Aus dem Zentrum Anatomie
Abteilung funktionelle und angewandte Anatomie der Medizinischen Hochschule Hannover Arbeitsgruppe vergleichende Lymphangiologie
(Prof. Dr. D. Berens von Rautenfeld)
EINE METHODE ZUR DARSTELLUNG INITIALER LYMPHGEFÄSSE IN DER MUNDSCHLEIMHAUT DES MENSCHEN
Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Zahnmedizin der Medizinischen Hochschule Hannover
vorgelegt von Angelika Alt aus Hannover Hannover, 2006
Angenommen vom Senat der Medizinischen Hochschule Hannover
am 27.04.2006
Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover
Präsident: Prof. Dr. med. D. Bitter-Suermann
Betreuer der Arbeit: Prof. Dr. D. Berens v. Rautenfeld
Referent: Priv.-Doz. Thomas Tschernig
Koreferent: Prof. Dr. Dr. Alexander Schramm
Tag der mündlichen Prüfung: 27.04.2006
Promotionsausschussmitglieder:
Prof. Dr. Ernst Ungewickell Prof. Dr. Kurt Wonigeit
Prof. Dr. Harald Tschernitschek
Inhaltsverzeichnis
1 EINLEITUNG UND PROBLEMSTELLUNG...6
1.1 Schrifttumsübersicht ... 7
1.1.1 Nomenklatur ... 7
1.1.1.1 Anatomischer Aufbau des Lymphgefäßsystems und Vergleich mit dem Blutgefäßsystem ... 7
1.1.1.2 Nomenklatur der Lymphgefäße unter topographischen, funktionellen und strukturellen Gesichtspunkten ... 8
1.1.1.3 Lymphkapillaren ... 9
1.1.1.4 Präkollektoren ... 11
1.1.2 Drainagegebiete der Lymphgefäße im Mund- und Gesichtsbereich ... 11
1.1.2.1 Lymphknoten... 11
1.1.2.2 Drainagegebiete aus dem Gesichtsbereich ... 11
1.2 Problemstellung der vorliegenden Arbeit... 13
2 MATERIAL, TECHNIK UND METHODEN...15
2.1 Patientengut ... 15
2.2 Größe der Mundschleimhautbiopsien ... 15
2.3 Materialentnahmetechniken... 15
2.4 Präparatespanner... 16
2.5 Injektionstechnik mit Berliner Blau ... 19
2.6 Indirekte Applikationstechnik mit Glutaraldehyd ... 19
2.7 Indirekte Applikationstechnik mit Tardoplast ... 21
3 ERGEBNISSE...23
3.1 Topographie der initialen Lymphgefäße... 23
3.2 Injektionstechnik mit Glutaraldehyd - Initiale Lymphgefäße im rasterelektronenmikroskopischen Bild... 27
3.2.1 Lymphkapillaren ... 27
3.2.2 Präkollektoren... 33
3.2.3 Kollektoren... 34
3.2.4 Interendotheliale Öffnungen ... 36
3.2.5 Anker- und Basalfilamente ... 37
3.2.6 Intraluminale Gefäßstrukturen der Lymphkapillaren ... 37
3.2.7 Interendotheliale Brücken... 37
3.2.8 Trabekel... 37
3.2.9 Spindelzellen ... 38
3.2.10 Lymphgefäßklappen ... 38
4 DISKUSSION...39
4.1 Diskussion der Methoden ... 39
4.1.1 Aufarbeitungsmethoden der Schleimhautbiopsien... 39
4.1.1.1 Extensionstechnik ... 40
4.1.1.2 Vakuumtechnik... 40
4.1.1.3 Perfusion mit Berliner Blau... 40
4.1.1.4 Perfusion mit Mercox oder Tardoplast ... 41
4.1.1.5 Direkte und indirekte Lymphographie ... 41
4.1.2 Einfluss der Präparationsmethode auf die Größen- und Abstandsmessungen 43 4.1.3 Rasterelektronenmikroskopisches Auswertungsprinzip... 43
4.2 Diskussion der Ergebnisse ... 43
4.2.1 Abhängigkeit der Qualität der Ergebnisse von der Größe der Materialproben.. 43
4.2.2 Abhängigkeit der Darstellungsqualität der Lymphgefäße von der ... Perfusionsgeschwindigkeit ... 44
4.2.3 Abhängigkeit von der Perfusionsdauer auf den Endothelüberzug initialer Lymphgefäße ... 45
4.2.4 Rasterelektronenmikroskopische Unterscheidung von Lymph- und Blutkapillaren ... 45
4.2.5 Andere Methoden zur Unterscheidung von Blut- und Lymphkapillaren ... 46
4.2.6 Nomenklatur "Lymphkapillaren und initialer Lymphsinus"... 47
4.2.7 Topographie der Lymphgefäße ... 47
4.2.7.1 Initiales Lymphgefäß ... 48
4.2.7.2 Präkollektoren ... 49
4.2.7.3 Kollektoren ... 50
4.2.8 Morphologische Strukturen initialer Lymphgefäße ... 50
4.2.8.1 Interendotheliale Öffnungen... 50
4.2.8.2 Basallamina... 51
4.2.8.3 Anker- und Basalfilamente ... 52
4.2.8.4 Interendotheliale Brücken ... 52
4.2.8.5 Spindelzellen ... 53
4.2.8.6 Trabekel ... 53
4.2.8.7 Gewebekanäle ... 53
4.2.9 Öffnungsmechanismus der interendothelialen Öffnungen und Füllung der initialen Lymphgefäße... 54
4.2.10 Klinische Beziehungen und Anwendungen - Theoretische Erklärungen zur ... hohen Malignität intraoraler Tumoren... 54
4.3 Schlussfolgerungen... 56
5 ZUSAMMENFASSUNG ... 57
6 LITERATURVERZEICHNIS... 59
1 Einleitung und Problemstellung
Lange Zeit wurden die initialen Lymphgefäße von der wissenschaftlichen Forschung vernachlässigt. Die Gründe dafür sind u. a. die ungünstige und damit nur schwer zu- gängliche Lage der Gefäße sowie präparationstechnisch bedingte Hindernisse (s. u.).
Generell reicht die lichtmikroskopische Technik nicht aus, um initiale Lymphgefäße eindeutig aufgrund charakteristischer morphologischer Merkmale von Blutkapillaren auszuweisen. Erst mit der Einführung der Transmissionselektronenmikroskopie An- fang der 1960er Jahre war es möglich, die Angioarchitektur initialer Lymphgefäße ge- nauer zu charakterisieren (LEAK und BURKE 1966). Anfang der 1980er Jahre gelang es zum ersten Mal, das initiale Lymphgefäßsystem der Rattenzunge rasterelektro- nenmikroskopisch zu beschreiben (CASTENHOLZ 1984a). BERENS VON RAUTENFELD und sein Team modifizierten diese Methode zur Untersuchung initialer Lymphgefäße in menschlichen Präparaten (BERENS VON RAUTENFELD et al. 1986, BERENS VON RAUTENFELD und KLANKE 1987).
Mit Hilfe der Rasterelektronenmikroskopie ist es möglich, eine plastische und räumli- che Darstellung der Lymphgefäße zu gewinnen und gleichzeitig einen Einblick in das Gefäßlumen zu bekommen. Die Ergebnisse dieser Strukturforschung ermöglichen die Erstellung eines Modells, das die funktionsmorphologischen Eigenschaften (CASTENHOLZ 1999) und die Aufgaben der Lymphgefäßabschnitte zu erklären vermag (BERENS VON RAUTENFELD et al. 1986).
Die vorliegende Untersuchung befasst sich mit der rasterelektronenmikroskopischen Angioarchitektur peripherer Lymphgefäße in der menschlichen Mundschleimhaut, wo- bei neue Methoden zur Weitstellung des Lymphdrainagesystems zur Anwendung kommen (siehe dazu 1.2).
1.1 Schrifttumsübersicht 1.1.1 Nomenklatur
1.1.1.1 Anatomischer Aufbau des Lymphgefäßsystems und Vergleich mit dem Blutgefäßsystem
Funktionell werden beim Menschen der große (Körperkreislauf) und der kleine (Lun- genkreislauf) Blutkreislauf unterschieden. Morphologisch sind beide ähnlich aufgebaut und besitzen vergleichbare Aufgaben: Über den Körperkreislauf erfolgt durch die Arte- rien die Versorgung aller Gewebe mit Sauerstoff, Nährstoffen und Wasser. Der Ab- transport von Schlackenstoffen und Kohlendioxyd wird vom venösen Schenkel über- nommen. Die Aufgaben des kleinen Kreislaufes in der Lunge sind der Gasaustausch, die Abgabe von Kohlendioxyd und die Aufnahme von Sauerstoff. Beide Blutkreisläufe sind geschlossen und werden durch eine Pumpe, den Herzmuskel, angetrieben.
Im Vergleich zum geschlossen Blutkreislauf ist das Lymphgefäßsystem ein zum Ve- nensystem parallel gestelltes Drainagesystem (BERENS VON RAUTENFELD und CLAUS 2005). Die Lymphgefäße haben ihren Ursprung stets blind in der Peripherie und arbeiten unter extremen Niederdruckbedingungen (CASTENHOLZ 1999). Der Ver- lauf der Kollektoren wird durch zwischengeschaltete Lymphknoten unterbrochen. Ein drittes Unterscheidungskriterium ist das Einmünden der Lymphsammelstämme in das Venensystem. Beim Menschen sind das der rechte und der linke Venenwinkel.
