Histamin-Rezeptor vermittelte Effekte im
Entzündungsgeschehen der Haut im Mausmodell
INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -
(Dr. med. vet.)
vorgelegt von Hilke Oltmanns
Leer
Hannover 2020
Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. Manfred Kietzmann
Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie
1. Gutachter: Prof. Dr. Manfred Kietzmann
2. Gutachter: Prof. Dr. Bernhard Ohnesorge
Tag der mündlichen Prüfung: 09.06.2020
Für meine Eltern - in Liebe und Dankbarkeit -
I
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung ... 1
2. Literatur ... 3
2.1.Atopische Dermatitis ... 3
2.2.Mausmodelle der atopischen Dermatitis ... 4
2.2.1. Angeborene Atopie bei Mausmodellen ... 4
2.2.2. Epikutane Sensibilisierungsmodelle bei Mäusen ... 5
2.3.Histamin ... 7
2.4.Histamin-1-Rezeptor ... 7
2.4.1. Histamin-1-Rezeptor-Antagonisten ... 7
2.5.Histamin-2-Rezeptor ... 8
2.5.1. Histamin-2-Rezeptor-Antagonisten ... 8
2.6.Histamin-3-Rezeptor ... 8
2.7.Histamin-4-Rezeptor ... 9
2.7.1. Histamin-4-Rezeptor-Antagonisten ... 9
2.8.Rolle des Histamin-4-Rezeptors bei atopischer Dermatitis ...10
2.9.Kombination von Histamin-1- und Histamin-4-Rezeptor-Antagonisten ...12
2.10. Zielsetzung dieser Arbeit ...14
3. Material und Methoden ... 15
3.1.Material ...15
3.1.1. Chemikalien ...15
3.1.2. Geräte ...15
3.1.3. Allgemeine Materialien ...16
3.1.4. Zusammensetzung des Puffers ...16
II
3.1.5. Material für In-vivo-Versuche ...16
3.1.6. Material für In-vitro-Versuche ...17
3.1.7. Material für die Proteinextraktion ...17
3.1.8. ELISA ...17
3.1.9. Versuchstiere und Tierhaltung ...18
3.2.Methoden ...19
3.2.1. Versuchsübersicht ...19
3.2.2. Calcipotriol-Modell ...20
3.2.3. Zellkulturversuche mit Calcipotriol ...25
3.2.4. Ovalbumin-Modell ...25
3.2.5. Untersuchte Parameter ...26
Hautläsionen ... 26
Lymphknoten ... 26
Histologie ... 27
TSLP-Bestimmung in Hauthomogenisaten und Zellkulturüberstände (ELISA) ... 27
3.2.6. Statistische Auswertung ...28
4. Ergebnisse ... 29
4.1.OVA-Modell ...29
4.1.1. Histologische Auswertung ...31
4.1.2. TSLP-Konzentration ...31
4.2.Calcipotriol-Modell ...31
4.2.1. Calcipotriolbehandlung bei Balb/c-Mäusen ...32
Histologische Auswertung ... 36
TSLP-Konzentration ... 37
4.2.2. Calcipotriolbehandlung bei H4R-/--Mäusen ...38
III
Histologische Auswertung ... 41
TSLP-Konzentration ... 42
4.2.3. Effekt von Dexamethason auf induzierte Entzündungsreaktionen ...43
Histologische Auswertung ... 46
TSLP-Konzentration ... 47
4.2.4. Effekt von H1- und H4-Antagonisten auf induzierte Entzündungsreaktionen ...48
Histologische Auswertung ... 51
TSLP-Konzentration ... 53
4.2.5. Effekt von inversen H4R-Agonist und H1R-Antagonist auf induzierte Entzündungsreaktionen ...54
Histologische Auswertung ... 57
TSLP-Konzentration ... 59
4.3.Freisetzung von TSLP durch Keratinozyten ...59
5. Diskussion ... 61
5.1.Reproduzierbarkeit der Tiermodelle ...62
5.2.Untersuchte Parameter ...65
5.3.Calcipotriol-Behandlung bei Wildtyp- und Knockout-Tieren ...67
5.4.Effekt von JNJ 39758979 auf Entzündungsreaktionen ...68
5.5.Calcipotriolbehandlung in Kombination mit Dexamethason ...71
5.5.1. Glukokortikoideinfluss auf TSLP-Konzentration ...72
5.6.Calcipotriolbehandlung in Kombination mit inversen H4R-Agonist ...73
5.7.Calcipotriol induzierte TSLP-Freisetzung ...74
5.8.Schlussfolgerung ...75
6. Zusammenfassung... 77
7. Summary ... 79
IV
8. Literaturverzeichnis ... 81
9. Anhang ... 98
9.1.Vorträge und Poster ...98
9.2.Danksagung ...99
V Abkürzungsverzeichnis
AD Atopische Dermatitis
Aqua ad inj. Aqua ad injectionem, Wasser für Injektionszwecke
Aqua bidest. Aqua bidestillata
BSA Bovines Serumalbumin
DC Dendritische Zellen
DNCB Dinitrochlorbenzol
ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay FKS fetales Kälberserum
HE Hämatoxylin-Eosin
H1R Histamin-1-Rezeptor H2R Histamin-2-Rezeptor H3R Histamin-3-Rezeptor H4R Histamin-4-Rezeptor
IL Interleukin
i.p. intraperitoneal JAK-1 Januskinase-1 JNJ 3975 JNJ 39758979 MC 903 Calcipotriol
OVA Ovalbumin
OVA-Modell Ovalbumin-induziertes Mausmodell PBS Phosphate buffered saline
RPMI Roswell Park Memorial Institute Medium
VI
TDI Tolendiisocyanat
TNCB Trinitrochlorbenzen TNF-α Tumor-Nekrosefaktor-α
TSLP Thymic stromal lymphopoietin
VII
1
1. Einleitung
Die atopische Dermatitis (AD), auch als Neurodermitis bekannt, ist eine chronisch-entzündliche, nicht-infektiöse Hautkrankheit. Diese tritt sowohl bei Tieren, häufig bei Hunden, als auch bei Menschen auf. Insbesondere bei Kindern ist diese Krankheit die am häufigsten vorkommende chronische Krankheit (SCHMITT et al.
2009).
Patienten leiden anfänglich unter roten, ödematösen Erosionen und Juckreiz sowie Erythemen. In der chronischen Phase haben Erkrankte häufig eine stark verdickte Epidermis und Lichenifikation an den betroffenen Stellen. Atopie-Patienten leiden nicht nur unter Hautläsionen und Juckreiz, sondern verlieren auch an Lebensqualität (WERFEL et al. 2016c; GEDON u. MUELLER 2018). Der Juckreiz und dadurch möglicher Schlafentzug können zu Konzentrationsstörungen führen, die unter anderem das Berufsfeld beeinflussen können.
Die Behandlung von Atopie-Patienten erfolgt nach Einteilung in verschiedene Schweregrade. Dazu werden Scoring-Systeme verwendet, wie beispielsweise der
„eczema area and severity index“ (EASI) (HANIFIN et al. 2001). Anfängliche topische Therapie mit fettenden Cremes reicht bei schwerwiegenden Symptomen nicht mehr aus. Von einer Behandlung mit Glukokortikoiden wird aufgrund der Nebenwirkungen auf Dauer abgeraten. Beispielsweise wird Dupilumab bei mittelschweren bis schweren Atopien eingesetzt. Dupilumab ist ein gegen den Interleukin (IL)-4-Rezeptor gerichteter monoklonaler Antikörper, der spezifisch, im Gegensatz zu Glukokortikoiden, wirkt.
Auch sehr spezifisch wirkt der Histamin-4-Rezeptor-Blocker ZPL-3893789, der sich in der klinischen Testphase befindet. Er soll weniger Nebenwirkungen als beispielsweise Glukokortikoide haben (WERFEL et al. 2019). Bei schwerer Atopie kann auch Cyclosporin A zum Einsatz kommen. Dieses Medikament wirkt immunsuppressiv, indem es indirekt die T-Zell-Aktivität hemmt. Cyclosporin A führt beim Menschen häufig zu starken Nebenwirkungen, wie zum Beispiel Nierenfunktionsstörungen, bei Hunden treten diese Nebenwirkungen weniger auf. Bei Hunden und Katzen wird auch Oclacitinib angewendet. Dieses Medikament ist ein selektiver Januskinase-1-Inhibitor (JAK1) (GEDON u. MUELLER 2018). JAK1 ist involviert in den inflammatorischen
2
Entzündungsprozess und beeinflusst unter anderem die Zyktokin-Sekretion von IL-4 und IL-31. Durch eine Konzentrationszunahme von IL-4 und IL-31 wird Juckreiz ausgelöst. Durch Gabe von Oclacitinib kann der Juckreiz reduziert werden. Als weitere Möglichkeit kann beim Hund Lokivetmab (ZTS-00103289) verabreicht werden. Der gegen den IL-31-Rezeptor gerichtete monoklonale Antikörper kann Juckreiz mindern (MICHELS et al. 2016).
Die Pathophysiologie der AD ist komplex. Verschiedene auslösende Faktoren stehen im Forschungsschwerpunkt der Dermatologie. Es muss diskutiert werden, ob genetische Faktoren sowie Störungen der Epidermis oder immunologische Mechanismen und Umweltfaktoren an AD beteiligt sind.
Unterschiedliche Modelle dienen dazu, differenzierte pathophysiologische Abschnitte der Atopie zu verstehen. Es werden In-vivo-Modelle genutzt, um Mechanismen im Gesamtkomplex zu verstehen und um die Pathophysiologie auf zellulärer Ebene zu untersuchen.
