Aus dem Institut
für Medizinische Mikrobiologie, Justus-Liebig-Universität Giessen These zur Erlangung des Grades
eines Doctor of Philosophy (Ph.D.) durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
C h . S te in
VVB LAUFERSWEILER VERLAG
édition scientifique VVB LAUFERSWEILER VERLAGG L E I B E R G E R W E G 4 D - 3 5 4 3 5 W E T T E N B E R G Tel: +49-(0)6406-4413 Fax: -72757 r e d a k t i o n @ d o k t o r v e r l a g . d e w w w . d o k t o r v e r l a g . d e
VVB LAUFERSWEILER VERLAG
édition scientifique9 7 8 3 8 9 6 8 7 4 3 1 3
ISBN 3-89687-431-4
VVB
G e n o m se q u e n z ie ru n g v o n
zwei apathogenen
Spezies des Genus Listeria
L . w e ls h im e ri L . se e li g e ri u n d
Genomsequenzierung von
und
L. welshimeri L. seeligeri
Nach erfolgter Annotation wurden die allgemeinen Charakteristika des
L . w e l s h i m e r i - b z w . d e s L. seeligeri-Genoms ermittelt und Vergleiche zu den Genomsequenzen
von L. monocytogenes EGDe, L. monocytogenes F2365, L. innocua CLIP 11262 und L. ivanovii PAM 55 durchgeführt.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Genomsequenzen von L.
w e l s h i m e r i u n d
L. seeligeri, zwei apathogenen Vertretern der Gattung Listeria, erstellt.
zwei apathogenen
Spezies des Genus Listeria
Genomsequenzierung von
und
L. welshimeri
L. seeligeri
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1. Auflage 2005
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written permission of the Author or the Publishers.
1 Edition 200st 5
© 2005 by VVB LAUFERSWEILER VERLAG, Wettenberg Printed in Germany
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édition scientifique
GLEIBERGER WEG 4, D-35435 WETTENBERG Tel: 06406-4413 Fax: 06406-72757
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Genomsequenzierung von L. welshimeri und L. seeligeri, zwei apathogenen Spezies des
Genus Listeria
These
Zur Erlangung des Grades eines Doctor of Philosophy
-Ph.D.-
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
vorgelegt von Christiane Steinweg
aus Lüdenscheid
Gießen 2005
Betreuungsgruppe: Prof. Dr. T. Chakraborty Prof. Dr. G. Gerlach
Prof. Dr. Dr. E. Töpfer-Petersen
1. Gutachten: Prof. Dr. T. Chakraborty
Institut für Medizinische Mikrobiologie Justus-Liebig-Universität Gießen
Prof. Dr. G. Gerlach Institut für Mikrobiologie
Tierärztliche Hochschule Hannover
Prof. Dr. Dr. E. Töpfer-Petersen Institut für Reproduktionsmedizin Tierärztliche Hochschule Hannover
2. Gutachten: Prof. Dr. Jürgen Wehland GBF, Braunschweig
Datum der mündlichen Prüfung: 1. Juni 2005
Die Forschungsarbeit wurde im Rahmen des Kompetenzzentrums für Genomforschung an pathogenen Bakterien (PathoGenoMik) erstellt und von dem Projektträger Biologie, Energie, Umwelt des BMWi (BEO), Forschungszentrum Jülich GmbH finanziert.
Für meine Mutter und für Pavel
INHALTSVERZEICHNIS
1. EINLEITUNG ... 1
1.1. Identifizierung und Charakterisierung von pathogenen Mikroorganismen ... 1
1.2. Bakterielle Pathogenitätsfaktoren ... 3
1.3. Die Gattung Listeria... 7
1.4. Listeriose: klinisches Bild und Pathogenese ... 9
1.5. Organisation und Evolution der Virulenzgene in Listeria spp... 14
1.6. Die Sequenzierung bakterieller Genome... 19
1.7. Die Grundlagen der Sequenzierung ... 20
1.8. Die Hochdurchsatz-Sequenzierung als Grundlage für die Sequenzierung ganzer Genome ... 22
1.9. Strategien zur Sequenzierung bakterieller Genome ... 24
1.10. Einblick in die aus der Genomsequenz abgeleiteten Listeria-spezifischen Charakteristika ... 26
1.11. Zielsetzung dieser Arbeit ... 27
2. MATERIAL... 29
2.1. Bakterienstämme... 29
2.1.1. Escherichia coli... 29
2.1.2. Listeria spp... 29
2.2. Plasmide ... 30
2.3. Klonbibliotheken... 30
2.3.1. Shotgun-Klonbibliotheken ... 30
2.3.2. Fosmid-Klonbibliothek ... 31
2.3.3. BAC-Klonbibliothek ... 31
II INHALTSVERZEICHNIS
2.4. Sequenzen... 32
2.4.1. Shotgun-Sequenzen ... 32
2.4.2. Fosmid- und BAC-Sequenzen... 32
2.4.3. Sequenznomenklatur ... 33
2.5. Oligonukleotide... 35
2.6. Chemikalien, Enzyme ... 35
2.7. Molekulargewichtsmarker... 35
2.8. Anzuchtmedien... 36
2.9. Lösungen und Puffer ... 37
2.10. Geräte ... 39
2.11. Computerprogramme ... 41
3. METHODEN ... 42
3.1. Isolierung von DNA ... 42
3.1.1. Isolierung chromosomaler DNA ... 42
3.1.2. Isolierung episomaler DNA mittels Anionen-Austauscher- bzw. Silcia- Matrizes... 43
3.1.3. Isolierung von BAC- und Fosmid-DNA im 96-well Platten-Maßstab mit dem Montage BAC96Miniprep Kit von Millipore... 44
3.1.4. Konzentrationsbestimmung von DNA ... 44
3.2. Nukleinsäureanalytik... 44
3.2.1. Polymerase-Kettenreaktion (PCR)... 44
3.2.2. Aufreinigung von PCR-Produkten... 47
3.2.3. Restriktion von DNA mittels Restriktionsendonukleasen ... 47
3.2.4. Aufreinigung von Restriktions- und Ligationsansätzen... 48
3.2.5. Elektrophoretische Analyse von Nukleinsäuren ... 49
3.2.6. Klonierung von DNA-Fragmenten... 50
3.2.7. Transformation episomaler DNA in Escherichia coli... 52
3.2.8. Herstellung einer Shotgun-Genbank aus Listeria spp... 53
3.2.9. Herstellung einer Fosmid-Genbank aus Listeria spp. ... 55
3.2.10. Herstellung einer BAC-Genbank aus Listeria spp... 59
3.2.11. Anlegen von Glycerinkonserven... 65
3.2.12. Anlegen einer Genbank... 65
3.2.13. Amplifizierung von Plasmid-DNA im 96-Well-Platten-Maßstab mit dem TempliPhi 500 Amplification Kit von Amersham... 66
3.2.14. Sequenzierung von DNA ... 66
3.2.15. Aufreinigung von Sequenzierreaktionen... 69
3.3. Verarbeitung von Sequenzen ... 70
3.3.1. Umformatieren der Sequenzrohdatenformate und Ermittlung der Phred 20-Qualität... 70
3.3.2. Bestimmung der Basensequenz... 72
3.3.3. Zusammenfügen der Einzelsequenzen zu kontinuierlichen Sequenzen... 72
3.3.4. Editierung der Assemblierungsergebnisse ... 77
3.3.5. Vervollständigung der Genomsequenz von L. welshimeri und L. seeligeri... 81
3.3.6. Manuelle Vervollständigung der Genomsequenz mit Consed... 83
3.3.7. Sequenzierstrategie für die Genome von L. welshimeri und L. seeligeri... 83
4. ERGEBNISSE ... 84
4.1. Herstellung der Klonbibliotheken für L. welshimeri... 84
4.1.1. Shotgun-Klonbibliothek ... 84
4.1.2. BAC-Klonbibliothek ... 86
4.2. Erste Shotgun-Phase des L. welshimeri-Genomprojektes ... 89
4.2.1. Sequenzierung der Shotgun-Klonbibliothek ... 89
4.2.2. Sequenzierung der BAC-Klonbibliothek ... 90
4.3. Erste Finishing-Phase des L. welshimeri-Genomprojektes... 91
4.4. Zweite Shotgun-Phase des L. welshimeri-Genomprojekts... 92
4.4.1. Sequenzierung der Shotgun-Klonbibliotheken... 93
4.4.2. Herstellen der Fosmid-Klonbibliothek... 94
4.4.3. Fosmidsequenzierung... 96
4.5. Herstellung der Klonbibliotheken für L. seeligeri... 98
4.5.1. Shotgun-Klonbibliotheken ... 98
4.5.2. Fosmid-Klonbibliothek ... 98
IV INHALTSVERZEICHNIS
4.6. Shotgun-Phase des L. seeligeri-Genomprojektes ... 99
4.6.1. Sequenzierung der Shotgun-Klonbibliotheken... 99
4.6.2. Fosmidsequenzierung... 99
4.7. Einsatz von PhredPhrap/Consed in die Genomprojekte ... 101
4.7.1. Einstellung der Bibliotheken... 101
4.7.2. Eingabe der Vektorsequenzen... 104
4.7.3. Anpassung der Namenskonvention... 104
4.7.4. Assemblierung der Sequenzen der Shotgun-Phase ... 105
4.7.5. Automatisierte Vervollständigung der Genome mit Autofinish ... 109
4.7.6. Manuelle Vervollständigung der Genome mittels PCR... 115
4.7.7. Die vollständige Genomsequenz... 123
4.7.8. Die Verbesserung des Consensus-Sequenzqualität... 124
4.7.9. Ausrichtung der Genome ... 127
4.8. Annotation der Genomsequenzen ... 128
4.8.1. Automatische Annotation mit GenDB ... 128
4.8.2. Halbautomatische Annotation... 128
4.8.3. Manuelle Annotation... 132
4.9. Allgemeine Charakteristika des L. welshimeri- und des L. seeligeri-Genoms ... 134
5. DISKUSSION ... 142
5.1. Strategie der Sequenzierung des L. welshimeri- und des L. seeligeri- Genomprojektes ... 142