Das Hauptunterscheidungsmerkmal des Blutkreislaufes im Vergleich zum Lymphge- fäßsystem besteht darin, dass letzteres nicht von einer einheitlichen Pumpe, sondern von einer Aneinanderreihung von „Zwischenklappensegmenten“ (Lymphangionen) angetrieben wird und einen Halbkreis bildet.
Die Endothelzellen von Arteriolen, Venolen und initialen Lymphgefäßen unterscheiden sich in ihrem Zellmuster, ihrer einzelnen Zellkonfiguration, der Zelldimension und der Struktur der interzellulären Grenzbereiche (CASTENHOLZ 1999). Die Zellen der Veno- len haben die Konturen von Rauten, die an den Zellgrenzen fingerförmig ineinander greifen. Gering abweichende, organspezifische Varianten kommen vor. Die Zellkontu- ren der Arteriolen sind eher länglich und spindelförmig. Die Verzahnung der Endothel-
zellen miteinander ist gering. Ungewöhnlich großflächig sind dagegen die eichenblatt- förmigen Endothelzellen der initialen Lymphgefäße.
1.1.1.2 Nomenklatur der Lymphgefäße aus topographischer, funktioneller und struktureller Sicht
Es werden drei Kompartimente im Lymphgefäßsystem unterschieden:
Das oberflächliche, das tiefe sowie das Organ-Lymphgefäßsystem.
(FÖLDI et al. 2005)
Das oberflächliche System drainiert die Haut und die Subcutis (epifacial, subcutan).
Das tiefe subfaciale System transportiert die Lymphflüssigkeit aus den Nerven, den Gelenken, den Sehnenscheiden und der Muskulatur. Arterien, Nerven und Lymphge- fäße verlaufen hier parallel und sind nur beim Menschen gemeinsam von einer binde- gewebigen Gefäßscheide umschlossen (BERENS VON RAUTENFELD, pers. Mitt.) Eine gemeinsame Verbindung des oberflächlichen und des tiefen Lymphgefäßsystems besteht über lymphvaskuläre Perforansgefäße. Das dritte Lymphgefäßkompartiment ist organspezifisch und trägt demzufolge die Bezeichnung „System der Organlymphge- fäße“.
Die initialen Lymphgefäße lassen sich in Lymphkapillaren und Präkollektoren unter- gliedern (BERENS VON RAUTENFELD und CLAUS 2005). Den Präkollektoren nach- geschaltet, sind die größeren Kollektoren und die zentral gelegenen Lymphgefäß- stämme. Die Lymphkapillaren besitzen keinen regulären Basalmembranfilter, jedoch einen subendothelial gelegenen grobmaschigen Filter von Basal- und Ankerfilamenten (BERENS VON RAUTENFELD 1990, CASTENHOLZ 1999). Die Präkollektorenwand ist durch Bindegewebe verstärkt. Im weiteren Verlauf der Lymphgefäßbahn sind glatte Muskelzellen vorhanden, so dass die Wand der Kollektoren mit denen der Venen ver- gleichbar ist: Tunica interna, Tunica media und Tunica externa. Ein Unterschied zu den Blutgefäßen liegt jedoch in der nicht eindeutig histologisch abzugrenzenden Schichtung der Gefäßwand, da z.B. glatte Muskelzellen in allen drei Wandanteilen der Kollektoren nachzuweisen sind (BERENS VON RAUTENFELD und FEDELE 2005).
Die Aufgabe der Lymphkapillaren ist die Resorption von Gewebeflüssigkeit. Die Kol- lektoren dienen der Weiterleitung von Lymphe zu den zentralen Lymphgefäßstämmen.
Präkollektoren haben sowohl die Aufgabe, Flüssigkeiten zu resorbieren als auch wei- terzuleiten. Mit Ausnahme der Lymphkapillaren besitzen alle postkapillären Gefäßab- schnitte Klappen, welche als Rückflussklappen oder Einflussklappen funktionieren (BERENS VON RAUTENFELD und FEDELE 2005).
Einige Autoren, wie CASLEY-SMITH (1977, 1980, 1985) verstehen unter einem amor- phen, submikroskopischen Raum, der sich in der bindegewebigen Grundsubstanz zwi- schen den faserhaltigen Anteilen und den makromolekularen Glycanen befindet, ein prälymphatisches nicht endothelialisiertes Kanalsystem. In der englischsprachigen Literatur werden diese Zuflussräume zu den initialen Lymphgefäßen als „tissue chan- nels“ bezeichnet.
1.1.1.3 Lymphkapillaren
Ein polygonales, feinmaschiges Netz von Lymphkapillaren mit blind endenden Aus- buchtungen ist im interstitiellen Bindegewebe, in der Schleimhaut und in der Haut ein- gebettet. Bei dichten Kapillarnetzen, wie in der Haut existieren eine englumige, fein- maschige oberflächliche Schicht und eine tiefe Schicht, die ein weites Lumen besitzt und grobmaschig vernetzt ist (CASTENHOLZ 1999). Der Durchmesser der Lymphkapil- laren kann bis zu 60 µm groß sein. Dieses ist ein Unterscheidungsmerkmal zu den Blutkapillaren, welche Durchmesser von etwa 10µm zeigen. Im Vergleich zu den Lymphkapillaren haben Präkollektoren einen Durchmesser bis ca. 150 µm, während bei Kollektoren der Durchmesser zwischen 150 µm und 600 µm schwankt. Die Endo- thelzellen der initialen Lymphgefäße sind ungewöhnlich groß (CASTENHOLZ 1999) und haben die Kontur eines Eichenblattes. Die Bereiche der Zellgrenzen, an denen be- nachbarte Zellen mit ihren Zellrändern miteinander verschmelzen, werden „tight juncti- ons“ genannt. Die offenen interendothelialen Öffnungen repräsentieren „open juncti- ons“. CASTENHOLZ fand durch histometrische Messungen bis zu 4000 open junctions pro mm2 Endothelfläche.
Die Lymphkapillaren bestehen aus einem Endothelschlauch, dem eine reguläre Ba- salmembran fehlt. Diese wird durch einen subendothelialen Filz von Filamenten er- setzt. Der Filz von Filamenten setzt sich aus zwei unterschiedlichen Filamentenstruktu- ren zusammen: Den Basalfilamenten, welche parallel zum Gefäß verlaufen und den
Ankerfilamenten, die radiär zur Oberfläche angeordnet sind. Die elastischen suben- dothelialen Filamente stehen mit dem umgebenden Bindegewebsgerüst in Verbindung (GERLI und ALESSANDRINI 1995, FÖLDI et al. 2005).
CASTENHOLZ (1999) beschreibt die Lymphbildung wie folgt: Mit zunehmenden intersti- tiellen Druck weicht das Bindegewebsfasergrüst auseinander, die subendothelialen Filamente geraten unter Spannung und die interendothelialen Öffnungen werden weit- gestellt. Dadurch kann Gewebeflüssigkeit in das Lymphgefäßlumen über interendothe- liale Öffnungen einfließen.
BERENS VON RAUTENFELD und Mitarbeiter (1986) bezeichnen „open junctions“ auch als interendotheliale Kanälchen, welche sich bei hohem interstitiellem Druck zu poren- förmigen Öffnungen transformieren.
Die Basalfilamente stellen für den Eintritt von physiologischen Zellen durch die Endo- thelwand in die Lymphkapillaren kein wesentliches Hindernis dar. Auf ihrem Weg auf der Suche nach einem interendothelialen Kanälchen lösen die Zellen den Filz von Fi- lamenten vom Endothel und passieren über porenförmige Öffnungen das Gefäßlumen (BERENS VON RAUTENFELD et al. 1986).
Die Invasion von Melanomzellen in Lymphkapillaren folgt nicht dem von BERENS VON RAUTENFELD beschriebenen physiologischen Zellverhalten. PLATSCHEK und Mitarbei- ter (1990) bewiesen, dass Melanomzellen das Lymphgefäßendothel lokal zerstören.
Pseudopodien dieser Zellen heften sich an die Extrazellularmatrix der Endothelzellen und bevorzugen hier besonders das Fibronectin. Diese bevorzugte Adhäsion und die relativ freie Zugängigkeit zur extrazellulären Matrix des Endothels könnten eine mögli- che Erklärung für die bevorzugte Invasion der Melanomzellen in Lymphgefäße sein.
In Abschnitten der Präkollektoren und Kollektoren, in denen eine Basalmembran fehlt, übernehmen ebenfalls Ankerfilamente die Aufgabe, diese Gefäße mit dem Bindege- webe zu verankern.
1.1.1.4 Präkollektoren
Im Bereich der Präkollektoren ändert sich die morphologische Struktur der Endothel- zellen. Das eichenblattförmige Grenzlinienmuster, welches für die Lymphkapillaren charakteristisch ist, verändert sich zu einem eher rautenförmigen endothelialen Kon- turbild. Klappen mit zwei Zipfeln treten erstmals in Erscheinung, da Lymphkapillaren keine valvulären Einrichtungen besitzen. Präkollektoren der Ratte erreichen Durch- messer bis zu 150µm (CASTENHOLZ 1999). Im Gegensatz zu den Lymphkapillaren besitzen Präkollektoren einen eigenen Wandanteil kollagener und elastischer Fasern.