Im Jahr 2000 wurde ein vierter Histamin-Rezeptor entdeckt (NAKAMURA et al. 2000, ODA et al. 2000). Dieser Histamin-4-Rezeptor spielt eine große Rolle im Geschehen der AD (MOMMERT et al. 2011). Es wurde bereits in Tiermodellen, beispielsweise von SUWA et al. (2011), gezeigt, dass eine Blockierung des Histamin-4-Rezepoters zur Linderung des Juckreizes führt. Ziel der vorliegenden Arbeit war es zu untersuchen, ob das Entzündungsgeschehen der Haut über den Histamin-4-Rezeptor (H4R) zu beeinflussen ist.
3
2. Literatur
2.1. Atopische Dermatitis
Die atopische Dermatitis ist eine der häufigsten chronisch-entzündlichen Hauterkrankungen (HAY et al. 2014). Diese tritt mit einer Häufigkeit von bis zu 25 % bei Kindern und bis zu 3 % bei Erwachsenen auf (BIEBER 2008). Ihre Pathophysiologie ist hochkomplex und teilweise noch ungeklärt (GROBE et al. 2019).
Auch 5 bis 15 % der Hunde leiden unter AD (HILLIER u. GRIFFIN 2001). Als ein Faktor der Pathophysiologie gilt die gestörte Barrierefunktion der Haut. Außerdem spielen die genetische Disposition und Reaktion des Patienten auf Umweltfaktoren eine große Rolle.
Durch eine Mutation im Filaggrin-Gen kann es zur Störung der Hautbarriere kommen.
Ein Drittel der europäischen Patienten besitzen eine Loss-of-Function-Mutation (GROBE et al. 2019). Filaggrin geht aus dem im Stratum spinosum gebildeten Profilaggrin durch Dephosporylisierung im Stratum granulosum hervor. Im Stratum corneum führt Filaggrin zur Keratinfilament-Aggregation bei Gesunden. Durch das Fehlen von Filaggrin kommt es zu Verhornungsstörungen, was im weiteren Verlauf die Freisetzung proinflammatorischer Zytokine bedingen kann (PASTORE et al. 1997;
GIROLOMONI u. PASTORE 2001; SOUMELIS et al. 2002). Unter anderem steigt auch der pH-Wert an der Hautoberfläche, was zu einer weiteren negativen Beeinflussung der Hautbarriere führt. Patienten mit mutiertem Filaggrin-Gen besitzen eine geringere bakterielle Diversität als die Haut eines gesunden Patienten. So haben Erkrankte häufig eine übermäßige Besiedlung der Haut mit Staphylococcus aureus. Durch die bereits gestörte Hautbarriere ist es für Bakterien leichter, in die Haut einzudringen.
Dies kann zu Infektionen führen, aber es kann auch eine gesteigerte Immunreaktion resultieren. Gerade Staphylococcus bildet hohe Mengen an Enterotoxin, welches als Superantigen fungieren kann (BAURECHT et al. 2018). Die T-Zell-Proliferation nimmt zu. Des Weiteren werden IgE-Antikörper gebildet.
4
2.2. Mausmodelle der atopischen Dermatitis
Da die Prävalenz dieser Erkrankung stetig ansteigt, werden verschiedene Mausmodelle zur Hilfe genommen, um die unterschiedlichen Ebenen der Krankheit besser untersuchen zu können. Auch beim Hund steigt die Anzahl der erkrankten Tiere an und die auslösenden Faktoren der caninen AD sind ebenfalls nicht vollständig geklärt (SANTORO et al. 2015).
Die Vorteile der Untersuchung im Mausmodell dabei liegen unter anderem darin, dass Einblicke in die Pathogenese der Krankheit möglich sind und sich therapeutische Ansätze entwickeln lassen. So konnte an gentechnisch veränderten Mäusen die Relevanz von unterschiedlichen Genen besser verstanden werden.
2.2.1. Angeborene Atopie bei Mausmodellen
NC/Nga-Mäuse sind gentechnisch veränderte Inzuchtmäuse, die bei Kontakt mit Umweltallergenen Hautveränderungen, die einer Atopie ähneln, entwickeln. Es zeigen sich Veränderungen wie Erytheme, Blutungen, Ödeme, Erosionen, Schuppen und trockene Haut. Auch histologisch sind epidermale Hyperplasie sowie eine erhöhte eosinophile Granulozyten- und Mastzellenanzahl festzustellen (MATSUDA et al. 1997;
KOHARA et al. 2001).
Ein weiteres Modell ist das Flaky tail-Mausmodell. Die Tiere haben einen Funktionsverlust im Filaggrin und zeigen eine ähnlich gestörte Hautbarriere wie Atopie-Patienten. Bei topischer Behandlung mit Allergenen treten Ekzeme auf; ebenso sind erhöhte IgE-Spiegel im Serum nachweisbar (FALLON et al. 2009).
Auch HIKITA et al. (2002) konnten mit DS-Nh-Mäusen ein Modell zur atopischen Dermatitis etablieren. Bei den Tieren, die unter konventionellen Bedingungen gehalten werden, entstehen auch Hautläsionen, die bei der humanen Atopie auftreten wie Erytheme und Erosionen, verbunden mit Pruritus. Auch hier konnten histologisch Hyperkeratose, Akanthose und vermehrt Entzündungszellen in der Haut festgestellt werden.
5
Bei den genetisch veränderten Mäusen gibt es sowohl Stämme, die eine Überexpression von bestimmten Zytokinen aufweisen, sowie Zuchtstämme, bei denen bestimmte Gene fehlen, sogenannte Knockout-Tiere. Es gibt beispielsweise einen Inzuchtmausstamm, der eine Mutation im JAK1-Gen besitzt. Durch die Mutation hat dieser Mausstamm eine gestörte Hautbarriere. YASUDA et al. (2016) zeigten, dass diese Tiere durch Unterstützung der Barrierefunktion mit pflegenden Cremes vor einer AD geschützt werden können. Des Weiteren konnte durch eine Blockierung der Überexpression der JAK1 der Ausbruch der AD verzögert werden. Die Autoren YASUDA et al. (2016) konnten Hinweise darauf finden, dass bei einer Atopie die JAK1- vermittelte Kaskade in der Haut eine Rolle spielt.
IL-33 transgene Mäuse exprimieren vermehrt hautselektives IL-33, dass wiederum zu einer AD führen kann. Tiere zeigen histologisch eine erhöhte Anzahl von Eosinophilen, Mastzellen und größere Epidermisdicken. Des Weiteren waren die IgE-Spiegel im Blut erhöht (YASUDA et al. 2016; KAKE et al. 2019).
2.2.2. Epikutane Sensibilisierungsmodelle bei Mäusen
KAKE et al. (2019) zeigten, dass haarlose Mäuse bereits eine Woche nach einer einmaligen Gabe von Oxazolon (5%) sensibilisiert sind. Bei darauf folgenden über acht Wochen täglich durchgeführten Behandlungen mit Oxazolon (0,1%) entstanden Ähnlichkeiten zu einer atopischen Dermatitis. Die Hautveränderungen konnten durch Verabreichung von β-Carotin gemildert werden. Die β-Carotin-Gabe konnte auch die Freisetzung von Entzündungsmediatoren wie Zytokine (z.B. IL-4, TNF-α) senken.
SPERGEL et al. (1998) beschrieben ein Mausmodell (OVA-Modell) zur epikutanen Sensibilisierung von Mäusen. Dabei wurden die Tiere über eine Woche mit Ovalbumin behandelt. Nach einer zweiwöchigen Pause wurde das Prozedere wiederholt. Nach dreimaliger Sensibilisierung konnte histologisch eine Zunahme der Neutrophilen, Eosinophilen und Mastzellen in der Haut festgestellt werden. Des Weiteren wurden erhöhte IgE-Konzentrationen in der Haut ermittelt.
Es gibt auch die Möglichkeit, eine atopische Dermatitis mit Hausstaubmilben-Extrakten auszulösen. MATSUOKA et al. (2003) haben über acht Wochen dreimal wöchentlich
6
Extrakte aus Dermatophagoides farinae auf die Haut aufgetragen. Dabei ließen sich nicht nur klinische Hinweise auf eine AD feststellen, wie beispielsweise Schuppenbildung und Erosionen, sondern auch histologisch konnten erhöhte Anzahlen von Mastzellen, genauso wie eine Zunahme der Epidermisdicke, detektiert werden.
NAIDOO et al. (2018) zeigten, dass bei Mäusen eine topische Behandlung der Ohren mit Calcipotriol, einem Vitamin-D-Analogon, eine Entzündungsreaktion auslösen kann, die einer AD ähnelt. Die Tiere wurden über einen Zeitraum von 19 Tagen behandelt.
Über die gesamte Versuchsdauer nahm die Ohrdicke zu. Der transepidermale Wasserverlust (TEWL), der als ein Anzeichen einer Barrierestörung dient, war erhöht.
Dieser Parameter diente als ein klinisches Anzeichen von AD, da durch die gestörte Hautbarriere mehr Wasser abgegeben wird. NAIDOO et al. (2018) konnten durch die Behandlung mit Calcipotriol einen Anstieg der TEWL-Konzentration zeigen.
Histologisch waren Veränderungen wie Parakeratose, interzelluläre Ödeme und Akanthose festzustellen. Zudem nahmen die Dermis- und Epidermisdicke zu. Auch die Konzentrationen der Zytokine IL-4, IL-17 und das Thymic stromal lymphopoietin (TLSP) stiegen in der Haut an. Dabei konnte eine inverse Korrelation zwischen TSLP und IL-17 gezeigt werden. IL-4, IL-17 und TSLP spielen eine wichtige Rolle im Entzündungsgeschehen der AD (KLONOWSKA et al. 2018).
