Klinik für Plastische, Rekonstruktive und Ästhetische Chirurgie, Klinikum Bremen-Mitte und dem
Center for Biomolecular Interactions Bremen, Universität Bremen
Eignung bioartifizieller Matrices als dermaler Ersatz für die Hautwundheilung
Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin in der Medizinischen Hochschule Hannover
vorgelegt von
Marcin Specht geb. Dzięcioł
aus Poznań
Bremen 2019
Angenommen vom Senat der Medizinischen Hochschule Hannover am 30.09.2019
Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover
Präsident: Prof. Dr. med. Michael P. Manns
Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. med. Dr. phil. Ursula Mirastschijski
1. Referent: PD Dr. med. Heiko Sorg
2. Referent: Prof. Dr. med. Christian Herold
Tag der mündlichen Prüfung: 30.09.2019
Prüfungsausschuss:
Vorsitz: Prof. Dr. med. Alexander Kapp 1. Prüfer: PD Dr. med. Tomas Smith 2. Prüfer: PD Dr. med. Ingmar Mederacke
Luca Noah D zięcioł gewidmet
IV
Inhaltsverzeichnis
Abbildungsverzeichnis ... VII Tabellenverzeichnis ... IX
1 Einleitung ... 1
1.1 Zielsetzung und erwartete neue Erkenntnisse ... 2
1.2 Physiologie der normalen Hautwundheilung ... 2
1.3 Pathophysiologie der Narbenbildung ... 4
1.4 Die Verbrennungswunde ... 5
1.4.1 Pathogenese der Verbrennungsverletzung und hypertrophen Narbenbildung ... 6
1.4.2 Therapie bei Verbrennungen ... 7
1.5 Epidermale und dermale Ersatzmatrices ... 8
1.6 Amnion ... 10
2 Material und Methoden ... 11
2.1 Genehmigung der Studie ... 11
2.2 Humanes Gewebe ... 11
2.3 Versuchsmodell ... 11
2.3.1 Herstellung der de-epidermalisierter Dermis (DED) ... 12
2.3.2 Epiflex® ... 12
2.3.3 Matriderm® ... 13
2.3.4 Composite Herstellung und Inkubation ... 13
2.4 Analysen ... 15
2.4.1 Zellmigration ... 15
2.4.2 Histologische und immunhistochemische Untersuchungen ... 16
2.4.3 Biochemie ... 19
2.4.4 Multi-Array® Assay System ... 20
2.5 Statistische Verfahren ... 20
3 Resultate ... 21
3.1 Epitheliale Migration auf DED, Epiflex® und Matriderm® ... 21
3.1.1 Epitheliale Migration auf Amnion ... 22
3.1.2 Epitheliale Migration im Vergleich von Epiflex®-Sheets aus oberen und unteren Dermisanteilen ... 23
3.2 Hämatoxylin-Eosin Histologie ... 24
Inhaltsverzeichnis V
3.3 Immunhistochemische Analysen ... 26
3.3.1 Analyse der Proliferation mit Ki67 immunhistochemischer Färbung ... 26
3.3.2 Analyse der Apoptose mit Caspase-8 immunhistochemischer Färbung ... 27
3.3.3 Analyse der zellulären Differenzierung mit immunhistochemischen Färbungen für Zytokeratin-10 und Zytokeratin-14 ... 29
3.3.4 Analyse der Migration mit immunhistochemischen Färbungen für MMP-3 und MMP-10 ... 31
3.3.5 Analyse der Präsenz von Fibroblasten mit der immunhistochemischen Anfärbung für Vimentin ... 34
3.4 Multianalyt-Microarray-Assay ... 35
3.4.1 Zytokine ... 35
3.4.2 Matrix Metalloproteinasen ... 39
4 Diskussion ... 42
4.1 Epithelialisierung dermaler und kollagenhaltiger Matrices ... 42
4.2 Epitheliales Wachstum auf Amnion ... 45
4.3 Zelluläre Differenzierung auf verschiedenen Matrices ... 47
4.4 Kutane inflammatorische Reaktion auf verschiedenen Matrices ... 48
5 Zusammenfassung ... 51
Literaturverzeichnis ... 53
Anhang ... 59
Anhang 1: Abkürzungsverzeichnis ... 59