1.1.2 Drainagegebiete der Lymphgefäße im Mund- und Gesichtsbereich 1.1.2.1 Lymphknoten
Der „Circulus lymphaticus pericervicalis“ trägt seinen Namen aufgrund der anatomi- schen Lage vieler seiner regionalen Kopflymphknoten an der Hals-Kopfgrenze: Lnn.
occipitales, Lnn. mastoidei, Lnn. parotidei, Lnn. submentales und Lnn. submandibula- res. Inkonstante Lnn. faciales liegen im Gesichtsbereich (FÖLDI et al. 2005).
1.1.2.2 Drainagegebiete aus dem Gesichtsbereich
Die Beschreibung der Lymphgefäße des Gesichtes erfolgt nach (FÖLDI et al. 2005).
Der Lymphabflussbereich vom Kinn wird in drei Gebiete unterteilt. Die Kollektoren im mittleren Kinndrittel münden in die Lnn. submentales und die entsprechenden beiden lateralen Bereiche in die Lnn. submandibulares. Da sich die Kollektoren auch über- kreuzen und anastomosieren, können sie auch in beide Lymphknotengruppen drainie- ren.
• Die Abflusswege der Unterlippe sind mit denen des Kinns zu vergleichen und dementsprechend ähnlich. Im Bereich des M. orbicularis oris zeigen sich 2 Ab- flusswege. Die Kollektoren aus dem mittleren Bereichsdrittel münden in die Lnn. submentales. Die aus den lateralen Einflussgebieten münden in den Lnn.
submandibulares ein. Eine scharfe Abgrenzung der Tributärgebiete ist nicht
möglich, da sich die Abflusswege überkreuzen und miteinander anastomosie- ren.
• Ganz anders als aus der Unterlippe ist der Verlauf der Lymphgefäße aus der Oberlippe. Es gibt keine getrennten Drainagegebiete, da sich die Hautkollekto- ren überkreuzen. Die Kollektoren enden am häufigsten in die Lnn. submandi- bulares. Wenige von ihnen münden in die Lnn. infraauriculares oder Lnn. sub- mentales. Die Schleimhautkollektoren münden entweder direkt in die Lnn.
submandibulares oder einige von ihnen passieren zuvor den Lnn. mandibula- res. Nur wenige der Schleimhautkollektoren aus der Oberlippe münden in die Lnn. submentales ein.
• Die Lymphgefäße aus der Haut der Wange des infraorbitalen Gesichtsberei- ches münden in die Lnn. submandibulares. Der Kinn nahe Bereich wird in die Lnn. submentales drainiert. Das dorsale Hautgebiet drainiert in die Lnn. infra- auriculares. Die Lymphe der Wangenschleimhaut wird in die Lnn. submandibu- lares oder variabel in die Lnn. infra- oder praeauriculares drainiert. Im Vergleich zu den Hautkollektoren, die direkt in die Lnn. submentales ziehen, besteht bei denen der Schleimhaut nie eine direkte Verbindung zu diesen Filterstationen.
Weder aus der Haut noch aus der Schleimhaut können den Kollektoren kon- stante Lymphknoten zugeordnet werden, weil viele Überkreuzungen und Anastomosen der Lymphgefäße existieren.
1.2 Problemstellung der vorliegenden Arbeit
Die Methode dieser Untersuchungen an perfusionsfixiertem Material oder Ausguss- präparaten ist vor 15 Jahren entwickelt worden.
Die indirekte und direkte Lymphangiographie ermöglichen den Verlauf der Präkollekto- ren und Kollektoren - in der Regel jedoch nicht von Lymphkapillaren - wiederzugeben.
Detaillierte morphologische Strukturen können mit diesen radiologischen Methoden nicht erfasst werden. Genauer wurden die Strukturmerkmale initialer Lymphgefäße in menschlichen Organen bisher nur in der äußeren Haut, dem Eileiter und dem Hoden mit der Vakuumtechnik dargestellt (BERENS VON RAUTENFELD 1990).
Die Schwierigkeiten speziell für die Analyse von menschlichen Mundschleimhautbiop- sien ergeben sich aus ihrer geringen Größe und aus deren Forminstabilität. Infolge- dessen kommt es bei der Probeentnahme zur Schrumpfung der Biopsien und infolge- dessen zum Kollabieren der Lymphgefäße, die im interstitiellen Bindegewebsfaserge- rüst aufgehängt sind (ONIZAWA et al. 1997). Eine vergleichbare Problematik ist aus anderen Geweben und Organen bekannt (BERENS VON RAUTENFELD et al. 1987).
Ein weiteres Problem stellt die starke mechanische Beanspruchung der Schleimhaut durch das chirurgische Instrumentarium während der Operation dar.
Aus der Problematik ergibt sich die Fragestellung, ob es möglich ist, das Kollabieren initialer Lymphgefäße bei intraoperativer Entnahme zu verhindern bzw. die mechani- sche Beanspruchung auf ein Minimum zu reduzieren, so dass ein Vergleich mit bisher am Tierversuch gemachten morphologischen Befunden gezogen werden kann. Eine von CASTENHOLZ 1986 entwickelte Methode, rasterelektronenmikroskopisch initiale Lymphgefäße in der Zunge von narkotisierten Ratten darzustellen, ist aufgrund der erforderlichen indirekten Fixierungsbedingungen und Toxizität der Fixierungslösung nicht auf den Menschen übertragbar.
Bislang gab es keine Methode, die eine detaillierte Untersuchung der kleinsten Lymphgefäße aus der Mundschleimhaut vitaler Menschen erlaubt hätte. Mit der vorlie- genden Arbeit wurden zwei Ziele verfolgt:
• Die Entwicklung einer Technik, mit der intraoperativ kleinste Schleimhaut- proben entnommen werden können, ohne dass diese sich aufgrund ihrer Eigenelastizität zusammenziehen. Eine solche Technik ist Voraussetzung für eine realistische Darstellung der morphologischen Verhältnisse der Lymphgefäße, da kollabierte Lymphgefäße rasterelektronenmikroskopisch nicht ausreichend zur Darstellung kommen.
• Darüberhinaus könnten mit den rasterelektronenmikroskopischen Untersu- chungen und Expansiontechnik die Einwanderung bzw. der Einbruch von Tumorzellen in die initiale Lymphstrombahn erfasst werden (FRICKE 2004).
Bisher gelang es in der Haut nicht, Tumorzellen rasterelektronenmikrosko- pisch systematisch zu erfassen (BERENS VON RAUTENFELD, pers. Mitt.).
Deshalb sollte innerhalb dieser Untersuchung zunächst die Angioarchitektur des Lymphgefäßnetzes in der menschlichen Mundschleimhaut rasterlektro- nenmikroskopisch rekonstruiert werden.
2 Material, Technik und Methoden
2.1 Patientengut
Die zu untersuchenden Mundschleimhautbiopsien wurden aus Humanpräparaten von Patienten der Zahn-, Mund- und Kieferklinik sowie der Hals-Nasen-Ohrenklinik der Medizinischen Hochschule Hannover entnommen. Dabei handelte es sich um 24 Pati- enten, die wegen eines Plattenepithelkarzinoms operiert worden waren. Die für die Studie verwendeten Schleimhautproben kommen aus Wange Lippe, Zunge und Mundboden. Sie stammten aus dem sicherheitshalber mit exzidierten, makroskopisch gesunden Bereich. Von den 5 weiblichen und 19 männlichen Patienten wurde je eine Biopsieprobe untersucht. Das Alter der Personen lag zwischen 37 und 76 Jahren.
2.2 Größe der Mundschleimhautbiopsien
In der Breite variierten die Untersuchungsproben zwischen 0,3 cm und 2,5 cm und in der Länge zwischen 2 cm und 3 cm.
2.3 Materialentnahmetechniken
Vor der Entfernung des Tumorgewebeblocks wurde hinter dem äußeren Rand des Sicherheitsabstands zum Tumor eine Biopsie aus der Mundschleimhaut entnommen und in ein mit 0,9%iger Kochsalzlösung gefülltes Glasschälchen gelegt. Die Biopsie wurde dann mit einer Pinzette aus der Mundhöhle entfernt.
Vor der Weiterverarbeitung wurde die Probe bis zu maximal fünf Minuten in physiolo- gischer Kochsalzlösung (0,9%) aufbewahrt. Die Entnahmetechnik wurde dabei durch einen neu entwickelten Präparatespanner wesentlich erleichtert. Zur Probenentnahme musste der Präparatespanner in der Biopsie gesichert werden, um ein Loslösen beider Teile zu verhindern. Dazu wurde das Gerät mit seinen vier Spitzen in die zu entneh- mende Schleimhaut eingestochen. Durch eine Ligatur mit chirurgischen Fäden wurde
die Schleimhaut an den horizontalen Bügeln leicht fixiert, damit diese beim Heraus- nehmen nicht wegrutschen konnte ( Abb.1 und Abb.2).
Abb.1: Graphische Darstellung der intraoperativen Schnittführung um den Ex- tensor
2.4 Präparatespanner
Das erste Entwicklungsmodell des Präparatespanners (siehe Abb.1 und Abb.2) ist in seiner Länge und Breite invariabel und durch die Kantenlängen festgelegt. Es besteht aus vier horizontal, rechteckig miteinander verlöteten Drähten aus Federstahl und vier
weiteren daran senkrecht auslaufenden Drähten, an denen das Gerät in die Mund- schleimhaut eingestochen wird. Der Federstahldraht hat einen Durchmesser von 0,7 mm, eine Länge von 2 cm, eine Breite von 0,5 cm und eine Höhe von 0,5 cm (Abb.2).
In der entgegengesetzten Richtung zu den Querverstrebungen der einen Seite sind die in die Schleimhaut zu stechenden Stahlfüße in der Höhe des Gerätes spitz ange- schliffen.