5.2. Stand der Genomprojekte nach Abschluss der Shotgun-Phasen... 147
5.3. Finishing des L. welshimeri und des L. seeligeri-Genomprojektes ... 150
5.4. Annotation des L. welshimeri- und des L. seeligeri-Genoms ... 153
5.5. Vergleich des L. welshimeri- und des L. seeligeri-Genoms mit anderen Listeria- Spezies... 154
5.6. Vergleich des Genus Listeria mit anderen pathogenen Bakterien ... 162
5.7. Ausblick ... 165
6. ZUSAMENFASSUNG ... 166
7. SUMMARY... 169 8. LITERATURVERZEICHNIS ... 172
VI ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
A Adenin
A Ampere
Abb. Abbildung
ABC-Transporter ATP-Bindungs-Kassetten-Transporter
ATP Adenosintriphosphat
B. anthracis Bacillus anthracis B. cereus Bacillus cereus B. subtilis Bacillus subtilis
B. Brucella
BAC Bacterial Artificial Chromosome BHI Brain Heart Infusion
bp Basenpaare
BSA Bovine Serum Albumin
bzw. beziehungsweise
C Cytosin
°C Grad Celsius
ca. circa
cDNA komplementäre DNA
cm Zentimeter
d.h. dass heißt
dATP Desoxyadenosintriphosphat dCTP Desoxycytosintriphosphat ddATP Didesoxyadenosintriphosphat ddCTP Didesoxycytosintriphosphat ddGTP Didesoxyguanintriphosphat
ddH20 destilliertes Wasser ddNTP Didesoxynukleotid
ddTTP Didesoxytyrosintriphosphat dGTP Desoxyguanintriphosphat dITP Desoxyinosintriphosphat DNA Desoxyribonukleinsäure
dNTP Desoxynukleotid
DTT Dithiothreitol
dTTP Desoxytyrosintriphosphat E. coli Escherichia coli
EC Tris/NaCl/EDTA
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
EGTA Ethylenglycol-bis(β-aminoethylether)-N,N,N´,N´-tetraacetat et al. et alteri
etc. ecetera
F Farad
Fe Eisen
fwd forward
g Gramm
G Guanin
GES Guanidiniumthiocyanat/EDTA/Natrium-N-lauroylsarcosinat-Reagenz
ggf. gegebenenfalls
HIV Human Immundeficiency Virus IS-Element Insertionselement
k Kilo
Kb Kilobasen
l Liter
L. Listeria
LB Luria Bertani
LIPI Listeria pathogenicity island
LRR Leucine Rich Repeat
VIII ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
m milli
µ mikro
M molar
Mb Megabasen
min Minute
MLEE Multilocus Enzymelektrophorese MPI Max-Planck-Institut
MQ-H20 entmineralisiertes Wasser
n nano
NaCl Natriumchlorid
nm Nanometer
o.g. oben genannten
OD optische Dichte
orf offenes Leseraster (open reading frame) ORF offenes Leseraster (Open Reading Frame) oriV origin of replication
p pico
PCR Polymerase Chain Reaction PFGE Pulsfeld Gelelektrophorese
pH negativer dekadischer Logarithmus der Wasserstoffionenkonzentration PTS-Systeme Sugar Phosphotransferase System
Pwo Pyrococcus woesei
rDNA ribosomale Desoxyribonukleinsäure
rev reverse
rpm Umdrehungen pro Minute
rrn ribosomale Ribonukleinsäure RRN ribososmale Ribonukleinsäure rRNA ribosomale Ribonukleinsäure
RT Raumtemperatur
RV-Puffer Restriktionsverdau-Puffer S. agalacitae Streptococcus agalactiae
S. aureus Staphylococcus aureus S. pneumoniae Streptococcus pneumoniae S. pyogenes Streptococcus pyogenes
s.o. siehe oben
sek Sekunden
sogen. so genannten
spp. Spezies
Tab. Tabelle
TAE Tris/Acetat/EDTA-Standardpuffer
Taq Thermus aquaticus
TBE Tris/Borat/EDTA-Standardpuffer
TE Tris/EDTA
TEN Tris/NaCl
Tn Transposon
Tris Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan tRNA transfer Ribonukleinsäure
U Unit
u.a. unter anderem
ÜN Über Nacht
UV Ultraviolett
V Volt
(v/v) Volumen pro Volumen (volume per volume)
Vol. Volumen
W Watt
YAC Yeast Artificial Chromosome
z.B. zum Beispiel
z.T. zum Teil
Zn Zink
ZNS Zentrales Nervensystem
% Prozent
X ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
DATEI FORMATE
.ab1 Ausgabeformat von ABI-Sequenzierautomaten .abd Ausgabeformat von MegaBace-Sequenzierautomaten .ace Assembly-Ausgabeformat für Consed
.esd Ausgabeformat von MegaBace-Sequenzierautomaten .fas Sequenzformat, das nur die Basen der Sequenz enthält .phd Editor-lesbares Format für Sequenzdateien
.qual Phred-Qualitätsdatei
.scf Standarddateiformat für Chromatogramm-Dateien
ABBILDUNGSVERZEICHNIS
Abbildung 1.1: Phylogenetischer Baum von Listeria spp... 8
Abbildung 1.2: Virulenzgencluster in Listeria spp... 16
Abbildung 1.3: Internaline in Listeria spp... 18
Abbildung 1.4: Desoxynukleotid (dNTP)... 21
Abbildung 1.5: Didesoxynukleotid (ddNTP)... 21
Abbildung 1.6: Ausschnitt aus einem Sequenziergel... 22
Abbildung 1.7: pUC19-Sequenziervektor... 23
Abbildung 1.8: Whole Genome Shotgun-Ansatz und hierarchischer Ansatz... 25
Abbildung 3.1: scf-retype Programm von Dr. Schummer ... 71
Abbildung 3.2: Assembly-Prozess: Überlappungen von Einzelsequenzen. ... 73
Abbildung 3.3: Bildung der Contig-Sequenz aus überlappenden Sequenzen... 73
Abbildung 3.4: Navigate-Fenster des Editors Consed. ... 77
Abbildung 3.5: Low consensus quality-Fenster des Editors Consed. ... 78
Abbildung 3.6: Aligned Reads-Fenster des Editors Consed. ... 78
Abbildung 3.7: Trace-Fenster des Editors Consed ... 79
Abbildung 3.8: Optionen des Editors Consed... 79
Abbildung 4.1: Mit dem Nebulizer gescherte genomische DNA von L. welshimeri. ... 84
Abbildung 4.2 und 4.3: Gelstück vor und nach Exzision der DNA von L. welshimeri im 1,6-Kb-Bereich... 85
Abbildung 4.4: Größenkontrolle der DNA nach Exzision und Gelelution... 85
Abbildung 4.5: Ermittlung der Insert-Größen durch PCR mit Taq Polymerase... 86
Abbildung 4.6 und 4.7: Gelstück vor und nach Exzision der HindIII verdauten chromosomalen DNA von L. welshimeri... 87
Abbildung 4.8: EcoRI-Verdau der TempliPhi-DNA. ... 89
XII ABBILDUNGSVERZEICHNIS
Abbildung 4.9 und 4.10: Gelstück vor und nach Exzision der chromosomalen DNA von
L. welshimeri und L. seeligeri im 40 Kb-Bereich... 95
Abbildung 4.11: Ermittlung der Insert-Größe durch Restriktionsverdau mit NotI... 96
Abbildung 4.12: Fosmidkarte des L. welshimeri-Genoms... 97
Abbildung 4.13: BAC-Karte des L. welshimeri-Genoms. ... 97
Abbildung 4.14: Fosmidkarte des L. seeligeri-Genoms... 100
Abbildung 4.15: Lander-Watermann-Plot des L. welshimeri-Genomprojektes. ... 105
Abbildung 4.16: Lander-Watermann-Plot des L. seeligeri-Genomprojektes. ... 106
Abbildung 4.17: Consed Assembly View des L. welshimeri-Genomprojekts nach Beendigung der zweiten Shotgun-Phase. ... 107
Abbildung 4.18: Consed Assembly View des L. seeligeri-Genomprojektes nach Beendigung der Shotgun-Phase... 108
Abbildung 4.19: Primer walking-Read, dargestellt im Consed Aligned Reads View... 112
Abbildung 4.20: Im Consed Aligned Reads View dargestellter Finishing-Read, der am Ende Vektorsequenz enthält... 113
Abbildung 4.21: Finishing-Read auf Grundlage eines PCR-Produktes, dargestellt im Consed Aligned Reads View. ... 117
Abbildung 4.22: Restriktionsverdau des das Doppeloperon enthaltenden Fosmids von L. welshimeri mit SpeI. ... 120
Abbildung 4.23: Restriktionsverdau des Fosmids mit SpeI. ... 121
Abbildung 4.24: Restriktionsverdau der pUC19-Klone mit KpnI und SalI... 122
Abbildung 4.25: Restriktionsverdau des das Doppeloperon enthaltenden Fosmids von L. seeligeri... 123
Abbildung 4.26: Consed Assembly View des L. welshimeri-Genoms nach Abschluss der Finishing-Phase... 124
Abbildung 4.27: Consed Assembly View des L. seeligeri-Genoms nach Abschluss der Finishing-Phase... 124
Abbildung 4.28: Consed Aligned Reads View im Bereich eines durch ein PCR-Produkt durchgeführten Polishings. ... 126
Abbildung 4.29: Consed Aligned Reads View: Polishing auf einem Plasmid. ... 126
Abbildung 4.30: BLASTP-Abgleich von L. seeligeri bzw. L. welshimeri zu
L. monocytogenes EGDe, L. innocua CLIP 11262 und L. monocytogenes
F2365 (4b)... 129
Abbildung 4.31: Charakteristika des L. welshimeri- und L. seeligeri-Genoms... 136
Abbildung 4.32: Das zirkuläre Chromosom von L. welshimeri... 137
Abbildung 4.33: Das zirkuläre Chromosom von L. seeligeri. ... 137
Abbildung 4.34: Cluster der orthologen Gene zwischen den Listeria-Spezies. ... 138
Abbildung 4.35: MUMmer-Alignment der Genome von Listeria spp. verglichen zu dem L. monocytogenes EGDe-Genom... 139
