). Auch diese Erkenntnisse tragen zu einem besseren Verständnis der Feinmodulation des Immunsystems bei und eröffnen Ansätze für neue therapeutische Möglichkeiten. So wurde zum Beispiel bei Patienten mit Arteriosklerose ein verändertes Glykosaminoglykanmuster entdeckt, welches eine Veränderung des haptotaktischen Chemokingradienten und somit eine Veränderung der Migration der Leukozyten ins Gewebe zur Folge hatte (MIDDLETON et al. 2002). KUSCHERT et al.
(1999) machten eine weitere interessante Beobachtung: Gebundene und gelöste GAGs scheinen unterschiedliche Funktionen auszuüben. Wenn gebundene GAGs eine Interaktion
mit einem Chemokin eingehen, so verstärkt sich dessen Aktivität, wohingegen ein Komplex aus gelöstem GAG und Chemokin zu einem Aktivitätsverlust führt (KUSCHERT et al. 1999).
Tabelle 2. Interaktion ausgewählter Chemokine mit Glykosaminoglykanen (GAGs)
CCL5 CXCL8 CCL2 CCL3
Heparin ++++ ++++ ++++ ++++
Heparinsulfat ++ +++ +++ +++
Chondroitinsulat + + + ++
Dermatansulfat +++ + + +
Die Selektivität der aufgeführten Chemokine (oberste Zeile) für GAGs (linke Spalte) ist individuell verschieden.
+ steht in dieser Tabelle für die geringste, ++++ für die höchste Affinität. Die höchste Affinität besitzen alle Chemokine zu Heparin. Die Varianz zwischen den einzelnen Affinitäten ist jedoch unterschiedlich hoch: So besitzt CCL5 eine 750fach höhere Affinität zu Heparin als zu Chondroitinsulfat, wohingegen für das Chemokin mit der geringsten Selektivität innerhalb der GAG-Familie, CCL3, nur ein 7facher Unterschied besteht. Nach KUSCHERT et al. 1999.
Die Oligomerisation von Chemokinen scheint im Zusammenhang mit der Bindung an Glykosaminoglykane und somit auch der Extravasation zu stehen. HOOGEWERF et al.
(1997) beobachteten eine durch Glykosaminoglykane induzierte Oligomerisation, welche zu einem lokalen Konzentrationsanstieg von Chemokinen führte (HOOGEWERF et al. 1997;
HOOGEWERF u. KUSCHERT 2000). Um einen besseren Einblick in die Bedeutung der Oligomerisation zu erhalten, testeten PROUDFOOT et al. (2003) mit diesem Hintergrund die in vivo Chemotaxis von monomeren Varianten der CC-Chemokine CCL2, CCL4 und CCL5.
Die eingesetzten Varianten wiesen eine uneingeschränkte in vitro Aktivität auf. Es war ihnen jedoch nicht möglich, in vivo Zellen zu rekrutieren (PROUDFOOT et al. 2003). Dennoch sind Unterschiede bei den verschiedenen Chemokinen zu erkennen. So konnte eine oligomere Struktur von beispielsweise CCL11 bisher nicht nachgewiesen werden (CRUMP et al. 1998).
Eine Injektion mit natürlichem CCL11 in die Haut von Meerschweinchen induzierte jedoch die Rekrutierung von Eosinophilen (JOSE et al. 1994). PROUDFOOT et al. (2003) stellten für dieses Phänomen zwei Hypothesen auf. Die erste Möglichkeit impliziert, dass Chemokine, welche für die Rekrutierung von Leukozyten aus dem Blutstrom verantwortlich sind, eine Oligomerisation benötigen und die zweite, dass Chemokine, für die eine Überschneidung der Chemokinrezeptorbindungsstelle und der GAG-Bindungsstelle vorliegt (CCL2, CCL4, CCL5), eine Oligomerisation für die Bindung an beiden Strukturen nötig ist (PROUDFOOT et al. 2003). Welche der beiden Möglichkeiten zutrifft, bedarf weiterer Untersuchungen.
2.5 Beispiele für die pathophysiologische Bedeutung der Chemokine
2.5.1 Allergische Erkrankungen
Asthma ist eine Erkrankung der peripheren Atemwege, welche durch die Inhalation von Allergenen hervorgerufen wird. Grundsätzlich wird Asthma durch eine Hyperreaktivität der Atemwege, eine erhöhte Mukusproduktion und Bronchokonstriktion sowie die Akkumulation von spezifischen Leukozyten im Gewebe charakterisiert (ELSNER et al. 2004).
Prinzipiell lässt sich die Pathogenese von Asthma in drei verschiedene Phasen einteilen:
1. Initiationsphase
Die erste Phase wird vornehmlich durch einen hohen IgE Spiegel und die Akkumulation von Mastzellen im Lungengewebe bestimmt.
2. Propagationsphase
In der zweiten Phase, welche auch als „Propagationsphase“ bezeichnet wird, kommt es zu einer Anhäufung von Th2-Lymphozyten und Eosinophilen. Aufgrund der Tatsache, dass Eosinophile spezifische Proteine, z.B. „eosinophil cationic protein“ (ECP) und
„major basic protein“ (MBP), sowie radikale Sauerstoffspezies freisetzen, können sie durchaus zu diesem Entzündungsgeschehen und der damit verbundenen Gewebeschädigung beitragen (ELSNER et al. 1996).
3. Effektorphase
Die dritte Phase, die Effektorphase, ist gekennzeichnet durch eine Hyperreaktivität der Atemwege, welche durch die Sekretion von spasmogenen Substanzen hervorgerufen wird (ELSNER et al. 2004).
Die Rolle der Cytokine IL4, IL5 und IL13, welche von Th2-Lymphozyten sezerniert werden, ist in der Pathogenese des Asthma kontrovers diskutiert worden. Versuche verschiedener Autoren zeigten mit dem Einsatz eines IL5 blockierenden mAk (LECKIE 2003) und IL4- knockout Mäusen (COHN et al. 1997) eine deutliche Reduktion von Eosinophilen im Lungengewebe, weshalb den Zytokinen eine bedeutende Rolle zugesprochen wurde. Th2-
Lymphozyten besitzen auch die Fähigkeit über einen CCR3- und CXCR1- vermittelten Weg, die Migration von Mastzellen zu induzieren (SUTCLIFFE et al. 2006).