Abbildung 2: Präparatespanner der 1. Generation in einem Mundschleimhautpräparat vom Schwein (Unterlippe)
Die weiterentwickelte und verbesserte Ausführung des beschriebenen Gerätes lässt sich in der Länge und in der Breite verstellen (Abb.3). Es besteht aus zwei über Eck verlaufenden Teleskopröhrchen, in die jeweils ein um 90° gebogener Draht hineinge- schoben ist. Der Draht läuft auf Friktion im Röhrchen. An den beiden jeweils getrennt verlaufenden Drähten befindet sich an dem langen bzw. an dem kurzen Ende des ent- sprechenden Drahtes eine Schraube, die durch einen daran fest angelöteten Ring
verläuft. Ein weiteres Führungsröhrchen für die Schraube ist am Teleskopröhrchen fixiert. Wie bei dem Grundmodell befinden sich auch an der verbesserten Geräteent- wicklung die senkrecht dazu angesetzten Nadeln an den Eckpunkten. Durch Drehung an einer der beiden Schrauben lässt sich der Spanner entweder in der Länge oder in der Breite verstellen .
Abb.3: Technische Zeichnung des Präparatespanners der 2. Generation
2.5 Injektionstechnik mit Berliner Blau
Die ersten, anfänglichen Biopsien dieser Versuchsreihe wurden mit Berliner Blau- Farblösung perfundiert, um das subepitheliale Lymphgefäßnetz schon während der Aufarbeitung kenntlich zu machen. Bei der Auswertung und der Beurteilung der Präpa- rate mit dem Rasterelektronenmikroskop zeigte sich bei diesen Proben ein immer wie- der auftretender filzartiger Belag von Berliner Blau, der durch reinigende Spülvorgänge mit physiologischer Kochsalzlösung nicht vollständig ausgewaschen werden konnte. In der Folge kam Berliner Blau nicht mehr zur Anwendung. Die Proben wurden lediglich mit physiologischer Kochsalzlösung gespült um evtl. verbliebene Blutreste zu entfer- nen. Anschließend musste der Gewebeblock mit Glutaraldehyd injektomatisch fixiert werden.
2.6 Indirekte Applikationstechnik mit Glutaraldehyd
Glutaraldehyd besitzt die Eigenschaft, die Lymphgefäße weit zu stellen und das Ge- webe in diesem Zustand zu fixieren.
Bei der Injektion von Glutaraldehyd in den interstitiellen Geweberaum entsteht durch das vermehrte Flüssigkeitsaufkommen eine örtliche Applikationsquaddel. Das Angebot an Flüssigkeit dehnt das Bindegewebsfasernetz, an dem die initialen Lymphgefäße über Filamente aufgehängt sind. Es entsteht dadurch ein Zug am Lymphgefäß über seine Basal- und Ankerfilamente. Dabei werden die interendothelialen Öffnungen weit gestellt, indem interendotheliale Überlappungen zu porenförmigen Einlassventilen transformiert werden. Glutaraldehyd fließt vornehmlich in das Lymphgefäßlumen. Auf- grund der toxischen Eigenschaften kann Glutaraldehyd bei Untersuchungen am le- benden Menschen nicht eingesetzt werden, sondern nur am exzidierten Material oder bei narkotisierten Tieren im Letalversuch.
Das Untersuchungsmaterial wurde nach der Entnahme sofort weiterverarbeitet. Vor der Entwicklung des Präparatespanners ist die Biopsie lediglich mit Nadeln auf eine Korkplatte gespannt worden. Später wurden die Präparate im Präparatespanner ge- meinsam auf der Korkplatte fixiert. In Abhängigkeit von der Schleimhautgröße wurden zwei bis vier feine Kanülen (Butterfly 25) möglichst dicht intramukös gesetzt. Die But- terflies waren über Spritzen (2 ml Inhalt) mit einer elektromechanisch gesteuerten In-
fusionspumpe (Precidor 5003, G. Heinemann, Schwäbisch-Gmünd) verbunden. Das Gewebe wurde zunächst durch Kochsalzspülungen (0,9%) von Blutresten und Verun- reinigungen befreit. Die Applikationsgeschwindigkeit lag bei vier Präparaten bei 0,5 ml pro Minute und bei 13 Präparaten bei 0,2 ml pro Minute. Die Perfusionszeit betrug je- weils 5 Minuten. Die anderen sieben Präparate wurden nicht vorperfundiert, sondern nur in einer Schale mit Kochsalzlösung (0,9%) vorgespült und anschließend wie alle anderen Präparate weiterverarbeitet.
Nach Beendigung der Vorperfusion mit Kochsalz wurde mit Glutaraldehyd weiter per- fundiert. Zehn Proben wurden mit einer Injektionsgeschwindigkeit von 0,3 ml pro Minu- te und 14 Biopsien mit einer Applikationsgeschwindigkeit von 0,4 ml pro Minute per- fundiert. Die Perfusionszeit lag zwischen 20 Minuten und 30 Minuten. Die Spritzen, deren Kolben von der Infusionspumpe vorwärts transportiert wurden, waren über einen Dreiwegehahn mit den Butterflies verbunden. Damit sollte verhindert werden, dass Luft über die Schläuche in das System gelangen konnte.
Nach Abschluss der gleichzeitig über mehrere Systemschläuche laufenden Perfusion (Simultaninjektion) wurde das Schleimhautareal von der Korkplatte oder dem Präpara- tespanner gelöst und zur Immersionsfixierung in 4%iges Glutaraldehyd gelegt. Die Präparate wurden zum Teil direkt vor Ort nach der Entnahme oder ca. eine Stunde später im Labor mit histologischen Rasierklingen zugeschnitten. Die Breite der Schnit- te betrug 1 bis 2 mm.
Die zugeschnittenen Präparate wurden weiter für eine Woche in Glutaraldehyd (0,4%) nachfixiert. Im Anschluss wurden sie in 0,1 mol Cacodylatpuffer (21,4 g Natriumcaco- dylat pro 1000 ml Aqua bidest) sechs- bis achtmal im Zeitabstand von einer halben Stunde gespült. Die Lösung wurde auf einen pH-Wert von 7,4 eingestellt. Die Weiter- verarbeitung der Proben erfolgte durch Entwässerung in einer aufsteigenden Aceton- reihe (30%, 50%, 70%, 90%, 96%). In jeder Konzentrationsstufe verweilten die Proben 40 Minuten. Nach den ersten 20 Minuten wurde die Lösung gleicher Konzentration ausgewechselt und aufgefrischt. Nach dem Entwässern wurden die Proben mit Leit- kohle auf Aluminiumträgern fixiert und mit einer Gold-Palladium-Schicht besputtert (beschichtet). Die Untersuchung der Proben erfolgte mit dem Rasterelektronenmikro- skop "SEM 505" (Fa. Siemens) bei 10 kV.
2.7 Indirekte Applikationstechnik mit Tardoplast
Diese Entnahmetechnik der Mundschleimhautpräparate ähnelt prinzipiell dem unter 2.6 beschriebenen Verfahren von Glutaraldehyd. Auch diese Methode kann aufgrund der toxischen Eigenschaften von Tardoplast nicht am lebenden Menschen, sondern nur am exzidierten Material oder bei narkotisierten Tieren im Letalversuch eingesetzt werden. Die Biopsien wurden in der Folge auf eine Korkplatte gespannt. Das Kunst- harz Tardoplast wurde manuell subepithelial mit einer 1 ml Insulinspritze mit gleichmä- ßig geringem Druck appliziert. Die Dauer der Applikation lag je nach Druck zwischen 30 und 45 Sekunden. In der Regel bildete sich in der Schleimhaut eine Quaddel. Die Aushärtungszeit von Tardoplast betrug ca. eine Stunde.
Bei der Injektion von Tardoplast in den interstitiellen Geweberaum entsteht durch das vermehrte Flüssigkeitsaufkommen eine Gießharzquaddel. Das höhere Angebot an Flüssigkeit dehnt das Bindegewebsfasernetz, an dem die Lymphgefäße über Filamen- te aufgehängt sind. Es entsteht dadurch ein Zug am Lymphgefäß über seine suben- dothelialen Filamente. Dabei werden die interendothelialen Öffnungen weit gestellt, indem die interendothelialen Überlappungen zu porenförmigen Einlassventilen trans- formiert werden. Tardoplast gelangt in der Regel selektiv in das System initialer Lymphgefäße, sofern nicht Blutgefäße durch die Injektionsnadel eröffnet wurden.
Der Gewebeblock wurde nach der Aushärtung vollständig in eine Lösung von Kali- und Natronlauge (25%) getaucht. Diese Lösung musste täglich solange aufgefrischt und erneuert werden, bis das den Kunststoff umgebende Gewebe vollständig mazeriert war. Danach wurden die zurückgebliebenen Kunststoffausgüsse in Aqua bidest ge- spült - bis alle Beläge entfernt waren - und an der Luft getrocknet. Die Ausgüsse wur- den mit histologischen Rasierklingen auf die Größe der Aluminiumträger passend zu- rechtgeschnitten und auf diesen mit Leitkohle fixiert. Anschließend erfolgte die Besput- terung der Präparate mit Gold/Palladium. Die Untersuchungen wurden mit dem Ras- terelektronenmikroskop der Firma Siemens ("SEM 505") durchgeführt. Die Strom- spannung betrug 5 - 8 kV.