Abbildung 4.36: Vergleich der sechs Listeriengenome mittels des Programms Mauve. ... 140
Abbildung 4.37: Phylogenetischer Baum der sechs Listerienspezies... 141
Abbildung 5.1: Phasen des L. seeligeri-Genomprojektes. ... 142
Abbildung 5.2: Phasen des L. welshimeri-Genomprojektes. ... 143
Abbildung 5.3: Vergleichende Darstellung der zirkulären genomischen Karten. ... 161
1. EINLEITUNG
1.1. Identifizierung und Charakterisierung von pathogenen Mikroorganismen
Schon seit der Antike werden übertragbare Krankheiten als eine besondere Bedrohung empfunden. Aber erst Robert Koch (1843-1910) führte die Ursachen von übertragbaren Krankheiten im Zusammenhang mit seinen Forschungen zur Biologie des Milzbranderregers Bacillus anthracis (1876), zur Ursache der Tuberkulose (1882) und zur Ausbreitung der Cholera (1884) auf sogenannte „pathogene Agentien“ zurück. Koch formulierte Kriterien, die auch als Kochsches Postulat bezeichnet werden, die erfüllt sein müssen, wenn man nachweisen will, dass eine bestimmte Art von Mikroorganismus eine bestimmte Krankheit verursacht. Diese Kriterien besagen, dass 1.) Krankheitserreger aus Patientenmaterial isolierbar und in Reinkultur anzüchtbar sein müssen, dass 2.) sie in Versuchstieren ensprechende Krankheitssymptome auslösen und 3.) aus den Läsionen reisolierbar sein sollten. Da bestimmte humanpathogene Erreger (z.B. Shigellen) nicht in der Lage sind, ein gleichwertiges Krankheitsbild in Versuchstieren zu erzeugen, erweiterte Kiyoshi Shiga (1870- 1957) deshalb 1898 das Kochsche Postulat um die Bedingung, dass das Patientenserum den für die Infektion verantwortlichen Erreger agglutinieren sollte, um die Induktion einer humoralen Immunantwort zu belegen. Diese nun geschaffene Möglichkeit zur Identifizierung von pathogenen Mikroorganismen bewirkte, dass vor allem in Mitteleuropa und in Nordamerika das Auftreten von Infektionskrankheiten stark reduziert wurde. Tatsächlich konnten aber mit dem von Koch veröffentlichten Postulat nur die obligat pathogenen Mikroorganismen erfasst werden, zu denen die Erreger des Typhus (Salmonella typhi), der Cholera (Vibrio cholerae), der Pest (Yersinia pestis), der Tuberkulose (Mycobacterium tuberculosis) oder der Diphterie (Corynebacterium diphteriae) zählen. Nicht durch das von Koch veröffentlichte Postulat erfasst werden dagegen Krankheitserreger mit hoher
2 EINLEITUNG
Wirtsspezifität, oder aber fakultativ pathogene Mikroorganismen, zu denen Mikroorganismen der Haut (Staphylococcus epidermidis), der normalen Darmflora (Escherichia coli) oder der Umwelt (Pseudomonas aeruginosa, Listeria spp.) gehören. Letztere können unter bestimmten Voraussetzungen, wie z.B. einem abwehrschwachen Wirt, Krankheiten auslösen. Da heute die Mehrzahl der bakteriellen Infektionen in Europa durch fakultativ pathogene Mikroorganismen ausgelöst wird, ist es zum einen notwendig, den Begriff Pathogenität immer im Zusammenhang mit dem entsprechenden Wirt zu sehen, zum anderen die biologischen Eigenschaften des potentiellen Krankheitserregers zu charakterisieren. Durch molekularbiologische, genetische, biochemische, zellbiologische und immunologische Methoden konnte gezeigt werden, dass viele Krankheitserreger in der Lage sind, Eigenschaften auszubilden, die als Pathogenitäts- oder Virulenzfaktoren bezeichnet werden können. So können bestimmte Spezies einer Art durch spezifische Virulenzfaktoren zu organspezifischen Krankheitserregern werden; andere Vertreter sind dagegen apathogen.
S. Falkow transportierte das Koch-Henlesche Postulat auf eine molekulare Ebene.
Pathogenitätsfaktoren zeigen demnach folgende Charakteristika: Ein bestimmtes Gen oder ein bestimmtes Merkmal kommt bei pathogenen Mikroorganismen vor, eine Inaktivierung des korrespondierenden Gens muss zu einer Reduktion der Virulenz führen, und eine Rückführung des Gens in die avirulente Mutante sollte wieder das ursprüngliche Virulenzpotential herstellen. Nicht berücksichtigt wird dagegen, dass pathogene Mikroorganismen aufgrund eines hohen ökologischen Anpassungsdrucks bestimmte Stoffwechselleistungen ausbilden, die es ihnen ermöglichen, bestimmte Nischen zu besetzen und nachfolgend Infektionen auszulösen. Somit können diese Stoffwechselleistungen auch als indirekte Pathogenitätsfaktoren bezeichnet werden.
Durch den ständigen genetischen Austausch unter den Mikroorganismen, der auch als horizontaler Gentransfer bezeichnet wird, treten ständig neue hochpathogene Varianten auf, wobei erst nach Analyse der neuen Stammtypen gezielte Therapie- und Präventivmaßnahmen eingesetzt werden können. Auch Vakzinierungsmaßnahmen bleiben hier erfolglos, da diese nur gegen bekannte Erreger und Erregertypen eingeleitet werden können. Ebenfalls durch horizontalen Gentransfer können neue Resistenzen gegen Chemotherapeutika entstehen. Hier spielen virulenzassoziierte Gene als alternative Targets für Chemotherapeutika eine Rolle.
Die Identifizierung von Pathogenitätsfaktoren, spezifischen Stoffwechselleistungen, und Resistenzen gegen Chemotherapeutika dient nicht nur der Prävention von Infektionskrankheiten, sondern auch dazu, die diagnostischen sowie therapeutischen Methoden und Ansätze zu verbessern und um neue Aspekte zu erweitern.
Die Grundlagenforschung hilft u.a. auch bei der Entwicklung neuer Vakzinen, für die ein genaueres Verständnis der Lebensprozesse der pathogenen Erreger bis auf die molekulare Ebene des Genoms unerlässlich ist.
1.2. Bakterielle Pathogenitätsfaktoren
Generell unterscheidet man zwischen spezifischen Pathogenitätsfaktoren und unspezifisch wirkenden Faktoren. Spezifische Virulenzfaktoren wie Adhäsine, Invasine, Toxine, Kapseln, Lipopolysaccharide oder äußere Membranproteine weisen entweder eine aktive Beteiligung an der Infektionserkrankung auf (offensive Faktoren) oder sie sind für eine Umgehung bzw.
Überwindung der unspezifischen Immunabwehr des Wirtsorganismus erforderlich (defensive Faktoren). Unspezifische Virulenzfaktoren tragen zur Pathogenität von Mikroorganismen bei, indem sie die Vitalität beziehungsweise „Fitness“ der Mikroben erhöhen und damit gute Voraussetzungen für das Überleben und die Vermehrung im Wirt schaffen.
Die zu den offensiven Pathogenitätsfaktoren gehörenden Adhäsine bewirken eine spezifische Haftung der Mikroorganismen an distinkte Wirtszellrezeptoren. Die der adhäsinvermittelten Kolonisation folgenden biologischen Prozesse haben große Bedeutung für den Fortgang einer Infektion. So bilden insbesondere sich extrazellulär vermehrende Mikroorganismen Mikrokolonien oder Biofilme. Des Weiteren kann es durch die Bindung von Bakterien an Wirtszellrezeptoren zur Auslösung und Beeinflussung von Signaltransduktionskaskaden in Wirtszellen, aber auch zur Induktion von bakteriellen Signaltransduktionsvorgängen kommen.
Außerdem kann die Aufnahme der Bakterien in nichtprofessionell phagozytierende Wirtszellen induziert werden.
Bakterielle Invasine induzieren die Internalisierung der Bakterien ebenfalls infolge einer Interaktion mit als Rezeptoren dienenden eukaryontischen Oberflächenproteinen auf den Wirtszellen. Nach Invasion verbleiben die Bakterien entweder im Endosom, in welchem
4 EINLEITUNG
einige Bakterienspezies durch die Wirtszelle passagieren und diese auf der gegenüberliegenden Seite verlassen, oder aber sie entgehen durch Lyse des Endo- oder Phagosoms den bakteriziden Mechanismen in den Phagolysosomen und finden dann im nährstoffreichen Cytoplasma wichtige Substanzen für die bakterielle Vermehrung. Letzteres ist charakteristisch für Listerien, Shigellen und Rickettsien. Diese Erreger haben außerdem die Fähigkeit, Aktin an einem bakteriellen Zellpol zu polymerisieren und sich mittels dieses Aktinschweifes durch die Wirtszelle zu bewegen und in die Nachbarzelle vorzudringen, ohne die ursprünglich infizierte Wirtszelle verlassen zu haben.
