3. Material und Methoden
3.2. Methoden
3.2.5. Untersuchte Parameter
Hautläsionen
Die auftretenden Hautläsionen wurden beschrieben und fotografisch festgehalten. Die Bestimmung der Ohrdicken erfolgte mittels Messschieber.
Lymphknoten
Bei den Calcipotriol-Versuchen wurden die regionären Lnn. cervicales (bilateral) freipräpariert und gewogen. Anschließend wurden die einzelnen Lymphknoten in 1 ml sterilem PBS homogenisiert. Um die Zellzahl zu bestimmen, wurden 10 µl
27
Zellsuspension mit 90 µl Trypanblau angefärbt. Diese Suspension wurde in eine Neubauer-Zählkammer gegeben und unter dem Invertmikroskop ausgewertet. Beim OVA-Modell wurden die Lnn. axillares nach gleichem Prozedere untersucht.
Histologie
Eine histologische Untersuchung der Haut wurde durchgeführt, um pathophysiologische Merkmale einer atopischen Dermatitis nachzuweisen zu können.
In den Calcipotriol-Versuchen wurde der zentrale Teil der Ohrmuschel verwendet. Im OVA-Modell wurde ein Teil der Brusthaut untersucht. Die Bearbeitung und HE-Färbung sowie die Auswertung erfolgte durch das Institut für Pathologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover.
TSLP-Bestimmung in Hauthomogenisaten und Zellkulturüberstände (ELISA)
Für den TSLP Nachweis in Ohr- und Brusthaut wurden die bei -196°C gelagerten Proben mithilfe eines Mörsers zu einer feinen Substanz verarbeitet. Daraufhin wurde die Masse in ein 1,5 ml Probengefäß überführt. 200 µl RPMI-Medium und 10 µl Pefa Bloc wurden hinzugegeben. Nach einer Inkubationszeit von 2 Stunden auf Eis wurden die Proben zentrifugiert. Der Überstand wurde bei –20°C gelagert (BÄUMER et al.
2005). Zur Proteinbestimmung wurde ein Pierce™ BCA Protein Assay Kit nach Herstellerangaben verwendet. Alle Proben wurden auf den gleichen Proteinwert eingestellt.
Die Durchführung des ELISA erfolgte laut Herstellerangaben. Durch Vorversuche wurden die Hauthomogenisate, insbesondere Calcipotriol-behandelter Gruppen, vorverdünnt. Dies wurde bei der weiterführenden Auswertung berücksichtigt.
28 3.2.6. Statistische Auswertung
Die statistische Auswertung der Daten erfolgte mit dem Programm GraphPadPrism (Version 8.0.1, GraphPad Software, Inc.). Für die Auswertung wurden die behandelten Gruppen jeweils mit der Ethanol-behandelten Gruppe verglichen. Dazu wurde der Kruskal-Wallis-Test verwendet und die Irrtumswahrscheinlichkeiten von 5 %, 1 % und 0,1 % bestimmt. Wurden bei Parametern verschiedene Zeitpunkte untersucht, fand die zwei-faktorielle ANOVA-Analyse Verwendung.
29
4. Ergebnisse 4.1. OVA-Modell
Der OVA-Versuch erfolgte an zwei Mäusestämmen (Wildtyp Balb/c und Knockout H4R-/-). In diesem Versuchsansatz gab es vier Gruppen je Genotyp:
- unbehandelte Gruppe - PBS + Aqua ad inj.
- OVA + Aqua ad inj.
- OVA + JNJ 39758979 (20 mg/kg)
Als Parameter dienten: Lymphknotengewicht und Zellzahl der Lnn. axillares, die TSLP-Konzentration in der Brusthaut sowie die histologische Auswertung der Brusthaut. Es gab keine auffälligen Hautveränderungen. Daraufhin wurde auf ein Scoring verzichtet.
Bereits bei den Tieren, die mit dem Vehikel (PBS) behandelt wurden, gab es Zunahmen des Lymphknotengewichts und der -zellzahl, die nicht signifikant gegenüber den anderen Behandlungsgruppen sind.
Die Auswertung der Lymphknotengewichte zeigt im Vergleich zur unbehandelten Gruppe eine signifikante Zunahme bei den H4R-/--Tieren, die einer Behandlung mit PBS unterzogen wurden (Abbildung 6). Es gibt keine signifikanten Unterschiede bei beiden Genotypen im Lymphknotengewicht der Behandlungsgruppen weder im Vergleich PBS und OVA noch im Vergleich OVA und der OVA und JNJ 39758979 behandelten Gruppe.
30
Abbildung 6: Lymphknotengewicht (mg); von unbehandelten Tieren (K), von Tiere mit PBS-Patch (PBS), von Tieren mit OVA-Patch (OVA) und von Tieren mit OVA-Patch und JNJ 39758979 Behandlung (20 mg/kg) (OVA + JNJ); n=5/6; Angabe des Medians mit 95 % Quartil sowie der Einzelwerte;
* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001, ns nicht signifikant
Auch die Zellzahl der Lymphknoten zeigt eine signifikante Zunahme zwischen der unbehandelten Kontrollgruppe und der PBS behandelten Gruppe, jedoch nur bei den Knockout-Tieren (Abbildung 7). Es gibt keinen abnehmenden Trend zwischen der OVA-behandelten Gruppe und der OVA und JNJ 39758979 behandelten Gruppe bei beiden Genotypen (Abbildung 7).
