NNY-CCL14(G50,A51)
4.2 Ergebnisse der intrazellulären Calciummobilisation
Zur Bestimmung der biologischen Aktivität ist die Veränderung der intrazellulären Calciumkonzentration ein aussagekräftiges Signal, das fast am Anfang der Signalkaskade nach Rezeptoraktivierung steht. Durch die Bindung der Liganden an ihre Rezeptoren und der nachfolgenden Aktivierung werden verschiedene „second messenger“ Systeme aktiviert, wodurch u.a. die Freisetzung von Calcium aus den intrazellulären Speichern induziert wird.
Es wurde mit der FLIPR Methode gearbeitet und CCR1+-, CCR3-+ und CCR5+-Zelllinien sowie frisch isolierten PBMC eingesetzt.
4.2.1 Calciummobilisation vermittelt durch CCR1
0.1 1 10 100 1000
0 20 40 60 80 100
CCL14(9-74) NNY-CCL14
NNY-CCL14(G50,A51)
EC50:
CCL14(9-74): 2,2 nmol/l NNY-CCL14: 20,2 nmol/l NNY-CCL14(G50,A51): 45,6 nmol/l
Chemokinkonzentration (nmol/l)
Fluoreszenzänderung %
Abbildung 6. NNY-CCL14(G50,A51) ist ein moderater Agonist am CCR1
Zur Messung der Veränderungen der [Ca2+]i wurde mit der FLIPR-Methode gearbeitet. CCR1+ -300.19-Zelllinien wurden mit Fluo-4 inkubiert. Die Zellen wurden während der Messung mit CCL14(9-74) (n=16), NNY-CCL14 (n=13) und NNY-CCL14(G50,A51) (n=13) in Konzentrationen von 10-6 M bis zu 10-11 mol/l stimuliert. Die EC50-Werte wurden aus der Dose-Response Kurve mit Hilfe der Prism 3.03 Software berechnet
CCL14(9-74) ist ein bekannter Agonist am CCR1 (DETHEUX et al. 2000) und repräsentiert somit nicht nur den Precursor von NNY-CCL14(G50,A51), sondern dient auch als Positivkontrolle. Gleiches gilt für NNY-CCL14 (GUPTA et al. 2006).
Nach der Applikation von NNY-CCL14(G50,A51) kam es zu einer CCR1-vermittelten Calciummobilisation. Die EC50 Werte von NNY-CCL14(G50,A51) lagen bei 45,6 nmol/l und waren demnach deutlich erhöht im Vergleich zu NNY-CCL14 und CCL14(9-74). Bei diesen Derivaten lagen die EC50 Werte bei 20,2 nmol/l und 2,2 nmol/l.
4.2.2 Calciummobilisation vermittelt durch CCR3
In der nächsten Versuchsreihe wurde der Calciumflux aus den intrazellulären Speichern über eine Aktivierung am CCR3 bestimmt, da dieser eine wichtige Stellung im allergischen Geschehen innehat (ELSNER et al. 2004). Das natürliche CCL14(9-74) ist neben CCL11 ein bekannter Ligand dieses Chemokinrezeptors (DETHEUX et al. 2000). Seine Affinität konnte durch die N-Terminale Modifikation in NNY-CCL14 noch deutlich verbessert werden (FORSSMANN et al. 2004). Auch hier wurde mit transfizierten 300.19-Zelllinien gearbeitet.
0.1 1 10 100 1000
Abbildung 7. NNY-CCL14(G50,A51) mobilisiert deutlich weniger Calcium als seine Precursor am CCR3 Zur Messung der Veränderungen der [Ca2+]i wurde mit der FLIPR-Methode gearbeitet. CCR3+ -300.19-Zelllinien wurden mit Fluo-4 inkubiert. Die Zellen wurden während der Messung mit CCL14(9-74) (n=9), NNY-CCL14 (n=12) und NNY-CCL14(G50,A51) (n=15) in Konzentrationen von 10-6 mol/l bis zu 10-10 mol/l stimuliert. Die EC50 Werte wurden aus der Dose-Response Kurve mit Hilfe der Prism 3.03 Software berechnet.