Zu den offensiven Pathogenitätsfaktoren zählen weiterhin Toxine. Sie üben einen schädigenden Effekt auf den Wirtsorganismus aus, welcher nachfolgend dessen Tod bewirken kann. Proteintoxine stellen die Hauptvirulenzfaktoren bei Bakterien dar (Hacker et al., 2000).
Demgegenüber stehen die defensiven Pathogenitätsfaktoren, mit deren Hilfe das Bakterium die Immunantwort des Wirtes abwehrt. Zu diesen Faktoren rechnet man unter anderem Kapseln und Schleimstrukturen. Sie bieten Schutz gegen verschiedene Abwehrmechanismen des Wirtsorganismus, indem sie beispielsweise die Aufnahme der Bakterien durch professionell phagozytierende Zellen erschweren, oder aber durch die Nachahmung wirtseigener Oberflächenstrukturen durch die Polysaccharidkapsel, was auch als molekulare Mimikry bezeichnet wird, die Wirtsabwehr umgehen. Allerdings tragen nur bestimmte Kapseltypen zur Virulenz bei, andere aber nicht.
Auch Impedine gehören zu den defensiven Pathogenitätsfaktoren. Sie imitieren erfolgreich die Epitope wirtseigener Antigene und tragen damit ebenfalls zur Umgehung oder sogar Verhinderung der Immunantwort bei.
Moduline sind Faktoren, die bestimmte Funktionen von Enzymen der Wirtszelle nachahmen und dadurch das Immunsystem durch Immunmodulation oder Immunsuppression manipulieren. Somit können die Erreger länger im Wirtsorganismus überleben. Es gibt eine große Anzahl bakterieller Enzyme, die dazu dienen, die Abwehr des Wirtsorganismus zu überleben und diesen erfolgreich zu kolonisieren. Pathogene Bakterien können Proteine exprimieren, die antimikrobielle Peptide oder Komplementfaktoren direkt inaktivieren können, oder aber die Interaktion dieser Substanzen mit der Membran verhindern. Durch spezifische Transportsysteme kann ein nach einer Membranschädigung einsetzender
Ionenverlust kompensiert werden. Durch bakterielle Superoxiddismutasen (SODs) werden die von der Wirtszelle produzierten Sauerstoffradikale inaktiviert.
RecA stellt ein wichtiges Enzym der DNA-Reparatur nach bereits entstandenen oxidativen DNA-Schäden dar. Zum Schutz gegen Fehlfunktionen von beschädigten Proteinen verfügen Bakterien über eine Reihe von heat-shock-Proteasen wie etwa ClpC, welches unter Stressbedingungen exprimiert wird und für die Degradation beschädigter Proteine verantwortlich ist (Hacker et al., 2000). Der bakterielle Metabolismus stellt die Grundlage für das Wachstum und die Vermehrung der Bakterien dar und ist somit untrennbar mit der pathogenen Potenz eines Krankheitserregers verknüpft. So sind pathogene Mikroorganismen in der Lage, ihre Stoffwechselleistungen flexibel an neue Bedürfnisse anzupassen und so einen Wirtswechsel beziehungsweise einen Übergang aus einem Umwelthabitat auf einen Wirtsorganismus zu ermöglichen. So kann zum Beispiel eine Umstellung des Metabolismus auf eine Nutzung von Stoffwechselprodukten des Wirtes erfolgen. Diese Stoffwechselfunktionen leisten einen eher unspezifischen und dennoch essentiellen Beitrag zur bakteriellen Pathogenität, indem sie die Vitalität bzw. Fitness des Krankheitserregers erhöhen und damit erst die Voraussetzungen für die Besiedelung eines bestimmten Habitats und für die Persistenz und Proliferation eines Bakteriums im Wirtsorganismus schaffen. Man spricht deshalb von unspezifischen Pathogenitätsfaktoren im Gegensatz zu der zuvor geschilderten Vielfalt an spezifischen offensiven sowie defensiven Pathogenitätsfaktoren.
Zu den unspezifischen Pathogenitätsfaktoren gehören bakterielle Eisenaufnahme-Systeme, denn Eisen wird auch von apathogenen Bakterien für essentielle Prozesse wie den Elektronentransport benötigt. Extrazelluläre Mikroorganismen haben sehr unterschiedliche Strategien evolviert, um sich mit Eisen zu versorgen. Einige Bakterien produzieren Reduktasen, die extrazelluläres Eisen zu Fe2+ reduzieren, welches anschließend aufgenommen wird. Andere verwenden „Siderophoren“, die nach Bindung von Eisenionen ihrerseits an bakterielle Zellwandrezeptoren binden, welche den Transport der beladenen Verbindungen ins Cytoplasma bewirken. Wieder andere binden mittels spezifischer Rezeptoren eukaryotische Eisenträgersubstanzen wie Transferrin, Lactoferrin und Hämverbindungen, nehmen diese auf und nutzen das Eisen. Über die Strategien, die intrazelluläre Bakterien nutzen, um Eisen zu erwerben, ist relativ wenig bekannt. Eisen hat zusätzlich eine wichtige Bedeutung als ein Signal für die Induktion bzw. Repression der Gen-Expression, weil die
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Konzentration an freien Fe2+-Ionen in vielen Umwelthabitaten deutlich höher ist als in eukaryontischen Geweben. Sowohl von pathogenen als auch von apathogenen Mikroorganismen werden unterschiedliche Enzyme sezerniert, die zur Pathogenität beitragen können. Hierzu zählen Zn-Metalloproteasen, Ureasen, Katalasen sowie Superoxid- Dismutasen. Im Einzelfall ist aber schwer festzustellen, ob es sich um spezifische Anpassungs- und Pathogenitätsmechanismen handelt, oder ob sie eher unspezifisch in den Pathogenitätsprozeß eingreifen (Hacker et al., 2000).
Eine besondere Gruppe von pathogenen Erregern bilden die obligat und fakultativ intrazellulären Bakterien. Die intrazelluläre Lokalisierung dieser Bakterien bietet zum einen Schutz vor Angriffen des Immunsystems des Wirtes, der Wirkung von Antibiotika und vor natürlich mechanischen Abwehrmechanismen. Zum anderen ermöglicht es die Ausbreitung in tieferes Wirtsgewebe, was nachfolgend zur systemischen Dissemination führen kann. Obligat intrazelluläre Bakterien wie beispielsweise Chlamydien oder Rickettsien können bestimmte essentielle Moleküle nicht mehr selbst synthetisieren und sind deshalb nicht mehr in der Lage, sich außerhalb von Wirtszellen zu vermehren.
Im Gegensatz hierzu sind die professionell-fakultativ intrazellulären Bakterien, zu denen die Gattungen Listeria, Salmonella, Shigella und Yersinia gehören, zum Wachstum sowohl außerhalb als auch innerhalb von eukaryontischen Wirtszellen befähigt. Die Befreiung aus dem Phagosom nach der Internalisierung der Bakterien sowie Persistenz und Proliferation im Cytoplasma der Wirtszellen ist unter den intrazellulären Erregern wiederum charakteristisch für Listerien, Shigellen und Rickettsien (Hacker et al., 2000). Intrazelluläre Bakterien sind verantwortlich für eine Vielfalt von Infektionskrankheiten mit signifikanter Letalitätsrate.
Von daher sind sie von hoher medizinischer Relevanz. Durch Genomvergleich zwischen apathogenen und pathogenen Vertretern einer Gattung ist es möglich, sowohl spezifische als auch unspezifische Pathogenitätsfaktoren zu identifzieren. Hierdurch gewinnt man ein tieferes Verständnis von der Pathogenese einer Erkrankung, was eine wichtige Voraussetzung für Prävention und Therapie von Erkrankungen darstellt. Des Weiteren ermöglicht dieses neue Möglichkeiten für die Differenzierung zwischen pathogenen und apathogenen Vertretern im Zusammenhang mit der Diagnose einer Erkrankung. Listeria monocytogenes stellt in diesem Zusammenhang aufgrund seiner fakultativ intrazellulären Lebensweise einen
Modellorganismus für das Studium von spezifischen und unspezifischen Pathogenitätsfaktoren dar. (Chakraborty, 1999, Goebel et al., 1993, Tilney et al., 1993).
1.3. Die Gattung Listeria
Der Genus Listeria besteht aus einer Gruppe gram-positiver Bakterien mit niedrigem GC- Gehalt, eng verwandt mit Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Streptococcus und Staphylococcus. Listeria spp. sind fakultativ anaerobe, nicht sporenbildende, unbekapselte Stäbchen, welche zwischen 10-25°C beweglich sind (Collins et al., 1991, Rocourt, 1999, Sallen et al., 1996). Listerien zeichnen sich durch ein ubiquitäres Vorkommen aus. Sie wurden aus Erdboden, Pflanzen, Fäzes, vergehendem Gemüse, Wasserproben, tierischer Nahrung wie frischem und gefrorenem Geflügel oder frischem und verarbeitetem Fleisch, Rohmilchprodukten, Käse sowie aus asymptomatischen menschlichen und tierischen Trägern isoliert (Seeliger et al., 1986, Weis et al., 1975). Ihr natürlicher Lebensraum ist verwesendes Pflanzenmaterial, wo Listerien als Saprophyten leben. Listerien können sich auch bei hohen Salzkonzentrationen (10 % NaCl) und innerhalb eines breiten pH- (pH 4,5 bis 9) und Temperaturbereichs (0 bis 45°C) vermehren (Grau et al., 1990) und auch längere Perioden des Einfrierens und der Trockung überleben (Lou et al., 1998). Die Fähigkeit des Bakteriums, auch bei Kühlschranktemperaturen zu wachsen, erhöht das Kontaminationsrisiko für Milchprodukte, Fleisch, Meeresfrüchte und andere industriell hergestellte Nahrungmittel.
