3. Material und Methoden
3.1. Material
3.1.2. Geräte
Autoklav Schlumbohm Medizin- Labor- Technologie
GmbH, Hamburg
Brutschrank Hera Cell 150 Thermo Fisher, Braunschweig
Feinwaage Sartorius Lab Instruments GmbH ET.Co.
KG, Göttingen
Gefrierschrank Bauknecht, Stuttgart
Hybridisierungsinkubator 7601 GFL Gesellschaft für Labortechnik mbH, Burgwedel
Magnetrührgerät MR 3001 k OMNILAB, Gehrden Mikroskop Axiovert 25 Carl Zeiss AG, Jena
Kühlschrank Liebherr Comfort, Biberach an der Riß
Orbitalshaker SO3 Stuart Scientific, Stone, United Kingdom Photometer Microplatereader MRX Dynatech, Denkendorf
pH-Meter: pH 320 WTW, Weilheim
Pipetten (0,5–10 µl, 10–100 µl, 100–1000 µl, 1000–5000 µl)
Eppendorf, Hamburg
Sterilbank (TL-2248) Heraeus Laminar Air Heraeus, Waltham, USA
Vortex: Reax top Heidolph, Schwabach
Waage Scaltec OMNILAB, Gehrden
Waschpipette Eppendorf, Hamburg
16 3.1.3. Allgemeine Materialien
Chirurgisches Einmal-Skalpell Größe 10 Braun Aesculap AG, Tuttlingen
Faltenfilter 150 mm Whatman, Dassel
Plastikröhrchen (15 ml und 50 ml) Greiner Bio-One, Frickenhausen Messschieber (Pocket Thickness Gage) Mitutoyo Deutschland GmbH, Neuss Mikrotiterplatte (96-Well) Sarstedt, Nümbrecht
Multiwellplatten (24-, 96-Well) Greiner Bio-One, Frickenhausen Neubauer-Zählkammer VWR International GmbH, Darmstadt Pinzette, chirurgisch und anatomisch Hauptner Instrumente GmbH, Dietlikon,
Schweiz Pipettenspitzen (0,5–10 µl, 10–100 µl,
100–1000 µl, 1000–5000 µl)
Eppendorf, Hamburg
Reaktionsgefäße (1,5 ml) Eppendorf, Hamburg
3.1.4. Zusammensetzung des Puffers
PBS; sterilisiert 8 g/l NaCl, 0,2 g/l KCl, 1,44 g/l NaPO4, 0,2 g/l KH2PO4
in Aqua bidest., pH 7,4
3.1.5. Material für In-vivo-Versuche
Aqua ad injectabilia Braun, Melsungen
Baumwollgaze 20 x 20 cm Lohmann & Rauscher GmbH & Co. KG, Neuwied
Blenderm™ 3M Medica, Neuss
Calcipotriol (hydrate) Cayman Chemical Company, Michigan, USA
Dexamethason acis 8 mg Acis, Grünwald
Fixierpflaster Classic Hansaplast, Beiersdorf, Hamburg
JNJ 39758979 Janssen PRD, USA
Kanülen 26G Henke Sass Wolf, Tuttlingen
Mepyraminmaleat Sigma-Aldrich, Steinheim
Ovalbumin Grade V Sigma-Aldrich, Steinheim Ovalbumin Grade VI Sigma-Aldrich, Steinheim
Peha Haft Color Paul Hartmann AG, Heidenheim
Schermaschine Moser Elektrogeräte, Unterkirnach
17
Serum-Gel-Röhrchen Sarstedt, Nümbrecht
Skalpellklingen Bayha, Tuttlingen
ST1012 H. Stark, Heinrich Heine University
Düsseldorf
Veet®- Enthaarungscreme Reckitt Benckiser Deutschland GmbH, Mannheim
3.1.6. Material für In-vitro-Versuche
CellTiter 96 AQueous One Solution Assay Promega, Madison, USA Fetales Kälberserum (Superior; FKS) Biochrom AG, Berlin
Medium RPMI-1640 Medium + 10 % Fetales
Kälberserum + 1 % Penicillin/Streptomycin Penicillin/Streptomycin (10 mg/ml) Merck Biochrom GmbH, Berlin
ROTI®Cell RPMI-1640 Carl Roth, Karlsruhe
3.1.7. Material für die Proteinextraktion Bovines Serum Albumin
Mörser Pefa-Bloc SC
Pierce™ BCA Protein Assay Kit
Sigma-Aldrich, Steinheim
Haldenwanger GmbH, Waldkraiburg Roche, Mannheim
Thermo Scientific, Illinois, USA ROTI®Cell RPMI-1640 Carl Roth, Karlsruhe
3.1.8. ELISA
Duo Set® Mouse TSLP DuoSet® ELISA Development Systems, R&D Systems, Minneapolis, USA
18 3.1.9. Versuchstiere und Tierhaltung
Für alle Versuche wurden sechs bis acht Wochen alte weibliche Mäuse verwendet.