NNY-CCL14(G50,A51) (EC50=422,2 nmol/l) zeigte eine stark reduzierte Aktivität am CCR3.
Es war ein deutlicher Shift im Vergleich zu dem Agonisten CCL14(9-74) (EC50=124,3 nmol/l) und dem Super-Agonisten NNY-CCL14 (EC50=17,9 nmol/l) am CCR3 zu erkennen, wie es in Abbildung 7 dargestellt ist.
4.2.3 Calciummobilisation vermittelt durch CCR5
Die Bedeutung von CCR5 als Corezeptor des HIV ist bestens bekannt (DENG et al. 1996).
Kürzlich konnte gezeigt werden, dass dieser CC-Chemokinrezeptor auch im allergischen Geschehen eine Rolle einnimmt, (CHVATCHKO et al. 2003; SCHUH et al. 2002a).
CCL14(9-74) und NNY-CCL14 sind Agonisten des CCR5. In der Messung der intrazellulären Calciummobilisation in 300.19-Zelllinien erwies sich NNY-CCL14(G50,A51) als genauso potenter Agonist am CCR5 (EC50=2,9 nmol/l) wie NNY-CCL14 (EC50=1,7 nmol/l) und
Abbildung 8. NNY-CCL14(G50,A51) besitzt eine ähnliche Aktivität am CCR5 wie seine Ursubstanz Zur Messung der Veränderungen der [Ca2+]i wurde mit der FLIPR-Methode gearbeitet. CCR5+ -300.19-Zelllinien wurden mit Fluo-4 inkubiert. Die Zellen wurden während der Messung mit CCL14(9-74), NNY-CCL14 und NNY-CCL14(G50,A51) (n=15) in Konzentrationen von 10-6 mol/l bis zu 10-10 mol/l stimuliert. Die EC50 Werte wurden aus der Dose-Response Kurve mit Hilfe der Prism 3.03 Software berechnet.
4.2.4 Calciummobilisation in PBMC
0.1 1 10 100 1000
0 20 40 60 80 100
NNY-CCL14, n=16 NNY-CCL14(G50,A51) CCL14(9-74), n=8
EC50:
NNY-CCL14: 4,3 nmol/l NNY-CCL14(G50,A51): 25,8 nmol/l CCL14(9-74): 3,4 nmol/l
Chemokinkonzentration (nmol/l)
Fluoreszenzänderung %
Abbildung 9. Calciummobilisation in PBMC ist durch die Mutation in NNY-CCL14(G50,A51) nicht beeinträchtigt
Zur Messung der Veränderungen der [Ca2+]i wurde mit der FLIPR-Methode gearbeitet. PBMC wurden mit Fluo-4 inkubiert. Die Zellen wurden mit CCL14(9-74) (n=8), NNY-CCL14 (n=16) und NNY-CCL14(G50,A51) (n=15) in Konzentrationen von 10-6 mol/l bis zu 10-10 mol/l. Die EC50
Werte wurden aus der Dose-Response Kurve mit Hilfe der Prism 3.03 Software berechnet.
Zu den peripheren mononukleären Zellen (PBMC) zählen u.a. Lymphozyten und Monozyten.
Monozyten exprimieren vornehmlich CCR1, CCR2 und CCR5 auf ihrer Oberfläche. Diese Chemokinrezeptoren werden von Lymphozyten nicht konstitutiv, sondern erst nach mehrtägiger in-vitro-Stimulation exprimiert. Die Calciummobilisation nach Applikation von NNY-CCL14(G50,A51) war, wie es für die Zelllinien beobachtet wurde, etwas reduziert im Vergleich zu NNY-CCL14 und CCL14(9-74). Die EC50 Werte nach NNY-CCL14(G50,A51) Gabe lagen bei 25,8 nmol/l, für NNY-CCL14 bei 4,3 nmol/l und für CCL14(9-74) bei 3,4 nmol/l.