Zur Gattung werden insgesamt sechs Arten gerechnet: Listeria monocytogenes, L. ivanovii, L. seeligeri, L. innocua, L. welshimeri und L. grayi. Davon weisen zwei ein pathogenes Potential auf: L. monocytogenes ist sowohl tier- als auch humanpathogen, bei L. ivanovii handelt es sich um ein tierpathogenes Bakterium, das bevorzugt Schafe und Rinder infiziert.
Basierend auf unterschiedlichen Ansätzen wurden verschiedene Abstammungslinien unter den sechs Listeria-Spezies vorgeschlagen. Alle Ansätze gehen zunächst davon aus, dass L. grayi phylogenetisch am weitesten entfernt zu den anderen fünf Listeria-Spezies ist. Bei den letztgenannten unterscheiden sich aber die Ansätze in der Darstellung der Verwandtschaftsverhältnisse. Mit Hilfe der Multilocus Enzym Elektrophorese (MLEE) von 18 Enzymstellen begründeten Boerlin et al., dass L. seeligeri und L. ivanovii eine
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Abstammungslinie bilden. L. innocua, L. welshimeri und L. monocytogenes hingegen gehören zu einer anderen, wobei L. innocua und L. welshimieri als Schwesternspezies aus L. monocytogenes hervorgegangen sind (Boerlin et al., 1991).
Im Gegensatz dazu ergaben phylogenetische Untersuchungen auf der Basis von 16S-rRNA, dass L. monocytogenes und L. innocua eine enge Verwandtschaft aufweisen, L. welshimeri dagegen aber einen weiter entfernten Zweig innerhalb dieser Abstammungslinie bildet (Vaneechoutte et al., 1998). Außerdem wurde der intergenische Bereich zwischen der 16S- 23SrDNA aller Listeria-Spezies analysiert, der sich aus einer großen und einer kleinen Einheit zusammensetzt. Die Analyse ergab zwar eine enge Verwandtschaft zwischen L. monocytogenes und L. innocua, andererseits wurden aber widersprüchliche Verwandtschaftsverhältnisse zwischen L. innocua, L. welshimeri und L. seeligeri festgestellt (Graham et al., 1997).
Neueste Erkenntnisse zur Evolution des Genus Listeria wurden durch die Analyse der 16S- und 23S-rDNA sowie der iap-, ldh-, prs-, und vclB-Gene gewonnen, welche bei allen Mitgliedern des Genus vorhanden sind. Hiernach haben sich fünf Spezies in zwei Abstammungslinien von einem gemeinsamen Vorfahr aufgeteilt. Die eine Abstammungslinie enthält L. monocytogenes und L. innocua, während die andere L. welshimeri, L. ivanovii und L. seeligeri enthält, wobei L. welshimeri den tiefsten Zweig besetzt (Abb. 1.1) (Schmid et al., 2004).
Abbildung 1.1: Phylogenetischer Baum von Listeria spp (Schmid et al., 2004).
Listeria grayi
Listeria innocua
Listeria monocytogenes
Listeria ivanovii
Listeria seligeri
Listeria welshimeri 100
100 86
98
0.10
Innerhalb der Spezies L. monocytogenes konnte eine Heterogenität in Bezug auf das Virulenzpotential gezeigt werden. So sind nur drei Serotypen, 1/2a, 1/2b und 4b für mehr als 90% aller Infektionen mit L. monocytogenes verantwortlich, auch wenn andere Serotypen, wie 1/2c oder 4a, oft in kontaminierten Lebensmitteln nachgewiesen werden konnten (Farber et al., 1991, Rocourt et al., 1989). Durch Methoden der molekularen Epidemiologie, wie Pulsfeld Gelelektrophorese „PFGE” (Brosch et al., 1994), Ribotypisierung, Virulenzgenpolymorphismus (Rasmussen et al., 1995) und MLEE (Piffaretti et al., 1989) ließen sich die L. monocytogenes-Isolate in drei verschiedene evolutionäre Zweige unterteilen, die mit den Serotypen korrespondieren. So umfasst der erste Zweig (Serotyp 1/2b und 4b) Stämme, die für alle durch Lebensmittel übertragenen epidemischen Erkrankungen des Menschen sowie auch für einige Einzelfälle bei Mensch und Tier verantwortlich sind.
Dem zweiten Zweig (Serotyp 1/2a, 1/2c und 3a) werden klinische Isolate aus Mensch und Tier zugeordnet, die jedoch nie mit einem epidemischen Auftreten der Erkrankung assoziiert sind. Schließlich werden die Stämme des dritten Zweiges (Serotyp 4a) fast ausschließlich aus tierischen Wirten isoliert (Wiedmann et al., 1997b).
1.4. Listeriose: klinisches Bild und Pathogenese
Die offizielle Entdeckung der Gattung Listeria geschah 1924 durch E.G.D. Murray, als dieser L. monocytogenes als Ursache einer septikämischen Erkrankung aus dem Blut von Laborkaninchen und Meerschweinchen isolierte (Murray et al., 1926).
Vom ersten Fall humaner Listeriose wurde im Jahre 1929 aus Dänemark berichtet (Nyfelt, 1929), wobei die erste Listeria-Kultur aus dem Isolat eines an Meningitis erkrankten Patienten schon acht Jahre zuvor in Frankreich gewonnen worden war (Dumont et al., 1921, Seeliger, 1988). Die besondere Rolle von Listeria monocytogenes als Pathogen wurde aber zunächst nicht erkannt. Erst während der Nachkriegszeit wurde es als eine wichtige Ursache von neonataler Sepsis und Meningitis beschrieben (Potel, 1952). Mit der Entwicklung von immunsuppressiven Medikamenten wie z.B. Kortikosterioden und der Chemotherapie gegen Krebs in den 50er und 60er Jahren wurde Listeriose schließlich bei erwachsenen Patienten mit geschwächtem Immunsystem erkannt (Louria et al., 1967). Die Entwicklung von renaler
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Dialyse und später der Organtransplantation dehnte die Risikogruppe für Listeriose aus (Stamm et al., 1982).
Seit 1983 gewann die Listeriose durch eine Serie von epidemischen Ausbrüchen in Nord- Amerika und Europa als nicht zu unterschätzende Lebensmittelinfektion an Bedeutung (Bille, 1990, Fleming et al., 1985, Linnan et al., 1988, McLauchlin, 1987, Ryser, 1999). In den späten 80er Jahren kam durch die HIV-Epidemie eine weitere Risikogruppe hinzu, wobei hier das Risiko einer Erkrankung 500 mal größer ist als bei der Normalbevölkerung (Jurado et al., 1993).
Listeriose ist ferner auch weiterhin ein Problem in der Veterinärmedizin. Dort verursacht sie Aborte und Encephalitis bei Wiederkäuern. Die Krankheit wird auch „circling disease“
genannt, weil diese im Hinterhirn auftritt und so vor dem Tod zu Ataxien bei den betroffenen Tieren führt (Gill, 1937). Die Listeriose bei Tieren ist überwiegend eine fütterungsbedingte Erkrankung, und die Ursache für die Kontamination des Futters ist gewöhnlich umweltbedingt (Low et al., 1989, McLauchlin, 1997). Da Listerien in der Erde, in Pflanzen und in verrottender Vegetation vorkommen, können sie in diesen Materialien persistieren und die Tiere, die ihnen ausgesetzt werden, infizieren. Das Futter kann ferner auch durch wildlebende Säugetiere und Vögel kontaminiert werden, die die Listerien mit ihren Fäzes verbreiten (Smith, 1994). Ebenso können Farmtiere mit einer latenten Listerieninfektion durch ihre Fäzes die Umgebung kontaminieren. Daher kann der Bauernhof ein Reservoir für Listerien darstellen (Wesley, 1999).
Silage ist die häufigste Quelle einer fütterungsbedingten Listeriose (Fenlon, 1999, Gray, 1960, Wesley, 1999). Besonders pathogene Listerien, die auf dem Pflanzenmaterial vorhanden sind, vermehren sich, wenn dieses nicht richtig bei einem pH-Wert unter 4,5 fermentiert wurde (Fenlon, 1999). Mehrere Ausbrüche von Listeriose bei Tieren wurde darauf zurückgeführt, dass Silage von schlechter Qualität verfüttert wurde (Fenlon, 1999, Wesley, 1999, Wiedmann et al., 1997a).
Es gibt mehrere prädisponierende Faktoren für Listeriose bei Tieren. So wurde bei Schafen und Ziegen nachgewiesen, dass plötzlicher Futterwechsel, eine gleichzeitige Erkrankung, Zahnwechsel, overcrowding, schwere Regenfälle oder extreme Kälte sowie das Hinzukommen neuer Tiere in die Herde, Trächtigkeit, Geburt, Laktation und lange Transporte
prädisponierend für eine Listeriose sind. Dies geschieht hauptsächlich durch Schwächung der physikalischen und immunologischen Abwehr (Wesley, 1999).