Schon im Laufe der Aufarbeitung im Labor erwiesen sich die kleinflächigen Biopsien aus der Mundschleimhaut für diese Methode als zu klein und instabil. Es brachen bei der technischen Verarbeitung nach und nach immer mehr Gießharzanteile aus dem
Gewebe heraus. Das verbleibende Material war zur weiteren labortechnischen Aufar- beitung und damit auch für eine weitere Auswertung nicht mehr brauchbar.
3 Ergebnisse
Auf jedem angeschnittenen Gewebeblock wurden die initialen Lymphgefäße mit dem Rasterelektronenmikroskop identifiziert. Die Unterscheidung von Blut- und Lymphkapil- laren ist grundsätzlich dann möglich, wenn die Lymphkapillaren injektomatisch ausrei- chend weit gestellt sind, so dass der Endothelüberzug beurteilt werden kann (s. u.).
Dabei besitzen Blutkapillaren Querdurchmesser von etwa 10 µm, während weit gestell- te Lymphkapillaren Lumenweiten von 50 µm zeigen. Die Maschenweite, die Dichte des Lymphgefäßnetzes und der Abstand der initialen Lymphgefäße zur Basallamina des Epithels wurden vermessen und ausgewertet.
3.1 Topographie der initialen Lymphgefäße
Es wurde der Abstand von 82 initialen Lymphgefäßen zur Basallamina des Epithels ausgemessen. Die größte Anzahl von Gefäßen befand sich in einer Tiefe von bis zu 150 µm (65 bis 79%) direkt unterhalb der Basalschicht des Epithels (Abb.4). Weiterhin wurde die Anzahl der Lymphgefäße pro mm2 ausgezählt. Die Werte dafür lagen zwi- schen 11 und 31 pro mm2.
Auf keinem Gewebeblock war ein blind beginnender Abschnitt des Lymphkapillarnet- zes sichtbar. Es kann also keine Aussage darüber gemacht werden, ob die Gefäße wie bei den zu vergleichenden Tierpräparaten oder denen der humanen Cutis offen oder geschlossen sind bzw. blind beginnen.
Am dichtesten an der Basalmembran der Schleimhaut lagen Lymphkapillaren, gefolgt von den größeren, den Lymphkapillaren nachgeschalteten Präkollektoren. Sowohl in den oberflächlichen als auch in tieferen Scheimhautschichten konnten Kollektoren nachgewiesen werden. Angaben zur Maschenweite einer der drei Lymphgefäßab- schnitte in Anlehnung an die Abstandsmessung der Lymphgefäße zueinander (siehe Abb. 4 unten) ist nicht möglich, da die unzureichende Weitstellung der meisten Lymphgefäße keine Unterscheidung zwischen Lymphkapillaren, Präkollektoren oder
Kollektoren ermöglicht. Die zeichnende Rekonstruktion des mukösen Lymphgefäßnet- zes (Abb. 5) zeigt jedoch 2 lymphvaskuläre Besonderheiten der Mundschleimhaut:
• Präkollektoren als auch Lymphkapillaren sind nahe der Basalschicht des Schleimhautepithels zu finden.
• Auch Kollektoren erreichen den subepithelialen Schleimhautbereich.
Abbildung 4: Lymphgefäßnetzdichte
Abbildung 5: Schematische Rekonstruktion der Lymphgefäße in der Mundschleimhaut
3.2 Injektionstechnik mit Glutaraldehyd - Initiale Lymphgefäße im rasterelektronenmikroskopischen Bild
Die gewonnenen rasterelektronenmikroskopischen Aufnahmen zeigen, dass bestimm- te Strukturen in den verschiedenen Lymphgefäßabschnitten regelmäßig vorkommen und dass sich für einzelne Gefäßabschnitte - Lymphkapillare, Präkollektor, Kollektor - charakteristische Strukturen nachweisen lassen. Die Benennung der abgebildeten Details erfolgte durch den Vergleich mit tierexperimentellen Untersuchungen, die iden- tische morphologische Gefäßmerkmale aufweisen.
3.2.1 Lymphkapillaren
Die meisten Lymphkapillaren liegen dicht unter dem Schleimhautepithel in einer Ent- fernung von 0 bis 150 µm zur Basallamina des Epithels (siehe Abb. 4, oben). Das En- dothel (Abb.6) wird von einem abluminalen Filamentfilz von Anker- bzw. Basalfilamen- ten mantelartig umhüllt. Der Filamentfilz verbindet die abluminale Endotheloberfläche der Lymphkapillaren mit den umliegenden kollagenen und elastischen Bindegewebs- fasern. Der Filz von Basalfilamenten ist netzartig angelegt (siehe Abb. 6c u. 6d). Zu den charakteristischen Merkmalen der Lymphkapillaren gehören eichenblattförmige Endothelzellgrenzen (Abb. 7c u. 7d). Im Bereich der Interendothelialspalten sind alter- nierend Zellkontakte und interendotheliale Öffnungen angelegt. Interendotheliale Brü- cken (Abb.8) verbinden einzelne Endothelzellen miteinander und bestehen aus einer Endothelzellduplikatur.
Abbildung 6: Rastelekronenmikroskopische Darstellung: subendothelialer Ankerfila- mente und Bindegewebsfasern (siehe Abbildungslegende nächste Seite).
Legende zu Abb. 6:
6a und 6b: Weit gestelltes initiales Lymphgefäß mit Endothelüberzug (E) und Bindegewebsfasern (Bgfn).
6c und 6d: Endothelüberzug (E) eines initialen Lymphgefäßes in Kontakt mit Ankerfilamenten (AF), welche mit kollagenen Fasern (KF) in Verbindung stehen.
6e: Kollagenes Faserbündel (FB) im Verbund mit dem Endothelüberzug (E) eines initialen Lymphgefäßes verläuft senkrecht zum Endothelüberzug (E).
6f : subendotheliale elastische Fasern einer Lymphkapillare (Pfeile).
Abbildung 7: Rasterelektronenmikroskopische Darstellung des Öffnungsapparates initialer Lymphgefäße (siehe Abbildungslegende nächste Seite).
Abbildung 7:
7a: Interendotheliale Öffnungen (IEÖ) eines initialen Lymphgefäßes in luminaler An- sicht: Endothelbrücke (EB), Zellkern (ZK).
7b: Drei interendotheliale Öffnungen (IEÖ) zwischen zwei Endothelzellen (A und B) eines initialen Lymphgefäßes.
7c und 7d: Meanderförmiger Interzellularbereich (Pfeile) mit interendothelialen Öff- nungen (IEÖ) zwischen zwei (A und B) Endothelzellen.
7e und 7f: Im Vergleich zu den Abbildungen 7a–7d sind die interendothelialen Öffnun- gen porenförmig (P) erweitert, so dass die subendothelial gelegenen Ankerfilamente (AF) zu sehen sind.
Abbildung 8: Rasterelektronenmikroskopische Darstellung interendothelialer Brücken und Trabekel (siehe Abbildungslegende nächste Seite).
Legende zu Abbildung 8
8a: Endotheliale Brücke an der (EB) luminalen Endotheloberfläche eines initialen Lymphgefäßes.
8b: Zellgrenze (Freie Pfeile) zwischen zwei Endothelzellen (A und B) mit übersprin- genden Endothelbrücken (EB), Interendothelialer Öffnungen (IEÖ) und Zellkern (ZK) 8c und 8d: Bindegewebstrabekel (BT) im Lumen eines initialen Lymphgefäßes (ILG).Im Gegensatz zu den Endothelbrücken enthalten die Bindegewebstrabekel kol- lagene Fasern (KF).
8e: Verzweigter Bindegewebstrabekel (BT) .
8f: Bindegewebstrabekel (BT) mit Spindelzellen (SZ).
3.2.2 Präkollektoren
Die Präkollektoren sind den Lymphkapillaren nachgeschaltet. Sie sind von den Lymphkapillaren durch das Vorkommen von Klappen und charakteristischen Bindege- webstrabekeln (8c-8f) abzugrenzen. Bindegewebstrabekel kommen ausschließlich in Präkollektoren vor.
Die Zellgrenzen des Endothels sind weniger deutlich eichenblattförmig angelegt und es gibt weniger interendotheliale Öffnungen. Die Präkollektoren besitzen wie die Lymphkapillaren Anker- und Basalfilamente. Darüber hinaus weisen Präkollektoren einen dünnen Mantel von subendothelialen Bindegewebsfasern auf. Der Nachweis glatter Muskelzellen ist in der Wand von Präkollektoren rasterelektronenmikroskopisch nicht gelungen.
3.2.3 Kollektoren
Kollektoren (Abb. 9f) gehen aus Präkollektoren hervor. Nur wenige Kollektoren errei- chen den epithelnahen Schleimhautbereich, der durch die vorliegende Untersuchung erfasst wurde. Insgesamt gelang es nur 3 Kollektorenanschnitte rastelektronenmikro- skopisch darzustellen. Die Kollektorenanschnitte fallen durch Kalibergrößen von mehr als 150µm auf. Die Endothelzellen sind nicht eichenblattförmig, sondern besitzen ein spindelförmiges Aussehen (siehe Abb. 9f). Die Kollektoren bilden ein spindelförmiges Endothelpflaster in Anlehnung an den Endothelüberzug von kleinen Arterien. Trabekel fehlen in den Kollektorenanschnitten (siehe 3.2.2). Obwohl die Kollektoren glatte Mus- kelzellen aufweisen, sind sie rasterelektronenmikroskopisch nicht nachzuweisen.
