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OEUTSCHE DEMOKRATISCHE ^REPUBLIK

PAT ENTSCHR1FT DD

^,,.)

^{275 704 A1}

(12)

Wirtschaftspat

nt (19)

UU

⁽¹¹⁾

Erteiltgemafc5 17Absatz ¹ Patentgesetz 4(51)

C

12

N

15/00

AMT FUR ERFINDUNGS- UND PATENTWESEN

IndervomAnmeldereingereichtenFassungveroffentlicht

(21)

WPC

¹²

N/

3200820 (22) 23.09.88 (44) 31.01.90

(71)

Akademie

derWissenschaften der

DOR.

Otto-Nuschke-StraBe22/23, Berlin, 1080.

DD

(72) Borriss, Rainer. Dr.sc. nat.;

Wobus,

Ulrich.Prof. Dr. sc. nat.;Mendel,Ralf-Rainer. Dr.rer.nat.;Baumlein, Helmut.Dr.rer. nat..

DD

(54) VerfahrenzurHerstellung

von

Gerstenpflanzen

(55)Glukanase. Brauindustrie, ViskositatderBraumaische. Braugerste. Expressionskassette.Gerstenpflanzen, rekombinantesPlasmid

(57)Die Erfindung beziehtsichaufeinVerfahren,daseinebeta-GIukanaseherzustellenerlaubt, dieinder

BrauindustriezurVerarbeitunggroBer

Rohfruchtmengen

eingesetzt

werden

kann,

um

die Viskositatder

Braumaisch

erhdhende Glukan-Verbindungenhydrolytischzuspalten;dafursoilnachMoglichkeitkeinodernuringeringer

Meng

einGlukanasepraparat verwendet werden, sonderndieBraugerste mitetnem Glukanase-Genbereits inder Pflanze versehensein.Zu

diesem Zweck

wirdein

Gen

fur diebeta-GIukanaseineinerExpressionskassetteangeordnet,dieauf einem Vektorplasmidkonstruiertwird,dasinGerstenpflanzentransformiert

werden muB.

Die transformierten

Pflanzen

werden

selektiertundregeneriertundliefernimMaischprozeSdieerforderlichebeta-GIukanase.

ISSN 0433-6461 Seiten

-1- 275 704

Patentanspruch:

Verfahren zur Herstellung von Gerstenpflanzen, insbesondere

fur die

Verwendung

in

der

Brauindustrie, die mit dem Gen

^fur

^eine thermostabile endo-beta-

1.3-1.4-Glukanase ausgestattet sind

dadurch gekennzeichnet,

daft

eine Expressionskassette

einschliefclich

des Gens

fur

die thermostabile endo-beta-1,3-1 ,4-Glukanase auf einem Vektorplasmid konstruiert wird, das

sich in

Escherichia

coli

vermehren

^laGt,dafJ

die DNS dieses nunmehr rekombinanten Plasmids

ⁱⁿ

Zellen von Gerstenpflanzen transformiert wird und nach Selektion von

tatsachlich

transformierten Zellen vollstandige

Gerstenpflanzen regeneriert werden, wobei

^die

Expressionskassette aus - einer pflanzlichen Promotor-Region,

- einer Transkriptions-Initiations-Region mit nachfolgender,

^fur

das Gen

fur

endo-beta-1

^,3-1,4-

Glukanase kodierenden Region

einschlieBlich

einem Stop-Signal

fur

die Translation, und - einer 3'-flankierenden Region

fur

korrektes processing und Polyadenylierung und damit

die

Expression der mRNS der endo-beta-1,3-1,4-Glukanase

besteht.

Anwendungsgebiet

^derErfindung

OieErfindungbetriffteinVerfahrenzurHerstellung

von

Gerstenpflanzen, insbesonderefurdie

Verwendung

inderBrauindustrie, diemit

dem Gen

fureinethermostabile endo-beta-1,3-1,4-GIukanaseausgestattetsind.

Charakteristikdes bekannten Standesder Technik

FurdieHerstellung verschiedener Nahrungs-,

GenuG-

undFuttermittel

werden

Glukanase-Praparateeingesetzt,

wenn

die hydrolytischeSpaltungder beta-glykosidischenBindungen vonbeta-1^.3-1,4-Glukanen beabsichtigtist;vor alleminder Brauindustriewird durchdenEinsattsolcher pflanzenglukan-hydrolisierender

Enzyme

dieVerarbeitung groGerer

Rohfruchtmengen,

zum

Beispiel

von

^{GersteanstellevonMalz,moglich,}

ohne daG

dabei SchwierigkeitenbeiderFiltration

und

LauterungderBraumaischeinfolge

ungenugend

abgebauter, viskositStserhohenderGlukan-Verbindungenzubefurchten waren.

