Aus der Neurologischen Klinik der Medizinischen Hochschule Hannover
(Direktor: Prof. Dr. med. R. Dengler)
Kortikale Demyelinisierung des Kleinhirns -Eine Studie im Cuprizonemodell-
DISSERTATION
Zur Erlangung des Grades eines Doktors der Humanmedizin an der Medizinischen Hochschule Hannover
Vorgelegt von Jens-Heiko Bußmann
aus Braunschweig Hannover 2009
Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover
Präsident: Prof. Dr. Dieter Bitter-Suermann
Betreuer der Arbeit: Prof. Dr. med Martin Stangel
Referent/Referentin: Prof. Dr. med. Alexandru Constantin Stan Koreferent: Prof. Dr. med. Klaus Otto
Tag der mündlichen Prüfung: 06.10.2010
Promotionsausschussmitglieder: Prof. Dr. Christoph Gutenbrunner PD Dr. Gerald Küther
Prof. Dr. Matthias Zumkeller
Meinen Eltern gewidmet
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung...1-6
1.1 Multiple Sklerose (MS)………..1
1.2 Tiermodelle zur Untersuchung von De- und Remyelinisierungsvorgängen……. 3
1.3 Das Cuprizonemodell……….4
1.4 Zielsetzung……… 6
2. Material und Methoden...7-13 2.1 Versuchstiere………..7
2.2 Das Cuprizonemodell……….7
2.3 Experimentelles Design………..7
2.3.1 Versuch A: Cuprizonebehandlung über 12 Wochen………7
2.3.2 Versuch B: Cuprizonebehandlung über 14 Wochen………8
2.3.3 Versuch C: Cuprizonebehandlung über 16 Wochen………8
2.4 Durchführung der Versuche und Materialgewinnung………8
2.5 Färbungen………...9
2.5.1 Histochemische Färbungen………..9
2.5.2 Immunhistochemische Färbungen……….10
2.5.2.1 Durchführung der immunhistochemischen Färbungen………...10
2.5.2.2 Färbung von Oberflächenantigenen……….11
2.5 Auswertung………..12
2.5.1Myelinauswerung………...12
2.5.2Zellquantifizierung im zerebellären Kortex………...13
2.5.3Statistische Auswertung……….13
3. Ergebnisse...14-28 3.1 Cuprizonebehandlung führt zu deutlicher Demyelinisierung des zerebellären Kortex………...14
3.2 Der Demyelinisierungsgrad im Zerebellum ist regional unterschiedlich ausgeprägt……….17
3.3 Cuprizoneadministration führt zum Verlust an reifen Oligodendrozyten………19
3.3.1 Oligodendrozytenverhalten in der rostralen Region………...19
3.3.2 Oligodendrozytenverhalten in der kaudalen Region………..21
3.4 Cuprizonefütterung führt zur Mikrogliaaktivierung...23
3.4.1 Mikrogilainfiltration in der rostralen Region...23
3.4.2 Mikrogliainfiltration in der kaudalen Region...25
3.5Astrogliose während der Cuprizoneadministration...27
4. Diskussion...29-39 4.1 Methodische Vorüberlegungen...29
4.1.1 Das Cuprizonemodell...29
4.1.2 Histologie und Auswertung...29
4.2 Demyelinisierung und Remyelinisierung...31
4.3 Schicksal der Oligodendrozyten...33
4.4 Mikroglia: protektiv oder destruktiv?...34
4.5 Rolle der Astrozyten – mehr als nur Stützzellen...36
4.6 Mikroglia und Astrozyten zusammen betrachtet...38
5. Schlussfolgerung...40
6. Zusammenfassung...41
7. Literaturverzeichnis...43-52 8. Danksagung...53
9. Lebenslauf...54
10. Erklärung nach §2 Abs. 2 Nr. 5 und 6………......55
Abbildungsverzeichnis
Abb. 1 Experimentelles Design...8
Abb. 2 Demonstration der unterschiedenen Demyelinisierungsgrade...12
Abb. 3 Untersuchte Bereiche des Kleinhirns...13
Abb. 4 Immunhistochemische Bilder ausgewählter Bereiche...15
Abb. 5 Skizzen zum Ausmaß der Demyelinisierung der rostralen Region...16
Abb. 6 Skizzen zum Ausmaß der Demyelinisierung der kaudalen Region...18
Abb. 7 Oligodendrozytendichte während der Cuprizonefütterung in der rostralen Region...20
Abb. 8 Oligodendrozytendichte während der Cuprizonefütterung in der kaudalen Region...22
Abb. 9 Demonstration der Mikrogliainfiltration...23
Abb. 10 Aktivierte Mikroglia während der Cuprizonefütterung in der rostralen Region...24
Abb. 11 Aktivierte Mikroglia während der Cuprizonefütterung in der kaudalen Region...26
Abb. 12 Demonstration der Astrozytose...28
Tabellenverzeichnis:
Tabelle 1 Antikörper...12Abkürzungen
C1LA Crus I lobuli ansiformis
C2LA/LP Crus II lobuli ansiformis / lobulus paramedianus CC/ND comissura cerebelli/ nodulus
CU Culmen
DAB 3,3`Diaminobenzidin d.h das heißt
EAE experimentelle allergische Enzephalomyelitis ebd. ebenda
FGF-2 Fibroblast growth factor -2 GFAP Glial fibrillary acidic protein IFN- Interferon-gamma
LFB/PAS Luxol-Fast-Blue/Perjodic-Acid-Schiff-Färbung MBP Myelin basic protein
MOG Myelin oligodendrocyte glycoprotein MS Multiple Sklerose
OPC Oligodendrocyte precursor cell, Oligodendrozytenverläuferzellen PLP Proteolipid-Protein
SCP Oberer Kleinhirnstiel TNF- Tumornekrosefaktor-alpha TGF- Transforming growth factor ZNS Zentralnervensystem
1. Einleitung
1.1 Multiple Sklerose
Die Multiple Sklerose (MS, Encephalomyelitis disseminata) ist eine chronisch-entzündliche Erkrankung des zentralen Nervensystems (ZNS), die zu Myelinverlust in der weißen Substanz und im Kortex führt (Lassmann und Lucchinetti, 2008). MS ist die häufigste zu Demyelinisierung führende entzündliche Erkrankung des ZNS, und somit eine wichtige Ursache für Behinderungen sowohl jüngerer als auch älterer Menschen (Keegan und Noseworthy, 2002). Die Erkrankung reduziert die Lebenserwartung im Durchschnitt um 7 bis 8 Jahre und ist durch eine Vielzahl von Subtypen mit verschiedenen klinischen Verläufen gekennzeichnet (Trapp und Nave, 2008).
Die Ätiologie der Multiplen Sklerose ist weiterhin ungeklärt. Es wird angenommen, dass die Erkrankung immunvermittelt ist, und bestimmte genetische Suszeptibilitätsfaktoren existieren (Hohlfeld 1997). Die gängige Theorie zur Pathogenese der Erkrankung ist, dass unter bestimmten Umständen autoreaktive, d.h. gegen Myelinantigene gerichtete, Lymphozyten und Antikörper die Blut-Hirn-Schranke überwänden, und in das ZNS einwanderten. Die Bindung des Autoantigens an den T-Zell-Rezeptor führe zu einer weiteren Amplifikation der Entzündungsreaktion, die die Blut-Hirn-Schranke noch durchlässiger mache, so dass es zu einer zweiten Einwanderung von Monozyten und anderen inflammatorischen Zellen komme (Hohlfeld, 1997). Der genaue Mechanismus, durch den das humane Immunsystem Myelin als fremd ansieht, konnte noch nicht erklärt werden. Diskutiert wird eine Assoziation mit dem Humanen Herpesvirus 6, dem Epstein-Barr-Virus (Serafini, 2007), sowie einer bakteriellen Infektion mit Chlamydia pneumoniae (Keegan und Noseworthy, 2002).
Histopathologisches Kennzeichen der MS ist der entzündliche Plaque. Es können aktive und inaktive Plaques unterschieden werden (Lassmann 1998). Charakteristisch für aktive Plaques ist die Anwesenheit von Makrophagen und autoreaktiven T-Zellen, sowie das Vorhandensein von Myelinabbauprodukten, vor allem Myelinbasisches-Protein (MBP), Proteolipid-Protein (PLP) und Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein (MOG) (Wingerchuck, 2001) Im Plaque kommt es zum Verlust an Oligodendrozyten (Ozawa, 1994). In der Peripherie des Plaques befinden sich aktivierte Astrozyten (ebd.). Demyelinisierte Axone können wieder remyelinisiert werden (Patrikos et al., 2006, Patani et al., 2007). Oligodendrozyten treten innerhalb der Plaques wieder in Erscheinung und es kann zu einer kompletten
Remyelinisierung des Plaques kommen. Dies wird als „Shadow Plaque“ bezeichnet. Die neugebildete Myelinscheide ist jedoch dünner und kürzer (Blakemore, 1974).
Die Rolle der einzelnen Zelltypen im Ablauf von De- und Remyelinisierung ist nicht vollständig verstanden. Oligodendrozyten bilden durch Myelinisierung von Axonen die Markscheiden des zentralen Nervensystems. Die Aufrechterhaltung der Myelinscheiden ist ein beträchtlicher metabolischer Aufwand, so dass bereits kleinste Störungen im Energiehaushalt der Oligodendrozyten zu Demyelinisierung führen können (Zeis und Schaeren-Wiemers, 2008). Verschiedene Zellen können an der Schädigung von Oligodendrozyten beteiligt sein: CD8+-Lymphozyten können direkt Oligodendrozyten schädigen, CD4+-Lymphozyten können durch Aktivierung von Mikroglia und Makrophagen zur Zellschädigung beitragen, auch B-Zellen schädigen Oligodendrozyten durch Produktion von Antikörpern (Zeis und Schaeren-Wiemers, 2008). Die Rolle der Mikroglia im Entzündungsprozess erscheint ambivalent: einerseits scheinen sie einen Großteil der Oligodendrozytenschädigung zu bewirken (ebd.). Andererseits wurde beobachtet, dass sie auch die Remyelinisierung durch Abräumen von Zelldebris fördern (Neumann et al., 2008).