Abbildung 9: Rasterelektronenmikroskopische Darstellung von Aufzweigungen initia- ler Lymphgefäße und der Endotheloberfläche eines Kollektors
(siehe Abbildungslegende nächste Seite).
Legende zu Abbildung 9:
9a: Bindegewebspapille (BP) des Mundhöhlenepithels (ME) mit Blutkapillaren (BK) nahe der epithelialen Basalmembran (Pfeile).
9b: In der Übersicht eines Anschnittes der Mundschleimhaut ist das Verhältnis zwi- schen dem Mundhöhlenepithel (siehe gestrichelte Linie) und subepidermal gelege- nen Lymphkapillaren (LK) zu erkennen.
9c: Lymphkapillare (LK) nahe der Basalmembran (BM) des Mundhöhlenepithels (ME).
9d: Knotenpunkt (Pfeil) eines initialen Lymphgefäßnetzes nahe des Mundhöhlene- pithels. (ME).
9e: Verzweigungen (Pfeile) eines Präkollektors dicht unter dem Mundhöhlenepithel (ME).
9f: Endotheliale Oberfläche eines Kollektors mit spindelförmigen Zellkernen.
3.2.4 Interendotheliale Öffnungen
Die durch Glutaraldehyd weit gestellten Lymphkapillaren ermöglichen einen Einblick in das Gefäßlumen. In den Lymphkapillaren stehen benachbarte Zellen mit ihren Rän- dern nicht fortlaufend in Kontakt, sondern besitzen interendotheliale Öffnungen (siehe Abb. 7), die in Abhängigkeit vom interstitiellen Druck geöffnet oder verschlossen sind.
Die interendothelialen Öffnungen besitzen etwa einen Durchmesser von 5µm. In den nachfolgend größeren Gefäßabschnitten, den Präkollektoren, treten diese Öffnungen weniger häufig auf. In den wenigen weit gestellten Kollektorenanschnitten dieser Un- tersuchung konnten keine interendothelialen Öffnungen nachgewiesen werden.
3.2.5 Anker- und Basalfilamente
Die im Präparat quer oder tangential angeschnittenen Lymphkapillaren zeigen, dass ein eigentlicher Basalmembranfilter nicht ausgebildet ist. Die subendothelialen Ankerfi- lamente (siehe z.B. 6d) und Basalfilamente (siehe z.B. 6c) überkreuzen sich und zei- gen einen lockeren Verbund. Mit der rasterelektronenmikroskopischen Technik sind die in Abb. 6f abgebildeten Strukturelemente sicher als elastische Fasern anzuspre- chen. Diese elastischen Fasern können direkt im lymphvaskulären Endothelüberzug verankert sein.
3.2.6 Intraluminale Gefäßstrukturen der Lymphkapillaren
Die Oberflächenbeschaffenheit der Endothelzellen ist glatt. Die Zellkerne der Endo- thelzellen (siehe Abb. 7a, 7d und Abb. 8b) haben eine ovale Form und ragen in das Gefäßlumen hinein. Vereinzelt können Erythrozyten, die beim Spülvorgang während der Aufarbeitung der Präparate nicht entfernt werden konnten, im Gefäßlumen nach- gewiesen werden.
3.2.7 Interendotheliale Brücken
Intraluminal sind benachbarte Endothelzellen der Lymphkapillaren durch endothelarti- ge Strukturen miteinander verbunden, die interendothelialen Brücken (Ponticuli inte- rendotheliales) repräsentieren (siehe Abb. 8a und 8b). Es existieren unverzweigte und verzweigte Endothelbrücken. Sie sind häufig an ihrem Ende verzweigt. Auch eine Tei- lung an beiden Enden ist möglich. Der Durchmesser der interendothelialen Brücken beträgt etwa 1µm.
3.2.8 Trabekel
Nur in den Präkollektoren kommen Trabekel vor. Die Trabekel (Trabeculae fibroen- dotheliales) sind von einer Endothelschicht überzogen und haben innen einen aus Bindegewebe (siehe Abb. 8c-8f) bestehenden „Kern“. Ähnlich den interendothelialen Brücken kommen auch die Trabekel in verschiedenen Formen vor. Man kann ver-
zweigte (siehe Abb. 8e) von unverzweigten (siehe Abb. 8c, 8d und 8f) Trabekeln un- terscheiden.
3.2.9 Spindelzellen
An den Rändern von Klappen und Bindegewebstrabekeln befinden sich spindelförmige Zellen (siehe Abb. 8f). Sie sind in der Mitte bauchig und haben an den Enden dünn auslaufende Zellfortsätze. Sie kommen sowohl in verschiedenen Formen – mit einzel- nen oder mehreren Zellfortsätzen – als auch solitär oder gepaart hintereinander vor.
Charakteristisch treten sie an den Gefäßklappen der Präkollektoren auf. Einige haben Fortsätze, die an den Rändern von interendothelialen Öffnungen auslaufen und von den Fortsätzen anderer Spindelzellen überquert werden.
3.2.10 Lymphgefäßklappen
Lymphgefäßklappen kommen in Präkollektoren vor, wohingegen sie in den Lymphka- pillaren fehlen und in Kollektoren in der vorliegenden Untersuchung nicht nachgewie- sen werden konnten. Sie treten sowohl einzeln als auch paarig auf und befinden sich entweder im geraden Verlauf eines Lymphgefäßabschnittes oder an einer Gefäßtei- lungsstelle. Die Abbildung 9e (rechter Pfeil) zeigt eine Einmündungsklappe im Bereich eines initialen Lymphgefäßes.
4 Diskussion
Die ersten rasterelektronenmikroskopischen Darstellungen initialer Lymphgefäße ge- langen CASTENHOLZ (1984a) an Rattenzungen. Ziel seiner Untersuchungen war die detaillierte Darstellung der charakteristischen Endothelstrukturen. Anhand seiner Er- gebnisse und Befunde versuchte er, ein Modell zu erstellen, das die Funktionsweise der Lymphgefäße erklären sollte (CASTENHOLZ 1984 b). Die ersten Studien von initia- len Lymphgefäßen der menschlichen Haut wurden vonBERENS VON RAUTENFELD et al.(1987b) durchgeführt. Mit Hilfe der Rasterelektronenmikroskopie gelang es, in die Gefäße direkt hineinzusehen und ein räumliches Bild vom Aufbau und den einzelnen Strukturen zu erstellen (BERENS VON RAUTENFELD et al. 1987). Durch Einsatz des Präparatespanners kann die Angioarchitektur initialer Lymphgefäße in besonders elas- tischen Präparaten der menschlichen Mundschleimhaut rasterelektronenmikrosko- pisch optimal dargestellt werden. FRICKE (2004) hat dagegen ausschließlich durch indirekte Applikation von Glutaraldehyd Lymphgefäße der Mundschleimhaut weit ge- stellt.
Aufgrund der optimalen Weitstellung mittels Präparatespanners, konnte ein Modell postuliert werden, das die Aufgaben und Funktionen der einzelnen Strukturen - wie z. B. Trabekel, interendotheliale Öffnungen, Ankerfilamente, Spindelzellen - zu erklä- ren versucht. Weiterhin können die vorliegenden Ergebnisse direkt mit den tierexperi- mentellen Untersuchungen von CASTENHOLZ (1984a und b) verglichen werden. Somit befasst sich die von CASTENHOLZ (1986) formulierte Frage, inwieweit seine durch Strukturanalysen der Lymphbahnen am tierischen Organismus gewonnenen Ergeb- nisse auch für den Menschen Gültigkeit haben.
4.1 Diskussion der Methoden
4.1.1 Aufarbeitungsmethoden der Schleimhautbiopsien
Bislang wurden im Wesentlichen zwei unterschiedliche Techniken entwickelt, welche die rasterelektronenmikroskopische Untersuchung von Hautproben des Kopfes mög- lich machen: Die Extensionstechnik und die Vakuumtechnik (LUBACH et al. 1991, BERENS VON RAUTENFELD et al. 1989). Beide Methoden tragen der Elastizität der
Haut Rechnung und verhindern ein Kollabieren der darin gelegenen Lymphgefäße.
Allerdings besteht bei Verwendung des Präparatespanners weniger die Gefahr, dass die Lymphgefäße überdehnt werden. Darüberhinaus ist die menschliche Haut weniger elastisch als die Mundschleimhaut.
4.1.1.1 Extensionstechnik
Bei der Extensionstechnik wird ein entnommenes Gewebestück horizontal und vertikal mit Hilfe von Gewichten gedehnt. Anschließend werden durch eine injizierte Flüssigkeit die initialen Lymphgefäße fixiert (LUBACH et al. 1991). Je nach Größe der zu untersu- chenden Gewebe unterscheidet man die "large traction extension"-Methode und die
"small traction extension"-Methode. Für die "Zug-Extension von großen Präparaten"
wird eine Größe der Biopsie von ungefähr 2 cm2 gefordert, wohingegen die Methode der "Zug-Extension von kleinen Präparaten" nur eine Größe von 25 mm2 erfordert.
Nachteil der „small traction extension“-Methode ist, dass Lymphgefäße nicht immer optimal weitgestellt werden.
4.1.1.2 Vakuumtechnik
Bei dieser Methode wird ein Präparat in einer Vakuumkammer durch einen mit einer Wasserstrahlpumpe erzeugten Unterdruck extendiert und gleichzeitig mit einer Flüs- sigkeit (Glutaraldehyd) fixiert (LUBACH et al. 1991). Die Anzahl der weit gestellten Lymphgefäße, die bei der Aufarbeitung mit der Vakuumtechnik gefunden werden, liegt in der Regel höher als bei der Extensionstechnik. Die genaue Beschreibung der Vaku- um-Extensionstechnik wurde von BERENS VON RAUTENFELD erstmals 1987 im Rah- men des 'Internationalen Kongresses für Lymphologie' in Wien vorgestellt (BERENS VON RAUTENFELD et al. 1988).