Balb/c-Mäuse (Wildtyp) wurden von der Firma Charles River (Sulzfeld) bezogen. Die verwendeten H4R-/--Mäuse wurden zur Verfügung gestellt von Janssen Research &
Development, L.L.C., New Jersey, U.S.A. und wurden in der Eigenzucht im Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover vermehrt. Die Tiere stammten aus rückgekreutzten Wildtyp-Mäusen auf Balb/c-Hintergrund und wurden durch Genotypisierung kontrolliert.
Die Mäuse wurden in angereicherten Makrolonkäfigen Typ III gehalten; die Raumtemperatur lag bei 22°C. Es bestand ein Licht-Dunkel-Rhythmus von 12 Stunden. Futter (Altromin 1324, Lage/Lippe) und Wasser standen den Tieren ad libitum zur Verfügung. Die Mäuse wurden je nach Versuchsaufbau in Gruppengrößen von fünf bis sechs Tieren gehalten.
Die Tiere waren zu Beginn des Versuchs klinisch gesund und wurden 14 Tage vor Versuchsbeginn durch regelmäßiges Handling an den Umgang gewöhnt.
19
3.2. Methoden
3.2.1. Versuchsübersicht
Ziel dieser Arbeit war es, ein zusätzliches Modell zur Untersuchung der atopischen Dermatitis zu etablieren und dieses mit dem bereits in der Arbeitsgruppe etablierten OVA- induzierten Mausmodell nach SPERGEL et. al. (1998) zu vergleichen. Dieses AD-Modell zeichnet sich dadurch aus, dass die Mäuse mit Calcipotriol (MC 903), einem Vitamin D-Analogon, topisch behandelt werden. Zunächst wurden Wildtyp-Tiere (Balb/c) mit zwei unterschiedlichen Dosierungen von Calcipotriol behandelt. Danach wurde der Versuch mit Knockout-Tieren (H4R-/-) wiederholt. Im weiteren Verlauf wurde versucht, die Entzündungsreaktion durch Gabe eines Glukokortikoids zu unterdrücken. Um die Rolle des H4R bei atopischer Dermatitis weiter zu untersuchen, wurde zudem ein Versuch durchgeführt, bei dem die Mäuse mit einem H1R-Antagonisten in Kombination mit einem H4R-Antagonist behandelt wurden. Im nächsten Versuch wurde ein inverser H4R-Agonisten verwendet. Mit diesem wurde sowohl eine alleinige Behandlung als auch eine Kombinationsbehandlung mit einem H1R-Antagonist durchgeführt. Bei den Versuchen wurden jeweils die Ohrdicken gemessen sowie die Lymphknotenzellzahl und das Lymphknotengewicht bestimmt.
Zudem wurde Zytokin TSLP in der Ohrhaut bestimmt.
Zusätzlich wurde ein Zellkulturversuch mit murinen Keratinozyten der Zelllinie MSC p5 durchgeführt, um zu prüfen, ob die Zellen unter Calcipotriol-Behandlung TSLP ausschütten.
Außerdem wurde das OVA-Modell verwendet; dabei kam ein H4R-Antagonist zum Einsatz. Als Parameter dienten das Gewicht und die Zellzahl der Lymphknoten.
Zusätzlich wurde das Zytokin TSLP in der Brusthaut bestimmt.
20 3.2.2. Calcipotriol-Modell
In Tabelle 1 ist eine Gesamtübersicht der In-vivo-Versuche zu sehen.
Tabelle 1: Behandlungsübersicht der In-vivo-Versuche mit Calcipotriol-Behandlung
1. Versuch
Dexamethason Calcipotriol 0,5 nmol/20µl +
21
Die Calcipotriol-Behandlung fand nach dem folgenden Schema über 14 Tage statt:
Abbildung 2: Behandlungsschema Calcipotriol-Versuch; kennzeichnet die Behandlungen
Die Ohrdicken wurde mit Hilfe eines Messschiebers vor jeder Behandlung festgestellt.
Die Behandlung beider Ohren erfolgte topisch. Mit einer Pipette wurden dabei 20 µl der jeweiligen Substanz am Ohrrand aufgetragen. Sowohl die Innen- als auch Außenfläche der Ohrmuschel wurden dabei behandelt.
