Klonierung und Expression möglicher Virulenzgene von Helicobacter hepaticus

Medizinischen Hochschule Hannover

Klonierung und Expression möglicher Virulenzgene von Helicobacter hepaticus

Dissertation

zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin in der Medizinischen Hochschule Hannover

vorgelegt von Tim Seybold aus Aurich, Ostfriesland

Hannover 2014

Präsident: Prof. Dr. med. Christopher Baum Betreuer: Prof. Dr. med. Sebastian Suerbaum

Referent: Prof. Dr. med. Franz Bange Korreferent: PD Dr. med. Oliver Bachmann

Tag der mündlichen Prüfung: 15.12.2014

Prüfungsausschussmitglieder:

Prof. Dr. med. Hans-Heinrich Kreipe Prof. Dr. med. Sebastian Suerbaum

Prof. Dr. med. Matthias Eder

Inhaltsverzeichnis

1 ZUSAMMENFASSUNG ... 6

2 EINLEITUNG ... 9

2.1 Helicobacter pylori als Prototyp der Gattung Helicobacter ... 9

2.2 Andere gastrische Helicobacteraceae ... 10

2.3 Die enterohepatischen Helicobacter ... 11

2.4 Helicobacter hepaticus ... 12

2.4.1 Morphologie und Taxonomie ... 12

2.4.2 Kultivierung, Diagnostik und Therapie ... 13

2.4.3 Pathologie und Klinik an Leber und Gallengangssystem ... 14

2.4.4 Pathologie und Klinik im Intestinaltrakt ... 15

2.4.5 Virulenzfaktoren von Helicobacter hepaticus ... 21

2.4.5.1 Urease ... 22

2.4.5.2 Das Flagellensystem von Helicobacter hepaticus ... 24

2.4.5.3 Hydrogenase als Virulenzfaktor ... 24

2.4.5.4 Lipopolysaccharide ... 25

2.4.5.5 Potentielle Adhäsine ... 25

2.4.5.5.1 Peb1 als potentielles Adhäsin ... 26

2.4.5.7 Das zytolethale ausdehnende Toxin („Cytolethal Distending Toxin CDT“) ... 27

2.4.6 Die Pathogenitätsinsel HHGI1 von Helicobacter hepaticus ... 28

2.5 Typ-IV-Sekretionssysteme ... 30

2.5.1 Der Prototyp eines Typ-IV-Sekretionssystems – Aufbau des VirB-D- Sekretionsapparats von Agrobacterium tumefaciens ... 31

2.5.1.1 Der Kopplungsproteinmultimerkomplex ... 32

2.5.1.2 Der transmembranöse Proteinkomplex ... 33

2.5.1.3 Der Pilusapparat ... 34

2.5.2 Die Funktionsweise der T4SS – Modell nach Cascales und Christie ... 35

2.6. Die Familie der cysteinreichen Proteine ... 36

2.7 Enterohepatische Helicobacteraceae als potentielle Krankheitserreger beim Menschen ... 38

2.8 Zielsetzung ... 40

3 MATERIALIEN UND METHODEN ... 42

3.1 Materialien ... 42

3.1.1 Geräte ... 42

3.1.2 Chemikalien ... 42

3.1.3 Enzyme und Kits ... 43

3.1.4 Standards ... 43

3.1.5 Bakterienstämme ... 44

3.1.5.1 Escherichia coli ... 44

3.1.5.2 Helicobacter hepaticus ... 44

3.1.5.2.1 Wildtypstämme ... 44

3.1.5.2.2 Knockout-Mutanten von Helicobacter hepaticus ... 44

3.1.6 Medien ... 45

3.1.6.1 Feste Nährmedien ... 45

3.1.6.2 Flüssignährmedien ... 45

3.1.7 Plasmide ... 45

3.1.8 Oligonukleotide ... 46

3.2 Methoden ... 48

3.2.1 Anzucht auf festen Nährmedien ... 48

3.2.1.1 Escherichia coli ... 48

3.2.1.2 Helicobacter hepaticus ... 48

3.2.2 Anzucht in Flüssigmedium... 49

3.2.2.1 Escherichia coli ... 49

3.2.2.2 Helicobacter hepaticus ... 49

3.2.3 Einfrierkulturen ... 49

3.2.3.1 Escherichia coli ... 49

3.2.3.2 Helicobacter hepaticus ... 49

3.2.4 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ... 50

3.2.4.1 Standard-PCR ... 50

3.2.4.2 Inverse PCR ... 51

3.2.4.3 Sequenzierung von DNA ... 51

3.2.5 Arbeiten mit Nukleinsäuren ... 51

3.2.5.1 Vorbehandlung von Geräten und Lösungen ... 51

3.2.5.2 Reinigung von Nukleinsäuren ... 52

3.2.5.2.1 Extraktion von bakterieller DNA aus Helicobacter hepaticus ... 52

3.2.5.2.2 Aufreinigung von DNA ... 52

3.2.6 Klonierungen ... 52

3.2.6.1 Verdau von DNA mit Restriktionsendonukleasen ... 52

3.2.6.2 Alkalische-Phosphatase-Behandlung ... 52

3.2.6.3 Ligation ... 53

3.2.6.4 Herstellung kompetenter Escherichia coli-Zellen ... 53

3.2.6.5 Transformation von DNA ... 54

3.2.6.5.1 Escherichia coli ... 54

3.2.6.5.2 Helicobacter hepaticus ... 54

3.2.7 Isolierung von DNA ... 55

3.2.7.1 Plasmid Mini-Präparation (nach Birnboim & Doly, 1979) ... 55

3.2.7.2 Plasmid Midi-Präparation ... 56

3.2.7.3 Präparation von chromosomaler DNA aus Helicobacter hepaticus ... 56

3.2.8 Konzentrationsbestimmung und Reinheitskontrolle ... 56

3.2.9 Agarosegelelektrophorese ... 57

3.2.9.1 Standard-Agarosegelelektrophorese ... 57

3.2.9.2 Präparative Agarose-Gele ... 57

3.2.10 Proteinmethoden ... 58

3.2.10.1 Überexpression und Aufreinigung von Proteinen ... 58

3.2.10.2 Proteinbestimmungen ... 59

3.2.10.3 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE, Laemmli, 1970) ... 60

4 ERGEBNISSE ... 62

4.1 Deletion des putativen virB4-Homologs HH0260 im Helicobacter hepaticus-Stamm ATCC 51449 ... 62

4.1.1 Das Plasmid pSUS2308 - Klonierung des Inserts in den Vektor pUC18 ... 62

4.1.2 Das Plasmid pSUS 2309 – Selbstligation der freien Enden nach inverser PCR ... 65

4.1.3. Das Plasmid pSUS2311 – Insertion einer Chlorphenicolacetyltransferase ... 66

4.1.4 Deletion des virB4-Gens durch homologe Rekombination ... 71

4.2 Deletion des putativen hcpA-Homologs HH1222 im Helicobacter hepaticus-Stamm ATCC 51449 ... 73

4.2.1 Das Plasmid pSUS2303 - Klonierung des Inserts in den Vektor pUC18 ... 73

4.2.2 Das Plasmid pSUS 2304 – Selbstligation der freien Enden nach inverser PCR ... 74

4.2.3 Das Plasmid pSUS2305 – Insertion einer Chloramphenicolacetyltransferase ... 75

4.2.4 Deletion des hhcpA-Gens durch homologe Rekombination ... 77

4.3 Überexpression und Aufreinigung von HhcpA aus Escherichia coli ... 80

4.3.1 Konstruktion des Plasmids ... 80

4.3.2 Überexpression in ER2566 und Aufreinigung von HhcpA ... 82

4.3.3 Darstellung des Proteins HhcpA durch SDS-PAGE-Gelelektrophorese ... 83

4.4 Deletion des putativen peb1-Homologs HH1481 im Helicobacter hepaticus-Stamm ATCC 51449 ... 86

4.4.1 Das Plasmid pSUS2108 - Klonierung des Inserts in den Vektor pUC18 ... 86

4.4.2 Das Plasmid pSUS 2306 – Selbstligation der freien Enden nach inverser PCR ... 88

4.4.3 Das Plasmid pSUS2307 – Insertion einer Chloramphenicolacetyltransferase ... 89

4.4.4 Deletion des peb1-Gens durch homologe Rekombination ... 91

5 DISKUSSION ... 92

5.1 Das Helicobacter hepaticus-virB4-Homolog HH0260 als Virulenzgen? ... 93

5.2 Das Helicobacter hepaticus-hcpA-Homolog HH1222 als Virulenzgen? ... 98

5.3 Das Helicobacter hepaticus-peb1-Homolog HH1481 als Virulenzgen? ... 102

5.4 Fazit ... 104

6 LITERATURVERZEICHNIS ... 107

7 ANHANG ... 128

7.1 Abkürzungsverzeichnis ... 128

7.2 Lebenslauf ... 130

7.3 Erklärung nach § 2 Abs. 2 Nrn. 6 und 7 ... 130

7.4 Danksagung... 131

1 Zusammenfassung

Erstmals 1992 entdeckt, ist Helicobacter hepaticus mittlerweile das am besten untersuchte Bakterium der enterohepatischen Helicobacter-Spezies. Es ist ein anspruchsvolles, mikroaerophiles, gram-negatives Bakterium. Sein Genom umfasst etwa 1800 kbp, die für 1875 Proteine kodieren. Der natürliche Wirt von H. hepaticus ist die Maus; seine weltweite Verbreitung, nicht nur unter Versuchstieren, ist mittlerweile gesichert.