Im Blickpunkt der Arzneimittelforschung steht die Blockierung der Hyperreaktivität der Atemwege. Man konzentriert sich hierbei nicht nur auf einen Cytokin-basierten Ansatz, sondern auch auf Chemokinrezeptoren, insbesondere den CCR3. CCR3 nimmt eine bedeutende Rolle im allergischen Geschehen ein (ELSNER et al. 2004), da dieser Rezeptor auf Eosinophilen, Mastzellen, Th2-Lymphozyten und Basophilen exprimiert wird (DE PAULIS et al. 2001; KITAURA et al. 1996; MURPHY et al. 2000; SALLUSTO et al. 1997;
UGUCCIONI et al. 1997). CCR3-Knockout Mäuse zeigten nach Allergenexposition eine deutliche Abnahme von Entzündungszellen und klinischen Symptomen. Es war den Zellen zudem nicht möglich, sich aus dem subendothelialen Gewebe zu entfernen (MA et al. 2002).
Neben CCR3 wurden auch andere Rezeptoren in diesem Entzündungsgeschehen näher untersucht. Ein Zusammenhang konnte auch für CCR1 (CARPENTER et al. 2005; MA et al.
2004), CCR4 (KALLINICH et al. 2005; SCHUH et al. 2002b), CCR5 (HOGABOAM et al.
2005; SCHUH et al. 2002a), CCR6 (LUKACS et al. 2001), CCR7 (KALLINICH et al. 2005) und CXCR4 (HOGABOAM et al. 2005) festgestellt werden. CCR1 und CCR5 sind an dieser Stelle gesondert hervorzuheben, da Liganden dieser Chemokinrezeptoren, Methionin-CCL5, Aminooxypentan-CCL5 und NNY-CCL14, ebenfalls die Anreicherung von Eosinophilen in einem murinen Versuchsmodell minimieren, ohne CCR3 binden zu können (CHVATCHKO et al. 2003; GUPTA et al. 2006; SCHUH et al. 2002a).
CCL11 ist der bedeutenste Ligand des CCR3. Es wird von Endothelzellen, Epithelzellen, Fibroblasten, dendritischen Zellen und glatten Muskelzellen sezerniert und besitzt profibroblastische Effekte (PUXEDDU et al. 2006). Seine Konzentration korreliert mit dem Grad des Asthma (NAKAMURA et al. 1999). Weitere potente, native CCR3 Liganden sind beispielsweise CCL5 und CCL14(9-74) (DAUGHERTY et al. 1996; DETHEUX et al. 2000).
2.5.2 Virale Erkrankungen: AIDS
Relativ bald nach der Entdeckung, dass das Humane Immundefizienz-Virus „HIV“ CD4+-T- Zellen infiziert und sich in ihnen vermehrt, konnte man feststellen, dass dieses Virus neben dem CD4 auch andere Rezeptoren benötigt, um in die infizierbaren Zielzellen eindringen zu können. Aufgrund der Tatsache, dass bestimmte Chemokine, darunter CCL3, CCL4 und CCL5 (COCCHI et al. 1995), die zelluläre Invasion des HIV vermindern können, ließ sich der Chemokinrezeptor CCR5 als Corezeptor identifizieren (DENG et al. 1996). CXCR4, der Rezeptor von CXCL12, stellt einen weiteren weniger bedeutenden Corezeptor dar (FENG et al. 1996). Es werden zwei Unterstämme des HIV unterschieden, die je nach Infektionsweg als X4 (T-trope) oder als R5 (monozytotrope) Stämme bezeichnet werden können (BERGER et al. 1999).
CCR5 rückte vor allem in den Mittelpunkt der antiviralen Forschung, als eine Mutation im CCR5-Gen, CCR5∆32, identifiziert wurde. Die Träger eines solchen homozygoten, genetischen Defektes sind weitgehend gegen eine HIV-1 Infektion resistent, da die Corezeptorbindung dann nicht mehr möglich ist (LIU et al. 1996). Heterozygote Träger weisen nach DEAN et al. (1996) klinisch eine deutlich verlangsamte Progression zu AIDS auf (DEAN et al. 1996). Die Mutation des CCR5∆32 Allels tritt mit einer Frequenz von 5-14 % in Europa auf (SABETI et al. 2005; STEPHENS et al. 1998). In einer kaukasischen Population ist eine homozygote Mutation mit einer Prävalenz von ca. 1 % vertreten (DEAN et al. 1996).
Neben den erwähnten CCR5 Liganden zeigte unsere Arbeitsgruppe, dass auch CCL14(9-74) eine deutliche antivirale Aktivität besitzt (DETHEUX et al. 2000).
2.6 CCL14 und seine Derivate
CCL14 besteht aus 74 Aminosäuren und wird in verschiedensten Geweben konstitutiv exprimiert (SCHULZ-KNAPPE et al. 1996). CCL14 bindet und aktiviert CCR1 mit einer deutlich schwächeren Affinität als CCL3 (TSOU et al. 1998).
Bei der Untersuchung verschiedener N-terminal verkürzter CCL14-Analoga stellte sich CCL14(9-74) als die potenteste Form heraus. CCL14(9-74) ist ein starker Agonist von CCR1, CCR3 und CCR5 und ist somit auch ein potentieller HIV-Inhibitor (DETHEUX et al. 2000).