Abbildung 7: Lymphknotenzellzahl; von unbehandelten Tieren (K), von Tiere mit PBS-Patch (PBS), von Tieren mit OVA-Patch (OVA) und von Tieren mit OVA-Patch und JNJ 39758979 Behandlung (20 mg/kg) (OVA + JNJ); n=5/6; Angabe des Medians mit 95 % Quartil sowie der Einzelwerte;
* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001, ns nicht signifikant
H4R-/--Mäuse Balb/c-Mäuse
H4R-/--Mäuse Balb/c-Mäuse
31 4.1.1. Histologische Auswertung
Bei der histologischen Auswertung waren in den Behandlungsgruppen (auch in der Vehikelgruppe) einzelne Lymphozyten, Makrophagen und Neutrophile zu sehen.
Dieses Bild zeichnete sich bei beiden Genotypen ab.
4.1.2. TSLP-Konzentration
TSLP konnte in den Homogenisaten der Brusthaut nicht nachgewiesen werden.
4.2. Calcipotriol-Modell
Das Calcipotriol-Modell wurde in der Arbeitsgruppe etabliert. Es wurden verschiedene Versuche durchgeführt:
1. Versuch: Calcipotriol bei Wildtyp-Mäusen 2. Versuch: Calcipotriol bei Knockout-Mäusen
3. Versuch: Calcipotriol + Glukokortikoid bei Wildtyp-Mäuse
4. Versuch: Calcipotriol + H1R-Antagonist und H4R-Antagonist bei Wildtyp-Mäusen 5. Versuch: Calcipotriol + inverser H4R-Antagonisten und H1R-Antagonist bei Wildtyp-Mäusen
Folgende Parameter wurden zur Auswertung der Versuche herangezogen:
Ohrdickenmessung, Lymphknotenzellzahl und Lymphknotengewicht, Zytokinkonzentration von TSLP in Ohrhomogenisaten und histologische Beurteilung der Ohrhaut.
32
4.2.1. Calcipotriolbehandlung bei Balb/c-Mäusen Bei diesem Versuch gab es vier Behandlungsgruppen:
- unbehandelte Kontrolle
- Vehikel-Kontrolle (EtOH-behandelte Gruppe) - Gruppe mit 1 nmol/Ohr Calcipotriol behandelt - Gruppe mit 0,5 nmol/Ohr Calcipotriol behandelt
Am Tag nach der letzten Behandlung können an den behandelten Tieren makroskopisch pathologische Veränderungen wie Erosionen, Erytheme und Schwellung der Ohren festgestellt werden (Abbildung 8). Die Tiere der unbehandelten Gruppe oder der EtOH-behandelten Gruppe zeigen keine makroskopischen Auffälligkeiten (Abbildung 9).
Die Ähnlichkeiten der Vehikel-Kontrolle und der unbehandelten Kontrolle wird auch in der Ohrdickenmessung bestätigt (siehe Tabelle 3). Aus Gründen der Übersichtlichkeit wird im Folgenden (Abbildung 10) nur die Ohrdicke der Vehikel-Kontrolle (EtOH-behandelt, bereits Tabelle 3 gezeigt) dargestellt. Abbildung 10 zeigt den zeitlichen Verlauf der Ohrdickenzunahme der behandelten Gruppen. Die Ohrdicke ist bei der mit Calcipotriol (MC 903) behandelten Gruppe (1 nmol/Ohr) am letzten Versuchstag mehr als doppelt so dick wie bei der Ethanol-behandelten Gruppe. Auch die Behandlung mit der niedrigeren Calcipotriol-Konzentration (0,5 nmol/Ohr) führte zu einer signifikanten Ohrdickenzunahme im Vergleich zur Ethanol-behandelten Gruppe.
33
Abbildung 8: Ohren, die mit 1 nmol/20µl MC 903 behandelt wurden; a Ohrdickenzunahme; b Erythem und Erosion
Abbildung 9: Ohr, a unbehandelter Gruppe, b mit Ethanol behandeltes Ohr
Tabelle 3: Ohrdicken (µm) von Balb/c-Mäusen unbehandelt und mit Ethanol-behandelt; Mittelwert ± Standardabweichung; n=4, basierend auf 8 Ohrdickenmessungen an je 4 Mäusen pro Gruppe
Behandlungstag 0 2 5 7 9 12 14
Unbehandelt 219 ± 14 230 ± 12 221 ± 12 213 ± 10 210 ± 12 211 ± 11 225 ± 16 EtOH 206 ± 12 218 ± 16 216 ± 16 216 ± 10 218 ± 17 216 ± 15 231 ± 15
a b
a b
34
Abbildung 10: Ohrdicke (µm) von Mäusen mit Ethanol (EtOH) behandelt, mit 1 nmol/Ohr Calcipotriol (MC 903) und 0,5 nmol/Ohr behandelt; n=4, basierend auf 8 Ohrdickenmessungen an je 4 Mäusen pro Gruppe; * p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001
Abbildung 11 veranschaulicht das Gewicht der Lnn. cervicales der unterschiedlichen Behandlungsgruppen. Dabei zeigte die mit der hohen Konzentration von Calcipotriol (1 nmol/Ohr) behandelte Gruppe eine signifikante Zunahme im Vergleich zur Vehikel-Gruppe. Dieses zeichnet sich auch in der Auswertung der Lymphknotenzellzahl ab (Abbildung 12). Auch die niedrige Dosierung von Calcipotriol (0,5 nmol/Ohr) führt zu einer signifikanten Zunahme der Lymphknotenparameter (Abbildung 11, Abbildung 12).