H. hepaticus verursacht bei Mäusen mit fehlregulierter Immunantwort neben chronischer Hepatitis auch Entzündungen des Intestinums, deren Bild dem der chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen des Menschen, der Colitis ulcerosa und dem Morbus Crohn, ähnelt.

Darüber hinaus ist H. hepaticus, ähnlich wie sein enger Verwandter Helicobacter pylori, ein Karzinogen, welches in der Lage ist, bei Mäusen Wachstum von hepatozellulären und kolorektalen Karzinomen zu induzieren. Auch bei menschlichen Patienten mit Leber- und Gallenerkrankungen konnte bereits genetisches Material von diversen enterohepatischen Helicobacter-Spezies nachgewiesen werden, ein kausaler Zusammenhang ist bislang jedoch nicht bewiesen. Zwar teilt H. hepaticus seine Eigenschaft als Karzinogen mit H. pylori, nicht jedoch seine natürliche Nische. Während H. pylori den Magen kolonisiert, ist H. hepaticus, ähnlich wie ein zweiter naher Verwandter Campylobacter jejuni, im unteren Intestinaltrakt beheimatet. Nach Sequenzierung des kompletten Genoms konnten durch Genomvergleich mit H. pylori bzw. C. jejuni 938 bzw. 953 Orthologe identifiziert werden; 821 dieser putativen Homologe finden sich sogar in allen drei Organismen.

Drei Proteine aus dem Genom von H. hepaticus wurden in dieser Arbeit untersucht, VirB4, HhcpA und Peb1. Durch die Konstruktion spezifisch-defizienter Mutanten und die Aufreinigung von HhcpA wurde der Weg für spätere in-vitro und in-vivo Experimente zur endgültigen Bestätigung der bislang nur postulierten Virulenzfunktion dieser drei Einzelproteine geebnet.

Beim VirB4-Homolog HH0260 handelt es sich um eine von vier putativen Komponenten eines Typ-IV-Sekretionssystems, welche alle auf der genomischen Insel HHGI1 kodiert sind.

Typ-IV-Sekretionssysteme sind sowohl unter tier- als auch pflanzenpathogenen Keimen weit verbreitete Mechanismen, um diverse Makromoleküle aus dem Zytoplasma auszuschleusen.

Über Typ-IV-Sekretionssysteme sind verschiedene pathogene Bakterien in der Lage, onkogene DNA in die Wirtszelle einzuschleusen; tumorähnliches Wachstum kann eine Folge sein. Der Prototyp eines Typ-IV-Sekretionsapparats von Agrobacterium tumefaciens umfasst die Komponenten VirB1 bis VirB11 sowie VirD4. VirB4 ist an der inneren Zellmembran

lokalisiert und somit mutmaßlich an der Ausbildung der inneren Pore des Typ-IV- Sekretionsapparats beteiligt; es soll als Substratandockstelle an der inneren Kanalöffnung fungieren. Charakteristische Eigenschaft des VirB4-Homologs ist seine ATPase-Aktivität, wodurch Energie für den Substrattansport bereitgestellt wird.

Auch H. hepaticus gilt mittlerweile als gesichertes Karzinogen, so dass VirB4 als Teil des postulierten Typ-IV-Sekretionssystems entscheidend an der Ausbildung von hepatozellulären und/oder kolorektalen Karzinomen im Mausmodel beteiligt sein könnte. Im Rahmen dieser Doktorarbeit konnte das für VirB4 kodierende Gen erfolgreich deletiert werden, was weitere Versuche mit der konstruierten Knockoutmutante ermöglicht.

Analog wird die ebenfalls erfolgreich klonierte hhcpA-defiziente Mutante Rückschlüsse auf die Rolle von HhcpA für die Virulenz von H. hepaticus erlauben. Darüber hinaus konnte HhcpA durch Nutzung des IMPACT^TM Protein Purification Systems in kompetenten Escherichia coli Zellen überexprimiert und anschließend in aufgereinigter Form gewonnen werden. Als H. hepaticus-Pendant des H. pylori cysteinreichen Proteins A ist HhcpA teil einer relativ jungen Proteinfamilie, die bemerkenswerterweise bislang nur im Genom von Helicobacter-Spezies identifiziert werden konnten. Sowohl seine Penicillinbindefähigkeit als auch β-Laktamaseaktivität zeichnen HcpA aus, wobei deren Bedeutung in-vivo unklar ist.

Über ihre Beteiligung am Aufbau der Peptidoglykanschicht könnten die cysteinreichen Proteine darüber hinaus für die spezielle Morphologie kokkoider Persisterformen von H.

pylori verantwortlich sein. Klinisch erkrankte Patienten weisen gegenüber Gesunden erhöhte HcpA-Antikörpertiter auf, was für die Beteiligung von HcpA an der Pathogenese der Helicobacter-induzierten Magenschleimhautentzündung spricht. Als potenter Induktor der Immunantwort unterstützt HcpA über eine ineffektive Typ-1-Immunantwort der T4- Helferzellen aber auch die Virulenz von H. pylori. Aufgrund der strukturellen Verwandtschaft liegt für das H. hepaticus-spezifische HhcpA eine homologe Funktion äußerst nahe, der direkte Beweis steht aber auch hier derzeit noch aus; ein erster großer Schritt wurde mit Deletion des kodierenden Gens und Purifikation von HhcpA bereits absolviert.

Auch wenn H. hepaticus erstmals aus Lebergewebe isoliert werden konnte, findet es seine primäre Nische in den Krypten des Coecums und des Kolons. Um die Anhaftung an die Zotten und somit die Persistenz im Darm seines Wirtes zu gewährleisten, liegt die Existenz spezieller Adhäsine nahe. Während H. hepaticus die meisten der von H. pylori bekannten Virulenzfaktoren, einschließlich bekannter Adhäsine, missen lässt, weist sein Genom ein Homolog zum C. jejuni-Adhäsin Peb1 auf. Peb1, identisch mit dem bereits früher identifizierten so genannten cell binding factor (CBF1), ist eines von derzeit drei bekannten

Proteinen, denen eine Beteiligung an der Adhäsion von C. jejuni an intestinalen Epithelzellen sicher nachgewiesen werden konnte. Ein Fehlen von Peb1 resultiert nicht nur in einer deutlich reduzierten Adhäsions-, sondern auch in einer reduzierten Invasionfähigkeit des Pathogens.

Trotz analoger Vorgehensweise und unzähliger Versuche gelang es nicht, eine peb1- defiziente Mutante von H. hepaticus anzuzüchten. Schließt man unerwünschte Mutationen aus, dann ebnet dieser Fehlschlag den Weg für neue Spekulationen über eine möglicherweise essentielle Rolle des Peb1-Homologs für Stoffwechsel und Wachstum von H. hepaticus, die über die bislang postulierten Funktionen hinausgehen.

Aus humanmedizinischer Sicht besonders interessant, ist der Vergleich von Pathophysiologie bzw. Pathogenese einer H. hepaticus-Infektion der Maus und den chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen des Menschen. Dabei offenbaren sich teilweise erstaunliche Parallelen.

Sowohl beim Morbus Crohn und der Colitis ulcerosa, als auch bei der H. hepaticus-Kolitis findet sich eine T_H1-gewichtete Immunantwort mit Ähnlichkeiten in der induzierten Zytokinkaskade. Histologisch kommt es zu chronisch-entzündlichen Veränderungen in der Darmschleimhaut, bösartige Entartungen können die Folge sein. Mittlerweile konnten hierfür zahlreiche Mausmodelle etabliert werden. Dazu zählt unter anderem auch die H. hepaticus- induzierte Typhlokolitis. Durch Klonierung und Expression der o.g. Virulenzfaktoren von H.

hepaticus konnte ein erster erfolreicher Schritt zur näheren Charakterisierung dieser drei putativen Virulenzgene gemacht werden, der zukünftig weitere in-vivo und in-vitro Experimente erlauben wird.

2 Einleitung

2.1 Helicobacter pylori als Prototyp der Gattung Helicobacter

Im Jahre 1982 konnten Marshall und Warren erstmals ein bis dato unbekanntes gramnegatives Bakterium aus mehreren menschlichen Schleimhautbiopsien des Magenantrums isolieren (Marshall und Warren, 1984). Anfangs noch dem Genus Campylobacter zugeordnet, konnte im Jahr 1987 mittels 16S-rRNA Sequenzanalyse seine Eigenständigkeit gezeigt werden (Romaniuk et al., 1987). Schließlich erfolgte die Umbenennung in Helicobacter pylori (Goodwin et al., 1989). Mit etwa 1,6 Mio. Basenpaaren ist sein Genom vergleichsweise klein. Bemerkenswert ist die hohe genetische Variabilität innerhalb der Spezies H. pylori. Sie kommt durch eine hochfrequente DNA-Rekombination innerhalb der eigenen Spezies zustande, welche im Rahmen einer Co-Kolonisation mit unterschiedlichen Stämmen auftritt (Suerbaum et al., 1998). Die Übertragung erfolgt oral-oral bzw. fäkal-oral, wichtigster Wirt ist der Mensch. Mit einer Prävalenz von nahezu 50% der Weltbevölkerung ist H. pylori auch aus humanmedizinischer Sicht von großer Bedeutung.