Calcipotriol wurde im ersten und zweiten Versuch in einer Konzentration von 1 nmol/20µl und 0,5 nmol/20µl verwendet. Calcipotriol wurde dabei in 98 % Ethanol (EtOH) gelöst. Die Lösungen wurden vor jeder Behandlung neu angesetzt.
Im dritten Versuch wurde bereits zwei Tage vor der Calcipotriol-Behandlung 1 mg/kg Dexamethason (i.p.) injiziert (Abbildung 3). Die Calcipotriol-Behandlung wurde wie oben beschrieben durchgeführt.
Abbildung 3:Behandlungsschema des dritten Versuchs; kennzeichnen die systemische Behandlung mit Dexamethason oder Aqua ad inj., die Behandlungstage mit Calcipotriol und Dexamethason oder Aqua ad inj.
Im vierten Versuch wurden die Tiere zusätzlich mit H4R-Antagonisten und H1R-Antagonisten behandelt. Auch hier wurde die Behandlung bereits zwei Tage vor der topischen Behandlung mit einem H4R-Antagonisten JNJ 39758979 (20 mg/kg) begonnen (Abbildung 4). Mepyramin fand als H1R-Antagonist (20 mg/kg) Verwendung. Die Injektionen wurden an Tag 0 bis Tag 13 vier Stunden vor und nach der Calcipotriol-Behandlung durchgeführt. An Tag -2 und Tag -1 lagen acht Stunden zwischen den Injektionen.
22
Im fünften Versuch wurden die Mäuse mit dem inversen H4R-Agonisten ST1012 behandelt; dabei wurden unterschiedliche Konzentrationen getestet. Außerdem wurde eine Kombination von ST1012 und Mepyramin (20 mg/kg) untersucht, welches subcutan verabreicht wurde (Abbildung 5). ST1012 wurde in 10 % Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst.
23
Abbildung 4: Behandlungsschema Versuch 4; linke Spalte: Pfeile kennzeichnen die Calcipotriol-Behandlung; rechte Spalte: Pfeile kennzeichnen die Injektionen
24
Abbildung 5: Behandlungsschema Versuch 5; linke Spalte: Pfeile kennzeichnen die Calcipotriol-Behandlung; rechte Spalte: Pfeile kennzeichnen die Injektionen
25 3.2.3. Zellkulturversuche mit Calcipotriol
Um die Wirkung von Calcipotriol auf Keratinozyten zu untersuchen, wurden Zellen der murinen Zelllinie MSC p5 verwendet. In 24-Multiwellplatten wurden je 40.000 Zellen pro Well ausgesät und mit Calcipotriol in verschiedenen Konzentrationen (Kontrolle, EtOH, 10-5, 10-6, 10-7, 10-8 mol/l) behandelt. Mit je vier Wells wurden dabei identisch verfahren. Überstände wurden 24 und 48 Stunden nach der Behandlung gewonnen.
In den Überständen wurde TSLP gemessen (ELISA). Außerdem wurde ein Zellvitalitätstest (CellTiter 96 AQueous One Solution Assay) durchgeführt.
3.2.4. Ovalbumin-Modell
Der Ovalbumin-Versuch wurde über 92 Tage durchgeführt. Zunächst begann die epikutane Sensibilisierung mit Ovalbumin (OVA), die über drei Sensibilisierungswochen andauerte. Darauf folgten zwei Wochen Provokationsphase, die an Tag 63 und Tag 84 begannen. Zwischen den einzelnen Phasen lagen 14 Tage ohne Behandlung (in Anlehnung an SPERGEL et al. 1998, ROSSBACH et al. 2017 und KÖCHLING 2015).
Abbildung 10: Behandlungsschema des OVA-Modells
An Tag 0 wurden die Tiere mit Veet®-Enthaarungscreme im Brustbereich enthaart.
Nach 4 Stunden wurde den Mäusen ein Patch (3-lagige Baumwollgaze, 1,5 x 1,5 cm) mit OVA Grade V (100 µg/100µl PBS) aufgelegt. Das Patch wurde durch eine selbsthaftende Bandage (Peha Haft Color®) fixiert. Um das Verrutschen zu vermeiden, wurde diese durch chirurgisches Klebeband (Blenderm™) sowie zusätzlich mit einem Streifen Fixerpflaster (Hansaplast Classic®) fixiert. An Tag 3 wurde der Verband
26
erneuert und ein neues Patch mit OVA Grade V aufgelegt. An Tag 7 wurde der Verband entfernt; darauf folgten 14 Tage ohne Behandlung. Die zwei darauffolgenden Sensibilisierungswochen verliefen identisch. Der korrekte Sitz des Verbandes wurde zweimal täglich kontrolliert. In der ersten Provokationswoche wurde das Patch mit OVA Grade VI (100 µg/100µl PBS) versetzt. An Tag 66 wurde das Patch erneuert. Die zweite Provokationswoche verlief identisch (Tabelle 2). Kontrolltiere erhielten ein Patch mit 100 µl PBS. Die Mäuse wurden in beiden Provokationswochen entweder mit Aqua ad inj. oder JNJ 39758979 (20 mg/kg) zweimal täglich behandelt (i.p.).