Astrozyten spielen eine komplexe Rolle im Entzündungsprozess und können Demyelinisierung sowohl fördern als auch inhibieren. Ebenso kann die Remyelinisierung durch zytokinvermittelte Beeinflussung von Oligodendrozytenverläufern (OPC) sowohl gefördert, als auch durch Behinderung der OPC-Wanderung mittels Glia-Narbe behindert werden (Nair et al., 2008).
In der Erforschung der MS wurde schon frühzeitig die Beobachtung gemacht, dass sich die Erkrankung nicht nur auf die weiße Substanz beschränkt, sondern dass entzündliche Läsionen auch in der grauen Substanz auftreten (Taylor, 1894; Sander, 1898; Brownell und Hughes, 1962; Kidd et al., 1999; Filippi und Rocca, 2005; Kutzelnigg et al., 2007; Geurts und Barkhof, 2008; Stadelmann et al., 2008). Demyelinisierung der grauen Substanz wurde nicht nur im Großhirn beobachtet, sondern auch in anderen Bereichen grauer Substanz wie dem Hippocampus (Sicotte et al., 2008), dem Thalamus (Wylezinska et al., 2003) und dem Hypothalamus (Huitinga et al., 2001). Auch das Kleinhirn ist in besonderem Maße von kortikaler Demyelinisierung betroffen (Gilmore et al., 2008; Kutzelnigg et al., 2007). Es wird vermutet, dass zerebrale kortikale Läsionen für sensorische, motorische und kognitive Defizite im Krankheitsverlauf mitursächlich sind, und es wurde beobachtet, dass bei Patienten mit langer Krankheitsdauer das Ausmaß der kortikalen Läsionen besser mit dem Ausmaß an
Behinderung korreliert, als das Ausmaß an Läsionen der weißen Substanz (Fisniku et al., 2008; Morgen et al., 2006). Darüber hinaus wurde die Existenz einer rein kortikalen Variante der MS postuliert, die sich klinisch vor allem durch ein demenzielles Syndrom und andere neuropsychiatrische Syndrom auszeichne (Zarei et al., 2003). Die Demyelinisierung im zerebralen Kortex verläuft ohne signifikante Einwanderung von Leukozyten aus dem Blut (Bö et al., 2003a). Bö et al. (2003b) unterscheiden 4 verschiedene Typen kortikaler Demyelinisierung: Typ 1 ist ein kontinuierlich demyelinisierter Bereich, der sich über weiße und graue Substanz erstreckt. Typ 2 ist eine rein intrakortikal gelegene Läsion ohne Kontakt zu weißer Substanz oder Pia mater, Typ 3 stellt eine subpial gelegene Läsion dar. Typ 4 ist eine Läsion, die sich durch den gesamten Kortex zieht, jedoch nicht auf benachbart liegende weiße Substanz übergreift. Läsionen des Typs 3 und 4 machen prozentual den Großteil der kortikalen Läsionen aus (Bö et al. 2003b). Die Selektivität, die in Läsionen des Typs 4 deutlich wird, in denen bei Schonung der weißen Substanz großflächige Anteile des Kortex demyelinisiert werden, könnte auf unterschiedliche Pathomechanismen bei der Demyelinisierung von Kortex und weißer Substanz hindeuten.
Die Fähigkeit zur Remyelinisierung ist nicht auf die weiße Substanz beschränkt, auch im Kortex kann Myelin regeneriert werden. Histopathologische Untersuchungen zeigten, dass kortikale Remyelinisierung ein häufiger Vorgang bei langer Krankheitsdauer ist (Albert et al., 2007). Genau wie in der weißen Substanz beobachtet, erschien das wiederaufgebaute Myelin auch im Kortex im Vergleich zu Kontrollen weniger dicht (ebd.).
1.2 Tiermodelle zur Untersuchung von De- und Remyelinisierungsvorgängen
Die Erforschung der Pathogenese kortikaler Läsionen am Menschen ist nur eingeschränkt möglich, da die Läsionen radiologisch schwierig zu detektieren sind (Trapp und Nave, 2008), und Biopsiematerial zur histologischen Untersuchung nur eingeschränkt zur Verfügung steht.
Aus diesen Gründen sind geeignete Tiermodelle zur näheren Erforschung kortikaler Läsionen von großer Wichtigkeit. Zur Erforschung der Vorgänge bei De- und Remyelinisierung des ZNS wurden verschiedene Tiermodelle entwickelt. Man unterscheidet je nach Art der Schädigung des ZNS zwischen entzündlichen (EAE, Theiler-Virus) und toxischen Modellen (Cuprizone, Ethidiumbromid, Lysolecithin). Zur Erforschung kortikaler Läsionen sind bisher nur wenig geeignete Tiermodelle vorhanden.
Die Experimentelle allergische Enzephalomyelitis (EAE) ist ein T-Zell-vermitteltes entzündliches Modell zur Untersuchung von Demyelinisierung im ZNS verschiedener Tierarten (Olitsky und Yager, 1949). Durch Inokulation mit Hirngewebe, aufgereinigten Myelinproteinen wie z.B. MBP, PLP und MOG oder Myelinpeptiden in einem Adjuvanz wird ein Krankheitsbild induziert, das durch entzündliche Infiltrate und Demyelinisierung gekennzeichnet ist. Der Ausprägungsgrad der Demyelinisierung ist variabel und hängt vom benutzten Antigen und von der gewählten Tierart ab (Day MJ, 2005). Storch et al. (2006) fanden heraus, dass kortikale Demyelinisierung nur in bestimmten Rattenstämmen und nur unvollständig ausgelöst werden kann. Merkler et al. (2006) induzierten kortikale Läsionen durch lokale Injektionen mit den Zytokinen Tumornekrosefaktor-α (TNF-α) und Interferon- γ (IFN-γ) im EAE-Modell nach vorheriger Immunisierung mit dem Myelinprotein Myelin- Oligodendrozyten-Glykoprotein (MOG). Auch hier wird die Blut-Hirnschranke gestört.
Beim Theiler-Virus-Modell werden Demyelinisierungsvorgänge nach Infektion von Mäusen mit dem Theiler-Virus untersucht. Hierbei wird Mäusen das Virus in das Gehirn inokuliert, es kommt daraufhin zu fleckiger Demyelinisierung im Rückenmark (Lipton, 1974). Nachteil dieses Modells ist, dass durch die Inokulation die Blut-Hirn-Schranke verletzt wird, und die Demyelinisierung sich auf das Rückenmark beschränkt (Dal Canto und Lipton, 1977).
Beim toxischen Ethidiumbromid- und Lysolecitin-Modell wird eine fokale Demyelinisierung durch das stereotaktische Einbringen von Ethidiumbromid oder Lysolecithin in das ZNS von Nagern erzeugt. Ethidiumbromid interkaliert DNA und wirkt dadurch auf alle kernhaltigen Zellen, nicht nur auf die myelinbildenden Oligodendrozyten (Woodruff und Franklin, 1999).
Ein Verlust an Oligodendrozytenverläufern kann dadurch nicht ausgeschlossen werden.
Lysolecithin wirkt auf die Zellmembran und soll selektiv toxisch auf Myelinbildner wirken (ebd.). Bei der stereotaktischen Injektion der Substanzen wird die Blut-Hirnschranke verletzt, so dass die Reaktion des ZNS auf die Substanzen nicht unabhängig von Einflüssen der Peripherie untersucht werden kann. An der Remyelinisierung in diesem Modell sind auch Schwann-Zellen beteiligt (Woodruff und Franklin, 1999), die Markscheidenbildner des peripheren Nervensystems, die im ZNS physiologischerweise nicht vorkommen.
1.3 Das Cuprizonemodell
Das Cuprizonemodell ist ein toxisches Tiermodell zur Untersuchung von De- und Remyelinisierungsvorgängen im Gehirn von Nagern. Der Kupferchelator Cuprizone (bis-
cyclohexanon-oxaldihydrazon) bewirkt eine reproduzierbare Demyelinisierung im ZNS von Mäusen, wenn es dem Normalfutter zugesetzt wird (Blakemore, 1972). Zur Untersuchung von Vorgängen der Demyelinisierung und nachfolgender Remyelinisierung sind Mäuse vom Stamm C57BL/6N besonders gut geeignet. Durch Gabe von 0,2% Cuprizone über einen Zeitraum von 5 Wochen wird bei diesen Tieren eine nahezu komplette Demyelinisierung des Corpus callosum erzielt (Gudi et al., 2009; Hiremath et al., 1998) Die Auswirkungen chronischer Demyelinisierung lassen sich durch Verfüttern von 0,2% Cuprizone über 12 Wochen oder länger, untersuchen (Lindner et al., 2009; Mason et al., 2001, 2004). Die Konzentration von 0,2% Cuprizone gilt als ideal, da Demyelinisierung verlässlich induziert wird, ohne dass es zu Leberschädigung oder zu unnötiger Schwächung der Tiere kommt, was bei höheren Konzentrationen zu erwarten ist (Hiremath et al., 1998).
Cuprizone induziert verlässlich Myelinverlust in verschiedenen Bereichen des Gehirns. Die De- und Remyelinisierungsvorgänge wurden bisher im Corpus callosum des Großhirns (Hiremath et al., 1998; Morell et al., 1998; Stidworthy et al., 2003) und den oberen Kleinhirnstielen (Blakemore, 1973) untersucht. Darüber hinaus lassen sich durch Cuprizonegabe auch De- und Remyelinisierungsprozesse in der grauen Substanz untersuchen.