Bei ca. 10-20% der Infizierten enwickeln sich schwere Folgeerkrankungen (Suerbaum und Michetti, 2002). Aus einer aktiven Antrumgastritis (Gastritis Typ B) kann sich eine chronisch atrophische Gastritis entwickeln. Diese stellt eine Präkanzerose für das Adenokarzinom des Magens dar (Nomura et al., 1991; Fox et al., 1998 B). Insbesondere bei Patienten mit einem Ulcus duodeni (in nahezu 100% der Fälle), aber auch mit Ulcus ventriculi, lässt sich H. pylori in der überwiegenden Zahl der Fälle nachweisen (Suerbaum und Michetti, 2002).

Darüberhinaus ist unter chronischer H. pylori-Infektion ein deutlich erhöhtes Auftreten von gastrischen MALT-Lymphomen zu beobachten (Parsonnet et al., 1994; Zucca et al., 1998).

In manchen Fällen kann allein durch Eradikationstherapie eine Remission erzielt werden (Wotherspoon et al., 1993; Bayerdorffer et al., 1995).

Zahlreiche Virulenzfaktoren ermöglichen H. pylori die Adaptation an seinen Wirt und dessen körpereigene Immunabwehr (Salama et al., 2013). Mit Hilfe seiner extrem hohen Ureaseaktivität spaltet H. pylori Harnstoff in alkalischen Ammoniak und CO₂ (Burne und Chen, 2000). Dieses zink-abhängige Metalloenzym besteht aus zwei Untereinheiten, UreA und UreB. Es gewährleistet einen konstant neutralen periplasmatischen pH-Wert trotz saurem Umgebungsmilieu. Auf diese Weise wird das Membranpotential aufrechterhalten, was zumindest kurzfristig das Überleben im sauren Lumen erlaubt (Meyer Rosberg et al., 1996;

Stingl et al., 2002). Urease-negative Mutanten sind nicht in der Lage die menschliche Magenschleimhaut zu kolonisieren (Andrutis et al., 1995; Kavermann et al., 2003).

Ebenso wie die Urease ist die Beweglichkeit von H. pylori Grundvoraussetzung für eine Kolonisation der Magenschleimhaut (Andrutis et al., 1997; Eaton et al., 1997). Die einzelnen Filamente der vier bis acht unipolar angeordneten Geißeln, bestehen aus zwei verschiedenen Untereinheiten – den Flagellinen FlaA und FlaB (Kostrzynska et al., 1991;

Suerbaum et al., 1993). Die Expression beider Gene ist hierbei für eine vollständige Motilität notwendig (Josenhans et al., 1995). Erst dadurch kann das Bakterium seine natürliche Nische, die Grenzschicht zwischen Mucus und Mucosa, erreichen.

Um dort auch jahrelang persistieren zu können, heftet sich H. pylori mittels diverser Adhäsine an Oberflächenrezeptoren der Wirtszelle. Bislang konnten zwei unterschiedliche Typen dieser Bindungsproteine identifiziert werden: BabA2/ SabA (Ilver et al. 1998; Mahdavi et al., 2002), welche an das Lewis-b-Blutgruppen-Antigen bzw. an sialyl-Lewis x binden, und AlpA/

AlpB, deren Wirtsrezeptor noch nicht bekannt ist (Odenbreit et al., 1999). Beide Typen sind in der äußeren Membran des Bakteriums lokalisiert, weshalb sie zur großen Familie der Helicobacter outer membrane proteins (Hop) zählen.

Etwa die Hälfte der H. pylori Stämme exprimieren ein 95 kDa schweres, vakuolisierendes Zytotoxin VacA (vacuolating cytotoxin A). Es induziert die Bildung von Vakuolen durch intrazellulären Wassereinstrom (Papini et al., 1996). Zudem konnte eine Apoptoseinduktion durch VacA beobachtet werden (Kuck et al., 2001)

Zudem besitzen die meisten Stämme die cagA- (cytotoxic-associated gene A) Pathogenitätsinsel. Die Pathogenitätsinsel ist 40 Kilobasen groß und beinhaltet 29 Gene (Censini et al., 1996). Sie kodiert für ein Typ-IV-Sekretionssystem, welches das 120 kDa Protein CagA in die Epithelzelle des Magens einschleust. Hier kommt es zur Phosphorylierung von CagA (CagAP-tyr), was zur Dephosphorylierung verschiedener Wirtszellproteine und zu einer Umstrukturierung des Zytoskeletts führt (Odenbreit et al., 2000; Backert et al., 2001). Die Infektion mit einem CagA-positiven Stamm führt meist zu einer stärkeren Entzündungsreaktion und das Risiko für eine symptomatische Erkrankung ist erhöht (Blaser und Crabtree, 1996).

2.2 Andere gastrische Helicobacteraceae

Inzwischen umfasst die Familie der Helicobacteraceae mehr als 25 validierte Spezies, mehr als die Hälfte besiedeln primär den Magen. Von diesen ist lediglich noch Helicobacter heilmannii von erwähnenswerter humanpathologischer Bedeutung. 1987 wurde dieses

Bakterium erstmals bioptisch nachgewiesen. Morphologisch erscheint es größer, regelmäßiger gewunden und ist eher in Gruppen gelagert, so dass eine gute Abgrenzung gegenüber Helicobacter pylori möglich ist (Dent et al., 1987).

Primär scheint es sich bei einer Helicobacter heilmannii-Infektion um eine Zoonose zu handeln, die auch auf den Menschen übertragbar ist. Natürliche Wirte sind wahrscheinlich Hunde (Eaton et al., 1996), Katzen (Norris et al., 1999), Schweine (Queiroz et al., 1996) und eventuell noch weitere Säuger. Die hervorgerufene Antrumgastritis verläuft milder und zeigt eine geringere Prävalenz als eine Helicobacter pylori-Infektion (Hilzenrat et al., 1995;

Akin et al., 1995; Stolte et al., 1997). Sämtliche andere Komplikationen wie Ulzera (Debongnie et al., 1998), Magenkarzinom (Yang et al., 1995) oder das MALT-Lymphom (Regimbeau et al., 1998) treten äußerst selten auf, sollen aber prinzipiell vorkommen. Sollte eine Therapie notwendig sein, orientiert diese sich an den Richtlinien der Helicobacter pylori Therapie. Auch andere Spezies der gastrischen Helicobacteraceae wie z. B. Helicobacter mustelae, Helicobacter felis, Helicobacter bizzozeroni oder Helicobacter acinonychis rufen Gastritiden und peptische Ulzera unterschiedlicher Schweregrade sowie wahrscheinlich Malignome bei ihrem jeweiligen tierischen Wirt hervor (Solnick und Schauer, 2001). Die von ihnen besiedelte ökologische Nische entspricht in etwa der von Helicobacter pylori.

2.3 Die enterohepatischen Helicobacter

Im Herbst 1992 beobachteten Ward et al. eine erhöhte Inzidenz von hepatozellulären Karzinomen bei einer Kontrollgruppe von Inzucht-Mäusen. Neben Lebertumoren litten alle Versuchstiere unter einer chronisch-aktiven Hepatitis, die bemerkenswerterweise bei den männlichen Tieren stärker ausgeprägt war. Nachdem gezeigt werden konnte, dass die vermutete Infektion durch Inokulation einer Leberprobe auf gesunde Mäuse übertragbar und eine toxische Genese bereits ausgeschlossen war, wurde die Suche nach einem infektiösen Agens intensiviert. Schließlich konnte Helicobacter hepaticus mittels spezieller Färbetechnik sowohl in den Gallengängen als auch in der Gallenblase, nicht aber in den Hepatozyten selber, elektronenmikroskopisch dargestellt werden (Ward et al., 1994 A). Fox et al. gelang es dieses bis dahin unbekannte Bakterium aus Leber- und Schleimhautabstrichen des Coecums bzw. des Kolons von Mäusen mit chronisch-aktiver Hepatitis zu isolieren (Fox et al., 1994). Mittels 16S-rRNA Sequenzanalyse wurde gezeigt, dass Helicobacter hepaticus eine eigenständige Spezies innerhalb der Familie der Helicobacteraceae darstellt (Battles et al., 1995). Mit der Entdeckung von Helicobacter hepaticus wurde neben den gastrischen Helicobacter-Arten eine zweite Gruppe innerhalb des Genus Helicobacter etabliert: die

enterohepatischen Helicobacter. Mittlerweile wurde das Genom von fünf weiteren enterohepatischen Helicobacter-Spezies vollständig sequenziert - Helicobacter bilis, Helicobacter canadensis, Helicobacter cinaedi, Helicobacter pullorum und Helicobacter winghamensis (Fox et al., 2011). Auch hier führt eine murine Infektion zu chronischen Darmentzündungen mit ähnlicher Pathologie (Fox et al., 2002); Dysplasien bis hin zu intramukosalen Karzinomen können auftreten (Shen et al., 2009).

Während diese fünf Artverwandten allerdings auch aus Menschen mit gastrointestinalen Erkrankungen isoliert wurden, gibt es bislang keinen konkreten Anhalt für eine humanpathologische Bedeutung von H. hepaticus.

2.4 Helicobacter hepaticus

2.4.1 Morphologie und Taxonomie

Helicobacter hepaticus präsentiert sich morphologisch als ein spiraliger, bipolar-begeißelter Organismus mit einer Länge von 1,5 bis 5 μm und einem Durchmesser von ca. 0,3 μm; er gilt als Prototyp der enterohepatischen Helicobacter-Arten.

Abbildung 1: Transmissionsmikroskopische Darstellung von Helicobacter hepaticus (aus Josenhans et al., 2004).