Anhang 2: Materialien und Chemikalien ... 60
Anhang 3: HE Färbung (HXE-Färbung) ... 62
Anhang 4: Immunhistochemische Färbung ... 63
Anhang 5: Statistische Analysen ... 64
Anhang 5.1: Epithelialisierung ... 64
Anhang 5.2: Epitheliale Migration auf Amnion ... 65
Anhang 5.3: Epitheliale Migration im Vergleich von Epiflex®-Sheets aus oberen und unteren Dermisanteilen ... 66
Anhang 5.4: Horizontale und vertikale zelluläre Migration ... 67
Anhang 5.5: Proliferation ... 68
Anhang 5.6: Apoptose ... 69
Anhang 5.7: Zellulären Differenzierung ... 69
Anhang 5.8: Matrixmetalloproteinasen ... 70
Anhang 5.9: Fibroblastenpräsenz ... 71
Inhaltsverzeichnis VI
Curriculum vitae ... 72 Danksagung... 74 Erklärung nach § 2 Abs. 2 Nrn. 7 und 8 ... 75
VII
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Schematische Darstellung eines Composite ... 14
Abbildung 2: Versuchsaufbau mit den unterschiedlichen Composites auf modifizierten Zellsieben in einer 6-Well-Platte. ... 15
Abbildung 3: A. Fotographie eines Composites bestehend aus DED, darauf mit Micro Clips fixiertes Amnion B. Inkubation der Composites an der Air-Liquid-Interphase in 6-Brunnen Platten. ... 15
Abbildung 4: Schematische Darstellung der Meßmethode für die immunhistochemische Färbung Ki67 ... 19
Abbildung 5: Schematische Darstellung der Blickfelder, in denen Immunopositivität evaluiert wurde... 19
Abbildung 6: A. Epithelialisierung auf DED B. Epithelialisierung auf Amnion mit DED ... 21
Abbildung 7: Epitheliale Auswuchsfläche der Hauttransplantate auf DED ... 22
Abbildung 8: Epitheliale Auswuchsfläche von Hauttransplantaten auf Amnion ... 23
Abbildung 9: Epitheliale Auswuchsfläche der Hauttransplantate auf Epiflex® aus oberen und unteren Dermisanteilen ... 24
Abbildung 10: HE-Färbung, Hauttransplantate mit Neoepithel ... 25
Abbildung 11: Horizontale und vertikale zelluläre Migration ... 25
Abbildung 12: Immunhistochemische Färbung für Ki67 ... 26
Abbildung 13: Auswertung der immunhistochemischen Färbung für Ki67 ... 27
Abbildung 14: Immunhistochemische Anfärbung Caspase-8-positiver Zellen ... 28
Abbildung 15: Auswertung der immunohistochemischen Färbung für Caspase-8 ... 28
Abbildung 16: Immunhistochemische Anfärbung für Zytokeratin 10 und Zytokeratin 14 . 30 Abbildung 17: Auswertung der immunohistochemischen Färbung für Zytokeratin-10 und Zytokeratin 14 ... 31
Abbildung 18: Immunhistochemische Anfärbung für MMP-3 ... 32
Abbildung 19: Immunhistochemische Anfärbung für MMP-10. ... 33
Abbildung 20: Auswertung der immunohistochemischen Färbungen für MMP-3 und MMP-10 ... 33
Abbildung 21: Immunhistochemische Anfärbung mit dem fibroblastären Marker Vimentin ... 34
Abbildung 22: Auswertung der immunohistochemischen Färbung für Vimentin ... 35
Abbildung 23: Multianalyt-Microarray-Assay der Zytokine der Präparate der Gruppe Serie 1 ... 36
Abbildung 24: Multianalyt-Microarray-Assay der Zytokine der Präparate der Gruppe Serie 2 ... 36
Abbildungsverzeichnis VIII Abbildung 25: Multianalyt-Microarray-Assay der Zytokine der Präparate der Gruppe
Serie 3 ... 36 Abbildung 26: Statistische Analysen der Multianalyt-Microarray-Assay der Zytokine
mit signifikanten Unterschieden zwischen den Gruppen... 37 Abbildung 27: Statistische Analysen der Multianalyt-Microarray-Assay der Zytokine