CCL14(9-74) wirkt chemotaktisch auf Monozyten, eosinophile Granulozyten und T-Zellen (FORSSMANN et al. 2001). Basierend auf früheren Studien mit dem CCR5-Super-Agonisten NNY-CCL5 (SABBE et al. 2001) wurde in Analogie dazu NNY-CCL14 synthetisiert. Der Austausch des N-terminal gelegenen Glycins durch die Nonanoylsäure resultiert in einer super-agonistischen Aktivität am humanen CCR3. Es ist signifikant effizienter als das natürlich vorkommende CCL14(9-74) und vergleichbar mit dem CCR3-Agonisten CCL11 in bezug auf die CCR3-Internalisierung, die Freisetzung von intrazellulärem Calcium und radikalen Sauerstoffspezies sowie die Chemotaxis. Zudem konnte in in vivo Versuchen in der Maus gezeigt werden, dass es nach einer i.v. Applikation zu einer verringerten Akkumulation von eosinophilen Granulozyten im Lungengewebe kommt (FORSSMANN et al. 2004).
In einer weiteren Studie konnte gezeigt werden, dass NNY-CCL14 sowohl humane als auch murine CCR1 und CCR5 internalisiert und desensitisiert. Muriner CCR3 kann im Gegensatz zu humanem CCR3 durch eine Inkubation mit NNY-CCL14 nicht internalisiert werden (GUPTA et al. 2006).
2.7 Chemokine und therapeutische Ansätze
Aufgrund der zuvor beschriebenen Rolle der Chemokine und ihrer Rezeptoren in pathologischen Prozessen, rückten diese in den Blickpunkt der Arzneimittelforschung. Es wurde in diesem Zusammenhang mit verschiedenen therapeutischen Ansätzen gearbeitet.
Für den Einsatz der sogenannten „small molecules“, welche die Rezeptoren durch Veränderungen ihrer Konformation oder durch die Verdrängung ihrer natürlichen Liganden antagonisieren, gibt es diverse Vor- und Nachteile. Da es sich bei Chemokinrezeptoren, wie bei H1- und H2-Histamin- und den α- und β-adrenergen Rezeptoren, um Gi-Protein- gekoppelte Rezeptoren handelt, wurde anhand dieser Vorbilder eine Vielzahl von Chemokinrezeptorantagonisten entwickelt. „Small molecules“ besitzen allerdings einen hohen Verteilungskoeffizienten, der zu einer starken Anreicherung der Substanzen im Gewebe führt.
Bei den aus Piperidin und Piperazin gewonnenen Präparaten ist die Gefahr von unerwarteten Nebenwirkungen groß, so wie es für verwandte Antihistaminika beschrieben ist (ELSNER et al. 2004).
Die aus Peptiden gewonnenen Derivate sind trotz ihrer schlechteren oralen Verfügbarkeit und ihrer limitierten Wirkungsdauer eine wichtige Alternative (ELSNER et al. 2004). Besonders in der antiviralen Forschung und mit der Entdeckung, dass natürliche Liganden der Corezeptoren des HIV dessen Infektivität mindern, begann man mit Chemokinen und deren Derivaten zu arbeiten. Die Entwicklung von CCL5-Derivaten ist dabei bisher wegweisend gewesen und am weitesten fortgeschritten. Dieses Chemokin ist aufgrund seiner bedeutenden Rolle als natürlicher Suppressor des HIV Vorreiter zahlreicher Modifikationen. Das Zweistufenmodell bildete die Grundvoraussetzung für effiziente Modifikationen am N- Terminus. Die Extension von CCL5 mit der Aminosäure Methionin führte zur Generierung eines Antagonisten. Dafür ist scheinbar die hydrophobe Seitenkette der hinzugefügten Aminosäure verantwortlich (PROUDFOOT et al. 1996). Daher wurde in einem weiteren Schritt ein Lipid, Aminooxypentan, N-terminal an CCL5 gekoppelt (HARTLEY u. OFFORD 2005). AOP-CCL5 erwies sich allerdings nicht als Antagonist, sondern als Super-Agonist für CCR5 (MACK et al. 1998; MAROZSAN et al. 2001; PROUDFOOT et al. 1999).
Nachfolgend wurde ein weiteres Derivat mit noch stärkerer Affinität, NNY-CCL5, durch den Einbau der langkettigen Carbonsäure n-nonanoyl (NNY) generiert. Beide Derivate besaßen,
einhergehend mit der gesteigerten Aktivität am CCR5, auch eine verstärkte antivirale Aktivität (MOSIER et al. 1999; SABBE et al. 2001).
Die Tatsache, dass Agonisten eine antivirale und antiinflammatorische Aktivität aufweisen, ist unter anderem auf die Rezeptorinternalisierung zurückzuführen. FORSSMANN et al konnten kürzlich zeigen, dass die i.v. Verabreichung des Super-Agonisten, NNY-CCL14, welcher zur Internalisierung von Chemokinrezeptoren führt und antiinflammatorisch im Tiermodell wirkt, von Mäusen gut toleriert wurde. Eine mögliche intravaskuläre Aktivierung von Eosinophilen führte dabei zu keinem offensichtlichen Schaden bei den Tieren. Das unterstreicht wiederum den therapeutischen Ansatz, der auf solchen Molekülen basiert (FORSSMANN et al. 2004).
In der zuvor beschriebenen Rolle der Glykosaminoglykane liegt ein weiterer therapeutischer Ansatz, da möglicherweise durch die Blockade bzw. Aufhebung der entsprechenden Bindungsstellen die Extravasation von Leukozyten und dementsprechend die Gewebsschädigungen verhindert werden können. Die Applikation von (44(AANA)47)-CCL5 konnte eine Thioglycolat-induzierte Zellrekrutierung in die Peritonealhöhle, sowie eine Ovalbumin (OVA)-induzierte Zellrekrutierung in die Lunge und auch eine myelines Oligodendrozyten Protein (MOG)-induzierte experimentelle autoimmune Enzephalitis (EAE) verhindern. Somit ist für die Neutralisation des BBXB-Motivs von CCL5 ein weiterer therapeutischer Ansatz dargestellt (JOHNSON et al. 2004).