Das gramnegative Bakterium zeigt sowohl Urease- als auch Katalase- und Oxidaseaktivität (Solnick und Schauer, 2001). Suerbaum et al. publizierten 2003 die Genomsequenz des H.

0,5 µm

hepaticus Stamms ATCC51449. H. hepaticus besitzt ein ringförmiges Chromosom, welches 1799146 Basenpaare umfasst. Das entspricht in etwa der Genomgröße von H. pylori und Campylobacter jejuni. Das Genom kodiert für 1875 vorhergesagte Proteine. 938 bzw. 953 davon sind ortholog zu bereits bekannten Proteinen von H. pylori bzw. C. jejuni. Für 821 Proteine existieren gemeinsame Orthologe in beiden pathogenen Spezies (Suerbaum et al., 2003).

Die natürliche Transmission erfolgt wahrscheinlich auf fäkal-oralem Weg, seine ökologische Nische findet der Erreger natürlicherweise in den Krypten des Coecums und des Kolons.

Allerdings ist der Mechanismus durch den er die Leber kolonisiert unbekannt. Hier persistiert er extrazellulär in den Gallengängen; ein Befall der Hepatozyten selber kommt also nicht vor.

Bislang konnten lediglich Mäuse von unterschiedlichem Immunstatus als Wirt nachgewiesen werden. Während eine Infektion bei immunkompetenten Mäusen zu keinerlei klinischen Zeichen führt, sind bei immundefizienten Mäusen diverse Krankheitsbilder bekannt. Dazu zählen, neben der chronisch-aktiven Hepatitis und dem hepatozellulären Karzinom wie im Präzedenzfall, auch entzündliche Darmerkrankungen.

2.4.2 Kultivierung, Diagnostik und Therapie

Nach einer Inkubationszeit von etwa drei bis sechs Tagen unter mikroaerophilen Bedingungen wächst Helicobacter hepaticus als gräulich-gelblicher Film auf Selektivnährmedien. In der Regel werden dazu serum- oder bluthaltige Agarplatten verwandt, denen meist zur Wachstumsunterdrückung anderer Bakterien oder Pilze die Antibiotika Trimethoprim, Vancomycin, Polymyxin B und Amphotericin B zugegeben werden. Ein Überangebot an Sauerstoff kann das Wachstum von H. hepaticus inhibieren. Diese Beobachtung korreliert mit der Annahme, dass die Fermentation der Dicarbonsäuren im Zitratzyklus, wie bei vielen anderen Anaerobiern auch, unter reduzierenden Bedingungen abläuft. Auf der anderen Seite soll Aktivkohle aufgrund seiner Eigenschaft als Radikalfänger einen positiven Wachstumseffekt haben (Taneera et al., 2002).

Die optimale Inkubationstemperatur liegt bei ca. 37°C, eine Kultivierung bei 42°C oder 25°C ist hingegen nicht möglich (Solnick und Schauer, 2001). Als sensitivere und weniger aufwändige Nachweismethode als die Kultivierung hat sich die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) erwiesen. Mehrere Methoden sind mittlerweile beschrieben, darunter sowohl konventionelle PCR- als auch Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus-PCR (RFLP- PCR)-Methoden zur Amplifikation von 16S rRNA-Genfragmenten (Shames et al., 1995;

Antikörpertiters so genannte enzyme-linked immuno sorbent assays (ELISA) zum Einsatz, die allerdings zum Screening ungeeignet sind (Fox et al., 1996 A).

Eine Eradikation von H. hepaticus ist prinzipiell möglich. Mehrere Schemata zur antibiotischen Therapie, beispielsweise mittels Amoxicillin, sind bis zum jetzigen Zeitpunkt beschrieben (Russell et al., 1995; Foltz et al., 1996), allerdings treten auch Behandlungsmisserfolge auf.

2.4.3 Pathologie und Klinik an Leber und Gallengangssystem

1992 wurden am US National Cancer Institute bei bestimmten Mausstämmen (A/JCr, C3H/An, SJL/NCr, Balb/c, An/NCr, SCID/NCr) gehäuft Leberläsionen festgestellt. Im Folgenden konnte die Erkrankung durch Inokulation einer Lebersuspension aus einer erkrankten, vier Wochen alten A/JCr-Maus auf gesunde Tiere übertragen werden. Mittels Silberfärbung konnte ein Bakterium in den Gallengängen und zwischen den Krypten des Coecums und Kolons identifiziert und in vitro kultiviert werden. Nachdem die Inokulation dieses in vitro angezüchteten Bakteriums in gesunde A/JCr-Mäuse zu den gleichen Leberläsionen führte, stand Helicobacter hepaticus gemäß der Koch’schen Postulate als auslösendes Agens dieses Krankheitsbilds endgültig fest (Fox et al., 1994, Ward et al., 1994 B). Mittlerweile wurde die Entstehung einer nicht-eitrigen, später chronischen Hepatitis auf dem Boden einer Infektion mit H. hepaticus mehrfach bestätigt (Ward et al., 1996 B), wobei hierbei der klinische Ausprägungsgrad der Leber- und Gallengangsschädigung entscheidend von Geschlecht, Infektionsdauer und Abwehrlage des Wirts beeinflusst werden.

Histologisch zeigen sich anfangs entzündliche, insbesondere von den Periportalfeldern ausgehende Infiltrate, die sich dann auf das umliegende Leberparenchym und seine Venulen ausdehnen. Eine Gallengangshyperplasie, intranukleäre Pseudoeinschlüsse bis hin zu Einzelzellnekrosen sind beschriebene Folgen (Fox et al., 1996 B).

Sämtliche Schädigungen zeigen eine kontinuierliche Progredienz, wobei männliche Tiere nicht nur früher, sondern auch schwerer ausgeprägte Läsionen der Leber aufweisen. Der Grund für dieses Phänomen ist jedoch bislang unbekannt. Im Alter von 12 bis 18 Monaten sind bei den meisten männlichen Mäusen adenomatöse knotige Veränderungen der Leber festzustellen, histologisch findet sich das Bild einer Zirrhose mit Cholangitis (Ward et al., 1994 B; Fox et al., 1996 B). Nach natürlicher, oraler Infektion kommt es schließlich auf dem Boden einer chronisch-aktiven Hepatitis zur Entwicklung hepatozellulärer Neoplasien, was auch bei weiblichen Mäusen, wenn auch in geringerem Ausmaß, beobachtet werden kann (Fox et al., 1996 C).

Im Folgenden konnte gezeigt werden, dass eine Infektion mit H. hepaticus bei einer Reihe weiterer Mausstämme (AXB, B6C3F1 und C57BL) über Leberentzündung und –proliferation schließlich zur Entstehung von Lebertumoren führt (Ihrig et al., 1999; Garcia et al., 2008;

Fox et al., 2010).

Die genauen Mechanismen einer H. hepaticus-assoziierten Tumorinduktion sind weitgehend unverstanden. Bislang konnte weder eine Mutation im p53-Tumorsuppressorgen noch eine Aktivierung des ras-Onkogens, wie sie typischerweise bei chemisch induzierten Lebertumoren auftritt, nachgewiesen werden (Sipowicz et al., 1997 A). Möglicherweise könnte jedoch neben der erhöhten Apoptose- und Proliferationsrate oxidativer Stress zur Tumorentstehung beitragen. So zeigten Sipowicz et al., dass infizierte A/JCr-Mäuse eine erhöhte oxidative DNA-Schädigung und eine kompensatorische Überexpression bestimmter Isoenzyme des Zytochrom-P450-Systems aufweisen (Sipowicz et al., 1997 B). Außerdem gibt es einige Hinweise auf eine mögliche genetische Prädisposition mit dominantem Erbgang. Kreuzt man C57BL/6-Mäuse, die resistent für die Entwicklung einer H. hepaticus- assoziierten Hepatitis bzw. eines Tumors sind, mit dem anfälligen Mausstamm C3H, so ist eine Infektion der Nachkommen mit einer erhöhten Tumorinzidenz verbunden (Fox et al., 1998 B; Hailey et al., 1998). Auch Studien mit anderen rekombinanten Stämmen, z.B. mit AXB-Mäusen, legen eine genetische Komponente nahe (Ihrig et al., 1999).

Neuere Forschungsergebnisse offenbarten darüber hinaus, dass C57L/J-Mäuse, welche mit H.

hepaticus und Helicobacter bilis infiziert sind, unter lithogener Diät gehäuft unter Cholezystolithiasis leiden (Maurer et al., 2005). Eine Besiedlung mit Helicobacter pylori zieht hingegen keine erhöhte Prävalenz für Gallensteinleiden nach sich, so dass diese zusätzliche Lithogenität spezifisch für enterohepatische Helicobacter zu sein scheint (Maurer et al., 2006).

2.4.4 Pathologie und Klinik im Intestinaltrakt

Zwar führte initial die Beobachtung von vermehrt auftretenden Lebererkrankungen zur Identifikation von Helicobacter hepaticus, allerdings wurde rasch klar, dass es sich bei Leber und Gallengangssystem eigentlich um das sekundäre Habitat dieser enterohepatischen Helicobacter-Spezies handelt.

Noch bevor H. hepaticus die Leber kolonisiert, ist es bereits auf dem Oberflächenepithel bzw. in den Krypten des Darms nachzuweisen. Während bei maximal 60% der infizierten A/JCr-Mausmännchen eine Kultivierung von H. hepaticus aus einer Leberprobe gelang und

und Kolon nahezu aller A/JCr-Mäuse H. hepaticus isoliert werden (Fox et al., 1996 B). Die Anzucht von H. hepaticus aus Coecum- bzw. Kolonproben ist, verglichen mit einer Kultivierung aus Lebergewebe, also sensitiver für den Nachweis einer H. hepaticus-Infektion.

