Bestimmung der Heparinbindungsaffinität

Die Überprüfung der Heparinbindungsaffinität wurde in Kooperation mit Frau Dr. Sylvia Escher durchgeführt. Die Bindungsaffinität des im BBXB-Motiv veränderten NNY-CCL14(G50,A51) wurde mit Hilfe einer High Trap Heparin Säule (1 ml) ermittelt. Die Säule wurde in Puffer A (0,0125mol/l NaCl/0,025 mol/l Tris pH=8) equilibriert und jeweils 10µg der Derivate (0,5 µg/µl in H2O) injiziert. Die Chemokine wurden anschließend durch ansteigende Salzkonzentration (Puffer B 2 mol/l NaCl/0,025 mol/l Tris, pH=8) eluiert (Gradient: 0-25-50% B in 0-50-70 min) und mittels UV-Absorption bei 214 nm detektiert.

Über die Retentionszeit der Chemokine wird die zur Elution notwendige Salzkonzentration ermittelt. Diese Salzkonzentration ist ein Maß für die Stärke der ionischen Wechselwirkung zwischen Chemokin und Glykosaminoglykan, in diesem Fall Heparin.

3.3 Blutspender

Die für die Versuche verwendeten Zellen wurden aus dem Blut freiwilliger Spender gewonnen. Sie wurden nach den allgemeinen ethischen Grundsätzen aufgeklärt und gaben ihr Einverständnis. Es handelte sich hierbei sowohl um Nichtatopiker als auch Atopiker.

3.4 Zellisolation

3.4.1 Isolation von humanen Leukozyten

Den Spendern wurden ca. 90 ml venöses Blut entnommen. Zur Gerinnungshemmung wurden vorab 1 ml 0,1 mol/l EDTA pro 10 ml Blut in den Spritzen vorgelegt. Anschließend wurden vier Teile Vollblut mit einem Teil 6% Hydroxyethylstärke (HES) vorsichtig gemischt (d.h.

Raumtemperatur wurde der praktisch Erythrozyten-freie Überstand, welcher die Leukozyten enthielt, vorsichtig mit einer Stabpipette entnommen, in ein neues Röhrchen gegeben und mit PBS (phosphat buffered saline) auf 50 ml aufgefüllt. Dieses Gemisch wurde für 5 min bei 200 x g und 20°C zentrifugiert. Nach Absaugen des Überstandes wurde das Zellpellet in 20 ml RPMI 1640 resuspendiert und vorsichtig auf 15 ml Ficoll (Pharmacia) aufgetragen. Hiernach erfolgte die Dichtegradientenzentrifugation mit 500 x g, bei 20°C über 20 min und ungebremstem Auslauf. Hierdurch wurden die verschiedenen Blutzellen nach ihrer Dichte in Phasen aufgetrennt. Grundlage dafür bildet das in Ficoll enthaltene Röntgenkontrastmittel Isopaque, welches eine Dichte von 1,077 g/ml besitzt. Erythrozyten und Granulozyten (Ausnahme: basophile Granulozyten, die eine geringere Dichte haben) besitzen eine höhere Dichte und durchdringen die Phase des Ficolls, wohingegen sich die peripheren mononukleären Zellen (PBMC und Thrombozyten) aufgrund ihrer geringeren Dichte über der Phase des Ficolls befinden.