Daher besteht das Interesse an einer weiteren Modifikation des Chemokinderivats, NNY- CCL14, welches sich im Tiermodell als wirksam erwies, zu arbeiten. NNY- CCL14(G50,A51), bei dem eine Mutation in der GAG-Bindungsstelle vorhanden ist, stellt eine neue interessante Ergänzung dar, die in dieser Kombination bisher noch nicht beschrieben wurde und hier weiter charakterisiert wird.
3 MATERIAL UND METHODEN
3.1 Chemokine
Die Chemokinderivate CCL14(9-74), NNY-CCL14 und NNY-CCL14(G50,A51) wurden nach bekanntem Protokoll von Frau Dr. Sylvia Escher bei IPF PharmaCeuticals GmbH synthetisiert (ESCHER et al. 2004). In allen Versuchen wurden CCL14(9-74) und NNY- CCL14 als Referenzsubstanzen eingesetzt.
3.2 Bestimmung der Heparinbindungsaffinität
Die Überprüfung der Heparinbindungsaffinität wurde in Kooperation mit Frau Dr. Sylvia Escher durchgeführt. Die Bindungsaffinität des im BBXB-Motiv veränderten NNY- CCL14(G50,A51) wurde mit Hilfe einer High Trap Heparin Säule (1 ml) ermittelt. Die Säule wurde in Puffer A (0,0125mol/l NaCl/0,025 mol/l Tris pH=8) equilibriert und jeweils 10µg der Derivate (0,5 µg/µl in H2O) injiziert. Die Chemokine wurden anschließend durch ansteigende Salzkonzentration (Puffer B 2 mol/l NaCl/0,025 mol/l Tris, pH=8) eluiert (Gradient: 0-25-50% B in 0-50-70 min) und mittels UV-Absorption bei 214 nm detektiert.
Über die Retentionszeit der Chemokine wird die zur Elution notwendige Salzkonzentration ermittelt. Diese Salzkonzentration ist ein Maß für die Stärke der ionischen Wechselwirkung zwischen Chemokin und Glykosaminoglykan, in diesem Fall Heparin.
3.3 Blutspender
Die für die Versuche verwendeten Zellen wurden aus dem Blut freiwilliger Spender gewonnen. Sie wurden nach den allgemeinen ethischen Grundsätzen aufgeklärt und gaben ihr Einverständnis. Es handelte sich hierbei sowohl um Nichtatopiker als auch Atopiker.
3.4 Zellisolation
3.4.1 Isolation von humanen Leukozyten
Den Spendern wurden ca. 90 ml venöses Blut entnommen. Zur Gerinnungshemmung wurden vorab 1 ml 0,1 mol/l EDTA pro 10 ml Blut in den Spritzen vorgelegt. Anschließend wurden vier Teile Vollblut mit einem Teil 6% Hydroxyethylstärke (HES) vorsichtig gemischt (d.h.
Raumtemperatur wurde der praktisch Erythrozyten-freie Überstand, welcher die Leukozyten enthielt, vorsichtig mit einer Stabpipette entnommen, in ein neues Röhrchen gegeben und mit PBS (phosphat buffered saline) auf 50 ml aufgefüllt. Dieses Gemisch wurde für 5 min bei 200 x g und 20°C zentrifugiert. Nach Absaugen des Überstandes wurde das Zellpellet in 20 ml RPMI 1640 resuspendiert und vorsichtig auf 15 ml Ficoll (Pharmacia) aufgetragen. Hiernach erfolgte die Dichtegradientenzentrifugation mit 500 x g, bei 20°C über 20 min und ungebremstem Auslauf. Hierdurch wurden die verschiedenen Blutzellen nach ihrer Dichte in Phasen aufgetrennt. Grundlage dafür bildet das in Ficoll enthaltene Röntgenkontrastmittel Isopaque, welches eine Dichte von 1,077 g/ml besitzt. Erythrozyten und Granulozyten (Ausnahme: basophile Granulozyten, die eine geringere Dichte haben) besitzen eine höhere Dichte und durchdringen die Phase des Ficolls, wohingegen sich die peripheren mononukleären Zellen (PBMC und Thrombozyten) aufgrund ihrer geringeren Dichte über der Phase des Ficolls befinden.
3.4.2 Aufbereitung von Monozyten
Während der weiteren Bearbeitung der Zellen wurde als Puffer PBS+ verwendet, dem 1 mg/ml bovines Serumalbumin zugefügt wurde. Zur Gewinnung von Monozyten wurde die milchige Interphase, die sich nach der Dichtegradientenzentrifugation gebildet hatte, vorsichtig und ohne sie zu durchstoßen mit einer Pasteurpipette entnommen. Die so gewonnenen PBMC wurden zweimal mit Puffer gewaschen (300 x g, 10 min, 4°C) und anschließend gezählt. Die weitere Isolierung erfolgte nach dem Protokoll des Herstellers mittels MicroBeads (Miltenyi Biotec). Zunächst wurden den Zellen Puffer (30 µl/ 107 Zellen), sowie FcR-Blocking Reagent (10 µl/ 107 Zellen) zugesetzt. Durch den direkt anschließend zugegebenen Biotin-Antibody Cocktail (10 µl/ 107 Zellen) wurden die Oberflächenproteine der unerwünschten T- und B-Lymphozyten, NK-Zellen, dendritischen Zellen und basophilen Granulozyten (CD3, CD7, CD16, CD19, CD56, CD123, CD235a) markiert. Nach einer 10-minütigen Inkubation bei 4° C im Kühlschrank wurde erneut 30µl Puffer/ 107 Zellen, und zusätzlich MACS Anti-Biotin Microbeads (20 µl/ 107 Zellen) zu den Zellen gegeben. Die Zellsuspension wurde gut gemischt, für 15 min bei 4°C inkubiert und erneut gewaschen (300 x g, 10 min, 4°C). Das Zellpellet wurde in 500 µl/ 108 Zellen resuspendiert und über eine Trennsäule (MACS Depletion LS Column) gegeben. Die Säule wurde mit 10 ml PBS nachgespült. Durch die immunmagnetischen Wechselwirkungen der Anti-Biotin Microbeads, welche die unerwünschten Zellen markierten, wurden diese Zellen
in der Trennsäule zurückgehalten. Das aufgefangene Eluat enthielt somit die Monozyten. Die Reinheit der Zellsuspension wurde entweder mittels Cytospot oder Durchflußzytometrie bestimmt und lag bei >90%.