7
2.3. Histamin
Histamin ist ein Botenstoff und Neurotransmitter, der sowohl in tierischen als auch in pflanzlichen Organismen vorkommt. Histamin ist insbesondere in der Lunge, der Haut und dem Magen-Darm-Trakt vorhanden (ZIMMERMANN et al. 2011; PANULA et al.
2015).
Durch oxidative Decarboxylierung (Histidindecarboxylase) wird Histamin aus der Aminosäure L-Histidin gebildet. Histamin beeinflusst durch unterschiedliche Wirkungen verschiedene Prozesse im Körper. Es agiert an der Magenschleimhaut und fördert dort die Säureproduktion. Außerdem wirkt es am Herzen positiv chronotrop und ionotrop. Auch beeinflusst Histamin als Mediator Entzündungsprozesse (MOSSNER u. CACA 2005; THURMOND et al. 2008). Histamin vermittelt seine Wirkung über G- Protein-gekoppelte Rezeptoren (AKDIS u. SIMONS 2006).
2.4. Histamin-1-Rezeptor
Der Histamin-1-Rezeptor (H1R) ist der erste entdeckte Histaminrezeptor. Er wird von verschiedenen Zellen und Gewebetypen exprimiert, wie beispielsweise von Epithelzellen, Endothelzellen, neuronalen Zellen, aber auch von Immunzellen (LEURS et al. 1995). Auch die glatte Muskulatur ist mit H1R ausgestattet. Bei Aktivierung des H1R kann es zur Vasodilatation und erhöhten Gefäßpermeabilität kommen. Über den aktivierten H1R kommt es zu klassischen Anzeichen einer allergischen Entzündung wie Rötung, Juckreiz, Ödeme und Schmerz (BÄUMER u. ROSSBACH 2010).
2.4.1. Histamin-1-Rezeptor-Antagonisten
Die verwendeten Histamin-1-Rezeptor-Antagonisten (H1R-Antagonisten) werden in Generationen unterteilt. Die erste Generation verfügt über klassische Wirkstoffe wie beispielsweise Diphenhydramin, Doxylamin, Mepyramin und Dimetinden.
Problematisch bei diesen Stoffen sind die unerwünschten Nebenwirkungen. Diese stellen sich als Sedation und anticholinerge Effekte dar, da diese Wirkstoffe die Bluthirnschranke durchdringen können (HILL 1990; NICHOLSON et al. 1991). Heute
8
werden sie daher überwiegend zur Behandlung von Angst- oder Schlafstörungen eingesetzt. Die zweite Generation der H1-Antihistaminika ist so modifiziert, dass sie weniger sedativ wirken. Zu dieser Generation zählen Wirkstoffe wie Azelastin, Cetirizin, Levocetirizin, Fexofenadin und Loratadin. Die Vertreter der zweiten Generation werden zur Behandlung von allergischer Rhinitis, allergischer Konjunktivitis oder auch Urtikaria eingesetzt. Sie sind bei AD oder auch Asthma nur gering wirksam (OLIVRY et al. 2010; SIMONS u. SIMONS 2011).
2.5. Histamin-2-Rezeptor
Der Histamin-2-Rezeptor (H2R) befindet sich in fast allen peripheren Geweben sowie im zentralen Nervensystem (ZNS) (SIMONS 2004). Er spielt unter anderem eine Rolle bei der Produktion von Magensäure in den Parietalzellen und auch die bereits erwähnte chronotrope und ionotrope Wirkung am Herzen wird über den H2R vermittelt.
Weiterhin können über den H2R eine erhöhte vaskuläre Permeabilität, Hypotension und Kopfschmerzen beeinflusst werden (SIMONS 2004).
2.5.1. Histamin-2-Rezeptor-Antagonisten
Die ersten H2R-Antagonisten, wie beispielsweise Cimetidin und Ranitidin, waren zur Verminderung der Magensäureproduktion indiziert (MOSSNER u. CACA 2005).
Aufgrund der Nebenwirkungen, wie beispielsweise Übelkeit oder Kopfschmerzen, werden häufiger Protonenpumpenhemmer eingesetzt.
2.6. Histamin-3-Rezeptor
Dieser Rezeptor befindet sich vermehrt im Nervensystem. Dabei wird er als präsynaptischer Rezeptor exprimiert. Als Autorezeptor, der die Synthese und Freisetzung von Histamin aus histaminergen Neuronen reguliert, ist er an der Freisetzung von Neurotransmittern wie Acetylcholin, Dopamin, Serotonin und Noradrenalin beteiligt (SANDER et al. 2008; PANULA et al. 2015). Darüber hinaus wurde eine Mitwirkung des Histamin-3-Rezeptors (H3R) im Entzündungsgeschehen
9
der Haut beschrieben (ROSSBACH et al. 2011). ROSSBACH et al. (2011) zeigten, dass mit dem inversen H3R-Agonisten Pitolisant, intradermal verabreicht, starker Juckreiz ausgelöst werden konnte. Diese Reaktion konnte durch H1- und H4- Antagonisten gemildert werden.
2.7. Histamin-4-Rezeptor
Der H4R wurde im Jahr 2000 beschrieben (NAKAMURA et al. 2000; ODA et al. 2000).
Der Rezeptor wurde auf Zellen, wie beispielsweise Eosinophilen, Mastzellen, Monozyten sowie T- und B-Zellen nachgewiesen. Der H4R spielt eine wichtige Funktion bei der Immunantwort. Er hat Einfluss auf verschiedene Zellen im Immunsystem (GUTZMER et al. 2011). So ist der H4R an der Aktivierung dendritischer Zellen, deren Migration und an der T-Zell-Differenzierung beteiligt (GUTZMER et al.
2005; BÄUMER et al. 2008). Über diesen Rezeptor wird beispielsweise eine Migration von Mastzellen herbeigeführt, diese degranulieren jedoch nicht (HOFSTRA et al.
2003).
2.7.1. Histamin-4-Rezeptor-Antagonisten
Zurzeit befinden sich noch keine H4R-Antagonisten in der klinischen Anwendung. Der H4R kann bespielweise durch die Substanz JNJ 7777120 blockiert werden. Die Substanz hat eine hohe Affinität zum H4R. Für In-vivo-Versuche ist die Substanz nur mit Einschränkungen zu verwenden, weil die Verfügbarkeit, ebenso wie die Wirkdauer, zu gering ist. Für In-vitro-Versuche wird JNJ 7777120 jedoch erfolgreich verwendet (THURMOND et al. 2004; LIM et al. 2010).
Ein weiterer H4R-Antagonist ist JNJ 39758979. Dieser hat eine sehr hohe Affinität zum murinen H4R und wurde auch in der eigenen Arbeit verwendet. Weiterhin lindert diese Substanz Juckreiz bei Patienten mit atopischer Dermatitis (KOLLMEIER et al. 2014;
SAVALL et al. 2014; THURMOND et al. 2014; MURATA et al. 2015). Der Wirkstoff wurde bereits in Phase II klinischen Studien getestet. Es kam zu Agranulozytose bei einigen Teilnehmern und in Folge dessen zum Abbruch der Studien.
10
Bereits in der klinischen Erprobung ist der H4R-Antagonist ZPL-3893787. Beim Menschen führt die Gabe des H4R-Antagonisten zur Reduzierung der Hautläsionen (WERFEL et al. 2019).
2.8. Rolle des Histamin-4-Rezeptors bei atopischer Dermatitis
Die Pathophysiologie der AD ist komplex (SCHAPER-GERHARDT et al. 2018). Sie beruht hauptsächlich auf einer Th2-Antwort mit Keratinozyten-Interaktionen.
Die AD kann durch verschiedene Risikofaktoren, wie genetische Veranlagung bis hin zu Umwelteinflüssen, moduliert werden (WERFEL 2009; NUTTEN 2015). Die AD kann man in verschiedene Phasen einteilen. In der akuten Phase dringen zuerst Allergene durch die gestörte Hautbarriere (Abbildung 1, 1). Die Langerhans-Zellen binden Antigene und wandern zum regionalen Lymphknoten. Sie führen zu einer Differenzierung von Th2-Zellen. Die anfängliche dominierende Th2-Antwort wird zur Th1-Antwort (WERFEL et al. 2016b). In der akuten Phase (Th-2-Antwort) sind Mastzellen, Granulozyten, Makrophagen und Antigen-präsentierende Zellen (APC) in der Haut zu finden. Dendritische Zellen (DC) präsentieren IgE-Rezeptoren, wodurch es zur Freisetzung von Histamin aus Mastzellen und basophilen Granulozyten kommt (Abbildung 1, 2) (SCHAPER-GERHARDT et al. 2018). An den APC werden proinflammatorische Zytokine, wie IL-12, IL-27 und CCL2 herunterreguliert. Durch das freigesetzte Histamin werden über den H4R Basophile, Eosinophile und APC zur Migration in die Haut angeregt. Über die Histamin-4-Rezeptor-Stimulation wird die IL-31-Zytokinproduktion in den Th2-Zellen hochreguliert (Abbildung 1, 3) (GUTZMER et al. 2009). Die Th2-Zellen exprimieren IL-4, IL-5 und IL-13, die bei Atopie-Patienten im Gegensatz zu gesunden Patienten erhöht sind (HAMID et al. 1994). Insbesondere IL-4 spielt im Zusammenhang mit dem H4R eine große Rolle. Bei atopischer Dermatitis wird durch IL-4 der H4R an den CD4+ Zellen hochreguliert (SUGATA et al. 2007;
GUTZMER et al. 2009). Außerdem werden Keratinozyten über den aktivierten H4R angeregt, TSLP auszuschütten. Durch IL-31 und TSLP entsteht Juckreiz an den sensorischen Neuronen der Haut (Abbildung 1, 4). TSLP wird auch von anderen Zelltypen wie beispielsweise Mastzellen oder Fibroblasten produziert (MU et al. 2014).
