- Einleitung
- Vorstellung von Probenvorbereitungstechniken - Proteinfällung
- Flüssig-/Flüssigextraktion - Festphasenextraktion
- Restricted Access-Materialien (RAM) - Pinkerton-ISRP-Material
- Biotrap-500-Material - Lichrospher-ADS-Material - Phenylborsäure-Material - Experimenteller Teil - Chemikalien
- Probematerialien und Standards
- Chromatographische Instrumentierung und Bedingungen - Applikationen
- Katecholamine - Salbutamol - Benzodiazepine
- Tricyclische Antidepressiva - Antiepileptika
- Ausblick und Möglichkeiten für die toxikologische Analyse - Spezifität und Selektivität der online-Probenvorbereitung
- Kopplung von Identifikationsmöglichkeiten nach online-Probenvorbereitung - Standzeiten, Analysenzeiten (Kostenbetrachtung)
- Zusammenfassung - Literaturverzeichnis Einleitung
Proben biologischen Ursprungs stellen durch ihre komplexe Zusammensetzung und Hetero-genität ihrer Bestandteile eine große Herausforderung für die Bestimmung von endogenen und exogenen Analyten dar. Die systematische toxikologische Analyse hat drei wesentliche Ziele. Zum einen festzustellen, ob in der Probe bedrohliche Substanzen existieren, andererseits deren Identifizierung und ihre Quantifizierung, um deren Wirkung zu interpretieren. Dabei hat insbesondere die hochauflösende Flüssigchromatographie (HPLC) einen großen Stellenwert erlangt.
Eines der wichtigsten Probleme der Analyse von Drogen und Medikamenten in den unterschiedlichen biologischen Matrices mit HPLC ist die zumeist zeitaufwendige Probenvorbereitung. Diese kann die Abtrennung der störenden Matrix, die Anreicherung der/des zu bestimmenden Analyte/n oder beides beinhalten.
Proteinhaltige Proben können nicht direkt in ein chromatographisches System injiziert werden, da dies bei den am meisten verwendeten reversed phase C18-Säulen zur Ausfällung der Proteine führt. Dies führt zu einer Absorption an den Partikeln. Eine interne Akkumulation von Proteinen am Säulenkopf verschlechtert durch verstopfte Poren die Trennleistung der Säule, da der durch Diffusion erzielte Massentransport in die poröse Packung in erheblichem Maße eingeschränkt wird, so dass die Säulenkapazität abnimmt. Eine überschüssige Ansammlung denaturierter
Probenbestandteile führt dann zu einer Verringerung des Zwischenkornvolumens und behindert den Eluentenfluß durch die Säule.
Die Verteilung der Analyte über korpuskuläre Bestandteile (Zellen), Flüssigkeiten (Plasma, Serum, Urin, Liquor) und/oder feste Bestandteile (Stuhl) stellt oft hohe Anforderungen an die Verfahren der Probenvorbereitung. Bei der Hauptkomponentenanalyse (z.B. Albumin, Kreatinin) stehen vorwiegend physikalische Verfahren (z. B. Zentrifugation) im Vordergrund, bei denen eine eindeutige Abgrenzung der unterschiedlichen Matrizes (z.B. Serum von Zellen) erzielt wird.
Bei der Spurenanalyse endogener und exogener Verbindungen steht in aller Regel die Abtrennung der Matrix als erster Schritt der Probenvorbereitung im Vordergrund.
Hierbei gelangen sowohl physikalische als auch chemische Verfahren zur Anwendung. Nach einer Phasentrennung (z.B. Abtrennung von Zellen des Blutes) und/oder Proteinfällung kann man außerdem die unterschiedlichen Verteilungskoeffizienten der Probenbestandteile ausnutzen, um eine Abtrennung der Protein- und/oder Lipidmatrix zu erreichen. Bei den Festphasenextraktionen überlagern sich oft mehrere Aspekte. Bei dieser externen Technik wird durch die Nutzung chromatographischer Trennmaterialien eine Abtrennung der Martix erreicht.
Andererseits können sehr spezifisch Analyte extrahiert werden, die dabei zumeist auch angereichert werden (z.B. PAK's im Serum).
Neuere Entwicklungen führten zu einer Integration der Probenvorbereitung in den chromatographischen Prozess, wobei „inline" eine Abtrennung der Matrix und eine Anreicherung der Analyte erfolgt. Im darauf folgenden zweiten Schritt werden online der/die Analyt/e auf die Trennsäule überführt.
In der vorliegenden Arbeit soll die in den chromatographischen Prozess integrierte Probenvorbereitung anhand von Beispielen vorgestellt werden und hinsichtlich ihrer Verwendbarkeit für die toxikologische Analyse betrachtet werden.
Zusammenfassung
Die Analyse von Proben biologischen Ursprungs stellt durch ihre komplexe Begleitmatrix eine große Herausforderung hinsichtlich der Probenvorbereitung für chromatographische Verfahren dar.
In der vorliegenden Arbeit wurden einige der am Häufigsten eingesetzten Probenvor- bereitungstechniken vorgestellt. Die Proteinfällung wird auf Grund ihrer Einfachheit vielfach eingesetzt, hat jedoch Nachteile durch Mitfällung der Analyte. Oftmals wird die Proteinfällung mit der Flüssig/Flüssigextraktion kombiniert, um die Spezifität zu erhöhen. Nachteilig wirken sich jedoch dabei die hohen Kosten für die Lösungsmittel und deren Entsorgung aus. Hinzu kommt, dass sich beide Verfahren nur schwerlich automatisieren lassen. Die Festphasenextraktion besitzt hinsichtlich der Abtrennung der Matrix und Anreicherung der Analyte eine deutlich höhere Spezifität und lässt sich zudem hoch automatisieren. Allerdings gehört auch diese zu den externen Techniken.
Von den anschließend vorgestellten restricted-access Materialien haben sich insbesondere das Pinkerton-ISRP-, das BioTrap 500- und das RP-ADS-Material durchgesetzt. Alle Materialien werden für die online-Probenvorbereitung in HPLC- Systemen eingesetzt. Die Einsatzmöglichkeiten einiger dieser neuen Materialien wurde anhand von eigenen Applikationen im Rahmen dieser Arbeit erstmals vorgestellt.
Die Anreicherung von cis-Diol-Analyten gelingt an dem von Boos entwickelten Phenylborsäurematerial. Dies konnte mit den Applikationen für die Katecholamin- und Salbutamolbestimmung gezeigt werden.
Die Bestimmung hydrophober Analyte ist an RP-ADS-Materialien möglich. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die Bestimmung von Benzodiazepinen und tricyclischen Antidepressiva unter Verwendung von RP4-ADS-Material in der Anreicherungssäule vorgestellt. Die Bestimmung der hydrophileren Antiepileptika Lamotrigin und Sultiam gelingt mit dem hydrophoberen Anreicherungsmaterial RP18- ADS.
Der Grad der Automatisierung und die Einfachheit der Durchführung konnte anhand der Beispiele demonstriert werden. Dabei wurden trotz anfänglich höherer Investitionskosten überzeugende Resultate hinsichtlich der Wirtschaftlichkeit erzielt.