4.3 Rezeptorinternalisierung
Als weiteres wichtiges Signal zur Charakterisierung der biologischen Aktivität wurde die Rezeptorinternalisierung, die unmittelbar nach Rezeptoraktivierung auftritt, gemessen. Die Rezeptorinternalisierung folgt im Anschluss an eine Rezeptoraktivierung und ist im Vergleich zu der Mobilisation des intrazellulären Calcium eine etwas komplexere Reaktion. Sie führt zu einer Desensitisierung der Rezeptoren, weshalb diese nicht mehr von später eintreffenden Reizen aktiviert werden können. In dieser Versuchsreihe wurde ebenfalls mit transfizierten Zelllinien und natürlichen Zellen gearbeitet. Die Rezeptorinternalisierung wurde mittels Durchflußzytometrie bestimmt.
Abbildung 10. NNY-CCL14(G50,A51) zeigte eine dosisabhängige CCR1-Internalisierung
300.19-CCR1+ Zelllinien wurden für 30 Minuten bei 37°C mit CCL14(9-74) (n=7), NNY-CCL14 (n=6), NNY-NNY-CCL14(G50,A51) (n=11) in Konzentrationen von 10-7- 10-9 mol/l inkubiert.
CXCL12 diente als Negativkontrolle. Anschließend wurden die Zellen mit anti-CCR1 mAk gefärbt und die Fluoreszenzintensität mit einem Durchflußzytometer gemessen. *, p < 0,05
Um die Fähigkeit von NNY-CCL14(G50,A51) CCR1 zu internalisieren zu überprüfen, wurde in diesem Versuch die CCR1+-Zelllinie eingesetzt. Durch den Einsatz verschiedener Konzentrationen (100, 10, 1 nmol/l) wurde die Erstellung einer Dosis-Wirkungs-Beziehung ermöglicht. Wie in Abbildung 10 dargestellt ist, induzierten alle eingesetzten Derivate bei der höchsteingesetzten Konzentration die stärkste Rezeptorinternalisierung. Bei 100 nmol/l lag die relative Oberflächenexpression des CCR1 nur noch bei 19,2 % (NNY-CCL14(G50,A51);
NNY-CCL14(G50,A51) vs. CXCL12, p=0,0001) und induzierte somit eine vergleichbare Internalisierung zu NNY-CCL14 (15,8 %; NNY-CCL14 vs. NNY-CCL14(G50,A51), p=0,3239). CCL14(9-74) vermochte CCR1 mit 3,6 % Oberflächenexpression signifikanter zu internalisieren (CCL14(9-74) vs. NNY-CCL14(G50,A51), p=0,0001). Mit sinkenden Konzentrationen wurde die Internalisierungsrate geringer. Bei 10 nmol/l lagen die relativen Oberflächenexpressionen für NNY-CCL14(G50,A51) immerhin noch bei 37,8 %, für CCL14(9-74) bei 11,2 % und für NNY-CCL14 bei 30,0 %. Eine Konzentration von 1 nmol/l NNY-CCL14(G50,A51) resultierte in einer CCR1-Oberflächenexpression von 54,1 %, CCL14(9-74) von 47,7 % und NNY-CCL14 von 46,5 % CCR1. Die Internalisierung war somit bei dieser Konzentration nicht mehr sehr effizient.
4.3.2 Internalisierung des CCR3
Abbildung 11. NNY-CCL14(G50,A51) internalisiert CCR3 nicht in CCR3+-Zelllinien
300.19-CCR3+ Zelllinien wurden für 30 Minuten bei 37°C mit CCL14 (n=6) oder NNY-CCL14(G50,A51) (n>5) mit Konzentrationen von 10-7- 10-9 mol/l inkubiert. CCL14(9-74), ein mäßiger Agonist des CCR3, wurde nur in einer Konzentration von 10-7 mol/l eingesetzt (n=5) CXCL12 diente als Negativkontrolle. Anschließend wurden die Zellen mit anti-CCR3 mAk gefärbt und die Fluoreszenzintensität mit einem Durchflußzytometer gemessen. . *, p < 0,05
Als Positivkontrollen und Referenzsubstanzen wurden der CCR3-Agonist CCL14(9-74) und der CCR3-Super-Agonist NNY-CCL14 eingesetzt. CXCL12 fungierte auch hier aufgrund seines Unvermögens CCR3 zu aktivieren als Negativkontrolle.