Tabelle 2: Gruppen- und Behandlungsübersicht des OVA-Versuchs
Gruppe Stamm Behandlung topisch Medikament
1 H4R-/- Kontrolle Aqua ad inj.
3.2.5. Untersuchte Parameter
Hautläsionen
Die auftretenden Hautläsionen wurden beschrieben und fotografisch festgehalten. Die Bestimmung der Ohrdicken erfolgte mittels Messschieber.
Lymphknoten
Bei den Calcipotriol-Versuchen wurden die regionären Lnn. cervicales (bilateral) freipräpariert und gewogen. Anschließend wurden die einzelnen Lymphknoten in 1 ml sterilem PBS homogenisiert. Um die Zellzahl zu bestimmen, wurden 10 µl
27
Zellsuspension mit 90 µl Trypanblau angefärbt. Diese Suspension wurde in eine Neubauer-Zählkammer gegeben und unter dem Invertmikroskop ausgewertet. Beim OVA-Modell wurden die Lnn. axillares nach gleichem Prozedere untersucht.
Histologie
Eine histologische Untersuchung der Haut wurde durchgeführt, um pathophysiologische Merkmale einer atopischen Dermatitis nachzuweisen zu können.
In den Calcipotriol-Versuchen wurde der zentrale Teil der Ohrmuschel verwendet. Im OVA-Modell wurde ein Teil der Brusthaut untersucht. Die Bearbeitung und HE-Färbung sowie die Auswertung erfolgte durch das Institut für Pathologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover.
TSLP-Bestimmung in Hauthomogenisaten und Zellkulturüberstände (ELISA)
Für den TSLP Nachweis in Ohr- und Brusthaut wurden die bei -196°C gelagerten Proben mithilfe eines Mörsers zu einer feinen Substanz verarbeitet. Daraufhin wurde die Masse in ein 1,5 ml Probengefäß überführt. 200 µl RPMI-Medium und 10 µl Pefa Bloc wurden hinzugegeben. Nach einer Inkubationszeit von 2 Stunden auf Eis wurden die Proben zentrifugiert. Der Überstand wurde bei –20°C gelagert (BÄUMER et al.
2005). Zur Proteinbestimmung wurde ein Pierce™ BCA Protein Assay Kit nach Herstellerangaben verwendet. Alle Proben wurden auf den gleichen Proteinwert eingestellt.
Die Durchführung des ELISA erfolgte laut Herstellerangaben. Durch Vorversuche wurden die Hauthomogenisate, insbesondere Calcipotriol-behandelter Gruppen, vorverdünnt. Dies wurde bei der weiterführenden Auswertung berücksichtigt.
28 3.2.6. Statistische Auswertung
Die statistische Auswertung der Daten erfolgte mit dem Programm GraphPadPrism (Version 8.0.1, GraphPad Software, Inc.). Für die Auswertung wurden die behandelten Gruppen jeweils mit der Ethanol-behandelten Gruppe verglichen. Dazu wurde der Kruskal-Wallis-Test verwendet und die Irrtumswahrscheinlichkeiten von 5 %, 1 % und 0,1 % bestimmt. Wurden bei Parametern verschiedene Zeitpunkte untersucht, fand die zwei-faktorielle ANOVA-Analyse Verwendung.
29
4. Ergebnisse 4.1. OVA-Modell
Der OVA-Versuch erfolgte an zwei Mäusestämmen (Wildtyp Balb/c und Knockout H4R-/-). In diesem Versuchsansatz gab es vier Gruppen je Genotyp:
- unbehandelte Gruppe - PBS + Aqua ad inj.
- OVA + Aqua ad inj.
- OVA + JNJ 39758979 (20 mg/kg)
Als Parameter dienten: Lymphknotengewicht und Zellzahl der Lnn. axillares, die TSLP-Konzentration in der Brusthaut sowie die histologische Auswertung der Brusthaut. Es gab keine auffälligen Hautveränderungen. Daraufhin wurde auf ein Scoring verzichtet.