Auf der anderen Seite sind jedoch die intestinalen Symptome bei immunkompetenten Mäusen relativ gering. So verursacht eine Besiedlung mit H. hepaticus bei A/JCr-Mäusen erst relativ spät eine milde Entzündungsreaktion der Darmschleimhaut sowie epitheliale Hyperplasien, welche insbesondere das Coecum betreffen (Whary et al., 1998). Bei infizierten Swiss Webster Mäusen fand sich histologisch nach frühestens acht Monaten lediglich eine leichte Kolitis mit lymphoider Reaktion der Mucosa. Desweiteren fanden sich vermehrt Payer’sche Plaques (Fox et al., 1996 C); insgesamt waren die beobachteten Veränderungen bei immunkompetenten Mäusen jedoch kaum stärker als bei nicht infizierten Kontrolltieren.

Im Gegensatz dazu löst H. hepaticus bei diversen immundefizienten Mausstämmen, wie SCID- und RAG2-defizienten Mäusen, eine teils schwere Typhlitis/Kolitis aus (Ward et al., 1996 A; Cahill et al., 1997; Li et al., 1998; von Freeden-Jeffry et al., 1998; Erdmann et al., 2003 A; Maloy et al., 2003; Tomczak et al., 2003). Insbesondere ältere Tiere wiesen mittelschwere bis schwere Hyperplasien im Coecum sowie eine Mucosaverdickung auf.

Gehäuft kann ein Rektumprolaps beobachtet werden (Ward et al., 1996 A).

Die Typhlokolitis geht mit einer Einwanderung von Lymphozyten, Neutrophilen und Makrophagen in die Lamina Propria einher. Dabei handelt es sich um eine Th1-basierte Immunantwort, in deren Rahmen es zur vermehrten Sekretion von INF-γ, TNF-α und Stickstoffmonoxid (NO) kommt.

Eine mittelschwere Entzündung des Coecums sowie eine leichte Kolitis fanden sich auch bei H. hepaticus-infizierten IL-10 defizienten C57BL/6-Mäusen (Kullberg et al., 1998; Burich et al., 2001). Andererseits konnte in einer weiteren Studie mit ansonsten völlig sterilen Il-10- defizienten Mäusen H. hepaticus alleine keine chronische Darmentzündung induzieren. Diese Beobachtung spricht für die Notwendigkeit einer Co-Kolonisation mit anderen Darmkeimen, um durch H. hepaticus eine Infektion hervorzurufen (Dieleman et al., 2000). Bei RAG- defizienten Mäusen hingegen führt eine Infektion mit H. hepaticus neben einer Typhlokolitis sogar zur Ausbildung kolitis-assoziierter Kolonkarzinome (Erdmann et al., 2003 C).

Von entscheidender Bedeutung für die Entwicklung einer H. hepaticus-induzierten Kolitis, aber auch die Karzinogenese, ist also folglich die durch verschiedene T-Helferzellen vermittelte angeborene Immunabwehr. Die damit verbundenen immunregulatorischen Vorgänge, die beteiligten Zytokine und deren spezifische Funktionen sind äußerst komplex.

Sie stehen im Mittelpunkt diverser Studien.

Während IL-10 defiziente Mäuse also besonders anfällig für chronische Darmentzündungen sind, kommt es hingegen bei infizierten Wildtyp-Mäusen zur Ausschüttung von IL-10; diese Tiere blieben klinisch gesund. Ein Transfer von rekombinantem IL-10 kann einer Kolitis bei bei H. hepaticus-infizierten, RAG-2-defizienten Mäusen vorbeugen (von Freeden-Jeffry et al., 1998). Die IL-10-Ausschüttung nicht-immunkompromittierter Mäuse scheint also einen antiinflammatorischen und somit protektiven Effekt zu haben.

Auf der anderen Seite forcieren diverse andere Zytokine die intestinale Entzündungsreaktion, so auch insbesondere IL-12. Die Neutralisation von IL-12 führt bei IL-10-defizienten C57BL/6-Mäusen zu einer deutlich verminderten Entzündungsreaktion des Intestinums. Die Zahl Helicobacter-reaktiver T4-Helferzellen vom Typ I in den mesenterialen Lymphknoten war dabei signifikant niedriger, was auch mit einer verringerten Ausschüttung der proinflammatorischen Zytokine einherging (Kullberg et al., 2001). Eine Beteiligung von IL- 23 und TNF wird ebenfalls postuliert, da durch entsprechende Antikörper gegen diese Zytokine eine H. hepaticus-Kolitis bei RAG2-defizienten Mäsusen inhibiert werden konnte (Hue et al., 2006; Maloy et al., 2003).

Weitere Veröffentlichungen sprechen auch IL-23, als Teil der durch IL-12 ausgelösten Zytokinkaskade, eine wichtige Rolle bei der Ausbildung der durch H. hepaticus ausgelösten TH1- bzw. TH17-vermittelten Kolitis zu. Im Gegensatz zum unbehandelten Wildtyp entwickelte lediglich der mit Anti-IL-10-Rezeptor-Antikörpern versehene Wildtyp C57BL eine Kolitis. Dabei kommt es auch zu einer vermehrten Ausschüttung von IL-17 und IFN-γ (Kullberg et al., 2006). Auch im Kolon RAG2-defizienter Mäuse führt eine H. hepaticus- Infektion zu deutlich erhöhten Konzentrationen der T-Helferzellen-assozierten Zytokine IL- 17 und IFN-γ (Hue et al., 2006). Die Behandlung von H. hepaticus-infizierten RAG2- defizienten Mäusen mit Antikörpern gegen IL-17 oder IFN-γ verstärkt die induzierte Kolitis.

Nach Stimulation mit IL-23 kommt es zu einem signifikanten Anstieg von IL-17- bzw. IL-17- und IFN-γ-positiven Lamina propria-Zellen im Kolon. Eine spezifische Subpopulation dieser Zellen scheint selbst IL-17, IFN-γ und IL-22 zu produzieren, was sich ebenfalls durch IL-23 verstärken lässt. IL-23 ist also für diese TH17-gestützte chronische Entzündung von entscheidender Bedeutung (Buonocore et al., 2010).

Zwar sprechen diese Ergebnisse für eine proinflammatorische Rolle von IL-17 und IFN-γ bei der H. hepaticus-induzierten Kolitis, dennoch scheinen deren komplexe Funktionen nicht vollständig verstanden bzw. teils auch widersprüchlich zu sein. Während erste Experimente IFN-γ für eine durch H. hepaticus induzierte Kolitis notwendig erschienen ließen (Kullberg et al., 1998), konnte später gezeigt werden, dass die Ausprägung der Kolitis bei einer IL-

10/IFN-γ–Doppelknockoutmutante und einer IL-10-Einzelknockoutmutante sich nicht wesentlich unterschieden (Kullberg et al., 2001). Für IL-17 wurde bei mit CD4-positiven CD45RB^high T-Zellen-versehenen Lymphozyten-defizienten Mausstämmen neben der Induktion einer intestinalen Entzündung (Leppkes et al., 2009) sogar eine protektive Funktion postuliert (O’Connor et al., 2009). Ähnlich scheinbar widersprüchliche Ergebnisse finden sich z. B. auch für das ebenfalls von TH17-Zellen produzierte IL-22 (Sugimoto et al., 2008; Zenewicz et al., 2008)

Neben den beteiligten Zytokinen sind zuletzt auch die entsprechenden Rezeptoren in den Focus diverser Studien gerückt. So konnte für einzelne Untereinheiten des nuclear factor (NF)-κB sowohl ein pro- als auch ein antiinflammatorischer Effekt nach H. hepaticus- Infektion nachgewiesen werden. RAG2-defiziente Mäuse, denen darüberhinaus die NF-κB- Untereinheit c-Rel fehlte, zeigten keine H. hepaticus-induzierte intestinale Entzündung (Wang et al., 2008). Das Fehlen der p50/p105-Untereinheit von NF-κB hingegen führte bei 129SvEv-Mäusen zu einer verstärkten Entzündungsreaktion, der antiinflammatorische Effekt von IL-10 wird dadurch inhibiert (Tomczak et al., 2003 und 2006). Auch Toll-like- Rezeptoren (TLRs) scheinen bei der durch H. hepaticus induzierten Entzündungsreaktion in vivo eine gewichtige Rolle zu spielen. So konnte beispielsweise gezeigt werden, dass H.

hepaticus die angeborene Immunantwort durch Aktivierung von NF-κB über TLR2 stimuliert (Mandell et al., 2004). Andererseits hat das Fehlen von TLR2 bei RAG2-defizienten Mäusen keinen Einfluß auf das Ausmaß der H. hepaticus-induzierten Kolitis, so dass auch eine TLR2- unabhängige Induktion der intestinalen Entzündung postuliert werden muss (Boulard et al., 2009).