Es wurde mit CCR3+-Zelllinien gearbeitet. Die hohe Affinität von NNY-CCL14 und die
sich, da die relative Oberflächenexpression nach einer Inkubation mit NNY-CCL14 bei maximaler Konzentration auf 27,8 % sank. Nach einer Inkubation mit 100 nmol/l CCL14(9-74) lag die Oberflächenexpression bei 45,8 %. Die Inkubation mit NNY-CCL14(G50,A51) führte hingegen zu keiner signifikanten Reduktion der CCR3 Oberflächenexpression (CCL14(G50,A51) vs. CXCL12; p=0,18) und unterschied sich so von seinem Precursor NNY-CCL14 signifikant (NNY-NNY-CCL14 vs. NNY-NNY-CCL14(G50,A51); p=0,01). Der Unterschied zwischen der Rezeptorinternalisierung durch CCL14(9-74) und NNY-CCL14(G50,A51) war nicht signifikant (CCL14(9-74) vs. NNY-CCL14(G50,A51); p=0,30). Es konnten desweiteren auch nur geringe Differenzen zwischen den einzelnen relativen Oberflächenexpressionen nach NNY-CCL14(G50,A51) Gabe in den eingesetzten Konzentrationen beobachtet werden. Die relativen Oberflächenexpressionen lagen für NNY-CCL14(G50,A51) bei 64,5 % (100 nmol/l), 64,9 % (10 nmol/l) und 88,9 % (1 nmol/l). Für NNY-CCL14 wurde eine CCR3-Oberflächenexpression von 61,2 % (10 nmol/l) und 90,5 % (1 nmol/l) gemessen.
4.3.3 Internalisierung des CCR5
Abbildung 12. NNY-CCL14 induziert eine vergleichbare Rezeptorinternalisierung des CCR5
300.19-CCR5+ Zelllinien wurden für 30 Minuten bei 37°C mit CCL14(9-74) (n=9), NNY-CCL14 (n=7), NNY-NNY-CCL14(G50,A51) (n>7) mit Konzentrationen von 10-7- 10-9 mol/l inkubiert.
CXCL12 diente als Negativkontrolle. Anschließend wurden die Zellen mit anti-CCR5 mAk gefärbt und die Fluoreszenzintensität mit einem Durchflußzytometer gemessen. *, p < 0,05
Wie in den zuvor beschriebenen Experimenten wurde auch zur Überprüfung der CCR5-Internalisierung mit transfizierten Zelllinien gearbeitet. Sowohl CCL14 als auch NNY-CCL14 sind Agonisten des CCR5 und dienten somit als Referenzsubstanzen der GAG-Bindungsstellen-defizienten Mutante. CXCL12 wurde als Negativkontrolle eingesetzt.
Die Neutralisation des BBXB Motivs in NNY-CCL14(G50,A51) führte zu keiner signifikanten Veränderung seiner Fähigkeit, CCR5 zu internalisieren (NNY-CCL14 100 nmol/l vs. CCL14(G50,A51) 100 nmol/l, p=0,18; CCL14(9-74) vs. NNY-CCL14(G50,A51), p=0,1). Die in Abbildung 12 veranschaulichten Resultate verdeutlichen, dass NNY-CCL14(G50,A51) (relative Oberflächenexpression: 100 nmol/l: 30,7% (NNY-CCL14(G50,A51) vs. CXCL12; p=0,0001); 10 nmol/l: 56,4 %; 1 nmol/l: 69,5 %) in seiner Potenz und Effizienz bezüglich der CCR5-Internalisierung verbessert ist im Vergleich zu CCL14(9-74) (relative Oberflächenexpression: 100 nmol/l: 48,9 %; 10 nmol/l: 66,0 %; 1 nmol/l: 88,4 %), während NNY-CCL14 CCR5 tendenziell etwas stärker zu internalisieren vermochte (relative Oberflächenexpression 100 nmol/l: 18,1 %; 10 nmol/l: 43,1 %; 1 nmol/l:
56,9 nmol/l). Alle verwendeten Derivate zeigten mit steigender Konzentration eine verstärkte Internalisierung.