35
Abbildung 11: Lymphknotengewicht (mg) von Mäusen unbehandelt (K), mit Ethanol (EtOH) behandelt, mit 1 nmol/Ohr Calcipotriol (MC 903) und 0,5 nmol/Ohr behandelt; n=4, basierend auf 8 Lymphknoten von je 4 Mäusen pro Gruppe; Angabe des Medians mit 95 % Quartil sowie der Einzelwerte;
* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001
Abbildung 12: Lymphknotenzellzahl von Mäusen unbehandelt (K), mit Ethanol (EtOH) behandelt, mit 1 nmol/Ohr Calcipotriol (MC 903) und 0,5 nmol/Ohr behandelt; n=4, basierend auf 8 Lymphknoten von je 4 Mäusen pro Gruppe; Angabe des Medians mit 95 % Quartil sowie der Einzelwerte;
* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001
36 Histologische Auswertung
Im histologischen Bild sind im Vergleich zu den Kontrollgruppen insbesondere in der Gruppe, die mit 1 nmol/Ohr Calcipotriol behandelt wurde, vermehrt Lymphozyten, Makrophagen und neutrophilen Granulozyten zu sehen (Abbildung 13). Außerdem kann eine Zunahme der Epidermisdicke bei beiden Calcipotriol-behandelten Gruppen detektiert werden (Abbildung 13). Bei der Gruppe, die mit der hohen Konzentration Calcipotriol behandelt wurde, waren zum Teil intrakorneale Pusteln und eine Grenzflächendermatitis zu erkennen.
Abbildung 13: Histologie Ohrmuschel; a) Kontrolle b) Ethanol c) 1nmol/Ohr Calcipotriol d) 0,5nmol/Ohr Calcipotriol; HE-Färbung; 10 x Vergrößerung, Messbalken 100 µm
37 TSLP-Konzentration
Die Konzentration des Zytokins TSLP in den Ohrhomogenisaten ist bei den mit Calcipotriol-behandelten Gruppen im Vergleich zur Vehikel-Gruppe signifikant erhöht (Abbildung 14). Es zeigt sich ein von der Calcipotrioldosis abhängiger TSLP-Konzentrationsunterschied.
Abbildung 14: TSLP-Konzentration in Ohrhomogenisaten von Mäusen unbehandelt (K), mit Ethanol (EtOH) behandelt, mit 1 nmol/Ohr Calcipotriol (MC 903) und 0,5 nmol/Ohr behandelt; n=4, basierend auf 8 Ohren von je 4 Mäusen pro Gruppe; Angabe des Medians mit 95 % Quartil sowie der Einzelwerte;
* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001
38
4.2.2. Calcipotriolbehandlung bei H4R-/--Mäusen
Dieser Versuchsaufbau ist identisch zu dem ersten Versuch. Auch in diesem Versuch gab es vier verschiedene Gruppen:
- unbehandelte Kontrolle
- Vehikel-Kontrolle (EtOH-behandelte Gruppe) - Gruppe mit 1 nmol/Ohr Calcipotriol behandelt - Gruppe die mit 0,5 nmol/Ohr Calcipotriol behandelt
In diesem Versuch wurden H4R-/--Knockout-Mäuse verwendet. Am letzten Versuchstag konnten auch bei diesen Tieren makroskopische Veränderungen, wie beispielweise Erosionen, Erythem und Hyperämie (Abbildung 15) detektiert werden.
Abbildung 15: a Maus mit 1nmol/Ohr Calcipotriol behandelt, zeigt Hyperämie im Vergleich dazu b Ethanol-behandeltes Tier
Tabelle 4 zeigt, dass Vehikel-behandelte Tiere keine Ohrdickenzunahme haben im Vergleich zu unbehandelten Tieren. Aus Gründen der Übersichtlichkeit wird in Abbildung 16 daher nicht die Ohrendicke der unbehandelten Kontrollgruppe gezeigt.
Tabelle 4: Ohrdicken (µm) von unbehandelten H4R-/-- Mäusen (K), und mit Ethanol-behandelten (EtOH);
Mittelwert ± Standardabweichung; n=4/5, basierend auf 10 Ohrdickenmessungen an 4/5 Mäusen je Gruppe
Behandlungstag 0 2 5 7 9 12 14
unbehandelt 228 ± 20 240 ± 23 246 ± 18 251 ± 15 252 ± 12 238 ± 16 226 ± 15
EtOH 235 ± 19 236 ± 22 237 ± 18 237 ± 15 237 ± 20 236 ± 11 235 ± 22
a b
39
Auch in diesem Versuch zeichnet sich eine signifikante Ohrdickenzunahmen bei Calcipotriol-behandelten Tieren (Abbildung 16) ab. Es ist auch eine signifikante Zunahme zwischen den dosisabhängigen Calcipotriol-Behandlungen auszumachen.