Darüberhinaus könnten auch intrazellulären Rezeptoren aus der Nod-Familie bei der durch H.

hepaticus-induzierten Inflammation von Bedeutung sein. Diese Rezeptoren spielen eine entscheidene Rolle bei der Erkennung von Substraten, die über bakterielle Sekretionssysteme in die epitheliale Wirtszelle injiziert werden. Erst kürzlich konnte ein derartiges Typ-VI- Sekretionssystem (T6SS) im Genom von H. hepaticus identifiziert werden. H. hepaticus- Knockoutmutanten, denen dieses T6SS fehlt, führten bei mit CD4⁺CD45RB^hi-T-Zellen versehene RAG2-defizienten Mäusen zu vermehrter Kolonisation und Expression proinflammatorischer Gene. Diese Tatsache legt eine antiinflammatorische Wirkung des durch dieses T6SS eingeschleusten Substrats beim Wildtyp nahe (Chow und Mazmanian, 2010).

Bei Helicobacter muridarum, einer verwandten, enterohepatischen Helicobacter-Spezies, scheint die Aktivierung von NF-κB Nod1-vermittelt zu erfolgen. Dies konnte für H. hepaticus

allerdings bislang nicht beschrieben werden, die Induktion von NF-κB war hier nur marginal (Chaouche-Drider et al., 2009). Vielmehr konnte sogar gezeigt werden, dass H. hepaticus bzw. seine Lipopolysaccharide die TLR4-induzierte Expression inflammatorischer Gene bei murinen Epithelzellen inhibieren (Sterzenbach et al., 2007). Diese Beobachtungen sprechen eher gegen eine Nutzung des Nod1-Rezeptors durch H. hepaticus. Allerdings könnten Nod2- Rezeptoren zur Erkennung von H. hepaticus beitragen. So zeigten Nod2-defiziente Mäuse nach Infektion gegenüber dem infizierten Wildtyp ein erhöhte Kolonisation mit H. hepaticus (Petnicki-Ocwieja et al., 2009).

Schon früh wurde erkannt, dass auf dem Boden der H. hepaticus-induzierten Kolitis schließlich ein Kolonkarzinom mit Einbruch ins Peritoneum entstehen kann (Cahill et al., 1997; Erdmann et al., 2003 A und B). Da RAG2-defiziente Mäuse, denen Lymphozyten fehlen, nach H. hepaticus-Infektion kolorektale Karzinome aufwiesen, scheint auch hierfür in besonderem Maße die angeborene Immunabwehr von entscheidener Bedeutung zu sein.

Durch Transfer CD4⁺CD25⁺-positiver T-Zellen konnte nicht nur die Entstehung einer Kolitis, sonder auch die eines kolorektalen Karzinoms unterbunden werden (Erdmann et al., 2003 B). Auch bei infizierten immunkompetenten Wildtyp-Mäusen beugen IL-10-abhängige Mechanismen einem Karzinom des Dickdarms vor. Ein Ungleichgewicht zwischen IL-6, IL- 10 und TNF-β begünstigt hingegen die neoplastische Epithelinvasion. Bei RAG2-defizienten Mäusen war das neoplastische Wachstum durch Unterdrückung der Entzündugsreaktion mittels Anti-IL-6- bzw. Anti-TNF-α-Antikörper reversibel (Poutahidis et al., 2007;

Erdmann et al., 2009). Desweiteren konnte gezeigt werden, dass H. hepaticus bei Mäusen mit einer Mutation im Apc-Gen zur Entstehung adenomatöser Darmpolypen, welche als Präkanzerose anzusehen sind, führt (Rao et al., 2006 A). Dieses Wachstum lässt sich durch Transfer IL-10-abhängiger regulatorischer T-Zellen unterbinden, was auf deren Fähigkeit zur IL-10-Produktion beruht (Erdmann et al., 2005, Rao et al., 2006 B). Neuere Studien sprechen auch IL-17 und IL-23 eine Schlüsselrolle bei der Kanzerogenese zu (Wu et al., 2009; Erdmann et al., 2010). Es finden sich außerdem Hinweise, dass H. hepaticus auch an der Enstehung extraintestinaler Neoplasien beteiligt sein könnte. So konnte beispielweise gezeigt werden, dass eine H. hepaticus-Infektion bei Mäusen mit Mutation im Apc-Gen zu Mamma-Tumoren führt (Rao et al., 2006 A und B)

Zusammenfassend sprechen diese Ergebnisse dafür, dass die angeborene, T-Helferzell- gestützte Immunantwort entscheidend an der Induktion einer Kolitis bzw. Kanzerogenese bei verschiedenen immundefizienten Mausstämmen beteiligt ist. Bei Wildtyp-Mäusen hingegen ist zwar nach H. hepaticus-Infektion eine dauerhafte Kolonisation zu beobachten, zu einer

Kolitis führt dies in der Regel jedoch nicht. Demzufolge kann eine intakte angeborene Immunabwehr eine durch H. hepaticus-induzierte Entzündungsreaktion bzw.

paraneoplastisches Wachstum verhindern.

Diese These wird durch weitere Studien gestützt. Während eine H. hepaticus-Infektion bei SCID-Mäusen, welche zuvor mit naiven CD4⁺CD45RB^high-T-Zellen versehen wurden, zu einer deutlichen Krankheitsmanifestation führte (Cahill et al., 1997), scheinen CD4⁺CD45RB^low-T-Zellen hingegen einen protektiven Effekt zu haben. So konnten diese in ihrer Funktion als regulatorische Zellen im Zusammenspiel mit IL-10 einer Inflammation vorbeugen (Asseman et al., 1999). Ähnliches beobachteten auch Kullberg et al., als sie durch Zugabe von CD4⁺CD45RB^low T-Zellen zu H. hepaticus-infizierten RAG2-defizienten Mäusen, welche zuvor mit T₄-Helferzellen versehen worden waren, die Entzündungsreaktion supprimieren konnten. Die Rekonstitution mit T₄-Helferzellen von Interleukin-10-Knockout- Mäusen hatte bei den RAG2-defizienten Mäusen, welche selbst keine T-Zellen mehr ausbilden können, nach Infektion mit H. hepaticus zu einer starken Entzündung des Darms geführt (Kullberg et al., 2002; Kullberg et al., 2003) . Diese Beobachtung entspricht der von Cahill et al. bei rekonstitutionierten SCID-Mäusen. Da der schützende Effekt nur nach Transfer CD4⁺CD45RB^low-T-Zellen von infizierten Wildtyp-Mäusen, nicht jedoch von uninfizierten Wildtyp-Mäusen auftritt, scheint diese Subpopulation von T-Zellen eine Gedächtnisfunktion inne zu haben, welche eine Entzündungsreaktion auf H. hepaticus hemmen kann (Kullberg et al., 2002). Ähnliches konnte nach Transfer von regulatorischen CD4⁺CD25⁺-positiven T-Zellen in RAG2-defiziente Mäuse beobachtet werden; die Induktion einer Kolitis durch H. hepaticus konnte so ebenfalls verhindert werden (Erdmann et al., 2003 B; Maloy et al., 2003). Werden H. hepaticus-infizierte RAG2-defiziente Mäuse mit bereits manifester Kolitis mit CD4⁺CD25⁺-positiven T-Zellen versehen, kommt es sogar zu raschem Abklingen der Erkrankung. Durch vorherige Infektion der Donor-Maustämme mit H.

hepaticus lassen sich auch hier sowohl protektiver als auch kurativer Effekt der transferierten CD4⁺CD25⁺-positiven T-Zellen noch verstärken (Kullberg et al., 2002; Poutahidis et al., 2007). Über Expression von IL-10 gelingt es den transferierten T-Zellen eine Kolitis zu inhibieren, wohingegen transferierte IL-10-defiziente, CD4⁺CD25⁺-positiven T-Zellen sogar zu einer Krankheitsexazerbation führen (Erdmann et al., 2003 A; Maloy et al., 2003 und 2005). Ebenfalls einen protektiven Effekt sollen Lactobacillen zu vermitteln. So führte eine Koinfektion von H. hepaticus mit probiotischen Lactobacillen bei Interleukin-defizienten Mäusen nicht nur zu einer geringeren Ausschüttung von TNF-α und INF-γ, sondern auch zu einer verminderten intestinalen Entzündungsreaktion (Pena et al., 2005).

Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass die Infektion mit H. hepaticus bei immunkompromittierten Mäusen zu einer Th1- und Th17-gewichteten, jedoch fehlerhaften Immunantwort mit erhöhten Spiegeln von TNF und INF-γ führt. Normalerweise sind regulatorische T-Zellen in der Lage, die durch das angeborene Immunsystem ausgelöste Entzündungsreaktion zu unterdrücken. Eine entscheidende Rolle spielt dabei IL-10.

Letztendlich scheint eine Fehlregulation der immunologischen Vorgänge bzw. der Zytokinkaskade für die insuffiziente Erregerabwehr und spätere Krankheitsmanifestation verantwortlich zu sein.

Ähnliche immunologische Vorgänge können auch bei chronisch verlaufenden, entzündlichen Erkrankungen des Meschen beobachtet werden. Beispiele hierfür sind der Morbus Crohn, die rheumatoide Arthritis oder auch die Helicobacter pylori-Infektion. Als partielle Gegenspieler von Interleukin-10 finden sich auch hier deutlich erhöhte Spiegel proinflammatorischer Zytokine, wie INF-γ oder IL-2.

Darüberhinaus weisen auch Klinik und Histopathologie einer murinen, H. hepaticus- induzierten Typhlokolitis teils deutliche Parallelen zu den beiden chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen des Menschen – insbesondere dem Morbus Crohn, aber auch der Colitis ulcerosa - auf. Entzündliche Veränderungen betreffen insbesondere die Coecumregion, hier zeigt sich auch die höchste Kolonisationsdichte der enterohepatischen Helicobacter-Spezies.