11
Abbildung 1: Rolle des Histamin-4-Rezeptors bei atopischer Dermatitis, modifiziert nach SCHAPER- GERHARDT et al. (2018)
Das der H4R an Keratinozyten einen Einfluss auf die TSLP-Produktion hat, konnten SCHAPER et al. (2016) an humanen Keratinozyten zeigen. Dabei wurden die Zellen mit Vorinkubation von Poly I:C, welches auch ein TSLP-Induktor ist, vorstimuliert. Nach Zugabe von Histamin in den Zellkulturen kam es zur TSLP-Produktion. Dieser Effekt war auch bei der murinen Zelllinie MSC nachzuweisen (SCHAPER et al. 2016).
SUWA et al. (2011) lösten bei Mäusen eine allergische Hautreaktion durch die topische Gabe von Trinitrochlorbenzol (TNCB) aus, die durch die Gabe des H4R-Antagonisten JNJ 7777120 gemildert werden konnte. Die Effekte von JNJ 7777120 waren dosisabhängig. Es wurden unterschiedliche Dosierungen, 10 mg/kg und 30 mg/kg, verwendet. Eine Dosierung von 30 mg/kg JNJ 7777120 führte dazu, dass die Anzahl der Mastzellen in der Haut im Vergleich zur Kontrollgruppe sank. Die Effekte des
12
H1R-Antagonisten Fexofenadin (60 mg/kg) und des Glukokortikoid Dexamethason (3 mg/kg) wurde auch bewertet. Die Gabe von Dexamethason führte zur Abnahme des Juckreizes.
2.9. Kombination von Histamin-1- und Histamin-4-Rezeptor- Antagonisten
MATSUSHITA et al. (2012) konnten belegen, dass eine Kombination des H1R- Antagonisten Olopatadin und des H4R-Antagonisten JNJ 7777120 klinische Symptome der allergischen Kontaktdermatitis lindern konnte. Um die Kontaktdermatitis auszulösen, wurde TNCB über 17 Tage einmal täglich topisch aufgetragen. Olopatadin (10 mg/kg/Tag) und JNJ 7777120 (100 mg/kg/Tag) wurden oral verabreicht. Die Kombination des H1R- und H4R-Antagonisten führte zu einer Senkung des IgE-Spiegels und der IL-4 Konzentration im Vergleich zur alleinigen Gabe der Substanzen. Die histologische Auswertung zeigte, dass mit JNJ 7777120 behandelte Tiere eine geringere Epidermisdicke hatten als Kontrolltiere und auch Tiere in der Behandlungskombination von JNJ 7777120 und Olopatadin. Auch in diesem Versuch konnte die Anzahl der Mastzellen in der Epidermis durch JNJ 7777120 verringert werden.
COWDEN et al. (2010) zeigten in dem Kontaktallergiemodell (Fluoresceinisothiocyanat (FITC)) bei NC/Nga-Mäusen, dass eine Kombination von H1R- und H4R-Antagonisten einen Einfluss auf den Juckreiz hat. Dabei wurden die Tiere mit dem H1R-Antagonisten Olopatadin (3 mg/kg) und dem H4R-Antagonisten JNJ 7777120 (30 mg/kg) behandelt. Die Kombination der H1R- und H4R-Antagonisten erzeugte eine Abnahme des Zytokins TSLP in der Haut, genauso wie eine Abnahme des IgE-Gehalts im Serum. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass JNJ 7777120 auch bei alleiniger Verabreichung zu einer Senkung der Th2-Zytokine, wie beispielsweise IL-4 und IL-5, führte.
ROSSBACH et al. (2009) konnten durch die Gabe von JNJ 7777120 (15 mg/kg) keine verringerte Entzündungsreaktion im Kontaktallergiemodellen erzeugen, wenn JNJ 7777120 in der Challengephase verabreicht wurde. Als Allergiemodell diente eine
13
durch Dinitrochlorbenzen (DNCB) und Toluendiisocynat (TDI) provozierte Entzündungsreaktion. TDI induziert eine Th2-dominierte und DNCB eine Th1-dominierte Entzündungsreaktion. JNJ 7777120 konnte bei sensibilisierten Tieren in beiden Kontaktallergiemodellen eine Juckreizmilderung erzeugen. Eine Kombination des H1R-Antagonisten Cetirizin und JNJ 7777120 erzeugte die deutlichste Juckreizreduktion, jedoch keine Hemmung der Entzündungsreaktion.
KÖCHLING et al. (2017) konnte im OVA-Modell durch eine Kombination von H1R- und H4R-Antagonisten zeigen, dass sich die Entzündungsreaktion der Haut verringerte. Es wurde Mepyramin (20 mg/kg) und JNJ 39758979 (20 mg/kg) als HR-Antagonisten verwendet. Die Kombination führte auch zu einer Abnahme des Juckreizes, ebenso sanken die Zahl der Entzündungszellen und die Epidermisdicke bei der Kombination von Mepyramin und JNJ 39758979 im Vergleich zur Kontrollgruppe.
Um die entzündungshemmende Wirkung von H4R-Liganden weiter zu untersuchen, hat ADAMI et al. (2018) unter anderem den inversen H4R-Agonisten ST1012 getestet.
Dabei wurde mit Krotonöl eine akute Kontaktdermatitis an Mäuseohren ausgelöst. Die H4R beeinflussenden Substanzen wurden subcutan vor der Applikation von Krotonöl verabreicht. Die Testsubstanz ST1012 wurde in Dosierungen von 30 mg/kg und 100 mg/kg angewendet. Es wurde der Juckreiz und das Ohrödem beurteilt. Das Ohrödem nahm 2 Stunden nach Applikation von Krotonöl ab. ST1012 beeinflusste nicht den Juckreiz.
14
2.10. Zielsetzung dieser Arbeit
In dieser Arbeit sollte zunächst der Einfluss des H4R auf das atopische Entzündungsgeschehen näher untersucht werden. Mithilfe von epikutaner Sensibilisierung sollte ein Modell der AD entstehen. Es wurden sowohl das OVA-Modell als auch ein Modell mit Calcipotriol genutzt. Im OVA-Modell wurde ein Versuch mit Knockout-Mäusen (H4R-/-) durchgeführt, der andere mit Wildtyp-Mäusen (Balb/c). Das Calcipotriol-Modell wurde auch an Knockout-Mäusen und an Wildtyp-Mäusen getestet.
Der Einfluss von H4R auf das Entzündungsgeschehen wurde mit einem H4R- Antagonisten (JNJ 39758979) und einem inversen H4R-Agonisten (ST1012) getestet.
Außerdem wurde eine Kombination der H4R-beeinflussenden Substanzen mit einem H1R-Antagonisten (Mepyramin) untersucht.
15
3. Material und Methoden 3.1. Material
3.1.1. Chemikalien
Dimethylsulfoxid Merck KgAa, Darmstadt
Ethanol CG Chemikalien, Laatzen
Natriumchlorid Merck KgAa, Darmstadt
Schwefelsäure Merck KgAa, Darmstadt
Trypanblau Sigma-Aldrich, Steinheim
3.1.2. Geräte
Autoklav Schlumbohm Medizin- Labor- Technologie
GmbH, Hamburg
Brutschrank Hera Cell 150 Thermo Fisher, Braunschweig
Feinwaage Sartorius Lab Instruments GmbH ET.Co.