Esistseitlangembekannt,die ViskositatderBraumaischemitHilfe

von

beta-GlukanasenmesophilerBacillus-Stamme,wievon BacillusamyloliquefaciensodervonBacillussubtilis,herabzusetzen/1/.

Auch

die

Verwendung

gentechnisch manipulierter Bacillus-Stamme,diedasbeta-Glukanase-Gen von^Bacillusamyloliquefaciensinamplifizierter

Form

aufeinemVektorplasmid enthalten,istzurVerbesserungderAusbeute vonmesophilerGlukanase entsprechend

einem

alterenVorschlag der gteichen Anmelderinbereits ins

Auge

gefaGt/2/.

DerNachteil dieservorbekanntenVerfahren bestehtdarin,daGein spezielles

Enzym

derBraumaischezugesetzt

werden muG

lediglich,urnderenViskositatabzusenken,ohne

daG

einsolches PrSparat sonst gebrauchtwurde,

und daG

nachAufbereitung derBraumaische daszugesetxte

Enzym

inaktiviertist.

Esistauch schonbekannt,das

Gen

furendo-beta-1,3-1,4-GlukanasevonBacillussubtilis inverschiedenen

Hefestammen

zur Expressionzubringen/3/;/4/;/5/;/6/.Oabei wird dieses

Gen

ⁱⁿeininSaccharomycescerevistae

autonom

replizierendes Plasmid eingebaut

und

alsSelektionsmarker^dieResistenzgegenuberKupfergenutzt.Leidersind beidiesenKonstruktionendie entstehendenTransformantenmitotisch^instabil,dasheiGt,nach mehreren Passagenaufnichtselektivem

Medium gehen

die Plasmideund damit daa Glukanase-Genverloren.

Ferneristes gelungen, eine Brauereihefe

-

Saccharomycescerevisiaevar.carlsbergensis

-

zukonstruieren, beiderdas

Gen

fur endo-beta-1,3-1,4-Glukanase desPilzesTrichodermareeseiindas

Genom

einerHefeintegriert

worden

ist/7/.Dabei wird aber dieses

Gen

durchAustauschmit

dem Gen

furPhosphoglyzeratkinaseindas

Chromosom

^{derHefeeingebaut.}

^Da

^{dieseKinaseein}

Enzym

der Glykolyseist

und

daazugehdrige

Gen

beim Einbaudes

Gens

furdieGlukanaseinmindestenseinerKopie verloren geht,

kommt

esbeidiesen Brauereihefen,dieⁱⁿder Regel polyploidsind,zur Verringerung der^AktivitStder

Phosphoglyzeratkinase

und

damitzu verminderter

Wach

stum sgeschwindigkeit

Inzwischen

wurden

diese Schwierigkeitendurcheinen Vorschlag derAnmelderin/8/^{teilweisebeseitigt.}

Troudem

istes generell unpraktisch,

daG

mikrobielle

Enzyme

furden Brauvorgangspeziellentwederdirektzugefuhrt

werden

mussen,

was

von

manchen

Herstellernalsnicht naturlichstriktabgelehntwird,oderdieBrauhefeentsprechendmanipuliert

werden muG,

wobeiaufden ferneren Zusatz

von Enzymen

nicht vollstandig verzichtetwerdenkann;in

jedem

Fallsinddiese Verfahrendurchwegkostspielig

und

erfordern standige technologische Betreuung.

Zlelder Erfindung

DieErfindunghatdasZiel,die Wirtschaftlichkeitdes Brauprozesseshinsichtlichder

Verwendung

vonendo-beta-1,3-1^,4- Glukanasezuverbessern

und

den

w

^{itgehendenEinsatzvon}Gersten-Rohfruchtanstelle

von

Malzzuermoglichen,

ohne

^die obenausfuhrlichb schriebenen SchwierigkeitenⁱⁿKauf

nehmen

zumussen.

-2- 275 704

Darlegungdes

Wesens

der Erfindung

Demzufolgehat sich dieErfindungdieAufgabegestellt,Gerstenpflanzen genetisch sozuverandern.

daG

sieim BrauprozeG selbst

genugend

endo-beta«1.3«1,4-Glukanasebereitstellen,

ohne daG

spezielleZusatzedirektoder uberdieBrauhefe bendtigt werden,

und

daftdieseGlukanasebereits gebildetwird,

wenn

dieGerstensamenreifen.