3.4.3 Aufbereitung von eosinophilen Granulozyten
Zur Gewinnung der eosinophilen Granulozyten wurde das Zellpellet benötigt, in dem sich nach der Dichtezentrifugation auch noch restliche Erythrozyten befinden. Das Pellet wurde in 3 ml Aqua bidest. resuspendiert und die Erythrozyten somit lysiert. Die Behandlung wurde nach 25 bis 30 sec mit 7 ml 1,3%- NaCl–Lösung gestoppt. In den nachfolgend beschriebenen Schritten wurde lediglich mit PBS+ gearbeitet. Zur Trennung der eosinophilen von den restlichen Granulozyten wurde mit immunmagnetischen MicroBeads (Miltenyi Biotec) gearbeitet. Basierend auf der Tatsache, dass neutrophile Granulozyten im Gegensatz zu eosinophilen Granulozyten das Oberflächenprotein CD16 besitzen, wurden die Zellen mit CD16 mAk gekoppelten Beads (MACS CD16 Microbeads) (0,9 µl/ 106 Zellen) beladen, und 30 min bei 4°C inkubiert. Anschließend wurde die Zellsuspension auf eine Säule (MACS Depletion Column), die einem starkem Magnetfeld ausgesetzt wurde, gegeben. Aufgrund der immunmagnetischen Kräfte wurden die neutrophilen Granulozyten an der Säule fixiert und somit befanden sich die negativ selektierten eosinophilen Granulozyten in der gewonnenen Suspension. Diese wurden erneut gewaschen (200 x g, 5 min, 4°C), in den für das nächste Experiment erforderliche Puffer aufgenommen und gezählt. Die Reinheit wurde mittels Cytospot und anschließender DiffQuick Färbung (s.u.) bestimmt und lag bei >98%.
3.5 Zellkulturen
Murine transfizierte pre-B 300.19 Zelllinien wurden von B.Moser (Theodor Kocher Institut, Universität Bern, Schweiz) bezogen. Sie exprimierten entweder humanen CCR1, CCR3 oder CCR5 (GERBER et al. 1997). Es handelt sich hierbei um Suspensionszellen, welche in dem in Tabelle 6 beschriebenem Kulturmedium aufgenommen wurden. Diese Zelllinien wurden täglich subkultiviert und im Verhältnis 1:10 gesplittet. Es wurden Zellkulturflaschen mit einer Fläche von 75 cm2 und jeweils 10-15 ml Medium für ca. 8 – 10 Millionen Zellen eingesetzt.
Bei nachlassendem Wachstum wurde 0,1% β-Mercaptoethanol zum Medium hinzugefügt.
Jegliches Arbeiten mit diesen Zellkulturen bis zu ihrer Verwendung in den Versuchen erfolgte
3.6 Chemotaxis
Die Chemotaxis-Assays wurden in 48-Well Boyden-Mikro-Chemotaxiskammern nach einer im Labor etablierten Methode durchgeführt (FORSSMANN et al. 1997; FORSSMANN et al.
2004). In dieser Versuchsreihe wurde mit frisch isolierten Eosinophilen und Monozyten gearbeitet. Es wurden Peptidverdünnungen in Konzentrationen von 0,1 bis 1000 nM verwendet. Die Chemokine wurden im Dreifachansatz eingesetzt, als Negativkontrolle diente RPMI+ und als Referenzsubstanzen CCL14 sowie NNY-CCL14. Zur Durchführung der Chemotaxisassays wurden die Zellen in RPMI+ aufgenommen, bei einer Konzentration von 106 Zellen pro ml. Die Einhaltung dieser Zellkonzentration ist von großer Bedeutung, damit sich die Zellen in einem „monolayer“ auf dem Filter anordnen können.
In den unteren Teil der Kammer wurden pro Well 30 µl der gelösten und verdünnten Chemokine pipettiert. Auf den befüllten unteren Teil der Platte wurde ein Polyvinyl- Pyrrolidon–freier Polycarbonatfilter (25 x 80 mm mit 5 µm Poren (Nucleopore, Neurobe) mit Hilfe von Pinzetten mit der glänzenden Seite nach oben positioniert. Darüber wurde eine Gummimatte gelegt, der obere Teil der Kammer vorsichtig aufgesetzt, mit Schrauben fixiert und die oberen Wells mit jeweils 50 µl Zellsuspension (entspricht 5 x 104 Zellen) gefüllt. Die Kammern wurden für eine Stunde bei 37°C und 5% CO2 inkubiert. Nachfolgend wurde die obere Seite des Filters zur Entfernung der nicht migrierten Zellen mit PBS gewaschen und abgestrichen. Die Filter wurden luftgetrocknet und anschließend mit DIFFQuick Färbung (Dade Diagnostika) nach dem Protokoll des Herstellers gefärbt (Fixierung: 30 sec in Methanol, Färbung: jeweils 2 min in Eosin und Haematoxylin). Die getrockneten Filter wurden mit Entellan auf Objektträgern fixiert. Anschließend wurden fünf Gesichtsfelder im Mikroskop bei 1000facher Vergrößerung ausgezählt, um die Anzahl der migrierten Zellen zu bestimmen. Von den fünf ausgezählten Gesichtsfeldern wurden dann Mittelwerte bestimmt und anhand der Negativkontrolle die Migrationsindices oder der chemotaktische Index wie folgt berechnet: Quotient aus Stimulus-migrierten Zellen zu Medium-migrierten Zellen.
(FORSSMANN et al. 1997; FORSSMANN et al. 2004).