3.4.2 Aufbereitung von Monozyten

Während der weiteren Bearbeitung der Zellen wurde als Puffer PBS⁺ verwendet, dem 1 mg/ml bovines Serumalbumin zugefügt wurde. Zur Gewinnung von Monozyten wurde die milchige Interphase, die sich nach der Dichtegradientenzentrifugation gebildet hatte, vorsichtig und ohne sie zu durchstoßen mit einer Pasteurpipette entnommen. Die so gewonnenen PBMC wurden zweimal mit Puffer gewaschen (300 x g, 10 min, 4°C) und anschließend gezählt. Die weitere Isolierung erfolgte nach dem Protokoll des Herstellers mittels MicroBeads (Miltenyi Biotec). Zunächst wurden den Zellen Puffer (30 µl/ 10⁷ Zellen), sowie FcR-Blocking Reagent (10 µl/ 10⁷ Zellen) zugesetzt. Durch den direkt anschließend zugegebenen Biotin-Antibody Cocktail (10 µl/ 10⁷ Zellen) wurden die Oberflächenproteine der unerwünschten T- und B-Lymphozyten, NK-Zellen, dendritischen Zellen und basophilen Granulozyten (CD3, CD7, CD16, CD19, CD56, CD123, CD235a) markiert. Nach einer 10-minütigen Inkubation bei 4° C im Kühlschrank wurde erneut 30µl Puffer/ 10⁷ Zellen, und zusätzlich MACS Anti-Biotin Microbeads (20 µl/ 10⁷ Zellen) zu den Zellen gegeben. Die Zellsuspension wurde gut gemischt, für 15 min bei 4°C inkubiert und erneut gewaschen (300 x g, 10 min, 4°C). Das Zellpellet wurde in 500 µl/ 10⁸ Zellen resuspendiert und über eine Trennsäule (MACS Depletion LS Column) gegeben. Die Säule wurde mit 10 ml PBS nachgespült. Durch die immunmagnetischen Wechselwirkungen der Anti-Biotin Microbeads, welche die unerwünschten Zellen markierten, wurden diese Zellen

in der Trennsäule zurückgehalten. Das aufgefangene Eluat enthielt somit die Monozyten. Die Reinheit der Zellsuspension wurde entweder mittels Cytospot oder Durchflußzytometrie bestimmt und lag bei >90%.

3.4.3 Aufbereitung von eosinophilen Granulozyten

Zur Gewinnung der eosinophilen Granulozyten wurde das Zellpellet benötigt, in dem sich nach der Dichtezentrifugation auch noch restliche Erythrozyten befinden. Das Pellet wurde in 3 ml Aqua bidest. resuspendiert und die Erythrozyten somit lysiert. Die Behandlung wurde nach 25 bis 30 sec mit 7 ml 1,3%- NaCl–Lösung gestoppt. In den nachfolgend beschriebenen Schritten wurde lediglich mit PBS⁺ gearbeitet. Zur Trennung der eosinophilen von den restlichen Granulozyten wurde mit immunmagnetischen MicroBeads (Miltenyi Biotec) gearbeitet. Basierend auf der Tatsache, dass neutrophile Granulozyten im Gegensatz zu eosinophilen Granulozyten das Oberflächenprotein CD16 besitzen, wurden die Zellen mit CD16 mAk gekoppelten Beads (MACS CD16 Microbeads) (0,9 µl/ 10⁶ Zellen) beladen, und 30 min bei 4°C inkubiert. Anschließend wurde die Zellsuspension auf eine Säule (MACS Depletion Column), die einem starkem Magnetfeld ausgesetzt wurde, gegeben. Aufgrund der immunmagnetischen Kräfte wurden die neutrophilen Granulozyten an der Säule fixiert und somit befanden sich die negativ selektierten eosinophilen Granulozyten in der gewonnenen Suspension. Diese wurden erneut gewaschen (200 x g, 5 min, 4°C), in den für das nächste Experiment erforderliche Puffer aufgenommen und gezählt. Die Reinheit wurde mittels Cytospot und anschließender DiffQuick Färbung (s.u.) bestimmt und lag bei >98%.

3.5 Zellkulturen

Murine transfizierte pre-B 300.19 Zelllinien wurden von B.Moser (Theodor Kocher Institut, Universität Bern, Schweiz) bezogen. Sie exprimierten entweder humanen CCR1, CCR3 oder CCR5 (GERBER et al. 1997). Es handelt sich hierbei um Suspensionszellen, welche in dem in Tabelle 6 beschriebenem Kulturmedium aufgenommen wurden. Diese Zelllinien wurden täglich subkultiviert und im Verhältnis 1:10 gesplittet. Es wurden Zellkulturflaschen mit einer Fläche von 75 cm² und jeweils 10-15 ml Medium für ca. 8 – 10 Millionen Zellen eingesetzt.