Zudem finden sich neben entzündeten Kolonabschnitten immer wieder gesunde Darmsegmente, was dem typischen segmentalen Darmbefall beim Morbus Crohn entspricht (Nell et al., 2010). Ebenso wie die chronisch entzündlichen Darmerkrankungen des Menschen kann eine langfristige H. hepaticus-Infektion zur Ausbildung eines Kolonkarzinoms führen (Erdmann et al., 2003A und C; Maggio-Price et al., 2005)

2.4.5 Virulenzfaktoren von Helicobacter hepaticus

Bislang sind die Kenntnisse über die an der Pathogenese von Helicobacter hepaticus beteiligten Virulenzfaktoren noch relativ überschaubar. Interessanterweise scheinen die wichtigsten Virulenzfaktoren von Helicobacter pylori, wie zum Beispiel die meisten Gene der cag-Pathogenitätsinsel oder das Zytotoxingen vacA, im Genom von H. hepaticus zu fehlen.

Neben den bereits experimentell erforschten Virulenzfaktoren mit gesicherter Funktion existiert eine Vielzahl von putativen Virulenzfaktoren. Deren postulierte Funktion wird in der Regel aus ihrer Sequenzhomologie zu bereits bekannten Virulenzfaktoren anderer verwandter Bakterien abgeleitet. Im Folgenden soll ein Überblick über den bisherigen Kenntnisstand

Jahr 2003 erschienenen Artikel „The complete genome sequence of the carcinogenic bacterium Helicobacter hepaticus“ von Suerbaum et al. beruhen (Suerbaum et al., 2003) basieren.

Abbildung 2: Zirkuläre Darstellung des Genoms von H. hepaticus ATCC 51449 (übersetzt aus Suerbaum et al., 2003)

Funktionelle Genkategorien sind in der Farblegende (links) bezeichnet. Äußere zwei Kreise: Positionen der Gene, die auf den beiden Nukleotidsträngen des Genoms im Uhrzeigersinn und Gegenuhrzeigersinn transkribiert werden. Dritter Kreis: GC-Gehalt der Genomabschnitte; GC-Gehalt mehr als 5% des durchschnittlichen GC- Gehalts des Genoms (Pink) bzw. weniger (Türkis). Vierter und fünfter Kreis: Orthologe Gene zu Helicobacter pylori (Schwarz) und Campylobacter jejuni (Rot). Die Länge der schwarzen und roten Linien ist jeweils proportional zur Aminosäureidentität der orthologen Proteine. Die Lage der genomischen Insel HHGI1 ist innerhalb des fünften Kreises durch eine Linie mit Begrenzungen dargestellt.

2.4.5.1 Urease

Um eine permanente Kolonisation im sauren Milieu des Magens zu gewährleisten, produzieren die gastrischen Helicobacter-Arten Urease (Burne und Chen, 2000). Obwohl seine ökologische Nische einen annährend neutralen pH-Wert aufweist, verfügt auch Helicobacter hepaticus, ebenso wie ca. 40% der bekannten enterohepatische Helicobacter- Arten, über eine Ureaseaktivität (Ge et al., 2008 A). Trotz einiger Parallelen unterscheiden sich Funktion und Regulation der Ureaseaktivität von H. hepaticus als Vertreter der

enterohepatischen Helicobacter von der des gastrischen Helicobacter pylori. Dennoch ist neben der funktionellen auch die strukturelle Ähnlichkeit beider Enzyme auffällig. Bei der von H. hepaticus exprimierte Urease handelt es sich ebenfalls um ein streng nickelabhängiges Metalloenzym, welches aus den Untereinheiten UreA und UreB besteht. Allerdings scheint der für die Ureaseeaktivität notwendige putative Nickeltransporter eher mit dem bei Escherichia coli beschriebenen Nickeltransportsystem verwandt zu sein (Suerbaum et al., 2003). Desweiteren lässt sich jedem Gen, das mit der Ureaseaktivität von H. hepaticus assoziiert ist, ein orthologes Äquivalent im Genom von H. pylori zuordnen (Beckwith et al., 2001). Während H. pylori mittels Urease Harnstoff in Ammoniak spaltet, um im sauren Magenmilieu zu persistieren, ist der Nutzen einer derart hohen enzymatischen Aktivität für die Kolonisation der Leber und des Dickdarms unklar. Sie scheint aber auch bei H. hepaticus essentiell für die Kolonisation des Wirts zu sein. Die Produktion von Ammoniak als Stickstoffquelle zur Proteinsynthese sowie eine erhöhte Überlebensrate bei der Magenpassage durch Freisetzung von Ammoniumionen aus der Harnstoffspaltung wurden diskutiert (Burne und Chen, 2000). Später konnte jedoch gezeigt werden, dass die Urease von H. hepaticus keine erhöhte Säuretoleranz vermittelt. Im Gegensatz zum säureinduzierten Urease-System von H. pylori ist ihre Aktivität ph-unabhängig, in nickelhaltiger Umgebung steigt sie an (Belzer et al., 2005). Zudem wird die Urease-Aktivität bei H. hepaticus durch den Transkriptionsregulator Fur supprimiert (Belzer et al., 2007). Für H. pylori konnte schon relativ früh die schädigende Wirkung von entstehendem Ammoniak auf die Wirtszellen belegt werden (Smoot et al., 1990), eine analoge zytotoxische Wirkung auf Hepatozyten und intestinale Epithelzellen bei H. hepaticus liegt nahe. Zudem wirkt die von H. hepaticus produzierte Urease selbst chemotaktisch auf Fresszellen, induziert die Zytokinproduktion und initialisiert so die Immunantwort des Wirts (Dunn und Phadnis, 1998). Durch Infektion von A/JCr Mäusen mit einer Urease-defizienten Mutante von H. hepaticus konnte schließlich gezeigt werden, dass das Fehlen von Urease zwar nicht die Kolonisation des Coecums, sehr wohl aber die der Leber, beeinflusst. Im Vergleich zur Wildtyp-Infektion fanden sich signifikant niedrigere mRNA-Spiegel der proinflammatorischen Zytokine INF-γ und TNF-α in der Leber, die Hepatitis war weniger ausgeprägt (Ge et al., 2008 A).

Um im hepatobiliären Trakt seines Wirts persistieren zu können, spielt eine andere, bereits recht früh beschriebene Eigenschaft von H. hepaticus eine wichtige Rolle - seine Resistenz gegenüber hohen Gallensäurespiegeln (Fox et al., 1994; Ward et al., 1994 A).

Für die Kolonisation des Gastrointestinaltrakts von Hühnern mit Campylobacter jejuni scheint die von Lin et al. beschriebene Multi-Drug-Resistent-Efflux-Pumpe CmeABC von

entscheidender Bedeutung zu sein (Lin et al., 2003). Homologe Genabschnitte könnten auch im Genom von H. hepaticus eine ähnliche Gallensäureresistenz vermitteln. Ein endgültiger Nachweis steht aber bislang noch aus.

2.4.5.2 Das Flagellensystem von Helicobacter hepaticus

Um ausreichend Motilität zu gewährleisten, besitzen alle Helicobacter-Spezies ein Flagellensystem, oftmals werden die beteiligten Gene durch den Sigmafaktor FliA reguliert.

Bei Helicobacter hepaticus werden die beiden Flagellin-Untereinheiten FlaA und FlaB bemerkenswerterweise durch drei Gene kodiert, da das für die Hauptuntereinheit kodierende Gen flaA in zwei fast identischen Kopien - HH1364 (flaA1) und HH1653 (flaA2) – vorliegt.

Die Regulierung erfolgt über den Sigmafaktor FliA (Suerbaum et al., 2003). Sowohl Mutationen in fliA als auch in beiden Kopien des flaA-Gens verhindern die Synthese von FlaA vollständig. Beide Mutanten weisen ein stark degeneriertes Flagellensystem auf, was zu Immotilität und Verlust der Kolonisationsfähigkeit führt. Eine Mutation in einem der flaA- Gene hingegen führt zwar zu verminderter Motilität bei erhaltenem Flagellensystem unter Expression von FlaA und FlaB, dennoch kam es auch hier zu keiner Kolonisation. Folglich scheint die vollständige Motilität von H. hepaticus Grundvoraussetzung für eine intestinale Besiedlung des Wirts zu sein (Sterzenbach et al., 2008).

Wie die Flagellen anderer Bakterien scheint auch das Flagellensystem von H. hepaticus besonders stark antigen wirksam zu sein, was auch die veröffentlichten Versuchsergebnisse von Kullberg et al. 2003 widerspiegeln. Eine Infektion mit H. hepaticus führte bei C57BL/10 RAG2 Knockout-Mäusen, welche selber keine T-Zellen mehr besitzen, nur zu einer Kolitis, wenn ihnen gegen H. hepaticus gerichtete CD4⁺ T_H1-Zellen transferiert wurden. Proteine der äußeren Zellmembran von H. hepaticus wirkten dabei als stärkstes Antigen, wobei das flagelläre Hakenprotein FlgE eines der Hauptantigene darstellte (Kullberg et al., 2003).

Zur chemotaktischen Orientierung dienen H. hepaticus neun putative, potentiell methylierbare Proteine gegenüber lediglich vier derartigen Proteinen im Genom von Helicobacter pylori (Suerbaum et al., 2003). Diese Beobachtung korreliert mit der größeren Breite der besiedelten ökologischen Nische und deren unterschiedlichen Umgebungsbedingungen.