KG, Göttingen
Gefrierschrank Bauknecht, Stuttgart
Hybridisierungsinkubator 7601 GFL Gesellschaft für Labortechnik mbH, Burgwedel
Magnetrührgerät MR 3001 k OMNILAB, Gehrden Mikroskop Axiovert 25 Carl Zeiss AG, Jena
Kühlschrank Liebherr Comfort, Biberach an der Riß
Orbitalshaker SO3 Stuart Scientific, Stone, United Kingdom Photometer Microplatereader MRX Dynatech, Denkendorf
pH-Meter: pH 320 WTW, Weilheim
Pipetten (0,5–10 µl, 10–100 µl, 100–1000 µl, 1000–5000 µl)
Eppendorf, Hamburg
Sterilbank (TL-2248) Heraeus Laminar Air Heraeus, Waltham, USA
Vortex: Reax top Heidolph, Schwabach
Waage Scaltec OMNILAB, Gehrden
Waschpipette Eppendorf, Hamburg
16 3.1.3. Allgemeine Materialien
Chirurgisches Einmal-Skalpell Größe 10 Braun Aesculap AG, Tuttlingen
Faltenfilter 150 mm Whatman, Dassel
Plastikröhrchen (15 ml und 50 ml) Greiner Bio-One, Frickenhausen Messschieber (Pocket Thickness Gage) Mitutoyo Deutschland GmbH, Neuss Mikrotiterplatte (96-Well) Sarstedt, Nümbrecht
Multiwellplatten (24-, 96-Well) Greiner Bio-One, Frickenhausen Neubauer-Zählkammer VWR International GmbH, Darmstadt Pinzette, chirurgisch und anatomisch Hauptner Instrumente GmbH, Dietlikon,
Schweiz Pipettenspitzen (0,5–10 µl, 10–100 µl,
100–1000 µl, 1000–5000 µl)
Eppendorf, Hamburg
Reaktionsgefäße (1,5 ml) Eppendorf, Hamburg
3.1.4. Zusammensetzung des Puffers
PBS; sterilisiert 8 g/l NaCl, 0,2 g/l KCl, 1,44 g/l NaPO4, 0,2 g/l KH2PO4
in Aqua bidest., pH 7,4
3.1.5. Material für In-vivo-Versuche
Aqua ad injectabilia Braun, Melsungen
Baumwollgaze 20 x 20 cm Lohmann & Rauscher GmbH & Co. KG, Neuwied
Blenderm™ 3M Medica, Neuss
Calcipotriol (hydrate) Cayman Chemical Company, Michigan, USA
Dexamethason acis 8 mg Acis, Grünwald
Fixierpflaster Classic Hansaplast, Beiersdorf, Hamburg
JNJ 39758979 Janssen PRD, USA
Kanülen 26G Henke Sass Wolf, Tuttlingen
Mepyraminmaleat Sigma-Aldrich, Steinheim
Ovalbumin Grade V Sigma-Aldrich, Steinheim Ovalbumin Grade VI Sigma-Aldrich, Steinheim
Peha Haft Color Paul Hartmann AG, Heidenheim
Schermaschine Moser Elektrogeräte, Unterkirnach
17
Serum-Gel-Röhrchen Sarstedt, Nümbrecht
Skalpellklingen Bayha, Tuttlingen
ST1012 H. Stark, Heinrich Heine University
Düsseldorf
Veet®- Enthaarungscreme Reckitt Benckiser Deutschland GmbH, Mannheim
3.1.6. Material für In-vitro-Versuche
CellTiter 96 AQueous One Solution Assay Promega, Madison, USA Fetales Kälberserum (Superior; FKS) Biochrom AG, Berlin
Medium RPMI-1640 Medium + 10 % Fetales
Kälberserum + 1 % Penicillin/Streptomycin Penicillin/Streptomycin (10 mg/ml) Merck Biochrom GmbH, Berlin
ROTI®Cell RPMI-1640 Carl Roth, Karlsruhe
3.1.7. Material für die Proteinextraktion Bovines Serum Albumin
Mörser Pefa-Bloc SC
Pierce™ BCA Protein Assay Kit
Sigma-Aldrich, Steinheim
Haldenwanger GmbH, Waldkraiburg Roche, Mannheim
Thermo Scientific, Illinois, USA ROTI®Cell RPMI-1640 Carl Roth, Karlsruhe
3.1.8. ELISA
Duo Set® Mouse TSLP DuoSet® ELISA Development Systems, R&D Systems, Minneapolis, USA
18 3.1.9. Versuchstiere und Tierhaltung
Für alle Versuche wurden sechs bis acht Wochen alte weibliche Mäuse verwendet.
Balb/c-Mäuse (Wildtyp) wurden von der Firma Charles River (Sulzfeld) bezogen. Die verwendeten H4R-/--Mäuse wurden zur Verfügung gestellt von Janssen Research &
Development, L.L.C., New Jersey, U.S.A. und wurden in der Eigenzucht im Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover vermehrt. Die Tiere stammten aus rückgekreutzten Wildtyp-Mäusen auf Balb/c-Hintergrund und wurden durch Genotypisierung kontrolliert.
Die Mäuse wurden in angereicherten Makrolonkäfigen Typ III gehalten; die Raumtemperatur lag bei 22°C. Es bestand ein Licht-Dunkel-Rhythmus von 12 Stunden. Futter (Altromin 1324, Lage/Lippe) und Wasser standen den Tieren ad libitum zur Verfügung. Die Mäuse wurden je nach Versuchsaufbau in Gruppengrößen von fünf bis sechs Tieren gehalten.
Die Tiere waren zu Beginn des Versuchs klinisch gesund und wurden 14 Tage vor Versuchsbeginn durch regelmäßiges Handling an den Umgang gewöhnt.
19
3.2. Methoden
3.2.1. Versuchsübersicht
Ziel dieser Arbeit war es, ein zusätzliches Modell zur Untersuchung der atopischen Dermatitis zu etablieren und dieses mit dem bereits in der Arbeitsgruppe etablierten OVA- induzierten Mausmodell nach SPERGEL et. al. (1998) zu vergleichen. Dieses AD-Modell zeichnet sich dadurch aus, dass die Mäuse mit Calcipotriol (MC 903), einem Vitamin D-Analogon, topisch behandelt werden. Zunächst wurden Wildtyp-Tiere (Balb/c) mit zwei unterschiedlichen Dosierungen von Calcipotriol behandelt. Danach wurde der Versuch mit Knockout-Tieren (H4R-/-) wiederholt. Im weiteren Verlauf wurde versucht, die Entzündungsreaktion durch Gabe eines Glukokortikoids zu unterdrücken. Um die Rolle des H4R bei atopischer Dermatitis weiter zu untersuchen, wurde zudem ein Versuch durchgeführt, bei dem die Mäuse mit einem H1R- Antagonisten in Kombination mit einem H4R-Antagonist behandelt wurden. Im nächsten Versuch wurde ein inverser H4R-Agonisten verwendet. Mit diesem wurde sowohl eine alleinige Behandlung als auch eine Kombinationsbehandlung mit einem H1R-Antagonist durchgeführt. Bei den Versuchen wurden jeweils die Ohrdicken gemessen sowie die Lymphknotenzellzahl und das Lymphknotengewicht bestimmt.
Zudem wurde Zytokin TSLP in der Ohrhaut bestimmt.
Zusätzlich wurde ein Zellkulturversuch mit murinen Keratinozyten der Zelllinie MSC p5 durchgeführt, um zu prüfen, ob die Zellen unter Calcipotriol-Behandlung TSLP ausschütten.
Außerdem wurde das OVA-Modell verwendet; dabei kam ein H4R-Antagonist zum Einsatz. Als Parameter dienten das Gewicht und die Zellzahl der Lymphknoten.
Zusätzlich wurde das Zytokin TSLP in der Brusthaut bestimmt.
20 3.2.2. Calcipotriol-Modell
In Tabelle 1 ist eine Gesamtübersicht der In-vivo-Versuche zu sehen.
Tabelle 1: Behandlungsübersicht der In-vivo-Versuche mit Calcipotriol-Behandlung
1. Versuch Balb/c-Mäuse
2. Versuch H4R-/--Mäuse
3. Versuch Balb/c-Mäuse
4. Versuch Balb/c-Mäuse
5. Versuch Balb/c-Mäuse Kontrolle Kontrolle
EtOH EtOH EtOH EtOH EtOH
Calcipotriol 1 nmol/20µl
Calcipotriol 1 nmol/20µl Calcipotriol
0,5 nmol/20µl
Calcipotriol 0,5 nmol/20µl
Calcipotriol 0,5 nmol/20µl
Calcipotriol 0,5 nmol/20µl
Calcipotriol 0,5 nmol/20µl Calcipotriol
0,5 nmol/20µl + Dexamethason
Calcipotriol 0,5 nmol/20µl + JNJ 39758979 (täglich)
Dexamethason Calcipotriol 0,5 nmol/20µl + JNJ 39758979 Calcipotriol 0,5 nmol/20µl + JNJ 39758979 + Mepyramin (täglich)
Calcipotriol 0,5 nmol/20µl + ST1012 Calcipotriol 0,5 nmol/20µl + ST1012 + Mepyramin
21
Die Calcipotriol-Behandlung fand nach dem folgenden Schema über 14 Tage statt:
Abbildung 2: Behandlungsschema Calcipotriol-Versuch; kennzeichnet die Behandlungen
Die Ohrdicken wurde mit Hilfe eines Messschiebers vor jeder Behandlung festgestellt.
Die Behandlung beider Ohren erfolgte topisch. Mit einer Pipette wurden dabei 20 µl der jeweiligen Substanz am Ohrrand aufgetragen. Sowohl die Innen- als auch Außenfläche der Ohrmuschel wurden dabei behandelt.
Calcipotriol wurde im ersten und zweiten Versuch in einer Konzentration von 1 nmol/20µl und 0,5 nmol/20µl verwendet. Calcipotriol wurde dabei in 98 % Ethanol (EtOH) gelöst. Die Lösungen wurden vor jeder Behandlung neu angesetzt.
Im dritten Versuch wurde bereits zwei Tage vor der Calcipotriol-Behandlung 1 mg/kg Dexamethason (i.p.) injiziert (Abbildung 3). Die Calcipotriol-Behandlung wurde wie oben beschrieben durchgeführt.
Abbildung 3:Behandlungsschema des dritten Versuchs; kennzeichnen die systemische Behandlung mit Dexamethason oder Aqua ad inj., die Behandlungstage mit Calcipotriol und Dexamethason oder Aqua ad inj.
Im vierten Versuch wurden die Tiere zusätzlich mit H4R-Antagonisten und H1R-Antagonisten behandelt. Auch hier wurde die Behandlung bereits zwei Tage vor der topischen Behandlung mit einem H4R-Antagonisten JNJ 39758979 (20 mg/kg) begonnen (Abbildung 4). Mepyramin fand als H1R-Antagonist (20 mg/kg) Verwendung. Die Injektionen wurden an Tag 0 bis Tag 13 vier Stunden vor und nach der Calcipotriol-Behandlung durchgeführt. An Tag -2 und Tag -1 lagen acht Stunden zwischen den Injektionen.
22
Im fünften Versuch wurden die Mäuse mit dem inversen H4R-Agonisten ST1012 behandelt; dabei wurden unterschiedliche Konzentrationen getestet. Außerdem wurde eine Kombination von ST1012 und Mepyramin (20 mg/kg) untersucht, welches subcutan verabreicht wurde (Abbildung 5). ST1012 wurde in 10 % Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst.