3.7 Rezeptorinternalisierung
Die Messung der Rezeptorinternalisierung wurde im Rahmen dieser Arbeit wie in vorherigen Studien beschrieben durchgeführt (DULKYS et al. 2001; ELSNER et al. 2000). Zur Messung der Fluoreszenzintensität wurde ein Durchflußzytometer (FACScane) verwendet.
Durchführung:
Die Rezeptorinternalisierung wurde an CCR3+- und CCR5+- transfizierten 300.19 Zelllinien, sowie mit natürlichen Zellen (Eosinophilen und Monozyten) durchgeführt. Im Falle der Zelllinien wurde die aus den Kulturflaschen gewonnene Suspension in PBS + 0,5% BSA aufgenommen und einmal in diesem Medium und zwei weitere Male in gepuffertem RPMI 1640 gewaschen. Die natürlichen Zellen wurden nach oben beschriebenem Protokoll isoliert.
Im Anschluss wurden die Zellen gezählt und auf 5 x 105 Zellen/150 µl RPMI + HEPES eingestellt. Je 150 µl Zellsuspension wurden in 15 ml-Röhrchen überführt und zügig durch 1,5 µl Stimulus ergänzt. Es wurde mit Peptidkonzentrationen von 100, 10 und 1 nmol/l gearbeitet. Bei einem Probenröhrchen wurde anstatt des Stimulus Puffer zugegeben. Um die Rezeptorinternalisierung zu ermöglichen, folgte eine 30-minütige Inkubation bei 37°C und 5% CO2. Nach Ablauf der Zeit wurde die Reaktion unverzüglich auf Eis gestoppt und die Röhrchen mit kaltem PBS + 0,5% BSA auf 5 ml aufgefüllt. Die Suspension wurde bei 300 x g und 4°C für 5 min zentrifugiert. Alle weiteren Schritte wurden auf Eis durchgeführt, als Medium wurde PBS + 0,5% BSA verwendet. Zur Messung der indirekten Fluoreszenzintensität wurde die Zellsuspension in gekühlte FACS Röhrchen überführt.
Anschließend wurden die Isotypenkontrollen 2,5 µl bzw. die 2,5 µl Primärantikörper anti- CCR1, -CCR3 oder -CCR5 mAk zugegeben und die Zellsuspension für 30 min auf Eis inkubiert. Nachfolgend wurden 1-2 ml PBS + 0,5% BSA ergänzt, die Zellen abzentrifugiert (200 x g, 5 min, 4°C) und dekantiert. Danach wurde zu der Zellsuspension 2,5 µl FITC- konjugierter-Ziege-anti-Maus Sekundärantikörper zu anti-CCR1 und -CCR5 bzw. FITC- konjugierter-Ziege-anti-Ratte Sekundärantikörper zu anti-CCR3 Primärantikörpern hinzugefügt. Nach einer weiteren Inkubation von 30 min, wurden zu den Zellen erneut 2,5 ml PBS + 0,5% BSA gegeben, anschließend wurden sie abzentrifugiert (200 x g, 5 min, 4°C), dekantiert, in 0,2 ml PBS + 0,5% BSA resuspendiert und bis zur Messung auf Eis gestellt.
Die Fluoreszenzintenstät wurde mit dem FACScan gemessen. Hier erfolgt eine Zellsortierung zunächst nach dem Prinzip der Durchflusszytometrie. Der Vorwärtsstrahler (forward Scatter)
sortiert die Zellen nach ihrer Größe, wohingegen der Seitwärtsstrahler (Side Scatter) die Zellen nach ihrer Granularität aufgesplittet. So wurden beispielsweise Monozyten aus PBMC gegated, d.h. in einem Feld markiert und somit für die weitere Messung ausgewählt. In einem zweiten Schritt wurden die fluoreszierenden Antikörper mit einem Strahler angeregt und so die Fluoreszenzintensität gemessen.
Die relative Oberflächenexpression wurde anschließend mit folgender Gleichung in Prozent ermittelt:
Median channel fluorescence (Zellen mit Stimulus) – median channel fluorescence (Isotypkontrolle, Zellen ohne Stimulus) * 100/ (median channel fluorescence (Negativkontrolle, Zellen ohne Stimulus) – median channel fluorescence (Isotypkontrolle, Zellen ohne Stimulus)
Beispiel:
Median (Isotypkontrolle, Zellen ohne Stimulus): 3,3; Median (Negativkontrolle, Zellen ohne Stimulus): 52,8; Median (Zellen mit Stimulus): 10,4
(10,4 – 3,3) x 100/ (52,8 - 3,3) = relative Oberflächenexpression von 14,3%
3.8 Intrazelluläre Calciummobilisation
Der Anstieg der intrazellulären Calciumkonzentration wurde in einem FLIPR (Fluorometric Imaging Plate Reader)-System mit einer Laserintensität von 0,4 W gemessen. Dieses Messsystem besteht aus vier Komponenten: dem Computer, einem Argon Laser, einem 96- Well Pipettor und der gekühlten CCD-Kamera. Als Calciumindikator wurde Fluo-4-AM verwendet. Die Acetoxy-Methyl(AM)-Modifikation ermöglicht dem Fluo-4-AM während der 30-minütigen Inkubationszeit bei 37°C, die Zellmembran zu durchdringen. Intrazellulär wird Fluo-4-AM durch zytoplasmatische Esterasen gespalten, wodurch eine freie Säure entsteht.
Diese besitzt die Fähigkeit, freie Calciumionen zu binden. Es ist ihr jedoch nicht mehr möglich, Zellmembranen zu durchdringen. Diese neugebildete freie Säure wird über den Argonlaser angeregt. So kann der Anstieg von intrazellulärem Calcium zuverlässig detektiert werden. Um das Streulicht so gering wie möglich zu halten, strahlt der Argonlaser seitlich auf die ausplattierten Zellen.