Die Aufnahme des humanpathogenen Erregers L. monocytogenes durch den Menschen erfolgt in den meisten Fällen über den Verzehr kontaminierter Lebensmittel. Häufige Infektionsquellen sind Weichkäse und Milchprodukte, Pasteten und Würste, geräucherter Fisch, „Delikatessen“ und generell industriell hergestellte, im Kühlschrank gelagerte Fertiggerichte, die ohne gekocht oder aufgewärmt zu werden, gegessen werden (Farber et al., 1991, McLauchlin, 1991, McLauchlin et al., 1991, McLauchlin et al., 1990, Rocourt, 1996, Ryser, 1999).
Das Auftreten einer klinisch manifesten Listeriose hängt von drei grundlegenden Variablen ab: erstens von der Anzahl der mit der Nahrung aufgenommenen Erreger, zweitens von den pathogenetischen Eigenschaften des jeweiligen Stammes und drittens vom Immunstatus des Wirtsorganismus (Vazquez-Boland et al., 2001b).
Der Großteil aller Infektionen immunkompetenter Personen ohne Risikofaktoren verlaufen bei Aufnahme einer niedrigen Listeriendosis inapparent. Neben der zellulären Immunabwehr bietet auch das saure Milieu des Magens einen Infektionsschutz (Schlech et al., 1990). Die Risikogruppen für Listeriose sind Schwangere und Neugeborene, ältere Menschen und Menschen mit prädisponierenden Faktoren, die zur Minderung der zellvermittelten Immunität führen, wie zum Beispiel bei Krebspatienten (speziell bei Leukämie, Lymphomen oder Sarkomen), bei Chemotherapie, immunsupprimierender Therapie (Organtransplantationen und Gebrauch von Kortikosteroiden), chronischen Lebererkrankungen (Zirrhose oder Alkoholismus), Nierenerkrankungen und Diabetes (Farber et al., 1991, McLauchlin, 1990c, Moors et al., 1999, Rocourt et al., 1992, Schuchat et al., 1991).
Die durch L. monocytogenes verursachte Listeriose beim Menschen tritt hauptsächlich in zwei Erscheinungsformen auf: zum einen als eine milde nichtinvasive Magen-Darmerkrankung und zum anderen als eine invasive Erkrankung. Die nichtinvasive gastrointestinale Form der Listeriose tritt bei ansonst gesunden Erwachsenen auf und ist nach einer Inkubationszeit von 18 bis 20 Stunden durch Fieber, Durchfall und Erbrechen gekennzeichnet (Slutsker et al., 1999).
Bei der invasiven Listeriose unterscheidet man zwei grundlegende Erscheinungsformen: die Listeriose des Erwachsenen und die perinatale Listeriose. In beiden Fällen stehen die
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vorherrschenden klinischen Symptome im Zusammenhang mit einer generalisierten oder lokalen Entzündung des Zentralen Nervensystems (ZNS). Die invasive Listeriose ist gewöhnlich eine sehr schwere Erkrankung. Die durchschnittliche Mortalitätsrate liegt beim Menschen bei 20 bis 30 % oder höher, und dies trotz frühzeitiger antibiotischer Therapie (McLauchlin, 1990b, McLauchlin, 1990c, Rocourt et al., 1992, Schuchat et al., 1991).
Die fetomaternale oder neonatale Listeriose wird nach dem zeitlichen Auftreten der klinischen Symptome in eine „early-onset“ und eine seltenere (10 bis 15 % der Fälle perinataler Infektionen) „late-onset“ Form unterteilt.
Die häufigere „early-onset“ Form resultiert aus einer Infektion des Fetus durch die Plazenta bei Bakteriämie der Schwangeren und einer sich entwickelnden Chorioamnionitis. Auf dem Boden dieser sich entwickelnden Chorioamnionitis kann die Listeriose ab dem fünften Monat nach der Gestation zum Abort führen. Zudem kann sie sich in Form von Früh- oder Totgeburten in einer generalisierten Infektion des Neugeborenen manifestieren. Hier spricht man auch von dem klinischen Syndrom der Granulomatosis infantiseptica, das durch disseminierte Abszesse in verschiedenen Organen und eine hohe Mortalitätsrate gekennzeichnet ist (Klatt et al., 1986). Die infizierte Mutter zeigt für gewöhnlich einen weitgehend asymptomatischen Verlauf, gegebenenfalls auch leichte Grippe-ähnliche Symptome wie Fieber, Abgeschlagenheit, Kopfschmerzen sowie Gelenk- und Muskelschmerzen.
Die „late-onset“ Form der perinatalen Listeriose tritt ein bis acht Wochen post partum auf.
Meist zeigt sich hier das klinische Bild der Meningitis, in einigen Fällen auch Gastroenteritis und Pneumonie. Die Infektion erfolgt hierbei vermutlich über eine Aspiration von kontaminiertem mütterlichem Exsudat unter der Geburt oder nosokomial. Die Letalität ist bei der späten Form mit 10 bis 20 % niedriger als bei der „early-onset“ Form (15 bis 50 %).
L. monocytogenes ist eine der drei Hauptursachen der bakteriellen Neugeborenenmeningitis (Lorber, 1997, Rocourt et al., 1992, Schuchat et al., 1991, Synnott et al., 1994).
Die häufigste Form der Listeriose bei nicht schwangeren Erwachsenen ist eine ZNS- Erkrankung (55 bis 70 % der Fälle), meistens in Form einer Meningoencelphalitis, die mit schweren Bewusstseins- und Bewegungsstörungen einhergeht. Eine weitere, häufig vorkommende Form der Listeriose ist Bakteriämie oder Septikämie (15 bis 50 %) (Lorber, 1997). Es gibt des Weiteren noch andere, atypische klinische Formen (5 bis 10 %), wie z.B.
Endocarditis, (dritthäufigste Form), Myocarditis, Arteritis, Pneumonie, Pleuritis, Hepatitis, Peritonitis und lokalisierte Abzesse, Arthritis, Osteomyelitis, Sinusitis, Otitis, Conjunctivitis, Ophthalmitis und bei Kühen auch Mastitis (Blenden et al., 1987, Farber et al., 1991, Gallagher et al., 1988, Gauto et al., 1992, Lorber, 1990, Lorber, 1997, Low et al., 1997, McLauchlin, 1990b, McLauchlin, 1990a, McLauchlin, 1990c, Rocourt, 1994, Slutsker et al., 1999).
Nach Kontakt mit dem Genitaltrakt oder der Plazenta von Kühen, die eine Fehlgeburt aufgrund einer Listerieninfektion hatten, kann es gelegentlich auch zu Hautläsionen kommen.
Diese Art der Infektion tritt hauptsächlich bei Bauern und Tierärzten auf (Allcock, 1992, McLauchlin et al., 1994).
Da kontaminierte Lebensmittel die Hauptinfektionsquelle sowohl für epidemische als auch für sporadisch auftretende Fälle der Listeriose sind (Farber et al., 1991), stellt der Gastrointestinaltrakt die erste Station für den Eintritt pathogener Listerien dar. Von dort dringen die Erreger vermutlich über die M-Zellen im Bereich um die Peyer’schen Plaques in das Darmgewebe ein (Jensen et al., 1997, Racz et al., 1972) und gewinnen so Anschluss an das Lymphsystem oder die Blutbahn und gelangen von dort in die mesenterialen Lymphknoten, in die Milz und in die Leber (Marco et al., 1992, Raveneau et al., 1992). Hier werden sie schnell von ortsansässigen Makrophagen aus dem Blut enfernt und eliminiert (Conlan et al., 1991, Cousens et al., 2000, Mackaness, 1962). Die Vermehrung der überlebenden Listerien findet hauptsächlich in den Hepatozyten statt (Conlan et al., 1992, Cousens et al., 2000, Gaillard et al., 1996, Gregory et al., 2000, Gregory et al., 1992, Rosen et al., 1989). Generell entgeht L. monocytogenes mit der intrazellulären Lebensweise der humoralen Immunantwort des Wirtsorganismus. Weder Antikörper noch B-Zellen sind an der Abwehr einer L. monocytogenes-Infektion im immunkompetenten Wirt beteiligt. Lediglich eine zelluläre Immunantwort gegen L. monocytogenes konnte beobachtet werden. So spielen während dieser frühen Phase der Infektion zunächst Mikroabzesse bildende neutrophile Leukozyten eine Rolle (Rogers et al., 1993), die zwei bis vier Tage nach Infektion durch Granulome bildende Monocyten und Lymphozyten ersetzt werden (Heymer et al., 1988, Mandel et al., 1980). Fünf bis sieben Tage nach Infektion führt die Präsentation von spezifischem L. monocytogenes-Antigen durch Antigen-präsentierende Zellen wie Makrophagen zur Aktivierung und Proliferation von cytotoxischen T-Zellen und schließlich
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zur Eliminierung von L. monocytogenes aus dem infizierten Organismus (Chakraborty, 1999, Gregory et al., 2000, Harty et al., 1992, Kaufmann, 1993, Mielke et al., 1988). Auch CD4+
T-Zellen und natürliche Killerzellen spielen eine Rolle in der Abwehr einer L. monocytogenes Infektion (Cossart, 1995, Daugelat et al., 1996, Emoto et al., 1997, Geginat et al., 1998, Harty et al., 1992, Hsieh et al., 1993). Bleibt im Falle eines immunsupprimierten Wirtes eine Immunantwort aus, führt dieses zu einer ungehemmten Vermehrung der Bakterien im Leberparenchym mit der anschließenden Freisetzung der Bakterien in den Blutstrom. Von dort erreichen die Erreger eine Vielzahl von Organen, wobei L. monocytogenes einen Gewebetropismus für den graviden Uterus und das ZNS aufweist. Das Bakterium hat sowohl die Fähigkeit, die Blut-Hirn-Schranke zu überwinden, welches zu Meningitis oder Meningoencephalitis führt, als auch die Plazenta-Schranke zu überschreiten und anschließend den Fetus zu infizieren (s.o.).