23
Abbildung 4: Behandlungsschema Versuch 4; linke Spalte: Pfeile kennzeichnen die Calcipotriol-Behandlung; rechte Spalte: Pfeile kennzeichnen die Injektionen
24
Abbildung 5: Behandlungsschema Versuch 5; linke Spalte: Pfeile kennzeichnen die Calcipotriol-Behandlung; rechte Spalte: Pfeile kennzeichnen die Injektionen
25 3.2.3. Zellkulturversuche mit Calcipotriol
Um die Wirkung von Calcipotriol auf Keratinozyten zu untersuchen, wurden Zellen der murinen Zelllinie MSC p5 verwendet. In 24-Multiwellplatten wurden je 40.000 Zellen pro Well ausgesät und mit Calcipotriol in verschiedenen Konzentrationen (Kontrolle, EtOH, 10-5, 10-6, 10-7, 10-8 mol/l) behandelt. Mit je vier Wells wurden dabei identisch verfahren. Überstände wurden 24 und 48 Stunden nach der Behandlung gewonnen.
In den Überständen wurde TSLP gemessen (ELISA). Außerdem wurde ein Zellvitalitätstest (CellTiter 96 AQueous One Solution Assay) durchgeführt.
3.2.4. Ovalbumin-Modell
Der Ovalbumin-Versuch wurde über 92 Tage durchgeführt. Zunächst begann die epikutane Sensibilisierung mit Ovalbumin (OVA), die über drei Sensibilisierungswochen andauerte. Darauf folgten zwei Wochen Provokationsphase, die an Tag 63 und Tag 84 begannen. Zwischen den einzelnen Phasen lagen 14 Tage ohne Behandlung (in Anlehnung an SPERGEL et al. 1998, ROSSBACH et al. 2017 und KÖCHLING 2015).
Abbildung 10: Behandlungsschema des OVA-Modells
An Tag 0 wurden die Tiere mit Veet®-Enthaarungscreme im Brustbereich enthaart.
Nach 4 Stunden wurde den Mäusen ein Patch (3-lagige Baumwollgaze, 1,5 x 1,5 cm) mit OVA Grade V (100 µg/100µl PBS) aufgelegt. Das Patch wurde durch eine selbsthaftende Bandage (Peha Haft Color®) fixiert. Um das Verrutschen zu vermeiden, wurde diese durch chirurgisches Klebeband (Blenderm™) sowie zusätzlich mit einem Streifen Fixerpflaster (Hansaplast Classic®) fixiert. An Tag 3 wurde der Verband
26
erneuert und ein neues Patch mit OVA Grade V aufgelegt. An Tag 7 wurde der Verband entfernt; darauf folgten 14 Tage ohne Behandlung. Die zwei darauffolgenden Sensibilisierungswochen verliefen identisch. Der korrekte Sitz des Verbandes wurde zweimal täglich kontrolliert. In der ersten Provokationswoche wurde das Patch mit OVA Grade VI (100 µg/100µl PBS) versetzt. An Tag 66 wurde das Patch erneuert. Die zweite Provokationswoche verlief identisch (Tabelle 2). Kontrolltiere erhielten ein Patch mit 100 µl PBS. Die Mäuse wurden in beiden Provokationswochen entweder mit Aqua ad inj. oder JNJ 39758979 (20 mg/kg) zweimal täglich behandelt (i.p.).
Tabelle 2: Gruppen- und Behandlungsübersicht des OVA-Versuchs
Gruppe Stamm Behandlung topisch Medikament
1 H4R-/- Kontrolle Aqua ad inj.
2 H4R-/- PBS Aqua ad inj.
3 H4R-/- OVA Aqua ad inj.
4 H4R-/- OVA JNJ 39758979 (20 mg/kg 2 x täglich)
5 Balb/c Kontrolle Aqua ad inj.
6 Balb/c PBS Aqua ad inj.
7 Balb/c OVA Aqua ad inj.
8 Balb/c OVA JNJ 39758979 (20 mg/kg 2 x täglich)
3.2.5. Untersuchte Parameter
Hautläsionen
Die auftretenden Hautläsionen wurden beschrieben und fotografisch festgehalten. Die Bestimmung der Ohrdicken erfolgte mittels Messschieber.
Lymphknoten
Bei den Calcipotriol-Versuchen wurden die regionären Lnn. cervicales (bilateral) freipräpariert und gewogen. Anschließend wurden die einzelnen Lymphknoten in 1 ml sterilem PBS homogenisiert. Um die Zellzahl zu bestimmen, wurden 10 µl
27
Zellsuspension mit 90 µl Trypanblau angefärbt. Diese Suspension wurde in eine Neubauer-Zählkammer gegeben und unter dem Invertmikroskop ausgewertet. Beim OVA-Modell wurden die Lnn. axillares nach gleichem Prozedere untersucht.
Histologie
Eine histologische Untersuchung der Haut wurde durchgeführt, um pathophysiologische Merkmale einer atopischen Dermatitis nachzuweisen zu können.
In den Calcipotriol-Versuchen wurde der zentrale Teil der Ohrmuschel verwendet. Im OVA-Modell wurde ein Teil der Brusthaut untersucht. Die Bearbeitung und HE-Färbung sowie die Auswertung erfolgte durch das Institut für Pathologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover.
TSLP-Bestimmung in Hauthomogenisaten und Zellkulturüberstände (ELISA)
Für den TSLP Nachweis in Ohr- und Brusthaut wurden die bei -196°C gelagerten Proben mithilfe eines Mörsers zu einer feinen Substanz verarbeitet. Daraufhin wurde die Masse in ein 1,5 ml Probengefäß überführt. 200 µl RPMI-Medium und 10 µl Pefa Bloc wurden hinzugegeben. Nach einer Inkubationszeit von 2 Stunden auf Eis wurden die Proben zentrifugiert. Der Überstand wurde bei –20°C gelagert (BÄUMER et al.
2005). Zur Proteinbestimmung wurde ein Pierce™ BCA Protein Assay Kit nach Herstellerangaben verwendet. Alle Proben wurden auf den gleichen Proteinwert eingestellt.
Die Durchführung des ELISA erfolgte laut Herstellerangaben. Durch Vorversuche wurden die Hauthomogenisate, insbesondere Calcipotriol-behandelter Gruppen, vorverdünnt. Dies wurde bei der weiterführenden Auswertung berücksichtigt.
28 3.2.6. Statistische Auswertung
Die statistische Auswertung der Daten erfolgte mit dem Programm GraphPadPrism (Version 8.0.1, GraphPad Software, Inc.). Für die Auswertung wurden die behandelten Gruppen jeweils mit der Ethanol-behandelten Gruppe verglichen. Dazu wurde der Kruskal-Wallis-Test verwendet und die Irrtumswahrscheinlichkeiten von 5 %, 1 % und 0,1 % bestimmt. Wurden bei Parametern verschiedene Zeitpunkte untersucht, fand die zwei-faktorielle ANOVA-Analyse Verwendung.
29
4. Ergebnisse 4.1. OVA-Modell
Der OVA-Versuch erfolgte an zwei Mäusestämmen (Wildtyp Balb/c und Knockout H4R-/-). In diesem Versuchsansatz gab es vier Gruppen je Genotyp:
- unbehandelte Gruppe - PBS + Aqua ad inj.
- OVA + Aqua ad inj.
- OVA + JNJ 39758979 (20 mg/kg)
Als Parameter dienten: Lymphknotengewicht und Zellzahl der Lnn. axillares, die TSLP- Konzentration in der Brusthaut sowie die histologische Auswertung der Brusthaut. Es gab keine auffälligen Hautveränderungen. Daraufhin wurde auf ein Scoring verzichtet.
Bereits bei den Tieren, die mit dem Vehikel (PBS) behandelt wurden, gab es Zunahmen des Lymphknotengewichts und der -zellzahl, die nicht signifikant gegenüber den anderen Behandlungsgruppen sind.
Die Auswertung der Lymphknotengewichte zeigt im Vergleich zur unbehandelten Gruppe eine signifikante Zunahme bei den H4R-/--Tieren, die einer Behandlung mit PBS unterzogen wurden (Abbildung 6). Es gibt keine signifikanten Unterschiede bei beiden Genotypen im Lymphknotengewicht der Behandlungsgruppen weder im Vergleich PBS und OVA noch im Vergleich OVA und der OVA und JNJ 39758979 behandelten Gruppe.
30
Abbildung 6: Lymphknotengewicht (mg); von unbehandelten Tieren (K), von Tiere mit PBS-Patch (PBS), von Tieren mit OVA-Patch (OVA) und von Tieren mit OVA-Patch und JNJ 39758979 Behandlung (20 mg/kg) (OVA + JNJ); n=5/6; Angabe des Medians mit 95 % Quartil sowie der Einzelwerte;
* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001, ns nicht signifikant
Auch die Zellzahl der Lymphknoten zeigt eine signifikante Zunahme zwischen der unbehandelten Kontrollgruppe und der PBS behandelten Gruppe, jedoch nur bei den Knockout-Tieren (Abbildung 7). Es gibt keinen abnehmenden Trend zwischen der OVA-behandelten Gruppe und der OVA und JNJ 39758979 behandelten Gruppe bei beiden Genotypen (Abbildung 7).
Abbildung 7: Lymphknotenzellzahl; von unbehandelten Tieren (K), von Tiere mit PBS-Patch (PBS), von Tieren mit OVA-Patch (OVA) und von Tieren mit OVA-Patch und JNJ 39758979 Behandlung (20 mg/kg) (OVA + JNJ); n=5/6; Angabe des Medians mit 95 % Quartil sowie der Einzelwerte;
* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001, ns nicht signifikant
H4R-/--Mäuse Balb/c-Mäuse
H4R-/--Mäuse Balb/c-Mäuse
31 4.1.1. Histologische Auswertung
Bei der histologischen Auswertung waren in den Behandlungsgruppen (auch in der Vehikelgruppe) einzelne Lymphozyten, Makrophagen und Neutrophile zu sehen.