Auch hier wurde, wie bei der Rezeptorinternalisierung, mit CCR3+- und CCR5+- Transfektanten gearbeitet. Diese wurden zweimal mit HBSS+ (s. Tabelle 6) gewaschen und mit Hilfe einer Neubauerkammer gezählt. Pro 10-50 x 106 Zellen wurden 2µl Fluo-4-AM hinzugegeben, anschließend in 1 ml HBSS+ aufgenommen und gezählt. Diese Zellsuspension für 30 min bei 37°C inkubiert. Dem Farbstoff Fluo-4-AM wurde im Voraus ein Antischäummittel, Pluoronic F127, im Verhältnis 1:1 zugesetzt. Nach der Inkubation wurden die Zellen zwei weitere Male gewaschen und anschließend in soviel HBSS+ resuspendiert, um eine Endkonzentration von 4 x 105 Zellen in 150 µl zu erreichen. Auf einer schwarzen 96- Well Platte (Costar, 4 x 105 Zellen/Well) wurde diese Zellsuspension im Anschluss ausplattiert und für 1 Minute bei 200 x g bei 20°C zentrifugiert. Die Chemokine wurden auf einer Applikationsplatte zu jeweils 60 µl in vierfacher Konzentration vorgelegt. Danach wurde die Platte im FLIPR-System platziert, der Messzyklus gestartet und die Veränderungen der Fluoreszenz nach der automatischen Chemokinapplikation gemessen. Von den angesetzten 60 µl wurden während der Messung 50 µl zu der Zellsuspension pipettiert.
Die Messung der Calciumkonzentration erfolgte in drei aufeinanderfolgenden Schritten. Die ersten 10 Aufnahmen wurden alle sechs Sekunden angefertigt, anschließend 10 Aufnahmen innerhalb von 10 Sekunden (die Stimuli werden nach dem 12. Bild hinzupipettiert) und zum Abschluss 20 Aufnahmen alle sechs Sekunden. 100% entsprachen der maximalen Stimulation.
-2000 0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 16000 18000
0 50 100 150 200 250 300
Z ei t ( sek)
Abbildung 3. Darstellung einer Messung der intrazellulären Calciummobilisation mit der FLIPR- Methode
Die ersten sechs Aufnahmen wurden im Abstand von 10 Sekunden gemacht, im Anschluss 10 Aufnahmen pro Sekunde (Chemokinapplikation nach Bild 12) und abschließend 20 Aufnahmen alle 10 Sekunden
3.9 Statistische Auswertung
Die Anzahl der durchgeführten Versuche ist als n in den einzelnen Legenden dargestellt und repräsentiert jeweils unterschiedliche Blutspender. Die Ergebnisse aus Text und Figuren werden als Mittelwerte ± Standardfehler des Durchschnitts (standard error of the mean (SEM)) dargestellt. Die Berechnung erfolgte automatisch mit der Software SigmaStat TM für Windows (SPSS Inc., Erkrath). Die Signifikanz wurde mit dem t-test nach Student berechnet und p<0,05 wurde als signifikant akzeptiert. Die Graphiken wurden mit dem Computerprogramm GraphPad Prism erstellt.
3.10 Materialien
Tabelle 3. Chemikalien und Reagenzien
Chemikalien und Reagenzien Firma/Hersteller
Bovines Serumalbumin (BSA), Fraktion V pulverisiert, Nr. A4503, Lot. 129H913
Sigma, Deisenhofen
Bovines Serumalbumin (BSA), Fraktion V Serva Feinbiochemica GmbH & Co, Heidelberg
DiFFQuick Färbung bestehend aus folgenden Reagenzien:
Methanol, Eosin und Haematoxylin
Dade Diagnostika GmbH, Unterschleisheim
MACS CD16 (Eosinophilen) Isolierungskit Miltenyi Biotec, Auburn, CA Ethylene Diamine Tetra-Acetate (EDTA) Sigma, Deisenhofen
Entellan Merck, Darmstadt
Ficoll Pharmacia, Erlangen
Fluo-4-AM (Acetoxymethyl) Molecular Probes, Leiden, Niederlande HEPES gepuffertes HBSS (Hanks buffered salt
solution)
Invitrogen, Karlsruhe
Hydroxyethylstärke (HES) 6 % in isotonischer Kochsalzlösung
Fresenius Kabi GmbH, Bad Homburg
N-2-Hydroxylethyl-Piperazin-N-Ethan- Sulfonsäure (HEPES)
Life Technologies (Gibco BRL), Eggstein
Monozyten Isolierungs-Kit Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach
Natriumchlorid Merck, Darmstadt
Objektträger Menzel, Braunschweig
Phosphat gepufferte Salzlösung (PBS) Life Technologies (Gibco BRL), Eggstein
PBS zehnfach Life Technologies (Gibco BRL), Eggstein
Pluronic Molecular Probes, Leiden, Niederlande
RPMI 1640 Life Technologies (Gibco BRL), Eggstein
TRIS AppliChem, Darmstadt
Xylol Merck, Darmstadt
Tabelle 4. Geräte und Laborbedarf
Geräte und Laborbedarf Firma/ Hersteller
Costar Platten für FLIPR, 96-well Corning Incorporated, USA Boyden Chemotaxis Kammern NeuroProbe®, Gaithersburg, USA CO2-Brutschrank, Function Line Heraeus GmbH, Hanau
Durchflußzytometer (FACScan) BD Biosciences, Heidelberg FACS-Röhrchen (Minisorb-Röhrchen) 5ml Nunc GmbH, Wiesbaden High Trap Heparin HP Column (1ml) Amersham Pharmacia, Freiburg Kühlzentrifuge 6K10 mit Einsätzen für Platten Sigma, Deisenhofen