Im Vergleich zu Abbildung 10 kann bei den Knockout-Mäusen ein tendenziell höherer Anstieg der Ohrdicken ausgemacht werden. An Tag 0 wurden Ohrdicken von etwa 230 µm gemessen und stiegen durch die Behandlung mit Calcipotriol 1 nmol/Ohr bis etwa 550 µm an (Abbildung 16). Im Gegensatz dazu war bei den Wildtyp-Mäusen nach beginnenden Messungen von 210 µm am letzten Versuchstag Ohrdicken von etwa 430 µm festzustellen (Abbildung 10).
Abbildung 16: Ohrdicke (µm) von Mäusen mit Ethanol (EtOH) behandelt, mit 1 nmol/Ohr Calcipotriol (MC 903) und 0,5 nmol/Ohr behandelt; n=4/5, basierend auf 8/10 Ohrdickenmessungen an je 4/5 Mäusen pro Gruppe; * p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001
Im Vergleich zur Ethanol-behandelten Gruppe waren signifikante Zunahmen sowohl bei dem Gewicht als auch bei der Zellzahl der Lymphknoten (Lnn. cervicales) festzustellen (Abbildung 17 und Abbildung 18).
40
Abbildung 17: Lymphknotengewicht (mg) von Mäusen unbehandelt (K), mit Ethanol (EtOH) behandelt, mit 1 nmol/Ohr Calcipotriol (MC 903) und 0,5 nmol/Ohr behandelt; n=4/5, basierend auf 8/10 Lymphknoten von je 4/5 Mäusen pro Gruppe; Angabe des Medians mit 95 % Quartil sowie der Einzelwerte; * p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001
Abbildung 18: Lymphknotenzellzahl von Mäusen unbehandelt (K), mit Ethanol (EtOH) behandelt, mit 1 nmol/Ohr Calcipotriol (MC 903) und 0,5 nmol/Ohr behandelt; n=4/5, basierend auf 8/10 Lymphknoten von je 4/5 Mäusen pro Gruppe; Angabe des Medians mit 95 % Quartil sowie der Einzelwerte;
* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001
41 Histologische Auswertung
Bei der histologischen Auswertung (Abbildung 19) zeigt sich eine Epidermisdickenzunahme bei den Calcipotriol-behandelten Gruppen (0,5 nmol/Ohr und 1 nmol/Ohr Calcipotriol). Zudem konnte bei den Calcipotriol-behandelten Gruppen intrakorneale Pusteln festgestellt werden. Wie bei dem ersten Versuch mit Wildtyp-Tieren gab es hier eine Zunahme der Zahl von Lymphozyten, Makrophagen und neutrophilen Granulozyten im Vergleich zu den Kontrollgruppen. Verglichen mit den Wildtyp-Tieren nahm die Epidermisdicke mehr zu und die Entzündungsinfiltrate bei den Knockout-Tieren waren deutlicher ausgeprägt.
Abbildung 19: Histologie Ohrmuschel; a) Kontrolle; b) Ethanol; c) 1 nmol/Ohr Calcipotriol, d) 0,5 nmol/Ohr Calcipotriol; HE-Färbung; 10 x Vergrößerung, Messbalken 100 µm
42 TSLP-Konzentration
Die Konzentration des Zytokins TSLP in den Ohrhomogenisaten ist bei den mit Calcipotriol-behandelten Gruppen im Vergleich zur Vehikelgruppe (Ethanol) signifikant erhöht. Auch bei niedrig dosierten Calcipotriolbehandlungen (0,5 nmol/Ohr) ist eine signifikante Zunahme der TSLP-Konzentration auszumachen (Abbildung 20).
Abbildung 20: TSLP-Konzentration (ng/ml) in den Ohrhomogenisaten von Mäusen unbehandelt (K), mit Ethanol (EtOH) behandelt, mit 1 nmol/Ohr Calcipotriol (MC 903) und 0,5 nmol/Ohr behandelt; n=4/5, basierend auf 8/10 Ohren von je 4/5 Mäusen pro Gruppe; Angabe des Medians mit 95 % Quartil sowie der Einzelwerte; * p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001
Des Weiteren sind in diesem Versuch die TSLP-Gehalte höher als bei dem Versuch mit den Wildtyp-Tieren. Bei den Knockout-Tieren liegen die Werte etwa bei 15 ng/ml bei einer Behandlung von 1 nmol/Ohr Calcipotriol und bei Wildtyp-Tieren etwa bei 11 ng/ml bei gleicher Behandlung.
43
4.2.3. Effekt von Dexamethason auf induzierte Entzündungsreaktionen In diesem Experiment gab es vier Behandlungsgruppen mit je sechs Tieren:
- Vehikel-Kontrolle (Ethanol) + Aqua ad inj.
- Calcipotriol 0,5 nmol/Ohr + Aqua ad inj.