4.3.4 Internalisierung des CCR1 bei Monozyten
CCL14(9-74) 100
Abbildung 13. CCR1 wird durch NNY-CCL14(G50,A51) signifikant bei Monozyten internalisiert
Die PBMC wurden für 30 Minuten bei 37°C mit CCL14(9-74) (n>5), NNY-CCL14 (n=6) und NNY-CCL14(G50,A51) (n=8) (10-7 – 10-9 mol/l) inkubiert. Anschließend wurden die Zellen mit anti-CCR1 mAk gefärbt und die Fluoreszenzintensität mit einem Durchflußzytometer gemessen.
CCR1 wird von Monozyten, Lymphozyten, Eosinophilen, Basophilen und Neutrophilen exprimiert. Aus diesem Grund und um besser auf die in vivo Aktivität von NNY-CCL14(G50,A51) rückschließen zu können, wurde die CCR1-Internalisierung nicht nur in
gewonnen. Aus diesen wurden nach der Messung Monozyten mit Hilfe des FACScan Programms aufgrund ihrer Scatter-Eigenschaften gegated und so die CCR1-Internalisierung in Monozyten bestimmt.
Die Ergebnisse dieser Versuchsreihe stimmen im Wesentlichen mit denen der Zelllinien überein. CCR1 weist eine Oberflächenexpression von 18,5 % nach einer Stimulation mit 100 nmol/l NNY-CCL14(G50,A51) auf. In den niedrigeren Dosierungen hat die relative Oberflächenexpressionen Dosis-abhängig nicht so stark abgenommen (10 nmol/l: 37,1 %;
1nmol/l: 82,7 %). Eine Inkubation mit CCL14(9-74) resultierte in einer CCR1-Oberflächenexpression von 19,4 % und eine Inkubation mit NNY-CCL14 in einer relativen Oberflächenexpression von 15,0 % bei 100 nmol/l. Bei Konzentrationen von 10 und 1 nmol/l wurde eine relative Oberflächenexpression von 38,0 % und 67,4 % nach einer Inkubation mit CCL14(9-74) gemessen, und 28,8 % und 72,7 % nach einer Inkubation mit NNY-CCL14.
Daraus lässt sich eine vergleichbare Rezeptorinternalisierung (NNY-CCL14(G50,A51) vs.
NNY-CCL14; p=0,61 und NNY-CCL14(G50,A51) vs. CCL14(9-74); p=0,87) und somit auch Aktivität des NNY-CCL14(G50,A51) im Vergleich zu seinen Precursoren am CCR1 von nativen Zellen ableiten. Hiermit wird verdeutlicht, dass NNY-CCL14(G50,A51) mit ähnlicher Effizienz und Potenz CCR1 internalisiert.
4.3.5 Internalisierung des CCR3 bei Eosinophilen
Abbildung 14. NNY-CCL14(G50,A51) internalisiert CCR3 kaum bei Eosinophilen
Eosinophile Granulozyten wurden für 30 Minuten bei 37°C mit CCL14(9-74) (n=4), NNY-CCL14 (n>7), NNY-CCL14(G50,A51) (n=6) (10-7 – 10-9 mol/l) inkubiert. CXCL12 diente als Negativkontrolle. Anschließend wurden die Zellen mit anti-CCR3 mAk gefärbt und die Fluoreszenzintensität mit der Durchflußzytometrie bestimmt. *, p < 0,05
Die Fähigkeit CCR3 zu internalisieren wurde neben Zelllinien auch an eosinophilen Granulozyten getestet, da diese eine sehr hohe CCR3-Expression aufweisen.
Während CCL14(9-74) (relative Oberflächenexpression: 100 nmol/l: 24,7 %; 10 nmol/l: 56,5
%; 1 nmol/l: 80,4 nmol/l) und NNY-CCL14 (relative Oberflächenexpression: 100 nmol/l:
15,6 %, 10 nmol/l: 45,3; 1 nmol/l: 65,9 %) eine deutliche Internalisierung des CCR3 induzierten, war dieses durch NNY-CCL14(G50,A51) kaum möglich (NNY-CCL14(G50,A51) vs. CCL14(9-74); p=0,13, NNY-(NNY-CCL14(G50,A51) vs. NNY-CCL14;
p=0,0047) . Eine Differenz zwischen den Konzentrationen 10 (73,02 %) und 1 nmol/l (76,8
%) war praktisch nicht zu erkennen und auch die relative Oberflächenexpression von CCR3 bei 100 nmol/l (50 %) war nicht signifikant reduziert (NNY-CCL14(G50,A51) 100 nmol/l vs.