Bereits bei den Tieren, die mit dem Vehikel (PBS) behandelt wurden, gab es Zunahmen des Lymphknotengewichts und der -zellzahl, die nicht signifikant gegenüber den anderen Behandlungsgruppen sind.
Die Auswertung der Lymphknotengewichte zeigt im Vergleich zur unbehandelten Gruppe eine signifikante Zunahme bei den H4R-/--Tieren, die einer Behandlung mit PBS unterzogen wurden (Abbildung 6). Es gibt keine signifikanten Unterschiede bei beiden Genotypen im Lymphknotengewicht der Behandlungsgruppen weder im Vergleich PBS und OVA noch im Vergleich OVA und der OVA und JNJ 39758979 behandelten Gruppe.
30
Abbildung 6: Lymphknotengewicht (mg); von unbehandelten Tieren (K), von Tiere mit PBS-Patch (PBS), von Tieren mit OVA-Patch (OVA) und von Tieren mit OVA-Patch und JNJ 39758979 Behandlung (20 mg/kg) (OVA + JNJ); n=5/6; Angabe des Medians mit 95 % Quartil sowie der Einzelwerte;
* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001, ns nicht signifikant
Auch die Zellzahl der Lymphknoten zeigt eine signifikante Zunahme zwischen der unbehandelten Kontrollgruppe und der PBS behandelten Gruppe, jedoch nur bei den Knockout-Tieren (Abbildung 7). Es gibt keinen abnehmenden Trend zwischen der OVA-behandelten Gruppe und der OVA und JNJ 39758979 behandelten Gruppe bei beiden Genotypen (Abbildung 7).
Abbildung 7: Lymphknotenzellzahl; von unbehandelten Tieren (K), von Tiere mit PBS-Patch (PBS), von Tieren mit OVA-Patch (OVA) und von Tieren mit OVA-Patch und JNJ 39758979 Behandlung (20 mg/kg) (OVA + JNJ); n=5/6; Angabe des Medians mit 95 % Quartil sowie der Einzelwerte;
* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001, ns nicht signifikant
H4R-/--Mäuse Balb/c-Mäuse
H4R-/--Mäuse Balb/c-Mäuse
31 4.1.1. Histologische Auswertung
Bei der histologischen Auswertung waren in den Behandlungsgruppen (auch in der Vehikelgruppe) einzelne Lymphozyten, Makrophagen und Neutrophile zu sehen.
Dieses Bild zeichnete sich bei beiden Genotypen ab.
4.1.2. TSLP-Konzentration
TSLP konnte in den Homogenisaten der Brusthaut nicht nachgewiesen werden.
4.2. Calcipotriol-Modell
Das Calcipotriol-Modell wurde in der Arbeitsgruppe etabliert. Es wurden verschiedene Versuche durchgeführt:
1. Versuch: Calcipotriol bei Wildtyp-Mäusen 2. Versuch: Calcipotriol bei Knockout-Mäusen
3. Versuch: Calcipotriol + Glukokortikoid bei Wildtyp-Mäuse
4. Versuch: Calcipotriol + H1R-Antagonist und H4R-Antagonist bei Wildtyp-Mäusen 5. Versuch: Calcipotriol + inverser H4R-Antagonisten und H1R-Antagonist bei Wildtyp-Mäusen
Folgende Parameter wurden zur Auswertung der Versuche herangezogen:
Ohrdickenmessung, Lymphknotenzellzahl und Lymphknotengewicht, Zytokinkonzentration von TSLP in Ohrhomogenisaten und histologische Beurteilung der Ohrhaut.
32
4.2.1. Calcipotriolbehandlung bei Balb/c-Mäusen Bei diesem Versuch gab es vier Behandlungsgruppen:
- unbehandelte Kontrolle
- Vehikel-Kontrolle (EtOH-behandelte Gruppe) - Gruppe mit 1 nmol/Ohr Calcipotriol behandelt - Gruppe mit 0,5 nmol/Ohr Calcipotriol behandelt
Am Tag nach der letzten Behandlung können an den behandelten Tieren makroskopisch pathologische Veränderungen wie Erosionen, Erytheme und Schwellung der Ohren festgestellt werden (Abbildung 8). Die Tiere der unbehandelten Gruppe oder der EtOH-behandelten Gruppe zeigen keine makroskopischen Auffälligkeiten (Abbildung 9).