Bei nachlassendem Wachstum wurde 0,1% β-Mercaptoethanol zum Medium hinzugefügt.

Jegliches Arbeiten mit diesen Zellkulturen bis zu ihrer Verwendung in den Versuchen erfolgte

3.6 Chemotaxis

Die Chemotaxis-Assays wurden in 48-Well Boyden-Mikro-Chemotaxiskammern nach einer im Labor etablierten Methode durchgeführt (FORSSMANN et al. 1997; FORSSMANN et al.

2004). In dieser Versuchsreihe wurde mit frisch isolierten Eosinophilen und Monozyten gearbeitet. Es wurden Peptidverdünnungen in Konzentrationen von 0,1 bis 1000 nM verwendet. Die Chemokine wurden im Dreifachansatz eingesetzt, als Negativkontrolle diente RPMI⁺ und als Referenzsubstanzen CCL14 sowie NNY-CCL14. Zur Durchführung der Chemotaxisassays wurden die Zellen in RPMI⁺ aufgenommen, bei einer Konzentration von 10⁶ Zellen pro ml. Die Einhaltung dieser Zellkonzentration ist von großer Bedeutung, damit sich die Zellen in einem „monolayer“ auf dem Filter anordnen können.

In den unteren Teil der Kammer wurden pro Well 30 µl der gelösten und verdünnten Chemokine pipettiert. Auf den befüllten unteren Teil der Platte wurde ein Polyvinyl-Pyrrolidon–freier Polycarbonatfilter (25 x 80 mm mit 5 µm Poren (Nucleopore, Neurobe) mit Hilfe von Pinzetten mit der glänzenden Seite nach oben positioniert. Darüber wurde eine Gummimatte gelegt, der obere Teil der Kammer vorsichtig aufgesetzt, mit Schrauben fixiert und die oberen Wells mit jeweils 50 µl Zellsuspension (entspricht 5 x 10⁴ Zellen) gefüllt. Die Kammern wurden für eine Stunde bei 37°C und 5% CO₂ inkubiert. Nachfolgend wurde die obere Seite des Filters zur Entfernung der nicht migrierten Zellen mit PBS gewaschen und abgestrichen. Die Filter wurden luftgetrocknet und anschließend mit DIFFQuick Färbung (Dade Diagnostika) nach dem Protokoll des Herstellers gefärbt (Fixierung: 30 sec in Methanol, Färbung: jeweils 2 min in Eosin und Haematoxylin). Die getrockneten Filter wurden mit Entellan auf Objektträgern fixiert. Anschließend wurden fünf Gesichtsfelder im Mikroskop bei 1000facher Vergrößerung ausgezählt, um die Anzahl der migrierten Zellen zu bestimmen. Von den fünf ausgezählten Gesichtsfeldern wurden dann Mittelwerte bestimmt und anhand der Negativkontrolle die Migrationsindices oder der chemotaktische Index wie folgt berechnet: Quotient aus Stimulus-migrierten Zellen zu Medium-migrierten Zellen.

(FORSSMANN et al. 1997; FORSSMANN et al. 2004).

3.7 Rezeptorinternalisierung

Die Messung der Rezeptorinternalisierung wurde im Rahmen dieser Arbeit wie in vorherigen Studien beschrieben durchgeführt (DULKYS et al. 2001; ELSNER et al. 2000). Zur Messung der Fluoreszenzintensität wurde ein Durchflußzytometer (FACScane) verwendet.

Durchführung:

Die Rezeptorinternalisierung wurde an CCR3⁺- und CCR5⁺- transfizierten 300.19 Zelllinien, sowie mit natürlichen Zellen (Eosinophilen und Monozyten) durchgeführt. Im Falle der Zelllinien wurde die aus den Kulturflaschen gewonnene Suspension in PBS + 0,5% BSA aufgenommen und einmal in diesem Medium und zwei weitere Male in gepuffertem RPMI 1640 gewaschen. Die natürlichen Zellen wurden nach oben beschriebenem Protokoll isoliert.