1.5. Organisation und Evolution der Virulenzgene in Listeria spp.
Listeria monocytogenes kann seine Aufnahme in eine Vielzahl nichtphagozitierender Zelltypen induzieren. Hierzu gehören Epithelzellen (Gaillard et al., 1987, Mengaud et al., 1996, Portnoy et al., 1988), Fibroblasten (Kuhn et al., 1988, Sun et al., 1990), Hepatozyten (Dramsi et al., 1995, Gregory et al., 1996, Wood et al., 1993), Endothelzellen (Drevets et al., 1995, Greiffenberg et al., 2000, Parida et al., 1998) und verschiedene Arten von Nervenzellen, einschließlich Neuronen (Drevets, 1997). Sowohl in Makrophagen, als auch in den o.g.
Zelltypen durchläuft L. monocytogenes einen intrazellulären Lebenszyklus.
Nach der Adhäsion an der Oberfläche der eukaryotischen Zelle folgt die Invasion des Bakteriums in die Wirtszelle. Die Invasion erfolgt mittels Zipper-Mechanismus. Während hierbei die bakteriellen Ligandenmoleküle an die Rezeptormoleküle binden, stülpt sich die Wirtszellplasmamembran um die Bakterienzelle, bis das Bakterium völlig eingeschlossen ist (Dramsi et al., 1998, Hacker et al., 2000, Karunasagar et al., 1994, Kuhn et al., 2000, Mengaud et al., 1996, Swanson et al., 1995). Für diese initiale Anheftung und die darauffolgende Internalisierung in die Wirtszelle werden die Internaline A und B benötigt (Dramsi et al., 1995, Gaillard et al., 1991). Internalin A wird dabei vor allem für den Eintritt
in Enterocyten, wie zum Beispiel Caco-2-Zellen benötigt (Gaillard et al., 1991). Internalin B ermöglicht den Eintritt in ein größeres Spektrum von Zelltypen, zu dem verschiedene epithelielle und fibroblastische Zelllinien (Vero, HEp-2, HeLa, CHO, L2, S180) sowie Hepatozyten und Endothelzellen gehören (Dramsi et al., 1997, Greiffenberg et al., 1997, Mengaud et al., 1996, Muller et al., 1998, Parida et al., 1998). Der korrespondierende Wirtszellrezeptor für InlA ist E-Cadherin (Mengaud et al., 1996), InlB dagegen interagiert mit dem Met-Rezeptor (Shen et al., 2000). Nach der Invasion befindet sich das Bakterium in einer phagozystischen Vakuole (Gaillard et al., 1987). Es wird vermutet, daß L. monocytogenes einem Verschmelzen des Lysosoms mit dem Phagosom zum sog. Phagolysosom entgegenwirkt (Alvarez-Domínguez et al., 1997). Schließlich lysiert das Bakterium die Vakuole und es erfolgt ein Übertritt ins Zytoplasma der Wirtszelle. Dieses wird durch einen gemeinsamen Effekt von zwei sekretierten bakteriellen Proteinen, dem Listeriolysin (Hly) und der Phosphatidylinositol-spezifischen Phospholipase (PlcA) bewirkt. Anschließend akkumuliert das Bakterium mit Hilfe des bakteriellen ActA-Proteins wirtseigenes Aktin, welches anschließend zu einer Art Kometenschweif rearrangiert wird. Dieser befähigt das Bakterium zur intra- und interzellulären Bewegung. Nach Kontakt mit der Plasmamembran der Wirtszelle kommt es zu pseudopodartigen Ausstülpungen in die benachbarten Zellen.
Nach der Lyse der Plasmadoppelmembran durch Listeriolysin (Hly) und der Phosphatidylcholinspezifischen Phospholipase C (PlcB) innerhalb der neuen Wirtszelle beginnt ein neuer intrazellulärer Lebenszyklus (Chakraborty et al., 1997, Cossart et al., 1998, Portnoy et al., 1992, Tilney et al., 1993). Hierdurch entgeht das Bakterium den Abwehrmechanismen des Wirtes, wie zirkulierenden Antikörpern und Komplementfaktoren, was die Tatsache erklärt, dass bei Listerien nur eine T-Zell-vermittelte Immunität wirksam ist (Mielke et al., 1997).
Sechs der oben beschriebenen Virulenzfaktoren (prfA, plcA, hly, mpl, actA und plcB), die für den intrazellulären Lebenszyklus von L. monocytogenes verantwortlich sind, liegen auf einem 9-Kb großen chromosomalen DNA-Abschnitt, der auch als LIPI-1 (Listeria pathogenicity island) bezeichnet wird (Vazquez-Boland et al., 2001a). L. ivanovii trägt eine Kopie von LIPI-1. Diese Spezies hat ähnlich wie L. monocytogenes einen intrazellulären Lebenszyklus.
LIPI-1 fehlt in den Genomen der apathogenen Listerien mit Ausnahme von L. seeligeri (Chakraborty et al., 2000, Kreft et al., 1999, Vazquez-Boland et al., 2001a). Obwohl in dieser
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Spezies LIPI-1 in einer strukturell intakten Form vorhanden ist, wird es aufgrund der Insertion von orfE zwischen plcA und prfA nicht exprimiert (Karunasagar et al., 1997, Kreft et al., 1999). Zusätzlich enthält das LIPI-1 von L. seeligeri orfCD und Duplikationen der plcA und plcB Gene (Abb. 1.2) (Kreft et al., 1999, Vazquez-Boland et al., 2001a). Da LIPI-1 sich überall auf derselben Stelle des Chromosoms befindet, die Basenzusammensetzung der des Coregenoms entspricht, keine IS-Elemente, Transposons, Phagen oder Plasmidgene entdeckt wurden und keine typischen Integrationsstellen wie direkte Repeats oder tRNAs vorhanden sind (Chakraborty et al., 2000, Kreft et al., 1999, Vazquez-Boland et al., 2001a), geht man davon aus, dass LIPI-1 von einem gemeinsamen Vorfahr der Listerien erworben (Kreft et al., 1999, Vazquez-Boland et al., 2001a) und dann später durch Deletionen aus den Genomen von L. innocua und L. welshimeri entfernt wurde. Bis heute noch nicht geklärt ist die Frage, ob die zusätzlichen ORFs in LIPI-1 von L. seeligeri Insertionen in das ursprüngliche LIPI-1 darstellen oder ob diese als ursprüngliche Bestandteile des LIPI-1 in den Genomen von L. monocytogenes und L. ivanovii deletiert worden sind (Kreft et al., 1999).
Abbildung 1.2: Virulenzgencluster in Listeria spp (Vazquez-Boland et al., 2001b).
Obwohl eine ganze Reihe von Internalinen bekannt sind, zählen nur die o.g. inlA und inlB zu den bekannten Virulenzgenen. Die Internaline werden in große, zellwandgebunde, i.d.R.
PrfA- unabhängige und in unter PrfA-Kontrolle stehende, kleine sekretierte aufgeteilt (Abb.
1.3) (Dramsi et al., 1993, Engelbrecht et al., 1996, Engelbrecht et al., 1998b, Engelbrecht et al., 1998a, Lingnau et al., 1995, Raffelsbauer et al., 1998). Zu den für L. monocytogenes
spezifischen großen, zellwandgebundenen Internalinen gehören neben den PrfA-abhängigen InlA und InlB auch die Internaline C2/D bzw. H, E, F und G. Als einziges sekretiertes Internalin ist hier InlC zu nennen, bei L. ivanovii hingegen findet man nur sekretierte Internaline. Außer inlC und inlF von L. monocytogenes sind alle Internaline in Gruppen chromosomal angeordnet. Alle Internaline sind sehr homolog und enthalten eine variable Nummer an Repeats (LRR, Csa, GW). Dies führt zu der Annahme, dass die Vielfalt der Internaline innerhalb des listeriellen Chromosoms auf Genduplikationen, intra- bzw.
intergenetische Rearrangements und interspezifischen Genaustausch zurückzuführen ist. So entstand das inlH Gen eines L. monocytogenes EGDe-Stammes vermutlich durch Rekombination der inlC2/inlD-Gene eines anderen Stammes. Ebenso könnte das in L. monocytogenes vorhandene kleine sekretierte inlC von dem L. ivanovii–Homolog i-inlC abstammen (Engelbrecht et al., 1998a). Ein auch als LIPI-2 bezeichnetes 22 Kb großes L. ivanovii-spezifisches Virulenzgencluster enthält neben zehn sekretierten Internalinen auch ein Sphingomyelinasegen, dass nicht unter PrfA-Kontrolle steht und in entgegengesetzter Richtung zu den umgebenden Internalinen abgelesen wird (Gonzalez-Zorn et al., 1999). Man nimmt an, dass dieses Gen zu einem späteren Zeitpunkt in diese Stelle inseriert wurde. Das smcL-Gen trägt wahrscheinlich zur Wirtsspezifität dieser Spezies bei (Gonzalez-Zorn et al., 2000, Gonzalez-Zorn et al., 1999). Der GC-Gehalt dieses Clusters ist unterschiedlich zu dem des restlichen Chromosoms, seine Insertionsstelle liegt innerhalb von tRNAs und es kann spontan aus dem Chromosom deletiert werden, was zu einer abgeschwächten Virulenz in Mäusen und Schafen führt (Dominguez-Bernal et al., unpublished). All das führt zu der Annahme, dass LIPI-2 erst zu einem späteren Zeitpunkt der Evolution des Genus Listeria aufgenommen wurde.