Die Ähnlichkeiten der Vehikel-Kontrolle und der unbehandelten Kontrolle wird auch in der Ohrdickenmessung bestätigt (siehe Tabelle 3). Aus Gründen der Übersichtlichkeit wird im Folgenden (Abbildung 10) nur die Ohrdicke der Vehikel-Kontrolle (EtOH-behandelt, bereits Tabelle 3 gezeigt) dargestellt. Abbildung 10 zeigt den zeitlichen Verlauf der Ohrdickenzunahme der behandelten Gruppen. Die Ohrdicke ist bei der mit Calcipotriol (MC 903) behandelten Gruppe (1 nmol/Ohr) am letzten Versuchstag mehr als doppelt so dick wie bei der Ethanol-behandelten Gruppe. Auch die Behandlung mit der niedrigeren Calcipotriol-Konzentration (0,5 nmol/Ohr) führte zu einer signifikanten Ohrdickenzunahme im Vergleich zur Ethanol-behandelten Gruppe.
33
Abbildung 8: Ohren, die mit 1 nmol/20µl MC 903 behandelt wurden; a Ohrdickenzunahme; b Erythem und Erosion
Abbildung 9: Ohr, a unbehandelter Gruppe, b mit Ethanol behandeltes Ohr
Tabelle 3: Ohrdicken (µm) von Balb/c-Mäusen unbehandelt und mit Ethanol-behandelt; Mittelwert ± Standardabweichung; n=4, basierend auf 8 Ohrdickenmessungen an je 4 Mäusen pro Gruppe
Behandlungstag 0 2 5 7 9 12 14
Unbehandelt 219 ± 14 230 ± 12 221 ± 12 213 ± 10 210 ± 12 211 ± 11 225 ± 16 EtOH 206 ± 12 218 ± 16 216 ± 16 216 ± 10 218 ± 17 216 ± 15 231 ± 15
a b
a b
34
Abbildung 10: Ohrdicke (µm) von Mäusen mit Ethanol (EtOH) behandelt, mit 1 nmol/Ohr Calcipotriol (MC 903) und 0,5 nmol/Ohr behandelt; n=4, basierend auf 8 Ohrdickenmessungen an je 4 Mäusen pro Gruppe; * p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001
Abbildung 11 veranschaulicht das Gewicht der Lnn. cervicales der unterschiedlichen Behandlungsgruppen. Dabei zeigte die mit der hohen Konzentration von Calcipotriol (1 nmol/Ohr) behandelte Gruppe eine signifikante Zunahme im Vergleich zur Vehikel-Gruppe. Dieses zeichnet sich auch in der Auswertung der Lymphknotenzellzahl ab (Abbildung 12). Auch die niedrige Dosierung von Calcipotriol (0,5 nmol/Ohr) führt zu einer signifikanten Zunahme der Lymphknotenparameter (Abbildung 11, Abbildung 12).
35
Abbildung 11: Lymphknotengewicht (mg) von Mäusen unbehandelt (K), mit Ethanol (EtOH) behandelt, mit 1 nmol/Ohr Calcipotriol (MC 903) und 0,5 nmol/Ohr behandelt; n=4, basierend auf 8 Lymphknoten von je 4 Mäusen pro Gruppe; Angabe des Medians mit 95 % Quartil sowie der Einzelwerte;
* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001
Abbildung 12: Lymphknotenzellzahl von Mäusen unbehandelt (K), mit Ethanol (EtOH) behandelt, mit 1 nmol/Ohr Calcipotriol (MC 903) und 0,5 nmol/Ohr behandelt; n=4, basierend auf 8 Lymphknoten von je 4 Mäusen pro Gruppe; Angabe des Medians mit 95 % Quartil sowie der Einzelwerte;
* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001
36 Histologische Auswertung
Im histologischen Bild sind im Vergleich zu den Kontrollgruppen insbesondere in der Gruppe, die mit 1 nmol/Ohr Calcipotriol behandelt wurde, vermehrt Lymphozyten, Makrophagen und neutrophilen Granulozyten zu sehen (Abbildung 13). Außerdem kann eine Zunahme der Epidermisdicke bei beiden Calcipotriol-behandelten Gruppen detektiert werden (Abbildung 13). Bei der Gruppe, die mit der hohen Konzentration Calcipotriol behandelt wurde, waren zum Teil intrakorneale Pusteln und eine Grenzflächendermatitis zu erkennen.
Abbildung 13: Histologie Ohrmuschel; a) Kontrolle b) Ethanol c) 1nmol/Ohr Calcipotriol d) 0,5nmol/Ohr Calcipotriol; HE-Färbung; 10 x Vergrößerung, Messbalken 100 µm
37 TSLP-Konzentration
Die Konzentration des Zytokins TSLP in den Ohrhomogenisaten ist bei den mit Calcipotriol-behandelten Gruppen im Vergleich zur Vehikel-Gruppe signifikant erhöht (Abbildung 14). Es zeigt sich ein von der Calcipotrioldosis abhängiger TSLP-Konzentrationsunterschied.