2.4.5.3 Hydrogenase als Virulenzfaktor

Ebenso wie Helicobacter pylori verfügt auch Helicobacter hepaticus über das Enzym Hydrogenase. Durch dessen Fähigkeit molekularen Wasserstoff zu oxidieren sind sowohl

enterohepatische als auch gastrische Helicobacter in der Lage, Energie zu gewinnen. Bei H.

hepaticus kodieren die Leseraster HH0056 bis HH0059 für die vier Untereinheiten seiner Hydrogenase HyaA bis HyaD. Während Hydrogenase-defiziente H. pylori-Stämme den Magen deutlich schlechter kolonisieren, hat das Fehlen der Hydrogenase bei H. hepaticus durch Mutation in der HyaB-Untereinheit keinen Einfluss auf die Kolonisation von männlichen A/JCr-Mäusen. Allerdings waren Hydrogenase-defiziente H. hepaticus-Mutanten nicht in der Lage, den molekularen Wasserstoff zu nutzen, was in wasserstoffreicher Atmosphäre zu einem Wachstumsnachteil führte. Darüber hinaus zeigte sich eine signifikant verminderte Schädigung des Lebergewebes gegenüber dem Wildtyp. Möglicherweise wird die durch Wasserstoffoxidation gewonnene Energie zur Synthese Virulenz-assozierter Proteine genutzt, welche letztendlich zu Leber- und Darmentzündung sowie Nekrosen führen (Mehta et al., 2005).

2.4.5.4 Lipopolysaccharide

Ein bereits aus der Pathogenese von Helicobacter pylori bekannter Mechanismus, um die Immunantwort des Wirtes zu unterminieren, stellt das molekulare Mimikry mittels Modifikation exprimierter Lipopolysaccharide dar. Für die Variationsfähigkeit der Oberflächenantigene sind bestimmte phasenvariante Glykosyltransferasen verantwortlich (Wang et al., 2000). Suerbaum et al. postulieren die Kodierung ähnlicher Enzyme auch im Erbgut von Helicobacter hepaticus nebst entsprechend analoger Funktion (Suerbaum et al., 2003). Es konnte gezeigt werden, dass aufgereinigte H. hepaticus-Lipopolysaccharide nur schwach an TLR4 binden. Zudem unterdrücken H. hepaticus-Lipopolysacchariden die Toleranzentwicklung des murinen Wirts gegenüber Escherichia coli- Lipopolysacchariden.

Somit könnten Bakterien der kommensalen Darmflora die H. hepaticus-induzierte Darmentzündung entscheidend mitbeeinflussen (Sterzenbach et al., 2007)

2.4.5.5 Potentielle Adhäsine

Trotz Darmperistaltik gelingt es Helicobacter hepaticus die durch Enterozyten sezernierte Schleimschicht über Monate zu kolonisieren. Allein diese Beobachtung legt die Existenz bestimmter Oberflächenmoleküle nahe, die dem Keim nicht nur die Anhaftung an die Darmschleimhaut als ersten Infektionsschritt, sondern auch die anschließende Persistenz ermöglichen. Mittlerweile konnten im Genom von H. hepaticus verschiedene Gene identifiziert werden, die prinzipiell die Expression von Typ-IV-Pili ermöglichen könnten

(Suerbaum et al., 2003). Inwiefern diese aber eine Rolle bei der Adhäsion oder Transformation spielen, müssen nähere Untersuchungen noch klären – zumal eine Ausbildung von Pili in vivo bislang noch nicht beobachtet wurde.

Über die postulierten Pili hinaus konnten bei H. hepaticus einige Proteine zumindest als potentielle Adhäsine identifiziert werden. Trotz ihrer Ähnlichkeit zur Familie der OMPs– den

„outer membrane proteins“ - von Helicobacter pylori (Tomb et al., 1997) scheinen lediglich fünf dieser Proteine als echte Porine zu fungieren. Sechs weitere entsprechen vielmehr den so genannten Hor-Proteinen von H. pylori, den so genannten „Helicobacter outer membrane protein-related“-Proteinen (Suerbaum et al., 2003). Dieser Subgruppe der OMPs konnte allerdings bislang, im Gegensatz zu den Adhäsion-vermittelnden Hop-Proteinen, den

„Helicobacter outer membrane proteins“, keine eindeutige Funktion zugeordnet werden.

Möglicherweise stellen sie somit eine funktionell eigene Klasse dar.

2.4.5.5.1 Peb1 als potentielles Adhäsin

Während also im Genom von Helicobacter hepaticus bereits Orthologe zu Hop-Proteinen identifiziert wurden, scheinen Orthologe zu den OMPs von Campylobacter jejuni trotz der nahen Verwandtschaft und des ähnlichen Habitats zu fehlen. Stattdessen findet sich ein anderes putatives Protein mit möglicher Adhäsionsfunktion bei H. hepaticus, dessen Aminosäuresequenz mit einer Identität von 72% eine große Homologie zum Peb1-Protein von C. jejuni aufweist. Es handelt sich dabei um das offene Leseraster HH1481 (Suerbaum et al., 2003).

Mit einem Molekulargewicht von ca. 28 kDa ist Peb1 eines von drei Proteinen, denen eine Beteiligung an der Adhäsion von C. jejuni an intestinale Epithelzellen nachgewiesen werden konnte (Pei et al., 1998); ein entsprechendes Pendant im Genom von Helicobacter pylori existiert nicht. Es ist identisch mit dem bereits früher identifizierten, so genannten cell binding factor Cbf1 (Fauchere et al., 1989) und wahrscheinlich Teil eines in einem Operon liegenden ABC-Transporters (Pei und Blaser, 1993). Später konnten Pei et al. zeigen, dass die Inaktivierung des zuständigen Operons die Expression von Peb1 bei C. jejuni vollständig unterdrückt. Hierzu wurde das kodierende Gen peb1A mittels Insertion eines Kanamycin- Resistenz-Gens ausgeschaltet. Die so konstruierte Mutante offenbarte nicht nur eine um den Faktor fünfzig bis hundert verringerte Adhäsionsfähigkeit, sondern auch eine fünfzehnfach geringere Invasion unter Kulturbedingungen. Infizierte Mäuse wiesen zudem sowohl eine niedrigere Kolonisationsdichte, als auch eine kürzere Besiedlungsdauer des Darmes gegenüber einer Infektion mit dem Wildtyp auf (Pei et al., 1998).

2.4.5.7 Das zytolethale ausdehnende Toxin („Cytolethal Distending Toxin CDT“)

Taylor et al. beschrieben bereits 1995 ein von Helicobacter hepaticus sezerniertes, hitzelabiles Zytotoxin, das in vitro eine Vakuolenbildung bei murinen Hepatozyten induziert.

Betroffene Leberzellen zeigen ein auffälliges, granuliertes Aussehen (Taylor et al., 1995).

Mittlerweile konnte dieses von Taylor et al. erstmals beschriebene granulierende Toxin mit einem Molekulargewicht von mehr als 100 kDa zweifelsfrei als cytolethal distending toxin (CDT) identifiziert werden (Young et al., 2004). Es ist eng verwandt mit dem CDT von Campylobacter jejuni. Auch bei anderen enterohepatischen Helicobacteraceae, wie Helicobacter bilis, Helicobacter canis, Helicobacter cineadi oder Helicobacter pullorum konnte CDT bereits nachgewiesen werden (Chien et al., 2000; Young et al., 2000 A; Taylor et al., 2003).

Auch bei H. hepaticus wird das CDT durch ein Cluster von drei Genen, nämlich cdtA, cdtB und cdtC, kodiert. Die Untereinheiten CdtA und CdtC binden gemeinsam an CdtB, die eigentliche aktive Untereinheit des Toxins, und sorgen für seine intrazelluläre Einschleusung (Smith und Bayles, 2006). Mittlerweile konnten der CdtB-Untereinheit des Toxins mehrere Funktionen zugeordnet werden, unter anderem eine Desoxyribonuklease-I-Aktivität, eine Phosphatase-Aktivität, Unterbrechung des Zellzyklus sowie Apoptose-Induktion (Ge et. al., 2008 C; Liyanage et al., 2010).

Wie auch bei anderen Bakterien unterbricht das H. hepaticus CDT die Mitose in der G2- Phase, was die Vergrößerung des Zellkerns und der gesamten Zelle zur Folge hat (Young et al., 2000 B). Es führt aber nicht nur zur Inaktivierung des Zellzyklus, sondern über die Fragmentierung des Chromatins mittels seiner Desoxyribonuklease-I-Aktivität wahrscheinlich auch zur Apoptose. Die Fähigkeit zur DNA-Spaltung wird durch die DNAse-Aktivität von CdtB vermittelt, CdtA und CdtC sorgen vermutlich lediglich für die Translokation von CdtB in die Zielzelle. Während für die in vivo-Aktivität also alle drei Untereinheiten exprimiert werden müssen, führte die direkte Injektion von CdtB in die Zielzelle in vitro bereits zur Zelldistension und Unterbrechung des Zellzyklus (Lara-Tejero und Galan, 2000). Nachdem die Desoxyribonuklease-I-Aktivität der Untereinheit CdtB primär für das Toxin von C. jejuni gesichert worden war, konnte diese 2004 auch für CdtB von H. hepaticus nachgewiesen werden (Avenaud et al., 2004).

Im Vergleich zum Wildtypstamm verursachte eine Infektion mit CDT-defizienten H.

hepaticus-Mutanten bei IL-10-defizienten C57BL/6-Mäusen eine deutlich verminderte Entzündungsreaktion (Young et al., 2004; Ge et al., 2005).