18 EINLEITUNG
Abbildung 1.3: Große zellwandgebundene und kleine sekretierte Internaline in Listeria spp (Vazquez-Boland et al., 2001b).
Sechs weitere Gene (auto, ami, p60, bsh, hpt, fbpA), für die eine Assoziation mit der Virulenz nachgewiesen wurde, sind als einzelne Gene auf dem Chromosom organisiert. Das Oberflächenprotein Auto wird bei der Invasion in nichtphagozytierende eukaryotische Zellen benötigt (Cabanes et al., 2004). Die Amidase Ami ist in die Adhäsion der Listerien an Zielzellen verwickelt (Milohanic et al., 2001). P60 spielt eine Rolle bei der Invasion von Darmepithel und beim Überleben der Listerien in vivo (Hess et al., 1996, Hess et al., 1995).
Bsh (Bile salt hydrolase) dekonjugiert Gallensalze, ein Mechansimus, der zum Schutz der Bakterien vor der Toxizität von Gallensalzen dient. Dieser neue Typ vonVirulenzfaktor ist aber nicht nur in die intestinale, sondern auch in die hepatische Phase der Listeriose verwickelt (Dussurget et al., 2002). Mit Hilfe von Hpt, einem Hexose-Phosphat-Transporter, wird Glucose-1-Phosphat aus dem Zytoplasma der Wirtszelle aufgenommen. Dieses wird für die intrazytoplasmatische Vermehrung benötigt (Chico-Calero et al., 2002). Schließlich wird für das Oberflächenprotein FbpA neben einer Rolle bei der Adhäsion, eine Funktion als molekulares Chaperon angenommen, welches die Degradation der Virulenzproteine LLO und InlB verhindert (Dramsi et al., 2004).
1.6. Die Sequenzierung bakterieller Genome
Eine Voraussetzung für die umfassende Analyse eines Organismus ist es, die vollständige genetische Information des Genoms dieses Organismus zu kennen. Dadurch ist es möglich, komplexe biologische Vorgänge zu verstehen und ggf. verändern zu können. Ein umfassendes Verständnis eines Organismus erhält man nur, wenn man die gesamte Genomsequenz bestimmt hat. Man hat nicht nur die Sequenz jedes einzelnen Gens des Organismus vorliegen, sondern auch die Anordnung der einzelnen Gene im Genom. Letzere gibt Aufschluss über Strukturen wie Operons, Operatoren und regulative Bindestellen. Durch Vergleich nahe verwandter, vollständig sequenzierter Genome können spezifische phänotypische Eigenschaften der Organismen auf genetischer Ebene untersucht werden. Ebenso kann ein Vergleich von apathogenen und pathogenen Spezies einer Art Aufschluss über spezifische und unspezifische Pathogenitätsfaktoren und über die Evolution dieser Spezies geben.
Betrachtet man sehr entfernt verwandte Organismen auf genetischer Ebene, können z.B.
grundlegende Stoffwechselwege identifiziert werden, die den meisten Organismen gemein sind.
Die bereits vollständig sequenzierten Organismen können verschiedenen Gruppen zugeordnet werden. Die größte Gruppe ist die der human- oder tierpathogenen Bakterien. Zu dieser Gruppe gehören z.B. Staphylococcus aureus, Mycobacterium leprae, Helicobacter pylori oder Listeria monocytogenes. Diese Bakterien werden vor allem zur Entwicklung neuer Therapien zur Behandlung der durch sie hervorgerufenen Krankheiten untersucht. Auch pflanzenpathogene Organismen wie Xanthomonas campestris pv. campestris oder Pseudomonas syringae pv. tomato sind bereits vollständig sequenziert worden, um z.B.
Pflanzenschutztherapien zu entwickeln. Eine weitere für die Sequenzierung ganzer Genome interessante Gruppe ist die der extremophilen Mikroorganismen. Sequenzierte Vertreter dieser Gruppe sind z.B. Pyrococcus furiousus und Thermotoga maritima.
Im Folgenden werden die Grundlagen der Sequenzierung ganzer Genome beschrieben.
20 EINLEITUNG
1.7. Die Grundlagen der Sequenzierung
Die Entdeckung der DNA durch Johann Friedrich Miescher fand im Jahre 1869 statt (Miescher, 1871). Ihre Bedeutung für den Organismus wurde jedoch erstmals 1944 durch Oswald T. Avery beschrieben (Avery et al., 1944). Nach der Bestimmung der Struktur und der Funktionsweise der DNA durch Watson und Crick im Jahr 1953 (Watson et al., 1953) dauerte es weitere 20 Jahre, bis Sanger die erste direkte DNA-Sequenzierungsmethode, das Plus-Minus-Verfahren, entwickelte (Sanger et al., 1975). Dieses Verfahren nutzt das Enzym DNA-Polymerase zur Verlängerung von DNA-Ketten. Angewendet wurde dieses Verfahren 1977 zur Ermittlung der genomischen Sequenz des Bakteriophagens X174 mit einer Länge von 5368 bp (Sanger et al., 1978).
Die Methode der DNA-Sequenzierung, auf der die heute üblicherweise in Sequenzierlabors durchgeführten Protokolle beruhen, wurde von Frederic Sanger 1977 veröffentlicht (Sanger et al., 1977) und wird als Sanger-Methode bezeichnet. Bei der Sanger-Methode wird eine der PCR (Polymerase Chain Reaction (Saiki et al., 1988)) ähnliche Reaktion durchgeführt, wobei jedoch nicht nur die vier Desoxynucleotide dATP, dCTP, dGTP und dTTP (Abb. 1.4), sondern auch die leicht modifizierten Didesoxynucleotide ddATP, ddCTP, ddGTP und ddTTP (Abb. 1.5) eingesetzt werden. Diese modifizierten Moleküle besitzen ein Wasserstoffatom am 3`-Kohlenstoff der Desoxyribose. Bei Einbau dieses 2`-, 3`-didesoxynukleotids (ddNTP) kann die DNA-Kette durch die DNA-Polymerase nicht weiter verlängert werden und die Reaktion bricht ab. Da das Verhältnis von ddNTPs zu den jeweiligen dNTPs ca. eins zu 100 ist, findet der Einbau eines solchen modifizierten Moleküls seltener als der des unmodifizierten Moleküls statt. Dadurch entstehen DNA-Stränge unterschiedlicher Länge, die mittels Gelelektrophorese in einem Polyacrilamidgel aufgetrennt werden können. Um aus den aufgetrennten Strängen die Basenabfolge ablesen zu können, werden die zum Kettenabbruch führenden Didesoxynukleotide zusätzlich mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert. Bei dem heute am häufigsten verwendeten Verfahren, dem Dye-Terminator-Verfahren, wird für jede der vier Basen eine andere Fluoreszenz verwendet (Abb. 1.6). Das Ablesen der Basensequenz erfolgt durch Laser-Detekton der verschiedenen Fluoreszenzen im Gel. Es werden Chromatogramm-Dateien erzeugt, welche die Ausgangsbasis für die Weiterverarbeitung am Computer bilden.
Abbildung 1.4: Desoxynukleotid (dNTP). Ein Desoxynukleotid besteht aus drei Einzelbausteinen: einer organischen Base (Adenin, Thymin, Guanin oder Cytosin), einer Pentose- Desoxyribose und einer Phosphatgruppe. Die Phophatgruppe kann eine Bindung mit dem 3`-Kohlenstoffatom eines weiteren Desoxynukleotids eingehen. Diese Bindungsmöglichkeit ist die Grundlage für die Entstehung langer Desoxynukleotidketten.
Abbildung 1.5: Didesoxynukleotid (ddNTP). Am 3`-Kohlenstoff - atom fehlt diesem Molekül im Gegensatz zu einem Desoxynukleotid die OH-Gruppe. Diese ist beim Didesoxynukleotid durch ein Wasserstoffatom ersetzt. Durch das Fehlen der OH-Gruppe kann das Didesoxynukleotid keine Bindungen mit anderen Nukleotiden eingehen.
22 EINLEITUNG
Abbildung 1.6: Ausschnitt aus einem Sequenziergel. Die farblich markierten DNA-Fragmente unterschiedlicher Länge werden durch Gelelektrophorese aufgetrennt. Daraus kann die Sequenz der zu sequenzierenden DNA-Vorlage abgelesen werden.
1.8. Die Hochdurchsatz-Sequenzierung als Grundlage für die Sequenzierung ganzer Genome
Die Dye-Terminator-Sequenzierung nach Sanger ist Grundlage für heutige Hochdurchsatz- Sequenziertechniken. Um jedoch einen hohen Durchsatz, wie für die Sequenzierung ganzer Genome notwendig ist, erreichen zu können, mussten einige Optimierungen an der Sequenziertechnik vorgenommen werden.
Ein großer Fortschritt wurde durch die Verwendung von speziellen Sequenziervektoren erreicht (z.B. pUC19 und Derivate (Yanish-Perron et al., 1995)) (Abb. 1.7), in welche die zu sequenzierenden DNA-Fragmente inseriert (kloniert) werden. Diese Vektoren liegen in hoher Kopienzahl in der Wirtszelle vor, so dass die Konzentration an Plasmid-DNA in der Wirtszelle sehr hoch ist.
Die zur Sequenzierung notwendigen Primer (kurze Sequenzstücke, die an der DNA binden und die Arbeit der DNA-Polymerase initialisieren) binden am Vektor in der Nähe der inserierten DNA. Dabei wird die DNA von diesen Primerbindestellen aus abgelesen, so dass jede Sequenzierreaktion mit den gleichen Primern (Standardprimern) ausgeführt werden kann.