Abbildung 14: TSLP-Konzentration in Ohrhomogenisaten von Mäusen unbehandelt (K), mit Ethanol (EtOH) behandelt, mit 1 nmol/Ohr Calcipotriol (MC 903) und 0,5 nmol/Ohr behandelt; n=4, basierend auf 8 Ohren von je 4 Mäusen pro Gruppe; Angabe des Medians mit 95 % Quartil sowie der Einzelwerte;
* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001
38
4.2.2. Calcipotriolbehandlung bei H4R-/--Mäusen
Dieser Versuchsaufbau ist identisch zu dem ersten Versuch. Auch in diesem Versuch gab es vier verschiedene Gruppen:
- unbehandelte Kontrolle
- Vehikel-Kontrolle (EtOH-behandelte Gruppe) - Gruppe mit 1 nmol/Ohr Calcipotriol behandelt - Gruppe die mit 0,5 nmol/Ohr Calcipotriol behandelt
In diesem Versuch wurden H4R-/--Knockout-Mäuse verwendet. Am letzten Versuchstag konnten auch bei diesen Tieren makroskopische Veränderungen, wie beispielweise Erosionen, Erythem und Hyperämie (Abbildung 15) detektiert werden.
Abbildung 15: a Maus mit 1nmol/Ohr Calcipotriol behandelt, zeigt Hyperämie im Vergleich dazu b Ethanol-behandeltes Tier
Tabelle 4 zeigt, dass Vehikel-behandelte Tiere keine Ohrdickenzunahme haben im Vergleich zu unbehandelten Tieren. Aus Gründen der Übersichtlichkeit wird in Abbildung 16 daher nicht die Ohrendicke der unbehandelten Kontrollgruppe gezeigt.
Tabelle 4: Ohrdicken (µm) von unbehandelten H4R-/-- Mäusen (K), und mit Ethanol-behandelten (EtOH);
Mittelwert ± Standardabweichung; n=4/5, basierend auf 10 Ohrdickenmessungen an 4/5 Mäusen je Gruppe
Behandlungstag 0 2 5 7 9 12 14
unbehandelt 228 ± 20 240 ± 23 246 ± 18 251 ± 15 252 ± 12 238 ± 16 226 ± 15
EtOH 235 ± 19 236 ± 22 237 ± 18 237 ± 15 237 ± 20 236 ± 11 235 ± 22
a b
39
Auch in diesem Versuch zeichnet sich eine signifikante Ohrdickenzunahmen bei Calcipotriol-behandelten Tieren (Abbildung 16) ab. Es ist auch eine signifikante Zunahme zwischen den dosisabhängigen Calcipotriol-Behandlungen auszumachen.
Im Vergleich zu Abbildung 10 kann bei den Knockout-Mäusen ein tendenziell höherer Anstieg der Ohrdicken ausgemacht werden. An Tag 0 wurden Ohrdicken von etwa 230 µm gemessen und stiegen durch die Behandlung mit Calcipotriol 1 nmol/Ohr bis etwa 550 µm an (Abbildung 16). Im Gegensatz dazu war bei den Wildtyp-Mäusen nach beginnenden Messungen von 210 µm am letzten Versuchstag Ohrdicken von etwa 430 µm festzustellen (Abbildung 10).
Abbildung 16: Ohrdicke (µm) von Mäusen mit Ethanol (EtOH) behandelt, mit 1 nmol/Ohr Calcipotriol (MC 903) und 0,5 nmol/Ohr behandelt; n=4/5, basierend auf 8/10 Ohrdickenmessungen an je 4/5 Mäusen pro Gruppe; * p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001
Im Vergleich zur Ethanol-behandelten Gruppe waren signifikante Zunahmen sowohl bei dem Gewicht als auch bei der Zellzahl der Lymphknoten (Lnn. cervicales) festzustellen (Abbildung 17 und Abbildung 18).