ErfindungsgemaGwirddieAufgabe dadurchgeldst, dafteineExpressionskassetteeinschlieGlichdes

Gens

furdiethermostabile endo-beta«1,3-1,4-Glukanaseaufeinem Vektorplasmidkonstruiert wird,dassichvorzugsweiseinEscherichiacoli

vermehren

laGt,dafldie

DNS

dieses

nunmehr

rekombinanten PlasmidsinZellenvonGerstenpflanzentransformiertwird

und

nachSelektion vontatsachlichtransformiertenZellenvollstandigeGerstenpflanzenregeneriertwerden, wobeidieExpressionskassetteaus einer pflanzlichenPromotor-Region,einer Transkriptions-lnitiations-Regionmit nachfolgender,^furdas

Gen

furendo-beta-1,3-

1,4-Glukanase kodierenden RegioneinschlieGlich

einem

Stop-Signalfordie Translation,

und

einer 3'-flankierendenRegionfur korrektesprocessingundPolyadenylierung

und

damitdieExpression der

mRNS

der endo-beta-1,3-1,4-Glukanasebest;^'r

Aufdiese

Weise werden

die NachteiledesStandesderTechnikinuberraschendeinfacherWeisebeseitigt.DurchdieErfindung

la'Gtsich

nun

dieBildung der thermostabilen endo-beta-1,3-1,4-Glukanasebeliebig steuern.

Son

kann

man ohne

Schwierigkeit erreichen,

daG

dasGenproduktbereitsimnichtgekeimten Gerstenkorn akkumuliertwird,so

daG

derAnteilunvermalzter Gerstenrohfruchtbeim Maischvorgang ohneweiteres erhdhtwerdenkann.BemerkenswerterweisegestattetesdieErfindung, aufmikrobielles

Enzym

zu verzichtenund damit den Brauvorgangzuverbilligen,

ohne daG

indensonstigentechnologischen ProzeGeingegriffen

werden

muGte.

Ausfuhrungsbelspiel

OieErfindung wirdnachstehendaneinemAusfuhrungsbeispiel nahererlautert.OazuwirdinTabelle 1dieNukleotid-Sequenz einesDNS*Fragmentesmit

dem Gen

furdieendo-beta-1,3-1,4-GlukanasevonBacillusmacerans angegeben.

Oas

Gen

furdieendo-beta-1.3-1,4-Glukanase- nachfolgendkurzGlukanase-Gen

genannt-

wirdinbekannterWeise/9/aus Bacillusmacerans

gewonnen

undkloniert.

Ausgehend von

einem

DNS-Fragment

von 850Basenpaaren,dasdiegesamte kodierendeRegionfurdasGlukanase-GeneinschlieGlichder komplettenPromoter-Regiontr3gt/9/,

werden

mittelsdes RestriktionsenzymsDral die ersten70 Nukleotide

am

5'-Ende desONS-Fragmentesentfernt.DieseSchnittstellebefindetsich 23 Nukleotide vor

dem

ATG-Startkodon und^fuhrtzueinerpartiellenEntfernung desPromotorsstromaufwarts der -10-Region.

Die bakterielleRibosomen-Bindungsstellebleibt erhalten.InderTabelleistdiekomplette Nukleotid-Sequenz des

DNS-Fragmentes

gezeigt.NachKlonierungdesverkurzten.

nun

aus nurnoch780Basenpaaren bestehenden

DNS-Fragmentes

in

einen Vektor

dUC

^19/9/andenSchnittsteltenHindIII

und

DraI/Hinc^IIwirddaspartiellpromotorlose,verkurzte

DNS-Fragment

ⁱⁿ folgender

Weise

innerhalb der.multicloningsite^-desVektorspUC19eingebaut:5'-Ende- Hindllt/Sph l/PstI-

DNS

Fragment - Xbal/BamHI/Smal/Kpnl/Sacl/EcoRI

-

3'-Ende.Damithat

man

einen

Modul

furden AufbaueinerExpressionskassette

gewonnen.

ZurSteuerungderExpression des

Gens wahrend

derSamenreife

werden

Promotorenaus derAckerbohne/10/ verwendet,die nachweislichauchinanderenPflanzennachgeschaltete

Gene

exprimieren/10/.DasPlasmid p^delta4/12/10/enthaitden Promotor des Samenprotein-Gens Legumin B4/11/;durch dessenSpaltunganseiner (unikalen)

BamH

1-Schittstellewird das Glukanase-Geneingefugt;dabeiistseine richtigeOrientierung zusichern.DarananschlieGend wirdeine pflanzltche

3'-flankierendeRegioneingeschieust; ein

Sau3

A-Fragment des Samenprotein-Gens

Legumin B4

enthait dienotwendigen Sequenz-Stucke.