Bisher wurde ein cuprizonebedingter Verlust von kortikalem Myelin im Neokortex (Skripuletz et al., 2008) und Hippocampus beschrieben (Hoffmann et al., 2008; Koutsoudaki et al., 2009; Norkute et al., 2009).
Der genaue Wirkmechanismus von Cuprizone ist nicht vollständig aufgeklärt. Ursache für den Myelinschaden wird in einer Störung im Energiehaushalt von Oligodendrozyten vermutet (Matsushima und Morell, 2001; Morell et al., 1998). Es ist nicht bekannt, warum gerade Oligodendrozyten von der Cuprizonewirkung in so starkem Ausmaß betroffen sind.
Matsushima und Morell (2001) schreiben dies dem großen Energieaufwand des Perikaryons zu, der für den Unterhalt des Myelins benötigt wird. Hierdurch seien die Oligodendrozyten besonders anfällig für Störungen.
In Cuprizone-induzierten Läsionen kommt es zu einer Aktivierung von Mikroglia und Astrozyten (Blakemore, 1972; Blakemore, 1973b; Ludwin, 1978). Die Rolle, die diese Zellen im Ablauf von Demyelinisierung und Remyelinisierung spielen, ist nicht vollständig aufgeklärt. Es wird angenommen, dass Mikroglia Myelinreste phagozytieren und insbesondere an der Demyelinisierung beteiligt sind (Blakemore, 1972; Ludwin und
Sternberger, 1984; Smith, 1999). Phagozytiertes Myelin konnte ebenfalls in Mikroglia in Läsionen des zerebralen Kortex nachgewiesen werden (Skripuletz et al., 2008). Da sich aktivierte Mikroglia in demyelinisierten Läsionen ansammeln, und ihr Auftreten mit dem Auftreten von Oligodendrozyten-Vorläuferzellen zusammentrifft, wird ebenfalls eine die Initiation der Remyelinisierung beeinflussende Rolle diskutiert (Matsushima und Morell, 2001).
Die Blut-Hirnschranke bleibt im Cuprizonemodell intakt (Bakker und Ludwin, 1986; Kondo, 1987). Hierdurch lassen sich De- und Remyelinisierung ohne Einfluss der Peripherie untersuchen. Die De- und Remyelinisierungsprozesse sind gut reproduzierbar und zeitlich vorhersehbar, im Gegensatz zu anderen Tiermodellen wie der EAE oder bei der durch den Theiler Virus induzierten Demyelinisierung. Somit ist in diesem Modell (auch unter dem Vorbehalt, dass die Demyelinisierung durch einen anderen Mechanismus als bei der MS abläuft) eine bessere Abgrenzung der De- und Remyelinisierungsvorgänge möglich.
1.4 Zielsetzung
Die vorliegende Arbeit sollte Vorgänge der De- und Remyelinisierung im Kleinhirn von Mäusen vom Stamm C57BL/6N untersuchen. Der Schwerpunkt sollte hierbei auf der Frage liegen, ob es im Kortex des Kleinhirns zu Myelinverlust kommt und wie ausgeprägt dieser ist.
Myelin wurde hierzu mit den Methoden der Immunhistochemie auf die Marker MBP und PLP angefärbt, zusätzlich wurde die histochemische LFB-PAS-Färbung durchgeführt. Ein weiteres Augenmerk lag auf den Zellen, die im Lauf der Entzündungsreaktion auftreten, vor allem das Verhalten der Mikroglia im Kleinhirn war hier von besonderem Interesse. Die vorliegende Arbeit sollte hiermit eine Lücke in der bestehenden Literatur über das Cuprizonemodell füllen, da zur kortikalen Demyelinisierung des Kleinhirns bisher noch keine Daten zur Verfügung standen.
Die hieraus gewonnenen Erkenntnisse sollen zu einem besseren Verständnis der Pathomechanismen des Myelinverlustes, und möglicherweise damit zu einem besseren Verständnis der menschlichen Erkrankung Multiple Sklerose, führen.
2. Material und Methoden
2.1 Versuchstiere
Für die nachfolgenden Experimente wurden 66 männliche 8 Wochen alte Mäuse vom Stamm C57BL/6N (Bad Sulzfeld, Deutschland) verwendet. Die Tiere wurden zu dritt oder zu viert pro Käfig (Typ III: 42 x 26 x 15 cm) untergebracht. Die Haltung erfolgte bei einer konstanten Raumtemperatur von 22±2 °C und einem hell: dunkel Zyklus von 14:10 Stunden. Alle Tiere hatten freien Zugang zu Nahrung (Altromin Standard Diät 1320; Lage, Deutschland) und Leitungswasser, die Käfigeinstreu wurde einmal wöchentlich gewechselt. Geltende Tierschutzbestimmungen wurden eingehalten. Eine Tierversuchsgenehmigung für die Durchführung von Fütterungsversuchen mit Cuprizone lag vor (33.9-42502-04-07/1309, Niedersächsisches Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit, Oldenburg).
2.2 Das Cuprizonemodell
Für die vorliegende Arbeit wurde das Modell der toxisch induzierten Demyelinisierung durch die Verabreichung des Kupferchelators Cuprizone verwendet. Das Cuprizonemodell wurde bisher überwiegend für Untersuchungen von De- und Remyelinisierungsprozessen des Corpus callosum eingesetzt (Matsushima und Morell, 2001). Die Fütterung der Mäuse mit dem Neurotoxin Cuprizone führt innerhalb 5 Wochen zu einer vollständigen Demyelinisierung des Corpus callosum. Das Absetzen des Toxins führt zu einer vollständigen spontanen Remyelinisierung. In Vorarbeiten der Arbeitsgruppe wurde eine Konzentration von 0,2% als optimal herausgearbeitet (Lindner et al., 2008a, 2008b).
2.3. Experimentelles Design
Das experimentelle Design ist in Abbildung 1 illustriert. Es wurden insgesamt 3 Versuchsansätze (A, B und C) durchgeführt. Bei allen 3 Versuchen wurde eine Demyelinisierung der weißen und der grauen Substanz des Kleinhirns mittels Cuprizonefütterung ausgelöst. Die drei Versuchsreihen unterschieden sich in der Dauer der Cuprizoneexposition. Die Tierzahlen betrugen 5-6 pro Versuchszeitpunkt (Tierzahl insgesamt 66).
2.3.1. Versuch A: Cuprizonebehandlung über 12 Wochen
Im Versuch A wurden die Tiere mit 0,2% Cuprizone über 12 Wochen gefüttert, um die
Auswirkungen einer längeren Demyelinisierung auf das Kleinhirn zu untersuchen.
Anschließend wurde die Remyelinisierung bis zur Woche 8 nach Beenden der Cuprizonefütterung untersucht. Im Versuch A wurden die Gehirne zu folgenden Zeitpunkten untersucht: Woche 0 (Kontrolle), Woche 4, 6, 8, 10, 12, 13, 14 und 20.
2.3.2. Versuch B: Cuprizonebehandlung über 14 Wochen
Im Versuch B wurden Mäuse mit 0,2% Cuprizone über 14 Wochen gefüttert und durch Entnahme der Gehirne nach Woche 14 das Ausmaß der Demyelinisierung im Kleinhirn untersucht.
2.3.3. Versuch C: Cuprizonebehandlung über 16 Wochen
Im Versuch C wurden Mäuse mit 0,2% Cuprizone über 16 Wochen gefüttert und durch Entnahme der Gehirne nach Woche 16 das Ausmaß der Demyelinisierung untersucht.
Abbildung 1. Experimentelles Design.
2.4. Durchführung der Versuche und Materialgewinnung
Die Versuchsreihen wurden an zu Beginn 8 Wochen alten männlichen C57BL/6N Mäusen in den zentralen Tierversuchslabors der MHH durch Mitglieder der Neuroimmunologischen
Arbeitsgruppe der Klinik für Neurologie durchgeführt. Nach einwöchiger Gewöhnung der Tiere an gemahlenes Trockenfutter erfolgte der eigentliche Versuch. Hierzu wurde den Mäusen 0,2% Cuprizone in das Futter gemischt. Die Fütterung erfolgte aus Automaten an den Käfigwänden und aus auf dem Boden aufgestellten Petrischalen, damit auch geschwächte Tiere das Futter erreichen konnten. Je nach Versuchsdauer wurde die Cuprizonegabe zu einem bestimmten Zeitpunkt (12 Wochen, 14 Wochen, 16 Wochen) abgebrochen und somit die Remyelinisierung eingeleitet. Sowohl während der De- als auch während der Remyelinisierungsphase wurden zu festgelegten Abständen eine bestimmte Anzahl Tiere mittels CO2-Narkose getötet. Mittels kardialer Kanülierung erfolgte eine Perfusion mit 10ml 4% Paraformaldehyd (Sigma-Aldrich, Deutschland) und anschließend wurde das Gehirn entnommen. Die Gehirne wurden zunächst über Nacht in 4% Paraformaldehyd fixiert und dann in Paraffin eingebettet. Die Einbettung in Paraffinblöcke erfolgte in der Pathologie der Medizinischen Hochschule Hannover. Für mikroskopische Untersuchungen wurden serielle 7 µm Schnitte mittels eines Mikrotoms (Leica RM 2245) durchgeführt. Um zu untersuchen, ob es lokale Unterschiede in der Demyelinisierung und Gliaveränderungen im Kleinhirn gibt, wurden zwei Regionen untersucht, die erste zwischen Bregma –5,80 und –6,00 gelegen, die zweite zwischen Bregma –6,64 und Bregma 6,84 (nach dem Mausatlas von Paxinos und Franklin). Ergänzend wurden Gehirnschnitte aus dem Großhirn untersucht (zwischen Bregma -0,94 und 1,8). Die Schnitte wurden auf Objektträger (Menzel-Gläser, Braunschweig) im Wasserbad aufgebracht und anschließend bei 37°C über Nacht getrocknet.