40
Abbildung 17: Lymphknotengewicht (mg) von Mäusen unbehandelt (K), mit Ethanol (EtOH) behandelt, mit 1 nmol/Ohr Calcipotriol (MC 903) und 0,5 nmol/Ohr behandelt; n=4/5, basierend auf 8/10 Lymphknoten von je 4/5 Mäusen pro Gruppe; Angabe des Medians mit 95 % Quartil sowie der Einzelwerte; * p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001
Abbildung 18: Lymphknotenzellzahl von Mäusen unbehandelt (K), mit Ethanol (EtOH) behandelt, mit 1 nmol/Ohr Calcipotriol (MC 903) und 0,5 nmol/Ohr behandelt; n=4/5, basierend auf 8/10 Lymphknoten von je 4/5 Mäusen pro Gruppe; Angabe des Medians mit 95 % Quartil sowie der Einzelwerte;
* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001
41 Histologische Auswertung
Bei der histologischen Auswertung (Abbildung 19) zeigt sich eine Epidermisdickenzunahme bei den Calcipotriol-behandelten Gruppen (0,5 nmol/Ohr und 1 nmol/Ohr Calcipotriol). Zudem konnte bei den Calcipotriol-behandelten Gruppen intrakorneale Pusteln festgestellt werden. Wie bei dem ersten Versuch mit Wildtyp-Tieren gab es hier eine Zunahme der Zahl von Lymphozyten, Makrophagen und neutrophilen Granulozyten im Vergleich zu den Kontrollgruppen. Verglichen mit den Wildtyp-Tieren nahm die Epidermisdicke mehr zu und die Entzündungsinfiltrate bei den Knockout-Tieren waren deutlicher ausgeprägt.
Abbildung 19: Histologie Ohrmuschel; a) Kontrolle; b) Ethanol; c) 1 nmol/Ohr Calcipotriol, d) 0,5 nmol/Ohr Calcipotriol; HE-Färbung; 10 x Vergrößerung, Messbalken 100 µm
42 TSLP-Konzentration
Die Konzentration des Zytokins TSLP in den Ohrhomogenisaten ist bei den mit Calcipotriol-behandelten Gruppen im Vergleich zur Vehikelgruppe (Ethanol) signifikant erhöht. Auch bei niedrig dosierten Calcipotriolbehandlungen (0,5 nmol/Ohr) ist eine signifikante Zunahme der TSLP-Konzentration auszumachen (Abbildung 20).
Abbildung 20: TSLP-Konzentration (ng/ml) in den Ohrhomogenisaten von Mäusen unbehandelt (K), mit Ethanol (EtOH) behandelt, mit 1 nmol/Ohr Calcipotriol (MC 903) und 0,5 nmol/Ohr behandelt; n=4/5, basierend auf 8/10 Ohren von je 4/5 Mäusen pro Gruppe; Angabe des Medians mit 95 % Quartil sowie der Einzelwerte; * p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001
Des Weiteren sind in diesem Versuch die TSLP-Gehalte höher als bei dem Versuch mit den Wildtyp-Tieren. Bei den Knockout-Tieren liegen die Werte etwa bei 15 ng/ml bei einer Behandlung von 1 nmol/Ohr Calcipotriol und bei Wildtyp-Tieren etwa bei 11 ng/ml bei gleicher Behandlung.
43
4.2.3. Effekt von Dexamethason auf induzierte Entzündungsreaktionen In diesem Experiment gab es vier Behandlungsgruppen mit je sechs Tieren:
- Vehikel-Kontrolle (Ethanol) + Aqua ad inj.
- Calcipotriol 0,5 nmol/Ohr + Aqua ad inj.
- Calcipotriol 0,5 nmol/Ohr + Dexamethason (1 mg/kg) - Vehikel-Kontrolle + Dexamethason (1 mg/kg)
Makroskopisch konnten am letzten Versuchstag Unterschiede in der Rötung der Ohren festgestellt werden. In Abbildung 21 a ist das Ohr eines Kontrolltieres abgebildet und Abbildung 21 b zeigt ein mit Calcipotriol behandeltes Ohr. Ein mit Dexamethason behandeltes Ohr wird in Abbildung 21 c dargestellt. Durch die Dexamethason Gabe zeigt sich eine Abblassung der Haut.
Abbildung 21: Exemplarische Darstellung der behandelten Ohren; a Vehikel-Kontrolle, b Calcipotriol-Behandlung, Rötung der Ohrmuschel, c Dexamethason-Behandlung
Es besteht eine signifikante Zunahme der Ohrdicken zwischen den Calcipotriol behandelten Ohren und der Vehikel behandelten Ohren. Die Ohrdicke ist bei der Gruppe, die mit Calcipotriol und Dexamethason behandelt wurde, tendenziell niedriger
Es besteht eine signifikante Zunahme der Ohrdicken zwischen den Calcipotriol behandelten Ohren und der Vehikel behandelten Ohren. Die Ohrdicke ist bei der Gruppe, die mit Calcipotriol und Dexamethason behandelt wurde, tendenziell niedriger