- Calcipotriol 0,5 nmol/Ohr + Dexamethason (1 mg/kg) - Vehikel-Kontrolle + Dexamethason (1 mg/kg)
Makroskopisch konnten am letzten Versuchstag Unterschiede in der Rötung der Ohren festgestellt werden. In Abbildung 21 a ist das Ohr eines Kontrolltieres abgebildet und Abbildung 21 b zeigt ein mit Calcipotriol behandeltes Ohr. Ein mit Dexamethason behandeltes Ohr wird in Abbildung 21 c dargestellt. Durch die Dexamethason Gabe zeigt sich eine Abblassung der Haut.
Abbildung 21: Exemplarische Darstellung der behandelten Ohren; a Vehikel-Kontrolle, b Calcipotriol-Behandlung, Rötung der Ohrmuschel, c Dexamethason-Behandlung
Es besteht eine signifikante Zunahme der Ohrdicken zwischen den Calcipotriol behandelten Ohren und der Vehikel behandelten Ohren. Die Ohrdicke ist bei der Gruppe, die mit Calcipotriol und Dexamethason behandelt wurde, tendenziell niedriger als bei alleiniger Calcipotriol-Gabe (Abbildung 22). Außerdem war im Vergleich zur Kontrollgruppe eine geringere Ohrdicke bei der Gruppe, die nur mit Dexamethason behandelt wurde, festzustellen.
Bei dem Lymphknotengewicht und der Zellzahl konnte eine signifikante Zunahme zwischen der Calcipotriol behandelten Gruppe und der Calcipotriol und Dexamethason behandelten Gruppe festgestellt werden (Abbildung 23 und Abbildung 24).
a b c
44
Abbildung 22: : Ohrdicke (µm) von Mäusen mit 0,5 nmol/Ohr Calcipotriol (MC 903) behandelt, mit 0,5 nmol/Ohr Calcipotriol (MC 903) und 1 mg/kg Dexamethason behandelt, mit Ethanol behandelt (EtOH) und mit Ethanol (EtOH) und 1 mg/kg Dexamethason behandelt; n=6, basierend auf 12 Ohrdickenmessungen von je 6 Mäusen pro Gruppe; * p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001
Abbildung 23: Lymphknotengewicht (mg) von Mäusen mit Ethanol (EtOH) behandelt, mit 0,5 nmol/Ohr Calcipotriol (MC 903) behandelt, mit 0,5 nmol/Ohr Calcipotriol mit 1 mg/kg Dexamethason behandelt und mit Ethanol (EtOH) und 1 mg/kg Dexamethason behandelt; n=6, basierend auf 12 Lymphknoten von je 6 Mäusen pro Gruppe; Angabe des Medians mit 95 % Quartil sowie der Einzelwerte;
* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001
45
Abbildung 24: Lymphknotenzellzahl von Mäusen mit Ethanol (EtOH) behandelt, mit 0,5 nmol/Ohr Calcipotriol (MC 903) behandelt, mit 0,5 nmol/Ohr Calcipotriol (MC 903) und mit 1 mg/kg Dexamethason behandelt und mit Ethanol (EtOH) und 1 mg/kg Dexamethason behandelt; n=6, basierend auf 12 Lymphknoten von je 6 Mäusen pro Gruppe; Angabe des Medians mit 95 % Quartil sowie der Einzelwerte; * p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001
46 Histologische Auswertung
Abbildung 25 zeigt beispielhaft die Ohrhaut der verschiedenen Behandlungsgruppen.
Auffällig ist im Vergleich, dass vermehrt Lymphozyten, Makrophagen und Neutrophile in der Calcipotriol-behandelten Gruppe (Abbildung 25 b) festgestellt worden sind.
Auch die mit Calcipotriol und Dexamethason behandelte Gruppe zeigt einzelne Lymphozyten und Makrophagen (Abbildung 25 c) im Vergleich zur Ethanol-behandelten Gruppe (Abbildung 25 a) und alleiniger Dexamethason-Behandlung (Abbildung 25 d).
Abbildung 25: Histologie Ohrmuschel; a) Ethanol; b) 0,5 nmol/Ohr Calcipotriol; c) 0,5 nmol/Ohr Calcipotriol und Dexamethason, d) Dexamethason; HE-Färbung; 10 x Vergrößerung, Messbalken 100 µm
47 TSLP-Konzentration
Die Konzentration von TSLP ist in beiden mit Calcipotriol behandelten Gruppen signifikant erhöht im Vergleich zur Kontrollgruppe (Abbildung 26).
Abbildung 26: TSLP-Konzentration (ng/ml) in den Ohrhomogenisaten von Mäusen mit Ethanol (EtOH) behandelt, mit 0,5 nmol/20µl Calcipotriol (MC 903) behandelt, mit 0,5 nmol/20µl Calcipotriol und 1 mg/kg Dexamethason behandelt und mit Ethanol (EtOH) und 1 mg/kg Dexamethason behandelt; n=6, basierend auf 12 Ohren von je 6 Mäusen pro Gruppe; Angabe des Medians mit 95 % Quartil sowie der Einzelwerte; * p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001
48
4.2.4. Effekt von H1- und H4-Antagonisten auf induzierte Entzündungsreaktionen
In diesem Versuch wurden fünf Gruppen mit je sechs Tieren eingesetzt:
- Vehikel-Kontrolle (Ethanol) + Aqua ad. inj.