Dieses Bild zeichnete sich bei beiden Genotypen ab.
4.1.2. TSLP-Konzentration
TSLP konnte in den Homogenisaten der Brusthaut nicht nachgewiesen werden.
4.2. Calcipotriol-Modell
Das Calcipotriol-Modell wurde in der Arbeitsgruppe etabliert. Es wurden verschiedene Versuche durchgeführt:
1. Versuch: Calcipotriol bei Wildtyp-Mäusen 2. Versuch: Calcipotriol bei Knockout-Mäusen
3. Versuch: Calcipotriol + Glukokortikoid bei Wildtyp-Mäuse
4. Versuch: Calcipotriol + H1R-Antagonist und H4R-Antagonist bei Wildtyp-Mäusen 5. Versuch: Calcipotriol + inverser H4R-Antagonisten und H1R-Antagonist bei Wildtyp-Mäusen
Folgende Parameter wurden zur Auswertung der Versuche herangezogen:
Ohrdickenmessung, Lymphknotenzellzahl und Lymphknotengewicht, Zytokinkonzentration von TSLP in Ohrhomogenisaten und histologische Beurteilung der Ohrhaut.
32
4.2.1. Calcipotriolbehandlung bei Balb/c-Mäusen Bei diesem Versuch gab es vier Behandlungsgruppen:
- unbehandelte Kontrolle
- Vehikel-Kontrolle (EtOH-behandelte Gruppe) - Gruppe mit 1 nmol/Ohr Calcipotriol behandelt - Gruppe mit 0,5 nmol/Ohr Calcipotriol behandelt
Am Tag nach der letzten Behandlung können an den behandelten Tieren makroskopisch pathologische Veränderungen wie Erosionen, Erytheme und Schwellung der Ohren festgestellt werden (Abbildung 8). Die Tiere der unbehandelten Gruppe oder der EtOH-behandelten Gruppe zeigen keine makroskopischen Auffälligkeiten (Abbildung 9).
Die Ähnlichkeiten der Vehikel-Kontrolle und der unbehandelten Kontrolle wird auch in der Ohrdickenmessung bestätigt (siehe Tabelle 3). Aus Gründen der Übersichtlichkeit wird im Folgenden (Abbildung 10) nur die Ohrdicke der Vehikel-Kontrolle (EtOH- behandelt, bereits Tabelle 3 gezeigt) dargestellt. Abbildung 10 zeigt den zeitlichen Verlauf der Ohrdickenzunahme der behandelten Gruppen. Die Ohrdicke ist bei der mit Calcipotriol (MC 903) behandelten Gruppe (1 nmol/Ohr) am letzten Versuchstag mehr als doppelt so dick wie bei der Ethanol-behandelten Gruppe. Auch die Behandlung mit der niedrigeren Calcipotriol-Konzentration (0,5 nmol/Ohr) führte zu einer signifikanten Ohrdickenzunahme im Vergleich zur Ethanol-behandelten Gruppe.
33
Abbildung 8: Ohren, die mit 1 nmol/20µl MC 903 behandelt wurden; a Ohrdickenzunahme; b Erythem und Erosion
Abbildung 9: Ohr, a unbehandelter Gruppe, b mit Ethanol behandeltes Ohr
Tabelle 3: Ohrdicken (µm) von Balb/c-Mäusen unbehandelt und mit Ethanol-behandelt; Mittelwert ± Standardabweichung; n=4, basierend auf 8 Ohrdickenmessungen an je 4 Mäusen pro Gruppe
Behandlungstag 0 2 5 7 9 12 14
Unbehandelt 219 ± 14 230 ± 12 221 ± 12 213 ± 10 210 ± 12 211 ± 11 225 ± 16 EtOH 206 ± 12 218 ± 16 216 ± 16 216 ± 10 218 ± 17 216 ± 15 231 ± 15
a b
a b
34
Abbildung 10: Ohrdicke (µm) von Mäusen mit Ethanol (EtOH) behandelt, mit 1 nmol/Ohr Calcipotriol (MC 903) und 0,5 nmol/Ohr behandelt; n=4, basierend auf 8 Ohrdickenmessungen an je 4 Mäusen pro Gruppe; * p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001
Abbildung 11 veranschaulicht das Gewicht der Lnn. cervicales der unterschiedlichen Behandlungsgruppen. Dabei zeigte die mit der hohen Konzentration von Calcipotriol (1 nmol/Ohr) behandelte Gruppe eine signifikante Zunahme im Vergleich zur Vehikel-Gruppe. Dieses zeichnet sich auch in der Auswertung der Lymphknotenzellzahl ab (Abbildung 12). Auch die niedrige Dosierung von Calcipotriol (0,5 nmol/Ohr) führt zu einer signifikanten Zunahme der Lymphknotenparameter (Abbildung 11, Abbildung 12).
35
Abbildung 11: Lymphknotengewicht (mg) von Mäusen unbehandelt (K), mit Ethanol (EtOH) behandelt, mit 1 nmol/Ohr Calcipotriol (MC 903) und 0,5 nmol/Ohr behandelt; n=4, basierend auf 8 Lymphknoten von je 4 Mäusen pro Gruppe; Angabe des Medians mit 95 % Quartil sowie der Einzelwerte;
* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001
Abbildung 12: Lymphknotenzellzahl von Mäusen unbehandelt (K), mit Ethanol (EtOH) behandelt, mit 1 nmol/Ohr Calcipotriol (MC 903) und 0,5 nmol/Ohr behandelt; n=4, basierend auf 8 Lymphknoten von je 4 Mäusen pro Gruppe; Angabe des Medians mit 95 % Quartil sowie der Einzelwerte;
* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001
36 Histologische Auswertung
Im histologischen Bild sind im Vergleich zu den Kontrollgruppen insbesondere in der Gruppe, die mit 1 nmol/Ohr Calcipotriol behandelt wurde, vermehrt Lymphozyten, Makrophagen und neutrophilen Granulozyten zu sehen (Abbildung 13). Außerdem kann eine Zunahme der Epidermisdicke bei beiden Calcipotriol-behandelten Gruppen detektiert werden (Abbildung 13). Bei der Gruppe, die mit der hohen Konzentration Calcipotriol behandelt wurde, waren zum Teil intrakorneale Pusteln und eine Grenzflächendermatitis zu erkennen.
Abbildung 13: Histologie Ohrmuschel; a) Kontrolle b) Ethanol c) 1nmol/Ohr Calcipotriol d) 0,5nmol/Ohr Calcipotriol; HE-Färbung; 10 x Vergrößerung, Messbalken 100 µm
37 TSLP-Konzentration
Die Konzentration des Zytokins TSLP in den Ohrhomogenisaten ist bei den mit Calcipotriol-behandelten Gruppen im Vergleich zur Vehikel-Gruppe signifikant erhöht (Abbildung 14). Es zeigt sich ein von der Calcipotrioldosis abhängiger TSLP-Konzentrationsunterschied.
Abbildung 14: TSLP-Konzentration in Ohrhomogenisaten von Mäusen unbehandelt (K), mit Ethanol (EtOH) behandelt, mit 1 nmol/Ohr Calcipotriol (MC 903) und 0,5 nmol/Ohr behandelt; n=4, basierend auf 8 Ohren von je 4 Mäusen pro Gruppe; Angabe des Medians mit 95 % Quartil sowie der Einzelwerte;
* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001
38
4.2.2. Calcipotriolbehandlung bei H4R-/--Mäusen
Dieser Versuchsaufbau ist identisch zu dem ersten Versuch. Auch in diesem Versuch gab es vier verschiedene Gruppen:
- unbehandelte Kontrolle
- Vehikel-Kontrolle (EtOH-behandelte Gruppe) - Gruppe mit 1 nmol/Ohr Calcipotriol behandelt - Gruppe die mit 0,5 nmol/Ohr Calcipotriol behandelt
In diesem Versuch wurden H4R-/--Knockout-Mäuse verwendet. Am letzten Versuchstag konnten auch bei diesen Tieren makroskopische Veränderungen, wie beispielweise Erosionen, Erythem und Hyperämie (Abbildung 15) detektiert werden.
Abbildung 15: a Maus mit 1nmol/Ohr Calcipotriol behandelt, zeigt Hyperämie im Vergleich dazu b Ethanol-behandeltes Tier
Tabelle 4 zeigt, dass Vehikel-behandelte Tiere keine Ohrdickenzunahme haben im Vergleich zu unbehandelten Tieren. Aus Gründen der Übersichtlichkeit wird in Abbildung 16 daher nicht die Ohrendicke der unbehandelten Kontrollgruppe gezeigt.
Tabelle 4: Ohrdicken (µm) von unbehandelten H4R-/-- Mäusen (K), und mit Ethanol-behandelten (EtOH);
Mittelwert ± Standardabweichung; n=4/5, basierend auf 10 Ohrdickenmessungen an 4/5 Mäusen je Gruppe
Behandlungstag 0 2 5 7 9 12 14
unbehandelt 228 ± 20 240 ± 23 246 ± 18 251 ± 15 252 ± 12 238 ± 16 226 ± 15
EtOH 235 ± 19 236 ± 22 237 ± 18 237 ± 15 237 ± 20 236 ± 11 235 ± 22
a b
39
Auch in diesem Versuch zeichnet sich eine signifikante Ohrdickenzunahmen bei Calcipotriol-behandelten Tieren (Abbildung 16) ab. Es ist auch eine signifikante Zunahme zwischen den dosisabhängigen Calcipotriol-Behandlungen auszumachen.