2.5. Färbungen
Die Gehirnschnitte wurden mittels histochemischer und immunhistochemischer Färbeprotokolle analysiert.
2.5.1. Histochemische Färbungen
Es wurde die Luxol-Fast-Blue/Perjodic-Acid-Schiff-Färbung (LFB/PAS) eingesetzt. LFB ist eine spezifische chemische Myelinfärbung, die Aufschluss über den Myelinisierungsgrad eines Gewebes gibt. Myelin stellt sich hier blau gefärbt dar, im Gegensatz zu den durch PAS violett gefärbten Arealen, die von Demyelinisierung betroffen sind. Die Schnitte werden zur Vorbereitung zunächst 2x 10 min in Xylol entparaffiniert, danach folgt die Entwässerung in 2x Alkohol abs. und 2x Alkohol 96% für je zwei Minuten. Die Färbung erfolgt im Wärmeschrank bei 60 °C in LFB über1 h. Um überschüssige Farbe zu entfernen wird zweimal mit 96% Alkohol und zweimal mit Aqua dest. gespült. Durch kurzes Eintauchen in
Lithiumcarbonatlösung (Sigma-Aldrich, Deutschland) werden die Schnitte entfärbt, die gewünschte Farbintensität wird anschließend in 70% Ethanol erreicht. Es folgt eine Spülung mit Aqua dest. Die Schnitte werden nun in PAS-Lösung für 8 min eingetaucht, dann wird wieder mit Aqua dest. gespült. Hierauf folgt eine Behandlung mit dem Schiff'schen Reagenz für 15 min. Die Blaufärbung der Schnitte wird in den nächsten 10 min mit fließendem Leitungswasser erreicht. Es folgt kurzes Eintauchen in Aqua dest, anschließend wird die aufsteigende Alkoholreihe durchschritten, danach Xylol für 2x 10 min, darauf folgt das Eindecken mit Eukitt (Kindler GmbH & Co, Deutschland).
2.5.2. Immunhistochemische Färbungen
Es wurden immunhistochemische Färbungen nach der ABC-Peroxidasemethode durchgeführt, diese ist ein indirektes Nachweisverfahren und beruht auf dem folgenden Prinzip:
-Der Primärantikörper bindet an das Zielantigen auf dem Paraffinschnitt -Der an Biotin gebundene Sekundärantikörper bindet an den Primärantikörper
-Der Avidin-Biotin-Komplex bindet über das Avidin an das Biotin des Primärantikörpers -Durch die Zugabe des Chromogens DAB (=3,3’ Diaminobenzidin) zusammen mit Wasserstoffperoxid katalysiert die im ABC-Komplex enthaltene Peroxidase die Umwandlung eines phenolischen Substrats in dessen unlösliche Form.
2.5.2.1. Durchführung der immunhistochemischen Färbungen
Zuerst erfolgt das Entparaffinieren der Schnitte zweimal für je 10 min. in Xylol (J. T. Baker, Holland). Anschließend werden die Schnitte in einer absteigenden Alkoholreihe bewässert (2x 100% Ethanol für je 10 min., 90%, 80%, 70% Ethanol für je 5 min., PBS für 5 min.). Nach der Wässerung werden die Schnitte in Citratpuffer bei pH 6,0 in der Mikrowelle zum kochen gebracht, hierdurch sollen die zu färbenden Antigene verstärkt an die Zelloberfläche gebracht werden. Anschließend kühlen die Objektträger für 20 min ab und werden dann in PBS gespült. Die Schnitte werden nun auf dem Objektträger mit einem PAP-Pen (SCI Science Services, Deutschland) umkreist, dieser verhindert, dass Flüssigkeit vom Objektträger herunter rinnt und die Schnitte dadurch austrocknen. Die Objektträger werden nun in eine feuchte Kammer gelegt und mit 1% H2O2-Lösung (hergestellt aus 30% Stammlösung und PBS) für 30 min inkubiert.
Nach drei Waschschritten in PBS erfolgt die Inkubation mit Blockserum für 1 h um
unspezifische Antikörperbindungsstellen abzusättigen. Zum Blocken wird Ziegenserum verwendet, auf 3% verdünnt mit PBS + 0,1% TritionX-100. Um überschüssiges Serum zu entfernen werden die Objektträger nach der Inkubationszeit nur abgeklopft, anschließend erfolgt die Applikation des primären Antikörpers. Der Antikörper wird zuvor in PBS +0,1%
TritionX-100 verdünnt. Schließlich erfolgt die Inkubation mit dem primären Antikörper über Nacht bei 4 °C im Kühlraum.
Am zweiten Tag (16 h später) werden die Schnitte dreimal in PBS gewaschen und anschließend mit dem biotinylierten Sekundärantikörper bei Raumtemperatur für 1 h inkubiert. Der sekundäre Antikörper wird in PBS +0,1% TritionX-100 verdünnt. Hiernach erfolgt eine weitere dreimalige Spülung in PBS. Nun werden die Schnitte mit dem Avidin- Biotin-Komplex (ABC Kit, Vector Laboratories; Verdünnung 1:800 in PBS) bedeckt und 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert.
Schließlich werden die Schnitte durch Zugabe des DAB (Dako Cytomation, Hamburg, Deutschland) und Wasserstoffperoxidlösung für 10 min entwickelt, danach wird die Farbreaktion durch dreimaliges Waschen in Aqua dest gestoppt. Anschließend wird eine Kernfärbung mit Hämalaun (Mayers Hämalaun-Lösung, Merck, Darmstadt, Deutschland) angeschlossen. Die Schnitte durchlaufen jetzt die Alkoholreihe wieder in umgekehrter Reihenfolge und werden dann mit dem Kunstharz Eukitt (Kindler GmbH & Co, Deutschland) eingedeckt.
2.5.2.2. Färbung von Oberflächenantigenen
Die Färbung der Gehirnschnitte zur Analyse des Myelingrades und von verschiedenen Zellsubpopulationen erfolgte mittels kommerziell erhältlicher Antikörper. Insgesamt wurden 5 Primärantikörper verschiedener Spezifität eingesetzt (Tab. 1).
Folgende Antikörper wurden eingesetzt: Mac-3 zur Darstellung von Mikroglia (IgG aus der Ratte; BD Pharmingen, Heidelberg Deutschland), MBP (IgG aus der Maus; Sternberger Monoclonals Inc., Berkeley, CA) und PLP (IgG aus der Maus; Serotec, Düsseldorf, Deutschland) zur Darstellung von Myelinproteinen, Nogo-A (polyklonaler Antikörper aus dem Kaninchen; Chemicon, UK) zur Darstellung von Oligodendrozyten und GFAP (IgG aus der Maus; Chemicon, UK) zur Darstellung von Astrozyten.
Tabelle 1. Antikörper
2.6 Auswertung
2.6.1. Myelinauswertung
Um das Ausmaß der De- und Remyelinisierung im Kortex und weißer Substanz der Lappen des Zerebellums zu beschreiben, wurden die PLP und MBP gefärbten Schnitte in beiden Schnittebenen lichtmikroskopisch analysiert (Leica DMLB, Wetzlar, Germany). Der Myelinisierungsstatus sämtlicher Lappen in beiden Schnittebenen wurde erfasst und in eine Skizze eingezeichnet. Aus den Skizzen wurden schließlich Übersichtsskizzen zu den einzelnen Zeitpunkten angefertigt. Um eine Beurteilung des Myelinisierungszustandes möglich zu machen, wurden drei verschiedene Grade der Myelinisierung definiert: Grad 1 (eingezeichnet in blau) stellt eine leicht verminderte Myelindichte dar (Abb. 1B), Grad 2 (eingezeichnet in rot) eine mäßig verminderte Myelindichte (Abb. 1C), und Grad 3 (eingezeichnet in gelb) steht für einen starken Verlust des Myelins (Abb. 1D). Das Ausmaß von De- und Remyelinisierung und die anatomische Verteilung zu den einzelnen Zeitpunkten wird für die weiße Substanz auf der linken Seite der Skizzen in Abb. 5 und 6 gezeigt, für die graue Substanz auf der rechten Seite.
Abbildung 2. Demonstration der unterschiedenen Demyelinisierungsgrade anhand von PLP- Färbungen. Weiß steht für normale Myelinstruktur (A), blau stellt eine leicht verminderte Myelindichte dar (B), rot eine mäßig verminderte Myelindichte (C), gelb steht für einen starken Verlust an Myelins (D).
Primärer Antikörper
Antigen Zielstruktur Konzentration Referenz
Maus monoklonaler anti-MBP-IgG
MBP Myelinprotein 1:1000 Budka, 1983
Maus monoklonaler anti-PLP-IgG
PLP Myelinprotein 1:500 Hartman et al., 1982 Maus monoklonaler
anti-GFAP-IgG
GFAP Astrozyten 1:200 Ludwin et al., 1976
Kaninchen polyklonaler anti-NogoA-IgG
Nogo-A Oligodendrozyten 1:750 Kuhlmann et al. 2007
Ratte monoklonaler anti-Mac-3-IgG
Mac-3 Mikroglia 1:500 Ho und Springer,
1983
2.6.2. Zellquantifizierung im zerebellären Kortex
Sowohl reife Oligodendrozyten (Nogo-A) als auch aktivierte Mikroglia (Mac-3) wurden im kompletten Kleinhirn ausgezählt. Immunopositive Zellen mit identifizierbarem Kern (angefärbt durch Gegenfärbung mit Hämalaun) wurden im linken und rechten Teil des Zerebellums ausgezählt, in den Ergebnissen sind die Mittelwerte angegeben. In der 40er Vergrößerung (Leica DMLB, Wetzlar, Germany) wurden beide der oben angegebenen Schnittebenen ausgewertet. In der ersten, rostraler gelegenen Schnittebene wurden fünf verschiedene Areale ausgezählt: lingula cerebelli (LIC), lobulus centralis (LOC), lobus anterior (LA), lobulus simplex (LS), crus I lobuli ansiformis (C1LA) (siehe Abb. 3A). In der zweiten, caudaler gelegenen Region wurden vier Areale ausgezählt: comissura cerebelli/nodulus (CC/ND) culmen (CU), lobulus simplex/crus I lobuli ansiformis (LS/C1LA), crus II lobuli ansiformis/lobulus paramedianus (C2LA/LP) (siehe Abb. 3B).