Die3'-flankierendeRegion kannauchleichtaus

einem

vorbekanntenPlasmidpOcs2/12/ mittels einerBamHI-Hindlll- Doppelspaltung

gewonnen

werden.

Eine sohergestellteExpressionskassettegestattetes,daszugehorige Vektorplasmid unmittelbarzur direktenTransformation vonZellen

von

Gerstenpflanzeneinzusetzen.

Esistauchmoglich, einensamenspezifischenPromotorP30.1 zuverwenden,deraufeinemPlasmid

pUC/USPP

vorliegt/10/.

Nach

einerLinearisterung mittelsdes Restriktionsenzyms BglIIkannwieobenbeschrieben verfahrenwerden,

und man

erhalt auchaufdiesem We<}eeinfurdiedirekteTransformation geeignetes Vektorplasmid.

InbeidenFallenkonnendaruber hinautPromotor-Gen-Fragmente

gewonnen

werden,die zusatzlich

zum

Promotor

und

zurfur die*_5-'-Regionder

mRNS

kodierendenSequenzTeilederSamenprotein-Kodierungs-Sequehz^enthalten,

um

die korrekte Kanalisierung

und

Speicherung der endo-beta-1^,3-1,4-Glukanaseim Gersten-Endospermzusichern.

EineandereMdglichkertbesteht darin. dieSteuerelemente,also diePromotoren

zusammen

mftden3'-Regionen,aus

den

Samenprotein-Genender GersteselbstoderandererGetreide zuverwenden;beispielsweiseeinHindIH-BstX1-Fragment des Gersten-Hordein-Gens B1alsPromotor undein

Xba

l-Hind Ill-Fragmentals3'-Region/13/.DieseFragmente

werden zusammen

mit

dem

aus780 Basenpaaren bestehenden

DNS-Fragment

mit

dem

Glukanase-GeninfachublicherWeiseindasbereits genannte Plasmid

pUC

¹8 eingebaut

und

direkttransformiert,gegebenenfalls

zusammen

miteinemSelektionsmarker.

Auch

ein Hafer-Samenprotein-Promotorals

BamH

^1-HindIll-Fragmentaus einemPlasmidpPg108/14/istfurdiesen

Zweck

geeignet.

SchlieGlichkanndieExpressionskassette,

ohne

dieErfindung zuverlassen,auchineinemTi-Plasmid-Vektortransformiert werden.Inunmittelbarer Nachbarschaft der Expressionskassettebefindet sichwiebereitserwahnteinin

den

Gerstenpflanzen selektierbaresMarker-Gen,beispielsweisedasdieKanamyzin-Resistenz vermittelndenpt-Genunterder Kontrolleeines konstitutivenPromotors wieetwa

CaMV35S.

DieTransformation wirdwiefolgtdurchgefuhrt.

Aus

einerSuspensions-ZellkulturvonGerste

werden

Protoplasteninbekannter Weise/15/^isoliertundin

einem Medium

resuspendiert,welches 0,6MolMannitsowie 60^{- 10~3}MolCaCI₂und^10~3Mol MES-Puffermiteinem pH-Wert

von

5,6 enthait.

DieProtoplasten

werden

einerHitzebehandlungvon 45*Cuber5minunterzogenund dannaufRaumtemperaturabgekuhlt.Zu 10⁶Protoplastenineinem

Volumen

von0,25^•10"³_I

wecden

15^{• 10"*}gVektor-DNSin zirkularer

Form

in

einem Volumen

von 15^• 10~*lzugesetztsowiedaran anschlieGend0,1 ^• 10"^J_IPolyethylenglykol6000(24°Cin0,6Mol Mannit

und

^10*JMol

MES-Puffer miteinem pH-Wert von5,6).Nach

30min

InkubationbeiRaumtemperaturwirdin2 ^•

10°

I

KAO-Medium/1

6/ eingebettet.

-3- 275 704

dasnur Vs der Konzentration anMakro-

und

Mikrosalzenenthaltundals

Osmotikum

Mannit(Gesamtmolaritat

=

0,7osmol).als

Hormone

^10"3g/lZeatin

und

^10"3g/l2,4-0sowieniedrigschmelzendeAgarose(Endkonzentration = 0,6%) von BRL/17/ undals selektives

Agens

10. ..20^• 10~³_g/lG418.