Im Anschluss wurden die Zellen gezählt und auf 5 x 10⁵ Zellen/150 µl RPMI + HEPES eingestellt. Je 150 µl Zellsuspension wurden in 15 ml-Röhrchen überführt und zügig durch 1,5 µl Stimulus ergänzt. Es wurde mit Peptidkonzentrationen von 100, 10 und 1 nmol/l gearbeitet. Bei einem Probenröhrchen wurde anstatt des Stimulus Puffer zugegeben. Um die Rezeptorinternalisierung zu ermöglichen, folgte eine 30-minütige Inkubation bei 37°C und 5% CO2. Nach Ablauf der Zeit wurde die Reaktion unverzüglich auf Eis gestoppt und die Röhrchen mit kaltem PBS + 0,5% BSA auf 5 ml aufgefüllt. Die Suspension wurde bei 300 x g und 4°C für 5 min zentrifugiert. Alle weiteren Schritte wurden auf Eis durchgeführt, als Medium wurde PBS + 0,5% BSA verwendet. Zur Messung der indirekten Fluoreszenzintensität wurde die Zellsuspension in gekühlte FACS Röhrchen überführt.

Anschließend wurden die Isotypenkontrollen 2,5 µl bzw. die 2,5 µl Primärantikörper anti-CCR1, -CCR3 oder -CCR5 mAk zugegeben und die Zellsuspension für 30 min auf Eis inkubiert. Nachfolgend wurden 1-2 ml PBS + 0,5% BSA ergänzt, die Zellen abzentrifugiert (200 x g, 5 min, 4°C) und dekantiert. Danach wurde zu der Zellsuspension 2,5 µl konjugierter-Ziege-anti-Maus Sekundärantikörper zu anti-CCR1 und -CCR5 bzw. FITC-konjugierter-Ziege-anti-Ratte Sekundärantikörper zu anti-CCR3 Primärantikörpern hinzugefügt. Nach einer weiteren Inkubation von 30 min, wurden zu den Zellen erneut 2,5 ml PBS + 0,5% BSA gegeben, anschließend wurden sie abzentrifugiert (200 x g, 5 min, 4°C), dekantiert, in 0,2 ml PBS + 0,5% BSA resuspendiert und bis zur Messung auf Eis gestellt.

Die Fluoreszenzintenstät wurde mit dem FACScan gemessen. Hier erfolgt eine Zellsortierung zunächst nach dem Prinzip der Durchflusszytometrie. Der Vorwärtsstrahler (forward Scatter)

sortiert die Zellen nach ihrer Größe, wohingegen der Seitwärtsstrahler (Side Scatter) die Zellen nach ihrer Granularität aufgesplittet. So wurden beispielsweise Monozyten aus PBMC gegated, d.h. in einem Feld markiert und somit für die weitere Messung ausgewählt. In einem zweiten Schritt wurden die fluoreszierenden Antikörper mit einem Strahler angeregt und so die Fluoreszenzintensität gemessen.

Die relative Oberflächenexpression wurde anschließend mit folgender Gleichung in Prozent ermittelt:

Median channel fluorescence (Zellen mit Stimulus) – median channel fluorescence (Isotypkontrolle, Zellen ohne Stimulus) * 100/ (median channel fluorescence (Negativkontrolle, Zellen ohne Stimulus) – median channel fluorescence (Isotypkontrolle, Zellen ohne Stimulus)

Beispiel:

Median (Isotypkontrolle, Zellen ohne Stimulus): 3,3; Median (Negativkontrolle, Zellen ohne Stimulus): 52,8; Median (Zellen mit Stimulus): 10,4

(10,4 – 3,3) x 100/ (52,8 - 3,3) = relative Oberflächenexpression von 14,3%