Kortex und weiße Substanz wurden jeweils getrennt ausgezählt, die Werte werden als Zellen pro mm2 angegeben.
Abbildung 3. Anatomische Lage der untersuchten Bereiche in beiden Kleinhirnregionen (Abkürzungen siehe Text 2.6.2.).
2.6.3 Statistische Auswertung
Die Auswertung der Ergebnisse wurde mit Hilfe des Computerprogramms StatView 5.0 für Windows (SAS Institute Inc., Cary, USA) durchgeführt. Der Nachweis statistisch signifikanter Unterschiede erfolgte durch die einfaktorielle ANOVA (one-way analysis of variance) mit dem Faktor „Zeitpunkt/Woche“, gefolgt vom Fisher-PLSD-Test für den post hoc Vergleich. In den Abbildungen wurden alle Daten als Mittelwert ± Standardfehler (SEM
= Standard Error of the Mean) eingetragen. Signifikante post hoc Effekte, die sich in Bezug auf die Kontrollgruppen ergaben, sind mit Sternchen hervorgehoben (* p<0.05; ** p<0.01;
*** p<0.001).
3. Ergebnisse
3.1 Cuprizonebehandlung führt zu deutlicher Demyelinisierung des zerebellären Kortex Um zu untersuchen, ob Cuprizone bei Mäusen zerebelläre Demyelinisierung bewirkt, wurden PLP- und MBP-immunhistochemisch gefärbte Schnitte von zwei verschiedenen Kleinhirnregionen ausgewertet (Abb. 5 und 6). In der rostraler gelegenen Region konnte nach 4 Wochen Cuprizonefütterung eine leichtgradige Demyelinisierung der weißen Substanz, die sich auf den Pedunculus cerebellaris superior (SCP) und benachbarte Strukturen beschränkte, beobachtet werden (Abb. 5). Nach 4 Wochen Cuprizonefütterung war noch keine Demyelinisierung der grauen Substanz zu beobachten. Nach 6 Wochen Fütterung mit Cuprizone nahm die Myelindichte der weißen Substanz um den SCP herum weiter ab (Abb. 5 C). Zur gleichen Zeit konnte in der weißen Substanz und im Kortex aller Kleinhirn-Lappen eine leichtgradige Demyelinisierung beobachtet werden (Abb. 5 C). Nach Woche 8 war der Kortex aller Lappen schwerer von Demyelinisierung betroffen, als die weiße Substanz (Abb.
5 D). Die Demyelinisierung des Kortex erreichte ihre schwerste Ausprägung nach 12 Wochen Cuprizonefütterung. Der Kortex aller Lappen erschien zu diesem Zeitpunkt schwer demyelinisiert mit punktuell fast komplettem Verlust des Myelins. Die weiße Substanz aller Lappen wies dagegen von Woche 6 bis Woche 10 nahezu die gleiche, leicht verminderte, Myelindichte auf (Abb. 5 C-E), die sich im Vergleich zu den vorhergehenden Zeitpunkten auch nach 12 Wochen nur noch in den feinen, zur Granularschicht gelegenen, Bereichen verringerte. Auch der Pedunculus cerebellaris superior und das benachbarte Areal erreichte bei Woche 12 die maximal ausgeprägte Demyelinisierung mit nahezu komplettem Verlust des Myelins (Abb. 5 F).
Nach Absetzen der Cuprizonefütterung kam es in allen Bereichen des Kleinhirns zu einer Remyelinisierung. Das Myelin erreichte nach Woche 20 jedoch nicht die Dichte, die in den Kontrolltieren beobachtet worden war (Abb. 5 A und I).
Um zu untersuchen, ob eine länger als 12 Wochen dauernde Cuprizonefütterung zu schwererer Demyelinisierung führt, wurden weitere Experimente durchgeführt. Eine Cuprizonefütterung über 14 bzw. 16 Wochen bewirkte keine Zunahme des Demyelinisierungsgrades im Zerebellum im Vergleich zu 12 Wochen Cuprizoneadministration (Daten nicht gezeigt).
Da PLP- und MBP-Färbungen keine signifikanten Unterschiede aufwiesen, werden in den Abbildungen 4 und 5 nur Ergebnisse für PLP gezeigt. Die LFB-Färbung erwies sich als nicht sensitiv genug, um kortikale Demyelinisierungsvorgänge im Kleinhirn aufzuzeigen.
Abbildung 4. Demonstration der De- und Remyelinisierung anhand von Bildern ausgewählter Bereiche, gefärbt durch den Myelinmarker PLP. C57BL/6N Mäuse wurden 12 Wochen lang mit Cuprizone gefüttert, danach wurde Normalfutter weitergegeben. Wie in den Bildern zu sehen trat ausgeprägte Demyelinisierung nach 12 Wochen Cuprizonefütterung auf. Bei Woche 20 (nach 8 Wochen Erholung bei Normalfutter) nahm die Myelindichte wieder zu, erreichte jedoch nicht die in den Kontrollen beobachtete Dichte. Die Zeichnung über den Bildern zeigt die Bereiche in denen die Bilder gemacht wurden. Maßstäbe: 100 µm (A1-4, D1-4), 50 µm (B1-4, C1-4), 200 µm (E1-4).
Abbildung 5. Skizzen zur Demonstration der verschiedenen beobachteten Demyelinisierungsgrade in der rostral gelegenen Kleinhirnregion. C57BL/6N Mäuse wurden 12 Wochen lang mit Cuprizone gefüttert, danach wurde Normalfutter weitergegeben. Die Demyelinisierung wurde anhand von PLP- Färbungen beurteilt. Demyelinisierung der weißen Substanz wurde auf der linken Seite aufgetragen, kortikale Demyelinisierung auf der rechten Seite. Drei Demyelinisierungsgrade wurden unterschieden: leichte Demyelinisierung wird in Blau gezeigt, mäßige Demyelinisierung in Rot und vollständiger Verlust des Myelins in Gelb. Folgende Abkürzungen wurden zur Markierung der Areale benutzt: lingula cerebelli (LIC), lobulus centralis (LOC), lobus anterior (LA), lobulus simplex (LS), crus I lobuli ansiformis (C1LA), pedunculus cerebellaris superior (SCP).
3.2 Der Demyelinisierungsgrad im Zerebellum ist regional unterschiedlich ausgeprägt Um das Ausmaß kortikaler Demyelinisierung im Kleinhirn weiter zu untersuchen, wurden die Veränderungen im Myelinisierungsgrad zusätzlich in einer zweiten, weiter kaudal gelegenen Region des Kleinhirns untersucht. Auch für diese Region wurden Schnitte immunhistochemisch auf MBP und PLP gefärbt und ausgewertet. In der 2. Region begann die Demyelinisierung, ähnlich wie in der rostraleren Region, in der weißen Substanz um den Pedunculus cerebellaris superior herum nach 4 Wochen Cuprizonefütterung (Abb. 6 K). Eine leichtgradige Demyelinisierung der weißen Substanz in allen Lappen war ab Woche 4 zu erkennen. Von Woche 4 bis Woche 10 blieb die Myelindichte nahezu konstant. Der Kortex zeigte in allen Lappen eine ausgeprägte Verminderung der Myelindichte von Woche 6 an (Abb. 6 L). Der maximal beobachtete Myelinverlust des Kortex lag bei Woche 12 vor (Abb. 6 O), wohingegen die Demyelinisierung in der weißen Substanz bei Woche 12 im Vergleich zu 6, 8 und 10 nur geringfügig zugenommen hatte (Abb. 6 L-O). Das Areal um den Pedunculus cerebellaris superior herum wies einen nahezu kompletten Verlust des Myelins bei Woche 12 auf. Nach der Rückkehr zu Normalfutter persistierte die Demyelinisierung bei Woche 13 und 14 sowohl im Kortex als auch in der weißen Substanz aller Lappen nahezu unverändert. Zu diesen Zeitpunkten konnte nur in dem Areal um den Pedunculus cerebellaris superior herum eine Zunahme der Myelindichte beobachtet werden (Abb. 6 P und R). Erst bei Woche 20, also 8 Wochen nach dem Absetzten der Cuprizonefütterung, konnte eine Zunahme der Myelindichte im Kortex und in der weißen Substanz der Lappen beobachtet werden, aber auch zu diesem Zeitpunkt bestand immer noch eine leichtgradige Demyelinisierung (Abb. 6 S). Im Vergleich zu der rostraler gelegenen Region war das Ausmaß des Myelinschadens im Kortex geringer nach 8 und 10 Wochen Cuprizonebehandlung (Abb. 5 D und E, Abb. 6 M und N). Nach der Rückkehr zu Normalfutter verlief die Remyelinisierung in der kaudaler gelegenen Region langsamer.
Abbildung 6. Skizzen zur Demonstration der verschiedenen beobachteten Demyelinisierungsgrade in der kaudal gelegenen Region. C57BL/6N Mäuse wurden 12 Wochen lang mit Cuprizone gefüttert, danach wurde Normalfutter weitergegeben. Die Demyelinisierung wurde anhand von PLP-Färbungen beurteilt. Demyelinisierung der weißen Substanz wurde auf der linken Seite aufgetragen, kortikale Demyelinisierung auf der rechten Seite. Drei Demyelinisierungsgrade wurden unterschieden: leichte Demyelinisierung wird in Blau gezeigt, mäßige Demyelinisierung in Rot und vollständiger Verlust des Myelins in Gelb.