4.1.1.3 Perfusion mit Berliner Blau
Berliner Blau wurde in frühen Untersuchungen zur Markierung des initialen Lymphge- fäßnetzes eingesetzt, um das Auffinden der Lymphgefäße zu erleichtern. Das ist je-
doch nicht erforderlich, da Lymphgefäße rasterelekronenmikroskopisch aufgrund ihrer Wandstrukturen erkannt werden können (BERENS VON RAUTENFELD et al. 1987, WENZEL-HORA et al. 1987). Bei eigenen Vorversuchen zeigte sich, dass durch An- wendung von Berliner Blau, die Oberfläche der Präparate verunreinigt wird. Deshalb kam dieses Markierungsverfahren in dem hier vorgestellten Hauptversuch nicht zur Anwendung.
4.1.1.4 Perfusion mit Mercox oder Tardoplast
Die Präparate, bei denen mit den Gießharzen Mercox oder Tardoplast initiale Lymph- gefäße gefüllt wurden, zerfielen schon während der Verarbeitung beim Spülen bzw.
während der Maszeration im Labor. Die Instabilität war vermutlich durch die geringe Größe der Biopsien bedingt. Deshalb waren die verbliebenen Ausgusspräparate für eine rasterelektronenmikroskopische Auswertung ungeeignet. BERENS VON RAUTENFELD (1990) war dagegen in der Lage, durch Untersuchung größerer Proben (z.B. der Haut) auch die Endotheloberfläche initialer Lymphgefäße mit einer Art Ab- druck (Negativdarstellung) abzubilden. Darüber hinaus können die Angioarchitektur des Lymphgefäßnetzes, sein Verzweigungsmuster sowie die blindsackartig beginnen- den Lymphkapillaren visualisiert werden (CASTENHOLZ 1984b, CASTENHOLZ und BERENS VON RAUTENFELD 1987). Diese Präparationsmethode ist zur Darstellung von Gießharzausgießungen initialer Lymphgefäße in Gewebeproben nicht geeignet, da beim Schneiden der Gewebeblöcke das Gießharz zerbricht.
4.1.1.5 Direkte und indirekte Lymphographie
Das Prinzip der direkten Lymphographie beruht auf der Punktion eines Lymphgefä- ßes mit anschließender Injektion eines Farbstoffes oder Kontrastmittels zur Darstel- lung von Lymphgefäßen (TEICHMANN 1861, KINMONTH 1952). KINMONTH bediente sich dabei der Methode von MCMASTER et al. (1952), um Kollektoren mit einem Rönt- genkontrastmittel sichtbar zu machen. Bis in die 1960er Jahre waren dabei wasserlös- liche Kontrastmittel üblich (ARNAUDOW 1968), doch bald sollten pathologische Verän- derungen in den Lymphknoten visualisiert werden, so dass fettlösliche Kontrastmittel zum Einsatz kamen (TJERNBERG 1956, FUCHS 1964, COLETTE und HONORE 1967).
Lipidiol-UF® wird nur noch selten zum „tumor staging“ eingesetzt. Erst mit der Weiter- entwicklung wasserlöslicher Kontrastmittel (Iotasul) wurde auch eine ausreichende Darstellung der initialen Lymphgefäße im Kopf- und Gesichtsbereich ermöglicht (MÜLLER et al. 1985a). Diese Methode wird als indirekte Lymphographie bezeichnet.
Mit dem wasserlöslichen Kontrastmittel Iotasul bzw. Isovist® konnten erstmals Präkol- lektoren nachgewiesen werden und es wurden keine allergischen, lokalen, Früh- oder Spät-Reaktionen bei den Patienten beobachtet.
Bei der indirekten Lymphographie wird das wasserlösliche Kontrastmittel über ein Infusionssystem in das Gewebe appliziert. Die Spitze der Kanüle muss dicht unter der Epidermis platziert werden. Im subepithelilialen Bindegewebe entsteht durch das ver- mehrte Flüssigkeitsaufkommen eine Injektionsquaddel. Das höhere Angebot an Flüs- sigkeit dehnt das Bindegewebsfasernetz, wodurch initiale Lymphgefäße weit gestellt werden. Dadurch werden auch die interendothelialen Öffnungen initialer Lymphgefäße weit gestellt und das Kontrastmittel gelangt in das Lymphgefäßlumen. Dieser Mecha- nismus wurde von MCMASTER bei bestimmten Vitalstoffen entdeckt (MCMASTER und PARSONS 1939). Erst Anfang der 1980er Jahre fand die indirekte Lymphographie Ein- gang in den klinischen Anwendungsbereich (WENZEL-HORA et al. 1982, WENZEL- HORA et al. 1985a), wodurch eine Differenzierung verschiedener Ödemformen (Lymphödeme, Lipödeme, Phlebolymphödeme) und der Nachweis eines „artifiziellen Lymphödems“ möglich ist.
Bei den vorliegenden Untersuchungen kam die sogenannte simultane indirekte Fül- lungsmethode zum Einsatz , welche sowohl klinisch (MÜLLER et al. 1985a und b) als auch experimentell (WENZEL-HORA et al. 1985b) genutzt wird. Mehrere - in der Regel 2 bis 6 - Kanülen werden subepidermal platziert und über ein Infusionssystem mit ei- ner Injektionspumpe verbunden. Die zu applizierende Injektionsmasse wird gleichzeitig über alle Kanülen in das Gewebe infundiert. In der klinischen Anwendung wird wäh- rend der Perfusion von Röntgenkontrastmitteln gleichzeitig der Füllungsablauf radiolo- gisch kontrolliert (MÜLLER et al. 1985a und b, WENZEL-HORA et al. 1985a und b).
4.1.2 Einfluss der Präparationsmethode auf die Größen- und Abstandsmessungen Bei Anwendung der verschiedenen Techniken (siehe oben) ergeben sich unterschied- liche Werte bei der Messung von Gefäßdurchmessern, Gefäßabständen zum Epithel und der Gefäßvernetzung. Eine Erklärung dafür liegt in der Höhe des Applikationsdru- ckes bzw. der Applikationsgeschwindigkeit auf die Füllungsphänomene der initialen Lymphgefäße (siehe dazu 4.2.2). Ein Vergleich verschiedener Messwerte aus der Lite- ratur ist daher sehr schwierig. In den jeweiligen Studien liegen kaum vergleichbare Versuchsbedingungen vor (WENZEL-HORA et al. 1987).
4.1.3 Rasterelektronenmikroskopisches Auswertungsprinzip
Der Rasterelektronenmikroskopie stehen zwei Darstellungsformen zur Verfügung.
Zum einen ist es möglich, ein räumliches Bild von mit Kunststoff ausgegossenen Lymphgefäßstrecken zu erhalten und so das Lymphgefäßsystem mit seinen Vernet- zungsvarianten darzustellen. Zum anderen sind bei Verwendung der indirekten Perfu- sionsmethode mit Glutaraldehyd auch die inneren Wandabschnitte der Lymphgefäße und die intraluminal gelegenen Zellen zu erkennen. Versuchstechnische Untersuchun- gen mit Glutaraldehyd und Mercox (Kunststoff zur Ausgusstechnik) wurden von der Arbeitsgruppe BERENS VON RAUTENFELD (BERENS VON RAUTENFELD et al. 1987, WENZEL-HORA et al. 1987) durchgeführt.
4.2 Diskussion der Ergebnisse
4.2.1 Abhängigkeit der Qualität der Ergebnisse von der Größe der Materialproben Die Befunde zeigen, dass mit wachsender Größe der Biopsien die morphologischen Einzelheiten häufiger dargestellt werden können und dass die Details ohne Beschädi- gungen sichtbar sind. Daraus lässt sich ableiten, dass kleine Präparate wesentlich anfälliger für äußere Störfaktoren sind (z. B. Torsion, Expansion) als größere Proben.
Es lässt sich quantitativ und qualitativ nicht genau bestimmen, bei welchem Aufberei- tungsschritt die Beeinflussung am stärksten ist. Schon der operative Eingriff an sich kann Schädigungen des Gewebes mit sich führen und durch einen zu hohen Perfusi-
onsdruck können Risse im Lymphgefäßendothel entstehen (s. u.). Schließlich kann die Biopsie auch beim Schneiden der Präparate gequetscht werden.
4.2.2 Abhängigkeit der Darstellungsqualität der Lymphgefäße von der Perfusionsgeschwindigkeit
Die eigenen Beobachtungen zeigen, dass die Perfusionsgeschwindigkeit einen Grenz- bereich überschreiten muss, damit die morphologischen Strukturen gut dargestellt werden können. Ist die Perfusionsgeschwindigkeit zu hoch, dann reißt z. B. das Gefä- ßendothel, die interendothelialen Öffnungen werden maximal dilatiert, bis es zu Zer- reißungen kommt und die interendothelialen Brücken oder Trabekel werden über ihre normale Länge hinaus gezogen. Bei einer Perfusionsgeschwindigkeit, die zwischen 0,03 bis 0,3 ml pro Minute liegt, werden die Einzelheiten in den Lymphgefäßen und deren Umgebung gut dargestellt (WENZEL-HORA et al. 1987). Die Perfusions- geschwindigkeit muss folglich gut angepasst sein, um die Lymphgefäße optimal weit zu stellen und damit einen guten räumlichen Einblick in das Innere der Lymphgefäße mit dem Rasterelektronenmikroskop zu ermöglichen.