CXCL12 100 nmol/l; p=0,14). Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit den Resultaten der Messung der intrazellulären Calciummobilisation sowie der Rezeptorinternalisierung in CCR3+-Zelllinien, welche alle einen dramatischen Verlust an Aktivität an diesem Rezeptor aufwiesen.
4.4 Chemotaxis
Um die biologische Aktivität von NNY-CCL14(G50,A51) in Bezug auf die Rekrutierung von Zellen zu charakterisieren, wurden in vitro Mikrochemotaxisassays durchgeführt. Die chemotaktische Aktivität wurde mit frisch isolierten Eosinophilen und Monozyten bestimmt.
Bedeutend an Chemotaxisassays ist der Kurvenverlauf, der optimaler Weise glockenförmig verläuft. Entscheidend ist desweiteren die Beurteilung der Effizienz und Potenz, mit welcher Chemokine auf Zellen wirken. Als Orientierung zur Bestimmung der Potenz und Effizienz dient die maximale Zellmigration, der sogenannte Migrationspeak. Die Höhe dieses Peaks stellt die Effizienz und die Chemokinkonzentration, bei welcher der Peak auftritt, die Potenz dar. Umso höher der Migrationsindex ist, desto höher ist die Effizienz des Präparates. Je niedriger die Chemokinkonzentration des Migrationspeaks, desto höher ist die Potenz der getesteten Substanz.
4.4.1 Chemotaxisassays mit Monozyten
Monozyten tragen auf ihrer Oberfläche CCR1, CCR2 und CCR5, jedoch nicht in relevanten Mengen CCR3, den bei Eosinophilen prominenten Rezeptor. Eine glockenähnliche Migrationskurve war für NNY-CCL14(G50,A51) im untersuchten Konzentrationsbereich nicht mehr darstellbar. Die Effizienz ist, soweit ohne Migrationspeak darstellbar, nicht wesentlich reduziert, verglichen mit der Referenzsubstanz CCL14(9-74). Die maximale Migration durch NNY-CCL14(G50,A51) lag bei der maximal eingesetzten Konzentration 1000 nmol/l. Dahingegen zeigten die beiden Kontrollsubstanzen eine biphasische Migrationskurve. Die Migrationspeaks von NNY-CCL14 lagen zum einen zwischen 1000 und 100 nmol/l und zum anderen bei 1 nmol/l, wie es in Abbildung 15 illustriert ist. CCL14(9-74) induzierte eine maximale Migration bei 1000 und 1 nmol/l.
0.1 1 10 100 1000 0
2 4 6 8 10 12
CCL14(9-74) NNY-CCL14
NNY-CCL14(G50,A51)
Chemokinkonzentration (nmol/l)
M ig ra ti on si nd ex
Abbildung 15. NNY-CCL14(G50,A51) hat eine reduzierte chemotaktische Aktivität auf Monozyten Die Chemotaxisassays wurden in 48-Well Mikrochemotaxis Boyden Kammern für 60 min bei 37°C durchgeführt. Es wurden Konzentrationen von 10-6 bis 10-10 mol/l eingesetzt. Die migrierten Zellen wurden in 5 Gesichtsfeldern bei 1000facher Vergrößerung bestimmt.
Migrationsindices wurden anhand der Negativkontrolle bestimmt. CCL14(9-74) und NNY-CCL14 sind Positivkontrollen; hier dargestellt sind die gepoolten Daten von mehr als 6 verschiedenen Blutspendern.
4.4.2 Chemotaxisassays mit Eosinophilen
0.1 1 10 100 1000
0 2 4 6 8
NNY-CCL14(G50,A51) CCL14(9-74)