Folgende Abkürzungen wurden zur Markierung der Areale benutzt: comissura cerebelli/
nodulus (CC/ND), culmen (CU), lobulus simplex/crus I lobuli ansiformis (LS/C1LA), crus II lobuli ansiformis/lobulus paramedianus (C2LA/LP), pedunculus cerebellaris superior (SCP).
3.3 Cuprizoneadministration führt zum Verlust an reifen Oligodendrozyten
3.3.1 Veränderungen der Oligodendrozytendichte in der rostralen Region bei Cuprizoneadministration
Der Einfluss von Cuprizone auf die myelinbildenen Zellen, die reifen Oligodendrozyten, wurde mit Hilfe von Nogo-A-Färbungen untersucht. Nogo-A-positive Zellen wurden lichtmikroskopisch in allen Lappen der rostralen Kleinhirnregion sowohl im Kortex als auch in der weißen Substanz ausgezählt. In Kontrolltieren wurde im Kortex eine deutlich niedrigere Oligodendrozytendichte ermittelt, als in der weißen Substanz der Kleinhirnläppchen (Abb. 7).
Nach Cuprizonebehandlung war in der rostralen Region die Anzahl an Nogo-A positiven Zellen in allen beobachteten Arealen signifikant vermindert (Abb. 7; Kortex: LIC p<0.0001, LOC p<0.0001, LA p<0.0001, LS p<0.0001, C1LA p=0.0004; weiße Substanz: LIC p<0.0001, LOC p<0.0001, LA p=0.004, LS p<0.0001, C1LA p=0.0002). Die Anzahl an Oligodendrozyten veränderte sich signifikant im Lauf der Cuprizoneadministration, die niedrigste Dichte wurde nach 4 und 12 Wochen beobachtet, wohingegen die Dichte zwischen Woche 6 und 8, sowie nach dem Absetzen von Cuprizone (Woche 13) wieder zunahm. Nach 20 Wochen hatte sich die Oligodendrozytendichte in der rostralen Region wieder vollständig erholt.
Abbildung 7. Oligodendrozytendichte während der Cuprizonefütterung in der rostral gelegenen Region des Kleinhirns. Die Graphen stellen die Anzahl Nogo-A-positiver Zellen im Kortex (linke Säule) und in der weißen Substanz (rechte Säule) der verschiedenen Lappen dar. C57BL/6N Mäuse wurden 12 Wochen lang mit Cuprizone gefüttert (schwarze Balken), danach wurde Normalfutter weitergegeben (weiße Balken). Den Kontrollen gegenüber signifikante Ergebnisse sind durch
3.3.2 Veränderungen der Oligodendrozytendichte in der kaudalen Region bei Cuprizoneadministration
Um zu überprüfen, ob das Verhalten der Oligodendrozyten unter Cuprizoneeinfluss regionalen Unterschieden unterworfen ist, wurde eine zweite, kaudal gelegene, Region immunhistochemisch auf Nogo-A gefärbt. Auch in dieser Region wurden im Kortex und in der weißen Substanz aller Lappen Nogo-A-positive Zellen lichtmikroskopisch ausgezählt.
In Kontrolltieren wurde auch in der kaudal gelegenen Region im Kortex eine deutlich niedrigere Oligodendrozytendichte ermittelt, als in der weißen Substanz der Kleinhirnläppchen. In der kaudalen Region war die Anzahl an Nogo-A-positiven Zellen während der Cuprizoneadministration im Kortex und weißer Substanz aller Lappen ebenso wie in der rostralen Region signifikant vermindert (Abb. 8; Kortex: CC/ND p=0.0004, CU p<0.0001, LS/C1LA p<0.0001, C2LA/LP p=0.0003; weiße Substanz: CC/ND p<0.0001, CU p<0.0001, LS/C1LA p<0.0001, C2LA/LP p<0.0001). Auch hier wurde die niedrigste Oligodendrozytendichte zu den Zeitpunkten Woche 4 und Woche 12 beobachtet, wohingegen die Dichte zwischen Woche 6 und 8, sowie nach dem Absetzen von Cuprizone (Woche 13) wieder zunahm. Im Gegensatz zur rostralen Region, in der sich die Oligodendrozytendichte bei Woche 20 wieder vollständig erholt hatte, hatten einige Lappen der kaudalen Region zu diesem Zeitpunkt noch nicht wieder die in den Kontrolltieren beobachtete Dichte erreicht.
Abbildung 8. Oligodendrozytenzahl während der Cuprizonebehandlung in der zweiten, kaudaler gelegenen Region des Kleinhirns. Die Graphen zeigen die Anzahl Nogo-A-positiver Zellen im Kortex (linke Säule) und in der weißen Substanz (rechte Säule) der verschiedenen Lappen. C57BL/6N Mäuse wurden 12 Wochen lang mit Cuprizone gefüttert (schwarze Balken), danach wurde Normalfutter weitergegeben (weiße Balken). Den Kontrollen gegenüber signifikante Ergebnisse sind durch Sternchen gekennzeichnet (*p<0,05, **p<0,01 und ***p<0,001).
3.4 Cuprizonefütterung führt zu Mikrogliaaktivierung
3.4.1 Mikrogliainfiltration in der rostralen Region
Um das Verhalten aktivierter Mikroglia während der Cuprizoneadministration zu untersuchen, wurde der Marker Mac-3 immunhistochemisch angefärbt. Mac-3-positive Zellen wurden sowohl im Kortex als auch in der weißen Substanz in allen Lappen des Kleinhirns lichtmikroskopisch ausgezählt.
In Kontrolltieren konnten keine aktivierten Mikroglia gefunden werden (Abb. 9 A1 und B1, Abb. 10). Die Mikrogliadichte nahm in allen Lappen im Lauf der Cuprizonegabe signifikant zu (Abb. 10; für alle kortikalen Areale und Areale der weißen Substanz p<0.0001). In der weißen Substanz konnte eine höhere Mikrogliadichte beobachtet werden, als im Kortex. Die Mikrogliadichte erreichte im Kortex das Maximum bei Woche 6, in der weißen Substanz bei Woche 8. In den darauf folgenden Wochen kam es zu einer stetigen Abnahme der Mikrogliazahlen.
Abbildung 9. Demonstration der Mikrogliainfiltration nach 6 Wochen Cuprizonefütterung im Vergleich zu Kontrolltieren. Die Gewebeschnitte wurden immunhistochemisch auf den Mikrogliamarker MAC-3 gefärbt und dann zur Zellkernfärbung mit Mayers Hämalaun gegengefärbt.
Nach 6 Wochen Cuprizonefütterung konnten MAC-3-positive Zellen sowohl im Kortex, als auch in der weißen Substanz gefunden werden (A2, B2), wohingegen bei Kontrolltieren keine aktivierten Mikroglia gefunden werden konnten (A1, B1). Die Skizze links neben den Bildern zeigt die Bereiche, in denen die Bilder aufgenommen wurden. Maßstäbe: 100 µm (A1-2, D1-4), 50 µm (B1-2).
Abbildung 10. Aktivierte Mikroglia während der Cuprizonefütterung in der rostral gelegenen Region des Kleinhirns. Die Graphen zeigen die Anzahl MAC-3-positiver Zellen im Kortex (linke Säule) und in der weißen Substanz (rechte Säule) der verschiedenen Lappen. C57BL/6N Mäuse wurden 12 Wochen lang mit Cuprizone gefüttert (schwarze Balken), danach wurde Normalfutter weitergegeben (weiße Balken). Den Kontrollen gegenüber signifikante Ergebnisse sind durch Sternchen gekennzeichnet
3.4.2. Verhalten von Mikroglia in der kaudalen Region
Um zu überprüfen, ob das Verhalten der Mikroglia unter Cuprizoneeinfluss regionalen Unterschieden unterworfen ist, wurde eine zweite, kaudal gelegene, Region immunhistochemisch auf Mac-3 gefärbt, und im Kortex und in der weißen Substanz aller Lappen Mac-3-positive Zellen lichtmikroskopisch ausgezählt.
Auch in dieser Region konnten in Kontrolltieren keine aktivierten Mikroglia gefunden werden. Die Mikrogliadichte nahm im Lauf der Cuprizonegabe auch hier signifikant zu (Abb.
11; Kortex: CC/ND p<0.0001, CU p<0.0005, LS/C1LA p<0.0001, C2LA/LP p<0.002; für alle Areale der weißen Substanz p<0.0001). In der weißen Substanz war die Mikrogliadichte höher als im Kortex. Mit Ausnahme des „LS/C1LA“- Areals wurde das Maximum der Mikrogliadichte im Kortex bei Woche 8 erreicht, also 2 Wochen später als in der rostralen Region. In der weißen Substanz trat das Maximum der Mikrogliadichte bei Woche 10 auf, auch hier zwei Wochen später als in der rostralen Region. Zusätzlich wurden in der kaudalen Region auch nach Absetzten der Cuprizonefütterung noch signifikant erhöhte Mikrogliazahlen gefunden.
Abbildung 11. Aktivierte Mikroglia während der Cuprizonebehandlung in der zweiten, kaudalen Region des Kleinhirns. Die Graphen zeigen die Anzahl MAC-3-positiver Zellen im Kortex (linke Säule) und in der weißen Substanz (rechte Säule) der verschiedenen Lappen. C57BL/6N Mäuse wurden 12 Wochen lang mit Cuprizone gefüttert (schwarze Balken), danach wurde Normalfutter weitergegeben (weiße Balken). Den Kontrollen gegenüber signifikante Ergebnisse sind durch Sternchen gekennzeichnet (*p<0,05, **p<0,01 und ***p<0,001).