Heranwachsende

Kolonien

werden

aufAktivitatder

vom

npt-Marker-Gen kodiertenNeomyzin-Phospho-Transferase

und

auf korrekte Integrationder Expressionskassette, (Southern-Hybridisierung)^getestet.

Auf

dieseWeiseselektierte Calli

werden

zu Gerstenpflanzenregeneriertundauf Expressiondes Glukanase-Gens

wahrend

derSamenreifekontrolliert.

Lit«ratur

/I/ Borriss,R.u.Schroeder.K.-UZbl.Bakt.II.Abt..136(1981),S.324-329 111 DD-Patentschrift226012

/3/ G8-Patentschrift 21

75590

/4/ EP-Patentschrift147198

/5/ Cantwell, B.A.etal.,Curr.Genet.11 (1986), S.65-70 /6/ Hinchliffe,E./Box,W.G.,Curr.Genet. 8(1984),S.471-475 111 Penttilae,M.E.etal.,Curr.Genet. 12(1987),S.413-420 /8/ DD-Patentanmeldung

WP

C12N/317 51 8

4

ISI DD-Patentanmeldung

WP

C12N/315706

1

n

⁰¹ DD-Patentanmeldung

WP

C12N/305¹

366

/11/ DO-Patentschrift240911

/121 Montagu,M.^v.etal..Lab.Genet./Univ. Gent,unveroffentl.

/13/ Brandt,A.etal.,CarlsbergRes.

Comm.

50(1985),S.333-345

/14/ Schubert,R. etal.,ZentralinstitutfurGenetik

und

Kulturpflanzenforschung der

AdW

derDDR,unveroffentl.

/15/ Luehrs,R./loerz,H.,Planta (imDruck)

/16/ Kao, K.M./Michayluk,M.R.,Planta 115(1974),S.355-367 /17/ Hersteller:Gribzo/BRL

GmbH

(BW)

-4- 275 704

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File 350:Derwent World Patents Index

1963-1980, EQUIVALENTS THRU DW=9247

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DERWENT WORLD PATENTS INDEX-LATEST 1981+;DW=9250,UA=9237,UM=9208

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Set Items Description

?s pn=dd 275704

SI 1 PN=DD 275704

?t sl/9/all

1/9/1 ^{(Item 1} from file: 351) 008323630 WPI Acc ^No: 90-210631/28 XRAM Acc No: C90-091021

Prepn. of barley plants expressing heat stable beta-glucanase

- by

transforming cells with appropriate vector then regeneration giving

seeds useful in brewing without conversion to malt

Index Terms: PREPARATION BARLEY PLANT EXPRESS HEAT STABILISED BETA

GLUCANASE; TRANSFORM CELL APPROPRIATE VECTOR REGENERATE SEED USEFUL

BREW CONVERT MALT

Patent Assignee: (DEAK

)

AKAD WISSENSCHAFT DDR

Author (Inventor): BORRISS R; WOBUS U; MENDEL R R; BAUMLEIN H Number of Patents: 001

Patent Family:

CC Number Kind Date Week

DD 275704 A 900131 9028 (Basic) Priority Data (CC No Date): DD 320082 (880923) Abstract (Basic)

^:

DD 275704

Prodn. of barley plants provided with the gene (I) for a

heat-stable endobeta-1, ^3-1, 4-glucanase (A) comprises (1)

constructing

an expression cassette including ^{(I) in a} vector plasmid, (2)

replicating this in E.coli, ₍₃₎ transforming the plasmid DNA into

barley cells (4) selecting transformed cells and (5)

regenerating these

into complete barley plants.

The cassette consists of (1) a plant promoter region,

(2) a

transcription initiation region, followed by a region contg..

(I) plus a

translation stop signal and (3) a ³ '-flanking region for correct

processing and polyadenylation, ensuring expression ^of the mRNA for

(A)

.

USE/ ADVANTAGE ^- These plants are ^esp. useful in brewing, (A)

accumulates in the ripe (but ungerminated) ^{seeds, so} the proportion of

such seeds, relative to malted seeds, used in the mashing process can

be increased, without causing an unacceptable increasing in viscosity.

Addn. of an exogeneous ^{(A) is} not required. @(5pp Dwg.No.O/l)@

File Segment: CPI Derwent Class: D16;

Int Pat Class: C12N-015/00

Manual Codes (CPI/A-N)

^:

D05-B01

?logov"Hf

f

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