Im Vergleich zu Abbildung 10 kann bei den Knockout-Mäusen ein tendenziell höherer Anstieg der Ohrdicken ausgemacht werden. An Tag 0 wurden Ohrdicken von etwa 230 µm gemessen und stiegen durch die Behandlung mit Calcipotriol 1 nmol/Ohr bis etwa 550 µm an (Abbildung 16). Im Gegensatz dazu war bei den Wildtyp-Mäusen nach beginnenden Messungen von 210 µm am letzten Versuchstag Ohrdicken von etwa 430 µm festzustellen (Abbildung 10).
Abbildung 16: Ohrdicke (µm) von Mäusen mit Ethanol (EtOH) behandelt, mit 1 nmol/Ohr Calcipotriol (MC 903) und 0,5 nmol/Ohr behandelt; n=4/5, basierend auf 8/10 Ohrdickenmessungen an je 4/5 Mäusen pro Gruppe; * p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001
Im Vergleich zur Ethanol-behandelten Gruppe waren signifikante Zunahmen sowohl bei dem Gewicht als auch bei der Zellzahl der Lymphknoten (Lnn. cervicales) festzustellen (Abbildung 17 und Abbildung 18).
40
Abbildung 17: Lymphknotengewicht (mg) von Mäusen unbehandelt (K), mit Ethanol (EtOH) behandelt, mit 1 nmol/Ohr Calcipotriol (MC 903) und 0,5 nmol/Ohr behandelt; n=4/5, basierend auf 8/10 Lymphknoten von je 4/5 Mäusen pro Gruppe; Angabe des Medians mit 95 % Quartil sowie der Einzelwerte; * p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001
Abbildung 18: Lymphknotenzellzahl von Mäusen unbehandelt (K), mit Ethanol (EtOH) behandelt, mit 1 nmol/Ohr Calcipotriol (MC 903) und 0,5 nmol/Ohr behandelt; n=4/5, basierend auf 8/10 Lymphknoten von je 4/5 Mäusen pro Gruppe; Angabe des Medians mit 95 % Quartil sowie der Einzelwerte;
* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001
41 Histologische Auswertung
Bei der histologischen Auswertung (Abbildung 19) zeigt sich eine Epidermisdickenzunahme bei den Calcipotriol-behandelten Gruppen (0,5 nmol/Ohr und 1 nmol/Ohr Calcipotriol). Zudem konnte bei den Calcipotriol-behandelten Gruppen intrakorneale Pusteln festgestellt werden. Wie bei dem ersten Versuch mit Wildtyp- Tieren gab es hier eine Zunahme der Zahl von Lymphozyten, Makrophagen und neutrophilen Granulozyten im Vergleich zu den Kontrollgruppen. Verglichen mit den Wildtyp-Tieren nahm die Epidermisdicke mehr zu und die Entzündungsinfiltrate bei den Knockout-Tieren waren deutlicher ausgeprägt.
Abbildung 19: Histologie Ohrmuschel; a) Kontrolle; b) Ethanol; c) 1 nmol/Ohr Calcipotriol, d) 0,5 nmol/Ohr Calcipotriol; HE-Färbung; 10 x Vergrößerung, Messbalken 100 µm
42 TSLP-Konzentration
Die Konzentration des Zytokins TSLP in den Ohrhomogenisaten ist bei den mit Calcipotriol-behandelten Gruppen im Vergleich zur Vehikelgruppe (Ethanol) signifikant erhöht. Auch bei niedrig dosierten Calcipotriolbehandlungen (0,5 nmol/Ohr) ist eine signifikante Zunahme der TSLP-Konzentration auszumachen (Abbildung 20).
Abbildung 20: TSLP-Konzentration (ng/ml) in den Ohrhomogenisaten von Mäusen unbehandelt (K), mit Ethanol (EtOH) behandelt, mit 1 nmol/Ohr Calcipotriol (MC 903) und 0,5 nmol/Ohr behandelt; n=4/5, basierend auf 8/10 Ohren von je 4/5 Mäusen pro Gruppe; Angabe des Medians mit 95 % Quartil sowie der Einzelwerte; * p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001
Des Weiteren sind in diesem Versuch die TSLP-Gehalte höher als bei dem Versuch mit den Wildtyp-Tieren. Bei den Knockout-Tieren liegen die Werte etwa bei 15 ng/ml bei einer Behandlung von 1 nmol/Ohr Calcipotriol und bei Wildtyp-Tieren etwa bei 11 ng/ml bei gleicher Behandlung.
43
4.2.3. Effekt von Dexamethason auf induzierte Entzündungsreaktionen In diesem Experiment gab es vier Behandlungsgruppen mit je sechs Tieren:
- Vehikel-Kontrolle (Ethanol) + Aqua ad inj.
- Calcipotriol 0,5 nmol/Ohr + Aqua ad inj.
- Calcipotriol 0,5 nmol/Ohr + Dexamethason (1 mg/kg) - Vehikel-Kontrolle + Dexamethason (1 mg/kg)
Makroskopisch konnten am letzten Versuchstag Unterschiede in der Rötung der Ohren festgestellt werden. In Abbildung 21 a ist das Ohr eines Kontrolltieres abgebildet und Abbildung 21 b zeigt ein mit Calcipotriol behandeltes Ohr. Ein mit Dexamethason behandeltes Ohr wird in Abbildung 21 c dargestellt. Durch die Dexamethason Gabe zeigt sich eine Abblassung der Haut.
Abbildung 21: Exemplarische Darstellung der behandelten Ohren; a Vehikel-Kontrolle, b Calcipotriol-Behandlung, Rötung der Ohrmuschel, c Dexamethason-Behandlung
Es besteht eine signifikante Zunahme der Ohrdicken zwischen den Calcipotriol behandelten Ohren und der Vehikel behandelten Ohren. Die Ohrdicke ist bei der Gruppe, die mit Calcipotriol und Dexamethason behandelt wurde, tendenziell niedriger als bei alleiniger Calcipotriol-Gabe (Abbildung 22). Außerdem war im Vergleich zur Kontrollgruppe eine geringere Ohrdicke bei der Gruppe, die nur mit Dexamethason behandelt wurde, festzustellen.
Bei dem Lymphknotengewicht und der Zellzahl konnte eine signifikante Zunahme zwischen der Calcipotriol behandelten Gruppe und der Calcipotriol und Dexamethason behandelten Gruppe festgestellt werden (Abbildung 23 und Abbildung 24).
a b c
44
Abbildung 22: : Ohrdicke (µm) von Mäusen mit 0,5 nmol/Ohr Calcipotriol (MC 903) behandelt, mit 0,5 nmol/Ohr Calcipotriol (MC 903) und 1 mg/kg Dexamethason behandelt, mit Ethanol behandelt (EtOH) und mit Ethanol (EtOH) und 1 mg/kg Dexamethason behandelt; n=6, basierend auf 12 Ohrdickenmessungen von je 6 Mäusen pro Gruppe; * p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001
Abbildung 23: Lymphknotengewicht (mg) von Mäusen mit Ethanol (EtOH) behandelt, mit 0,5 nmol/Ohr Calcipotriol (MC 903) behandelt, mit 0,5 nmol/Ohr Calcipotriol mit 1 mg/kg Dexamethason behandelt und mit Ethanol (EtOH) und 1 mg/kg Dexamethason behandelt; n=6, basierend auf 12 Lymphknoten von je 6 Mäusen pro Gruppe; Angabe des Medians mit 95 % Quartil sowie der Einzelwerte;
* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001
45
Abbildung 24: Lymphknotenzellzahl von Mäusen mit Ethanol (EtOH) behandelt, mit 0,5 nmol/Ohr Calcipotriol (MC 903) behandelt, mit 0,5 nmol/Ohr Calcipotriol (MC 903) und mit 1 mg/kg Dexamethason behandelt und mit Ethanol (EtOH) und 1 mg/kg Dexamethason behandelt; n=6, basierend auf 12 Lymphknoten von je 6 Mäusen pro Gruppe; Angabe des Medians mit 95 % Quartil sowie der Einzelwerte; * p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001
46 Histologische Auswertung
Abbildung 25 zeigt beispielhaft die Ohrhaut der verschiedenen Behandlungsgruppen.
Auffällig ist im Vergleich, dass vermehrt Lymphozyten, Makrophagen und Neutrophile in der Calcipotriol-behandelten Gruppe (Abbildung 25 b) festgestellt worden sind.
Auch die mit Calcipotriol und Dexamethason behandelte Gruppe zeigt einzelne Lymphozyten und Makrophagen (Abbildung 25 c) im Vergleich zur Ethanol-behandelten Gruppe (Abbildung 25 a) und alleiniger Dexamethason- Behandlung (Abbildung 25 d).
Abbildung 25: Histologie Ohrmuschel; a) Ethanol; b) 0,5 nmol/Ohr Calcipotriol; c) 0,5 nmol/Ohr Calcipotriol und Dexamethason, d) Dexamethason; HE-Färbung; 10 x Vergrößerung, Messbalken 100 µm
47 TSLP-Konzentration
Die Konzentration von TSLP ist in beiden mit Calcipotriol behandelten Gruppen signifikant erhöht im Vergleich zur Kontrollgruppe (Abbildung 26).
Abbildung 26: TSLP-Konzentration (ng/ml) in den Ohrhomogenisaten von Mäusen mit Ethanol (EtOH) behandelt, mit 0,5 nmol/20µl Calcipotriol (MC 903) behandelt, mit 0,5 nmol/20µl Calcipotriol und 1 mg/kg Dexamethason behandelt und mit Ethanol (EtOH) und 1 mg/kg Dexamethason behandelt; n=6, basierend auf 12 Ohren von je 6 Mäusen pro Gruppe; Angabe des Medians mit 95 % Quartil sowie der Einzelwerte; * p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001