3.5 Astrogliose während der Cuprizoneadministration
Vor der Behandlung mit Cuprizone konnten nur wenig GFAP-positive Zellen in den Schnitten der rostral gelegenen Region gefunden werden, diese waren zum größten Teil periventrikulär und um den Pedunkel herum lokalisiert. Nur sehr wenig Astrozyten konnten in den Läppchen des Zerebellums gefunden werden (Abb. 8A1, B1). Nach 4 Wochen Cuprizone- induzierter Demyelinisierung nahm die Anzahl an Astrozyten periventrikulär zu. Die ersten GFAP- positiven Astrozyten in den Kleinhirnlappen, sowohl im Kortex als auch in der weißen Substanz, konnten nach 6 Wochen Cuprizoneadministration beobachtet werden (Abb. 12 A2, B2). Der Höhepunkt der Astrozytose wurde sowohl im Kortex als auch in der weißen Substanz nach Woche 8 erreicht. Die Astrozytendichte fiel nach diesem Zeitpunkt schnell ab.
Eine leichtgradige Astrozytose konnte periventrikulär dagegen noch bei Woche 20 beobachtet werden. Die Entwicklung der Astrozytose in der kaudalen Region verlief ähnlich.
Da in Vorarbeiten der Arbeitsgruppe (Skripuletz et al, 2008) im Kortex des Großhirns eine stark ausgeprägte Astrozytose nach Cuprizonebehandlung beobachtet worden war, wurden in dieser Arbeit in Ergänzung zur Beurteilung der Astrozytose im Kleinhirn ebenfalls Schnitte aus dem Großhirn analysiert. Im Vergleich zum Großhirn fiel auf, dass der Grad der Astrozytose im Kleinhirn deutlich geringer ausgeprägt war. Die Unterschiede zwischen Groß- und Kleinhirn werden in Abb. 12 demonstriert.
Abbildung 12. Astrozytose während der Cuprizonebehandlung wurde mit Hilfe des GFAP- Antikörpers sichtbar gemacht. Bei unbehandelten Kontrolltieren waren sowohl in den Lappen des Kleinhirns (Fig. A1, B1) als auch im zerebralen Kortex (C1) kaum GFAP-positive Zellen vorhanden.
Die Anzahl GFAP-positiver Astrozyten im Kleinhirn der Versuchstiere stieg nach 6 Wochen Cuprizone-induzierter Demyelinisierung an. Die Astrozytendichte erreichte das Maximum nach Woche 8. Die Astrozytose war im Kortex des Großhirns ausgeprägter, als im Kleinhirn (C2, C3). Die Skizzen über den Bildern zeigen die Bereiche, in denen die Bilder gemacht wurden. Maßstäbe: 50 µm (A1-3), 100 µm (B1-3, C1-3).
4. Diskussion
4.1 Methodische Überlegungen
In dieser Arbeit wurde die De- und Remyelinisierung des Kortex und der weißen Substanz des Kleinhirns von C57BL/6N- Mäusen im Cuprizonemodell untersucht. Es wurde eine rostral und eine kaudal gelegene Region untersucht. Obwohl kortikale Demyelinisierung im Großhirn bereits beschrieben wurde (Skripuletz et al., 2008), lagen für das Kleinhirn bisher keine Daten vor. Im Folgenden sollen die gemachten Beobachtungen im Zusammenhang mit aktuellen Forschungsergebnissen diskutiert werden.
4.1.1 Das Cuprizonemodell
Durch das Toxin Cuprizone lässt sich verlässlich eine Schädigung des Myelins und der myelinbildenen Zellen, der Oligodendrozyten, induzieren, das Ausmaß der Schädigung ist jedoch abhängig von Alter, Geschlecht und genetischem Hintergrund der Tiere (Matsushima und Morrell, 2001). In dieser Studie wurden Gehirne von Mäusen des C57BL/6N-Stamms untersucht. C57BL/6N ist ein Inzuchtstamm, die Tiere sind hierdurch genetisch und phänotypisch gleich (Torkildsen et al., 2008). Das Genom der Tiere wurde bereits entschlüsselt (Torkildsen et al., 2008). In Anlehnung an vorhergehende Arbeiten anderer Arbeitsgruppen wurden nur männliche zu Beginn der Versuche 8 Wochen alte Tiere ausgewählt, um die Auswirkungen hormoneller Schwankungen zu minimieren (Matsushima und Morell, 2001). Für alle drei Versuchsreihen über 12, 14 bzw. 16 Wochen wurde eine Cuprizonekonzentration von 0,2% gewählt, da höhere Konzentrationen mit einer erhöhten Sterblichkeit der Versuchstiere verbunden sind (Hiremath et al., 1998). Während der Demyelinisierung über 14 und 16 Wochen zeigte sich eine erhöhte Sterblichkeit der Tiere, sodass das Cuprizonemodell nicht geeignet erscheint, Demyelinisierungsvorgänge über einen längeren Zeitraum als 16 Wochen zu verfolgen (Lindner et al., 2009).
4.1.2 Histologie und Auswertung
Die für diese Studie verwendeten immunhistochemischen Färbungen sind langjährig etablierte und sehr sensitive Verfahren zum Nachweis des entsprechenden Myelinproteins oder Zelltyps (Lindner et al., 2008a; Ho und Springer, 1983; Kuhlmann et al., 2007; Ludwin et al., 1976).
Der Grad der Myelinisierung wurde mittels getrennter immunhistochemischer Färbungen der Myelinproteine PLP bzw. MBP festgestellt. MBP und PLP sind sensible Myelinmarker und beide werden früh im Verlauf der Remyelinisierung wiederexprimiert (Lindner et al., 2008a).
Die LFB-Färbung ist als histochemische Färbung sehr gut dazu geeignet, eine große Anzahl an Schnitten mit geringem Zeitaufwand auf Myelin zu färben. Leider erwies sich diese Färbung als nicht sensitiv genug, um kortikale Demyelinisierung im Kleinhirn aufzudecken.
Immunhistochemisch gefärbte Schnitte, in denen ein ausgeprägter Myelinverlust sichtbar war, erschienen in der LFB-Färbung weitgehend normal. Ähnliche Beobachtungen waren zuvor bereits im Großhirn (Skripuletz et al., 2008), sowie im Hippocampus (Koutsoudaki et al., 2009) gemacht worden. Dies könnte dadurch bedingt sein, dass auch abgebaute Myelintrümmer durch diese Färbung noch angefärbt werden, sodass das volle Ausmaß des Myelinschadens nicht deutlich wird (Matsushima und Morrell, 2001).
Aktivierte Mikroglia/Makrophagen wurden mittels des monoklonalen Antikörpers Mac-3 angefärbt. Mac-3 bindet an ein Antigen, dass auf der Oberfläche von mononukleären Phagozyten von Mäusen exprimiert wird (Ho und Springer, 1983; Springer, 1981). Mac-3 erwies sich als verlässlicher Marker zur Anfärbung von Mikroglia im Kleinhirn. Bei der Auszählung musste jedoch beachtet werden, dass durch eine ebenfalls positive Färbung von Endothelzellen die Gefahr von Fehlzählungen gegeben war (Hulette et al., 1992; Mannoji et al., 1986).
Oligodendrozyten wurden mittels des polyklonalen Antikörpers Nogo-A angefärbt. Nogo-A erwies sich als ausgezeichneter Marker zur Anfärbung von Oligodendrozyten sowohl im Kortex als auch in der weißen Substanz des Kleinhirns. Keine Kreuzanfärbungen von Astrozyten oder Makrophagen wurden durch diesen Antikörper beobachtet, dies deckt sich mit den Ergebnissen von Kuhlmann et al. (2007). Nogo-A ist ein Protein, das sich im Zytoplasma von Oligodendrozyten befindet, seine Funktion ist noch unklar (Kuhlmann et al., 2007). Zwar werden durch die Färbung mit dem Nogo-A-Antikörper auch Purkinje-Zellen und andere neuronale Subpopulationen angefärbt, diese Anfärbung ist von der Intensität her jedoch deutlich schwächer, als bei den Oligodendrozyten. Auch morphologisch unterscheiden sich Oligodendrozyten von Neuronen. Aus diesen Gründen bereitete es bei der Auswertung keine Schwierigkeiten, zwischen Oligodendrozyten und Neuronen zu unterscheiden.
Astrozyten wurden durch Anfärbung mit dem Marker GFAP sichtbar gemacht. GFAP ist ein etablierter Marker für Astrozyten (Ludwin et al., 1976; Nair et al., 2008), einzeln stehende Astrozyten können nach Anfärbung allein durch ihre charakteristische Sternform morphologisch identifiziert werden. Die Quantifizierung von Astrozyten in aktiven Läsionen
stellt ein Problem dar, da sich die Fortsätze durch die hohe Dichte an Zellen überlappen, und die gebildete Narbe selbst auch GFAP-positiv ist. Aus diesem Grunde war eine Zählung der Astrozyten nicht möglich, so dass die Dokumentation der Anwesenheit von Astrozyten sich auf photographische Bilder beschränken musste.
4.2 Demyelinisierung und Remyelinisierung
Kortikale Demyelinisierung des Kleinhirns konnte zuerst nach 6 Wochen Fütterung mit Cuprizone beobachtet werden. Das maximale Ausmaß an kortikalem Myelinverlust wurde in beiden beobachteten Regionen bei Woche 12 erreicht.
Parallel zur Entstehung dieser Arbeit forschten auch Groebe et al. (2009) an der Auswirkung von Cuprizone auf das kortikale Myelin des Kleinhirns. Die Arbeitsgruppe konnte hierbei keine Verringerung des kortikalen Myelins feststellen. Die Diskrepanz zwischen den eigenen Beobachtungen und den von Groebe et al. (2009) gemachten Beobachtungen ist dadurch zu erklären, dass Groebe et al. (2009) 0,2% Cuprizone nur über 5 Wochen lang verabreicht haben. Zu diesem Zeitpunkt konnte auch in der hier vorliegenden Arbeit noch kein Myelinverlust beobachtet werden.