- Calcipotriol 0,5 nmol/Ohr + Aqua ad inj.
- Calcipotriol 0,5 nmol/Ohr + JNJ 39758979 (20 mg/kg, 2 x täglich) - Calcipotriol 0,5 nmol/Ohr + JNJ 39758979 (20mg/kg, gleichentags mit
Calcipotriol-Behandlung)
- Calcipotriol 0,5 nmol/Ohr + JNJ 39758979 + Mepyramin (20 mg/kg, 2 x täglich)
Klinisch konnte kein Effekt der Behandlung mit JNJ 39758979 und in Kombination mit Mepyramin festgestellt werden. Im Vergleich zur Vehikelgruppe (Ethanol) hatten alle Tiere gerötete Ohren. Zwischen den unterschiedlichen Behandlungsgruppen konnten keine makroskopischen Unterschiede festgestellt werden (Abbildung 27).
Abbildung 27: Klinisches Bild Ohren; a mit 0,5 nmol/Ohr Calcipotriol (MC 903) behandelt, b mit 0,5 nmol/Ohr Calcipotriol (MC 903) und JNJ 39758979 behandelt, c mit 0,5 nmol/Ohr Calcipotriol (MC 903) und JNJ 39758979 und Mepyramin behandelt; Hyperämie ist bei allen Ohren zu erkennen
Die Ohrdicke ist in Abbildung 28 dargestellt. Es besteht eine signifikante Zunahme der Ohrdicken zwischen der Kontrollgruppe (Ethanol behandelt; Abbildung 28 a) und der Calcipotriol-Gruppe (MC 903 behandelt; Abbildung 28 b). Die signifikanten Zunahmen bestehen auch bei den anderen Behandlungsgruppen, wie mit JNJ 39758979 (täglich) behandelten Tieren, mit JNJ 39758979 gleichtägige Behandlung mit Calcipotriol und der JNJ 39758979 und Mepyramin behandelten Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe (Ethanol behandelt). Aus Gründen der Übersichtlichkeit werden nur diese Signifikanzen angezeigt. Zwischen den
a b c
49
verschiedenen Behandlungsgruppen bestehen keine signifikanten Zu- oder Abnahmen der Ohrdicken.
Die Lymphknotengewichte der Ethanol-behandelten Gruppe und der Gruppe mit Calcipotriol-Behandlung zeigen eine signifikante Zunahme. Zwischen den verschiedenen Behandlungsgruppen gibt es keine signifikanten Abnahmen der Lymphknotengewichte (Abbildung 29). Das spiegelt sich auch in den Zellzahlen wieder (Abbildung 30).
Abbildung 28: Ohrdicken (µm) von Mäusen mit Ethanol (EtOH) behandelt,mit 0,5 nmol/Ohr Calcipotriol (MC 903) behandelt, mit 0,5 nmol/Ohr Calcipotriol (MC 903) und JNJ 39758979 (20 mg/kg) behandelt, mit 0,5 nmol/Ohr Calcipotriol (MC 903) und JNJ 39758979 (gleichzeitig mit MC 903 Behandlung) behandelt, mit 0,5 nmol/Ohr Calcipotriol (MC 903) und JNJ 39758979 (20 mg/kg) und Mepyramin (20 mg/kg) behandelt; n=6, basierend auf 12 Ohrdickenmessungen von je 6 Mäusen pro Gruppe;
* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001
50
Abbildung 29: Lymphknotengewicht (mg) von Mäusen mit Ethanol (EtOH) behandelt (a), mit 0,5 nmol/Ohr Calcipotriol (MC 903) behandelt (b), mit 0,5 nmol/Ohr Calcipotriol (MC 903) und JNJ 39758979 (20 mg/kg) behandelt (c), mit 0,5 nmol/Ohr Calcipotriol (MC 903) und JNJ 39758979 (gleichzeitig mit MC 903 Behandlung) behandelt (d), mit 0,5 nmol/Ohr Calcipotriol (MC 903) und JNJ 39758979 (20mg/kg) und Mepyramin (20 mg/kg) behandelt (e); n=6, basierend auf 12 Lymphknoten von je 6 Mäusen pro Gruppe; Angabe des Medians mit 95 % Quartil sowie der Einzelwerte;
* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001
Abbildung 30:Lymphknotenzellzahlen von Mäusen mit Ethanol (EtOH) behandelt (a), mit 0,5 nmol/Ohr Calcipotriol (MC 903) behandelt (b), mit 0,5 nmol/Ohr Calcipotriol (MC 903) und JNJ 39758979 (20 mg/kg) behandelt (c), mit 0,5 nmol/Ohr Calcipotriol (MC 903) und JNJ 39758979 (gleichzeitig mit MC 903 Behandlung) behandelt (d), mit 0,5 nmol/Ohr Calcipotriol (MC 903) und JNJ 39758979 (20mg/kg) und Mepyramin (20 mg/kg) behandelt (e); n=6, basierend auf 12 Lymphknoten von je 6 Mäusen pro Gruppe; Angabe des Medians mit 95 % Quartil sowie der Einzelwerte;
* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001
51 Histologische Auswertung
Die histologische Auswertung zeigt bei allen Calcipotriol-behandelten Gruppen eine Zunahme der Zahl an Lymphozyten, Makrophagen und Neutrophilen in der Haut (Abbildung 31). Zudem waren bei einigen Behandlungsgruppen intrakorneale Pusteln zu sehen, wie beispielsweise aus der Calcipotriol-behandelten Gruppe, Calcipotriol und JNJ 39758979 und auch Calcipotriol und JNJ 39758979 und Mepyramin behandelten Gruppe. Einzelne Exozytosen waren bei allen Calcipotriol-behandelten Gruppen zu erkennen.