Laborwaage LC 2200S Sartorius Analytic, Göttingen Laborwaage A1205-D1 Sartorius Analytic, Göttingen LSColumn, Trennsäulen Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach Magnet für Trennsäule Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach
Magnetrührer MR 3001 Faust, Hamburg
Membranwischer NeuroProbe®, Gaithersburg, USA
Mikroskop Axioskop Zeiss, Göttingen
Modifizierte Boyden Chamber, 48 well NeuroProbe®, Gaithersburg, USA
Motorpipette easypet® Eppendorf, Hamburg
Multipette Eppendorf, Hamburg
Objektträger Menzel, Braunschweig
Pasteurpipette aus Plastik, 3 ml Elkay Eireann, Ireland Pipetten, einstellbar
(100-1.000 µl, 20-200 µl, 10-100 µl, 1-20 µl)
Eppendorf, Hamburg
Pipettenspitzen, weiß, gelb, blau Greiner, Frickenhausen Polycarbonatmembran PVPF, 25 x 80 mm
5 µm Porengröße
Whatman International Limited, Kent, England
Polypropylenröhrchen (“blue caps”), 15 ml Greiner, Frickenhausen Polypropylenröhrchen (“blue caps”), 50 ml Greiner, Frickenhausen Reaktionsgefäß 1,5 ml Greiner, Frickenhausen Serologische Pipetten (10 ml) Greiner, Frickenhausen Schüttler, KS 250 basic ILA Labortechnik, Staufen
Spritzen (30ml) Greiner, Frickenhausen
Zellkulturflaschen Sarstedt, Nümbrecht
Zellzählkammer nach Neubauer Blaub GmbH & Co. KG, Wertheim Zytozentrifuge (Cytospin 3)
Filter (thick and white, für eine Probenmenge von 0,5 ml)
Aufsätze und Gestelle
Shandon, Pittsburgh
Tabelle 5. Antikörper
Antikörper Firma/ Hersteller
Murine-anti-human CCR1 mAk Clone 53504.111; IgG2b
R&D Systems, Wiesbaden
Ratten-anti-humane CCR3 mAk Clone 61828.111; IgG2a
R&D Systems, Wiesbaden
Murine-anti-human CCR5-mAk Clone 2D7; IgG2a
BD Biosciences, Heidelberg
FITC oder PE-markierte Ziege-anti-Maus bzw.
Ziege-anti-Ratte Sekundärantikörper
Jackson Immuno Research Laboratories, Cambridgeshire, UK
Ratten und Maus IgG2a, Maus IgG2b Isotypkontrolle
R&D Systems, Wiesbaden
Tabelle 6. Puffer und Medien
Puffer und Medien Zusammensetzung
Puffer für die Heparinbindungsaffinität Puffer (A) 0,0125 mol/l NaCl
25 mmol/l TRIS, pH-Wert= 8,0 Puffer (B) 2 mol/l NaCl
25 mmol/l TRIS, pH-Wert= 8,0
Zellkulturmedium RPMI 1640
10% FCS
1% Penicillin/Streptomycin 1% L-Glutamin
1% Na-Pyruvat
0,1% β-Mercaptoethanol
Einfriermedium für Zellkulturen 50% komplettes Kulturmedium +40% FCS pur
+10% DMSO Puffer für Monozyten-Isolierung (PBS+) PBS
0,5 % BSA (Sigma) 0,1 mol/l EDTA Puffer für Eosinophilen-Isolierung (PBS+) PBS
0,5% BSA (Serva Feinbiochemica GmbH
& Co)
0,1 mol/l EDTA Medium für Chemotaxis-Versuche (RPMI+) =
Medium für Kontrollen
RPMI 1640 0,5% BSA Puffer für Rezeptorinternalisierung PBS + 0,5% BSA
RPMI 1640 + 25 mol/l HEPES Puffer für FLIPR-Versuche (HBSS+) 100 ml HBSS
0,1 % BSA 20 ml HEPES ad 1 l Aqua bidest
4 ERGEBNISSE
Die zu testende Substanz, NNY-CCL14(G50,A51), wurde in allen Versuchsreihen mit den Precursoren CCL14(9-74) und / oder NNY-CCL14 verglichen.
4.1 Ergebnisse der Überprüfung der Heparinbindungsaffinität
Für einige Chemokine konnte als GAG-Bindungsstelle ein BBXB-Motiv festgestellt werden.
(KOOPMANN et al. 1999; KOOPMANN u. KRANGEL 1997; PROUDFOOT et al. 2001;
SADIR et al. 2001). Dieses lag in CCL5 im Bereich der Aminosäuren 44-47.
In CCL14 ist ein solches Motiv im Bereich der Aminosäuren 49-52 vorhanden (s.Abb.4). Die beiden basischen Aminosäuren Lysin und Arginin dieses Motivs wurden in NNY- CCL14(G50,A51) durch ungeladene Aminosäuren ausgetauscht. Das nur bedingt basische Histidin wurde nicht ersetzt.
CCL5
SPYSSDTTPCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAVVFVTRKNRQVCANPEKKWVREYINSLEMS CCL14(9-74)
GPYHPSECCFTYTTYKIPRQRIMDYYETNSQCSKPGIVFIT(49)KRGH(52)SVCTNPSDKWVQDYIKDMKEN
NNY-CCL14(G50,A51)
NNY-PYHPSECCFTYTTYKIPRQRIMDYYETNSQCSKPGIVFITGAGHSVCTNPSDKWVQDYIKDMKEN
Abbildung 4. Aminosäuresequenzen von CCL5, CCL14 und NNY-CCL14(G50,A51)
Diese Abbildung veranschaulicht die Aminosäuresequenz von CCL5, CCL14(9-74) und NNY- CCL14(G50,A51). In NNY-CCL14 wurden die basischen Aminosäuren Lysin (K) und Arginin (R) (blau) durch Glycin (G) und Alanin (A) (rot) innerhalb des BBXB Motivs (unterstrichen) substituiert.
Die Bindungsaffinität wurde mit einer High Trap Heparin Säule bestimmt. Wie erwartet, waren die Retentionszeiten von NNY-CCL14(G50,A51) (21,4 min) wesentlich geringer als die von CCL14(9-74) (55,4 min) und NNY-CCL14 (56,2 min). Anhand der Retentionszeit wurden die Salzkonzentrationen berechnet, welche nötig sind, um die Derivate von der Heparinsäule zu eluieren. Diese waren, wie in Abbildung 5 dargestellt, ebenso wie die