Die im Rahmen dieser Arbeit im Kleinhirn gemachten Beobachtungen unterscheiden sich deutlich von in der Vergangenheit gemachten Beobachtungen im Großhirn. Skripuletz et al.
(2008) zeigten, dass es im Kortex des Großhirns von C57BL/6N-Mäusen bereits nach 6 Wochen Cuprizonegabe zu einem kompletten Verlust des Myelins kommt. Ein kompletter Verlust des Myelins konnte in der vorliegenden Studie im Kleinhirn zu keinem Zeitpunkt beobachtet werden. Nach 12 Wochen Cuprizonefütterung war das Myelin im Kleinhirnkortex zwar deutlich reduziert aber nicht vollständig untergegangen. Eine Verlängerung der Cuprizonegabe auf 14 bzw. 16 Wochen konnte kein komplettes Verschwinden des kortikalen Myelins bewirken.
Kortikale Remyelinisierung konnte in beiden Regionen nach Absetzen des Toxins beobachtet werden. In der kaudaler gelegenen Region verlief die Remyelinisierung jedoch langsamer.
Zum Zeitpunkt Woche 20 war die Myelindichte in beiden Kleinhirnregionen geringer ausgeprägt als sie in den Kontrolltieren beobachtet worden war.
Gering ausgeprägte Demyelinisierung in der weißen Substanz des Kleinhirns konnte in beiden Regionen nach 4 Wochen Cuprizonefütterung beobachtet werden. Die Demyelinisierung begann im Areal um den Pedunculus cerebellaris superior herum, und griff im weiteren Verlauf auch auf die weiße Substanz der Kleinhirnläppchen über. Es wurde jedoch zu keinem Zeitpunkt ein völliger Untergang des Myelins der weißen Substanz erreicht. Auch in der weißen Substanz unterscheidet sich der Ablauf der Demyelinisierung vom Großhirn.
Hiremath et al. (1998) beschreiben, dass mit 0,2% Cuprizone gefütterte C57BL/6N-Mäuse bereits nach 3 Wochen einen Verlust an Myelin in der weißen Substanz des Corpus callosums zeigen, nach 5 Wochen erscheint das Corpus callosum vollständig demyelinisiert.
Während die Demyelinisierung des Kleinhirnkortex bis zum Absetzten des Toxins nach 12 Wochen stetig zunahm, schien die Demyelinisierung in der weißen Substanz des Kleinhirns über lange Zeit bei leichtgradigem Myelinverlust stillzustehen. Nur in den feinen, in den Kortex einmündenden Myelinfasern der weißen Substanz kam es zu einer weiteren Ausdünnung des Myelins, das jedoch auch hier nicht vollständig verschwand.
In beiden Regionen wurde nach Absetzen des Toxins nach 12 Wochen wieder Myelin aufgebaut. Das Myelin erreichte in beiden Kleinhirnregionen in der weißen Substanz der Lappen bei Woche 20 des Versuchs nur eine geringere Dichte im Vergleich zu gesunden Tieren. Wie im Kortex beobachtet, so verlief auch die Remyelinisierung der weißen Substanz in der kaudalen Region langsamer als in der rostralen Region.
Bei Betrachtung der Ergebnisse sowohl für die weiße Substanz, als auch für das zerebelläre kortikale Myelin fällt auf, dass deutliche Unterschiede zu den im Großhirn gemachten Beobachtungen bestehen. Ein Grund hierfür könnte sein, dass im Kleinhirn andere Pathomechanismen eine Rolle spielen. Stidworthy et al. (2003) beschrieben bereits, dass die Cuprizonewirkung in verschiedenen anatomischen Bereichen des Großhirns variiert. So kommt es hier zu einer starken Demyelinisierung des kaudalen Corpus callosum, wohingegen der rostral gelegene Teil von Demyelinisierung weniger betroffen ist. Regionale Unterschiede im Ausmaß der Demyelinisierung wurden auch im Hippocampus beobachtet (Koutsoudaki et al., 2009).
Der Grad, der Demyelinisierung in bestimmten anatomischen Gebieten variiert auch bei der menschlichen Erkrankung Multiple Sklerose. Hier wurde beobachtet, dass das Ausmaß
kortikaler Demyelinisierung am größten im Kleinhirn und im Rückenmark ist (Gilmore et al.
2008). Es konnte noch nicht erklärt werden, warum diese Bereiche besonders betroffen sind.
Gilmore et al. (2008) fanden im Kleinhirn hauptsächlich subpial gelegene Stellen kortikaler Demyelinisierung. Eine Theorie zur Entstehung dieser subpialen Entzündungsherde ist, dass der zur Entzündung führende Reiz vom Liquor ausgeht, so dass graue Substanz, die nahe an den Ventrikeln, oder in einem Bereich relativer Liquorstase liegt, in besonderem Maß von Demyelinisierung betroffen ist (Kutzelnigg und Lassmann, 2006; Gilmore et al., 2008). Dies erklärt jedoch nicht, warum oft auch die graue Substanz des Rückenmarks ausgeprägte Demyelinisierung aufweist, obwohl kein direkter Kontakt mit dem Liquor besteht (Gilmore et al., 2008).
4.3 Schicksal der Oligodendrozyten
Während der Cuprizoneadministration kam es zum Verlust an reifen Oligodendrozyten, den Myelinbildnern des ZNS, in allen Bereichen beider Kleinhirnregionen. Die niedrigste Oligodendrozytendichte wurde in beiden Regionen zu den Zeitpunkten Woche 4 und 12 beobachtet. Zwischen Woche 6 und 8 nahm die Oligodendrozytendichte wieder zu. Durch die fortführende Behandlung mit Cuprizone wurde ein erneutes Absterben von Oligodendrozyten beobachtet. Nach dem Absetzen des Toxins nahm die Oligodendrozytendichte in beiden Regionen des Kleinhirns wieder zu. In der rostralen Region erholte sich die Oligodendrozytendichte zum Zeitpunkt Woche 20 vollständig, in der kaudalen Region wurde zu diesem Zeitpunkt eine geringere Dichte als in den Kontrolltieren beobachtet. Die Veränderungen der Oligodenrozytendichte im Kortex und weißer Substanz verliefen synchron.
Cuprizone ist ein Toxin, das sehr stark auf Oligodendrozyten zu wirken scheint. Der Grund hierfür könnte eine durch Cuprizone bewirkte Störung im Energiehaushalt der Oligodendrozyten sein, der den weiteren Erhalt des Myelins unmöglich macht (Matsushima und Morrell, 2001).
Interessanterweise geht eine niedrige Oligodendrozytendichte nicht zu allen Zeitpunkten mit einem gleichzeitig niedrigen Myelinisierungsgrad einher. Bei Woche 4 bestand eine niedrige Oligodendrozytendichte, trotzdem war die Demyelinisierung im Kortex und weißer Substanz noch nicht besonders ausgeprägt. Nach 12 Wochen Cuprizone dagegen wurde ein zweiter Tiefpunkt der Oligodendrozytendichte beobachtet, dieser geht einher mit dem maximalen beobachteten Demyelinisierungsgrad. Die Demyelinisierung durch Cuprizone scheint ein
Prozess zu sein, der nur bedingt mit der absoluten Oligodendrozytenzahl korreliert. Zu den Zeitpunkten Woche 6 und 8 nahm die Anzahl der Oligodendrozyten wieder zu, trotzdem schritt die Demyelinisierung im Kortex und weißer Substanz voran. Hieraus ist zu folgern, dass die Oligodendrozyten ihre Arbeit der Neubildung von Myelin entweder gar nicht beginnen können, da sie durch Cuprizone vorher sterben, oder dass ihre Myelinbildung unter laufender Cuprizonegabe zu ineffektiv ist, um das bereits geschädigte Myelin in nennenswerter Menge zu ersetzten.
4.4 Mikroglia: protektiv oder destruktiv?
In beiden Regionen traten im Laufe der Cuprizoneadministration aktivierte Mikroglia bereits nach 4 Wochen in Erscheinung und blieben während der gesamten Zeit der Cuprizoneadministration nachweisbar. Interessanterweise wurde das Maximum der Mikrogliadichte pro mm2 im Kortex 2 Wochen vor dem Maximum in der weißen Substanz erreicht. In der rostralen Region wurde das Maximum der Mikrogliadichte im Kortex bei Woche 6 erreicht, in der weißen Substanz bei Woche 8. In der kaudalen Region wurde das Maximum der Mikrogliadichte im Kortex bei Woche 8 beobachtet, in der weißen Substanz bei Woche 10.
Die Rolle der Mikroglia im Prozess von Demyelinisierung und Remyelinisierung erscheint ambivalent und komplex. In der vorliegenden Studie war der Entzündungsprozeß im Kortex durch eine ausgeprägte Mikrogliaaktivierung geprägt, trotzdem wurde kein vollständiger Myelinverlust im Kortex erreicht. Skripuletz et al. (2008) untersuchten die Cuprizonewirkung auf den Kortex des Großhirns, sowohl von Mäusen vom Stamm C57BL/6N, als auch von BALB/cJ-Mäusen. Bei den C57BL/6N-Mäusen kam es zu einem nahezu kompletten kortikalen Myelinverlust bei nur geringgradiger Mikroglia-Akkumulation, wohingegen die BALB/cJ-Mäuse eine starke Mikroglia-Akkumulation aber geringgradigere kortikale Demyelinisierung zeigten.
Ist es also möglich, dass eine erhöhte Mikrogliadichte mit einem geringgradigeren Myelinverlust einhergeht, als eine weniger ausgeprägte Mikrogliaaktivierung? Wirken Mikroglia also eher protektiv oder destruktiv?
In der Vergangenheit wurden Hinweise auf beide möglichen Verhaltensweisen der Mikroglia gefunden. Hiremath et al. (1998) untersuchten die Auswirkungen von 0,2% Cuprizone auf das