52
Abbildung 31: Histologie Ohrmuschel; a) Ethanol, b) 0,5 nmol/Ohr Calcipotriol, c) 0,5 nmol/Ohr Calcipotriol (MC 903) und JNJ 39758979 (täglich), d) 0,5 nmol/Ohr Calcipotriol (MC 903) und JNJ 39758979 (mit MC 903-Behandlung), e) 0,5 nmol/Ohr Calcipotriol (MC 903) und JNJ 39758979 und Mepyramin (täglich); HE-Färbung; 10 x Vergrößerung, Messbalken 100 µm
53 TSLP-Konzentration
Die bereits bei den Lymphknoten gezeigten Ergebnisse spiegeln sich ebenso in den TSLP-Konzentrationen wieder. Im Vergleich zur Vehikelgruppe (Ethanol) steigt die TSLP-Konzentration signifikant in der Calcipotriol-behandelten Gruppe an (Abbildung 32). Es zeichnet sich jedoch kein Effekt von JNJ 39758979 oder JNJ 39758979 in Kombination mit Mepyramin auf die TSLP-Konzentration in den Ohrhomogenisaten ab (Abbildung 32).
Abbildung 32: : TSLP-Konzentration (ng/ml) in Ohrhomogenisaten von Mäusen mit Ethanol (EtOH) behandelt (a), mit 0,5 nmol/Ohr Calcipotriol (MC 903) behandelt (b), mit 0,5 nmol/Ohr Calcipotriol (MC 903) und JNJ 39758979 (20 mg/kg) behandelt (c), mit 0,5 nmol/Ohr Calcipotriol (MC 903) und JNJ 39758979 (gleichzeitig mit MC 903 Behandlung) behandelt (d), mit 0,5 nmol/Ohr Calcipotriol (MC 903) und JNJ 39758979 (20mg/kg) und Mepyramin (20 mg/kg) behandelt (e); n=6, basierend auf 12 Ohren von je 6 Mäusen pro Gruppe; Angabe des Medians mit 95 % Quartil sowie der Einzelwerte;
* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001
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4.2.5. Effekt von inversen H4R-Agonist und H1R-Antagonist auf induzierte Entzündungsreaktionen
In diesem Experiment wurden die Tiere mit einem inversen H4R-Agonisten ST1012 behandelt. Zusätzlich gab es eine Gruppe, die mit ST1012 und dem H1R-Antagonisten Mepyramin behandelt wurde. Es wurden fünf verschiedene Behandlungsgruppen mit je sechs Tieren aufgestellt:
- Vehikel-Kontrolle (Ethanol behandelt) + Aqua ad inj.
- Calcipotriol 0,5 nmol/Ohr + Aqua ad inj.
- Calcipotriol 0,5 nmol/Ohr + ST1012 (30 mg/kg) - Calcipotriol 0,5 nmol/Ohr + ST1012 (50 mg/kg)
- Calcipotriol 0,5 nmol/Ohr + ST1012 (30 mg/kg) + Mepyramin (20 mg/kg)
Makroskopisch konnte am Tag nach der letzten Behandlung kein Unterschied zwischen den verschiedenen Behandlungsgruppen festgestellt werden. Im Vergleich zur Gruppe, deren Ohren lediglich mit Ethanol behandelt wurden, schienen alle anderen Tiere ähnlich gerötete Ohren zu haben.
Die Ohrdickenmessung zeigte, dass alle Behandlungsgruppen im Vergleich zur Vehikelkontrolle (Ethanol) eine signifikante Ohrdickenzunahme haben (Abbildung 33). Zudem besteht ein signifikante Abnahme der Ohrdicke zwischen der Calcipotriol-behandelten Gruppe und der ST1012 (50 mg/kg)-behandelten Gruppe (Abbildung 33).
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Abbildung 33:Ohrdicke (µm) von Mäusen mit Ethanol behandelt, mit 0,5 nmol/Ohr Calcipotriol (MC 903) behandelt, mit 0,5 nmol/Ohr Calcipotriol (MC 903) und ST1012 (30 mg/kg) behandelt, mit 0,5 nmol/Ohr Calcipotriol und ST1012 (50 mg/kg) behandelt, mit 0,5 nmol/Ohr Calcipotriol (MC 903) und ST1012 (30 mg/kg) und Mepyramin (20 mg/kg) behandelt; n=6, basierend auf 12 Ohrdickenmessungen von je 6 Mäusen pro Gruppe; * p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001
Abbildung 34 zeigt die Lymphknotengewichte. Dabei ist eine signifikante Zunahme zwischen der Ethanol-behandelten Gruppe und der Calcipotriol-behandelten Gruppe festzustellen. Die anderen Behandlungsgruppen zeigen keine signifikanten Gewichtsunterschiede zur Calcipotriol behandelten Gruppe.