Veränderungen und Beschädigungen des Gefäßendothels bei hohen Perfusionsdrük- ken von 0,5 ml pro Sekunde wurden, wie in den vorliegenden Untersuchungen auch, von der Arbeitsgruppe BERENS VON RAUTENFELD beschrieben (BERENS VON RAUTENFELD et al. 1986). Dabei können sich bei hohen Perfusionsdrücken von 0,5 ml pro Minute vornehmlich die subendothelialen Filamente aus der abluminalen Oberflä- che des Endothelüberzuges ablösen. Nach Ansicht von BERENS VON RAUTENFELD (1990) ist aber nicht allein dieser Mechanismus für die Veränderungen verantwortlich, sondern eine weitere Ursache muss auch in der darauf folgenden labortechnischen Verarbeitung gesehen werden. Aufgrund der Untersuchungen von WENZEL-HORA et al. (1987) ergibt sich die Empfehlung, mit niedrigem Infusionsdruck, möglichst mit 0,03 ml pro Minute die Lymphkapillarstrecken zu füllen. Eine Ausnahme stellt das Gewebe des Gaumens dar. Dort wo Lymphgefäße gänzlich elastisch im umliegenden Bindege- websfasergerüst aufgehängt sind, hält der Endothelüberzug auch einer höheren Infu- sionsgeschwindigkeit stand, ohne dass es zu Gewebsrissen kommt. Deshalb kamen in der vorliegenden Untersuchung Infusionsgeschwindigkeiten von 0,2 – 0,5 ml pro Minu- te zur Anwendung.
4.2.3 Abhängigkeit der Perfusionsdauer auf den Endothelüberzug initialer Lymphgefäße
In den eigenen Untersuchungen wurden die Biopsien unterschiedlich lange perfundiert (20 Minuten: 10 Präparate, 30 Minuten: 8 Präparate, 45, 25, 20, 10 Minuten: jeweils 1 Präparat). Dabei zeigte sich, dass die Dauer der Perfusion innerhalb dieser Zeitinter- valle keinen Einfluss auf die Qualität der Resultate hatte. Im Bereich des Endothel- überzuges wurden keine artifiziellen Veränderungen registriert, sofern Applikationsge- schwindigkeiten von 0,2 – 0,5 ml pro Minute zur Anwendung kamen (siehe 4.2.2).
4.2.4 Rasterelektronenmikroskopische Unterscheidung von Lymph- und Blutkapillaren
Blutkapillaren besitzen mehr oder weniger konstante Querdurchmesser von etwa 10µm, während Lymphkapillaren bei maximaler Weitstellung Querdurchmesser von 50µm aufweisen. Ohne indirekte Applikation von Glutaraldehyd sind alle Lymphkapilla- ren zur rasterelektronenmikroskopischen Untersuchung nicht ausreichend weit gestellt fixiert, während sich Blutkapillaren mehr oder weniger weit gestellt darstellen lassen.
Die injektomatische Weitstellung der Lymphkapillaren ist abhängig vom Abstand des Gefäßes zur Injektionskanüle in der Biopsie. Bereits wenige Millimeter vom Einstich- kanal der Kanüle können Lymphkapillaren keine ausreichende Weitstellung zur raste- relektronemikroskopischen Beurteilung aufweisen. Mitunter sind sogar Lymphkapillar- abschnitte nahe der Injektionsstelle nicht ausreichend dilatiert. Dadurch ist eine raste- relekronenmikroskopische Rekonstruktion von Lymphgefäßnetzen in Gewebeproben nur bedingt möglich. Das heißt, dass neben weit gestellten Lymphkapillarausschnitten können stets völlig kollabierte Lymphkapillarabschnitte vorhanden sein können, welche sich der rasterelektronenmikroskopischen Beurteilung entziehen.
4.2.5 Andere Methoden zur Unterscheidung von Blut- und Lymphkapillaren
Die hier vorgestellten Methoden, kamen bei vorliegenden Untersuchungen nicht zur Anwendung.
Mit lichtmikroskopischen Untersuchungen (z.B. Semidünnschnitten) ist eine eindeutige Untescheidung von Blut- und Lymphkapillaren nicht möglich. Blutkapillaren können vermehrt Erythrozyten enthalten (CASTENHOLZ 1984a, CASTENHOLZ 1985b).
Erythrozyten können aber auch im Lumen von Lymphkapillaren angetroffen werden, da rote Blutzellen aus dem interstitiellen Bindegewebsraum über interendotheliale Öff- nungen in das Lymphkapillarlumen gelangen können. Das ist der Fall, wenn Erythrozy- ten aus der terminalen Blutstrombahn der Biopsie bei der Entnahme in den Bindege- websraum gelangen (BERENS VON RAUTENFELD, pers. Mitt.).
Transmissionselektronenmikroskopisch ist eine Unterscheidung der Lymph- und Blut- kapillaren in der Regel möglich, da z.B. Blutkapillaren keinen subendothelialen Filz von Filamenten (KAINDL et al. 1967), aber Perizyten aufweisen, welche den Lymphkapilla- ren fehlen.
Auch mit der injektomatischen Fluoreszensmikroskopie in Drucklichtpräparaten z.B. im Lebendversuch in der Zunge der Ratte gelingt die Darstellung von Lymphkapillaren (CASTENHOLZ 1988c, 1990). Auch die erst nach Abschluss der vorliegenden Unter- suchungen entwickelten histochemischen und molekularen Darstellungsmethoden zur Differenzierung von Blut- und Lymphkapillaren in der Lichtmikroskopie stellen einen entscheidenden Fortschritt in der lymphangiologischen Forschung dar (siehe Über- sichtreferat BERENS VON RAUTENFELD und CLAUS 2005). Zur selektiven Darstel- lung von Lymphkapillaren können wichtige Marker wie z.B. LYVE- 1 und der Transkrip- tionsfaktor PROX-1, aber auch lymphvaskuläre Wachstumsfaktoren VEGF-C und VEGF-D bzw. ihre Rezeptoren VEGF-R3 verwendet werden.
Trotzdem dürfte die hier vorgestellte rasterelektronenmikroskopische Methode zur räumlichen Darstellung von Einbruch- bzw. Einwanderungsstadien von Tumorzellen im Bereich des Endothelüberzuges von Lymphkapillaren von Bedeutung sein, da es bis- lang noch nicht möglich ist, die Marker auch transmissionselektronenmikroskopisch zu nutzen.
4.2.6 Nomenklatur "Lymphkapillaren und initialer Lymphsinus"
In der Literatur (BERENS VON RAUTENFELD 1990) stößt man immer wieder auf die Begriffe „Lymphkapillare", „terminales Lymphgefäß“, „Wurzelgefäß“, „feines Lymphge- fäß“ und "initialer Lymphsinus". Die Lymphkapillaren stellen die Wurzeln des Lymph- drainagesystems dar. Den Begriff "initiales Lymphgefäß" führte CASLEY-SMITH und MART (1970) anstelle des Begriffes "Lymphkapillare" ein. Nach wie vor existieren Prä- kollektoren nicht in der englischsprachigen Literatur, obwohl sich Präkollektoren durch das Vorhandensein von Klappen und Bindegewebstrabekel eindeutig von Lymphkapil- laren unterscheiden lassen. CASTENHOLZ und BERENS VON RAUTENFELD (1987) haben den nomenklaturischen Versuch unternommen, die 5x größeren Lymphkapilla- ren im Vergleich zu Blutkapillaren, als „initialer Lymphsinus“ in Anlehnung an den
„intranodalen Lymphsinus“ zu benennen. Leider ist dieser Versuch misslungen , da sich dieser Begriff in der Literatur nicht etablieren ließ.
4.2.7 Topographie der Lymphgefäße
Mit den ersten Untersuchungen von menschlichen Hautpräparaten wurde auch der Frage nach der Vernetzung der initialen Lymphgefäße und deren Lage nachgegangen (WENZEL-HORA et al. 1987). Es wurden zwei Netzsysteme von initialen Lymphgefä- ßen beschrieben. Die Lymphkapillaren bilden maschenartige Segmente mit blind en- denden Gefäßen. Die Segmente liegen ungefähr 20 µm unter der Basalmembran der Epidermis. Die Arbeitsgruppe von Wenzel-Hora ermittelte eine Maschenweite der Lymphkapillaren von 200–500 µm. Das zweite, tiefer im Corium gelegene Lymphge- fäßnetz wird von Präkollektoren gebildet, dessen Maschenweite mehr als 500 µm be- trägt. Es ist das erste postkapilläre Netz, in welchem keine blind beginnenden Gefäß- abschnitte vorkommen. Beide Lymphgefäßnetze stehen miteinander in Verbindung (BERENS VON RAUTENFELD et al. 1985, KUBIK und MANESTAR 1985).
Die vorliegenden eigenen Ergebnisse erlauben keine eindeutige Aussage über die Maschenweite initialer Lymphgefäße. Die dreidimensionale Darstellung des Lymphge- fäßnetzes ist nur durch den Einsatz von Gießharzen möglich (siehe oben).
Die eigenen Ergebnisse zeigen, dass die meisten initialen Lymphgefäße in einer Ent- fernung von 0 bis 150 µm zur Basallamina des Epithels gelegen sind. Ähnliche Beo-