Diese Verhältnisse spiegeln sich auch in den Lymphknotenzellzahlen wieder (Abbildung 35). Auch hier besteht eine signifikante Zellzahlzunahme zwischen der Ethanol-behandelten Gruppe und der Calcipotriol-behandelten Gruppe. Die anderen Behandlungsgruppen zeigen keine signifikanten Unterschiede.
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Abbildung 34: Lymphknotengewicht (mg) von Mäusen mit Ethanol behandelt (a), mit 0,5 nmol/Ohr Calcipotriol (MC 903) behandelt (b), mit 0,5 nmol/Ohr Calcipotriol (MC 903) und ST1012 (30 mg/kg) behandelt (c), mit 0,5 nmol/Ohr Calcipotriol und ST1012 (50 mg/kg) behandelt (d), mit 0,5 nmol/Ohr Calcipotriol (MC 903) und ST1012 (30 mg/kg) und Mepyramin (20 mg/kg) behandelt (e); n=6, basierend auf 12 Lymphknoten von je 6 Mäusen pro Gruppe; Angabe des Medians mit 95 % Quartil sowie der Einzelwerte;* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001
Abbildung 35: Lymphknotenzellzahl von Mäusen mit Ethanol behandelt (a), mit 0,5 nmol/Ohr Calcipotriol (MC 903) behandelt (b), mit 0,5 nmol/Ohr Calcipotriol (MC 903) und ST1012 (30 mg/kg) behandelt (c), mit 0,5 nmol/Ohr Calcipotriol und ST1012 (50 mg/kg) behandelt (d), mit 0,5 nmol/Ohr Calcipotriol (MC 903) und ST1012 (30 mg/kg) und Mepyramin (20 mg/kg) behandelt (e); n=6, basierend auf 12 Lymphknoten von je 6 Mäusen pro Gruppe; Angabe des Medians mit 95 % Quartil sowie der Einzelwerte;* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001
57 Histologische Auswertung
In der histologischen Auswertung ist auffällig, dass alle Calcipotriol-behandelten Gruppen einen Anstieg von Lymphozyten, Makrophagen und Neutrophilen im Vergleich zur Ethanol-behandelten Gruppe aufwiesen (Abbildung 36). Weiterhin konnten auch einzelne Apoptosen und Exozytosen bei den Calcipotriol-behandelten Gruppen festgestellt werden.
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Abbildung 36: Histologie Ohrmuschel; a) mit Ethanol behandelten Mäusen, b) mit 0,5 nmol/Ohr Calcipotriol behandelten Mäusen, c) mit 0,5 nmol/Ohr Calcipotriol und ST1012 (30 mg/kg) behandelten Mäusen, d) mit 0,5 nmol/Ohr Calcipotriol und ST1012 (50 mg/kg) behandelten Mäusen, e) mit Calcipotriol und ST1012 (30 mg/kg) und Mepyramin (20 mg/kg) behandelten Mäusen; HE-Färbung;
10 x Vergrößerung, Messbalken 100 µm
59 TSLP-Konzentration
Die TSLP Konzentration in den Ohrhomogenisaten der Calcipotriol-behandelten Gruppe ist signifikant erhöht im Vergleich zur Ethanol-behandelten Gruppe (Abbildung 37). Die anderen Behandlungsgruppen zeigen keine signifikante Abnahme im Vergleich zur Calcipotriol behandelten Gruppe.
Abbildung 37: TSLP-Konzentration in den Ohrhomogenisaten von Mäusen mit Ethanol behandelt (a), mit 0,5 nmol/Ohr Calcipotriol (MC 903) behandelt (b), mit 0,5 nmol/Ohr Calcipotriol (MC 903) und ST1012 (30 mg/kg) behandelt (c), mit 0,5 nmol/Ohr Calcipotriol und ST1012 (50 mg/kg) behandelt (d), mit 0,5 nmol/Ohr Calcipotriol (MC 903) und ST1012 (30 mg/kg) und Mepyramin (20 mg/kg) behandelt (e); n=6, basierend auf 12 Ohren von je 6 Mäusen pro Gruppe; Angabe des Medians mit 95 % Quartil sowie der Einzelwerte;* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001
4.3. Freisetzung von TSLP durch Keratinozyten
Um die In-vivo-Ergebnisse weiter zu analysieren, wurden unterschiedliche Calcipotriol-Konzentrationen auf murine Keratinozyten (MSC p5) gegeben.
Die TSLP-Konzentration wurde 24 Stunden und 48 Stunden nach der Behandlung im Überstand gemessen. Nach 24 Stunden zeigt sich eine signifikante Zunahme der
Die TSLP-Konzentration wurde 24 Stunden und 48 Stunden nach der Behandlung im Überstand gemessen. Nach 24 Stunden zeigt sich eine signifikante Zunahme der