ohne signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen ... 38 Abbildung 28: Multianalyt-Microarray-Assay verschiedener MMP´s von Präparaten der
Gruppe Serie 1 ... 39 Abbildung 29: Multianalyt-Microarray-Assay verschiedener MMP´s von Präparaten der
Gruppe Serie 2 ... 39 Abbildung 30: Multianalyt-Microarray-Assay verschiedener MMP´s für Präparate der
Gruppe Serie 3 ... 40 Abbildung 31: Statistische Analysen der Multianalyt-Microarray-Assay für MMP-9 und
MMP-10 ... 40 Abbildung 32: Statistische Analysen der Multianalyt-Microarray-Assay für MMP-1,
MMP-2 und MMP-3 ... 41
IX
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Verbrennungsgrade ... 7 Tabelle 2: Einteilung gängiger Ersatzmatrices nach Herstellung, Hauptbestandteilen und
Kosten ... 9 Tabelle 3: Informationen zum transplantierten Gewebe ... 11 Tabelle 4: Aufteilung und Asservierung der Präparate nach Beendigung der
Kultivierung ... 16 Tabelle 5: Verwendete Antikörper für immunhistochemische Analysen ... 18 Tabelle 6: Evaluation der Immunopositivität bei immunhistochemischen Färbungen
mithilfe einer Skalierung von 1 bis 4. ... 18 Tabelle 7: Verwendete Analyse-Kits der Firma Meso Scale Discovery® ... 20
1
1 Einleitung
Gewebedefekte nach ausgedehnten Decollementverletzungen, Tumorexzisionen und tiefrei- chenden Verbrennungen sind assoziiert mit Verlusten von epidermalen und dermalen Be- standteilen der Haut. Bei großflächigen Weichteildefekten, fehlenden Donorarealen oder mul- timorbiden Patienten, die nur minimalinvasiv behandelt werden können, sind dermale Äqui- valente sinnvoll, um einen zügigen Wundverschluss zu ermöglichen [1]. Aktueller Goldstan- dard bei der Behandlung solcher Wunden ist die autologe Hauttransplantation. Wünschens- wert wäre jedoch ein vollschichtiger Gewebeersatz nach komplettem Hautweichteilverlust (wie z.B. bei Verbrennungen), da die alleinige Hauttransplantation nur unzureichend mit Hin- blick auf die Gewebeelastizität ist und sehr häufig zu Narbenkontrakturen führt mit Ein- schränkung der Gelenkbeweglichkeit und der Lebensqualität der Patienten [2, 3]. Zu diesem Zweck stehen derzeit künstlich hergestellte Kollagenmatrices und allogene azelluläre Kada- verhaut zur Verfügung und finden klinische Anwendung als Gewebeersatz, z.B. als Faszien- ersatz in der Abdominalchirurgie oder als subkutaner Gewebeersatz bei sehr schlanken Frauen mit prothetischer Brustrekonstruktion nach brusterhaltender Therapie [4].
Bislang werden diese Matrices nicht als kutaner Ersatz bei Hautweichteilverlust verwendet, da Informationen über die Zellbesiedlung, Vaskularisation und fibrozytäre Durchbauung nicht vorhanden sind. Neben tiefreichenden Verbrennungsverletzungen wären Druckgeschwüre bei multimorbiden Patienten, die nicht für einen großflächigen, autologen Gewebetransfer geeig- net sind, ein weiteres Einsatzgebiet. Vorangegangene Studien mit der porcinen, azellulären dermalen Matrix Strattice™ zeigten ein intaktes, aber verzögertes Migrations- und Differen- zierungsverhalten von humanen Hautzellen in vitro im Vergleich mit de-epithelialisierter Dermis. Allerdings bedingt die Aufarbeitung des von Schweinen her stammenden Gewebes einen chemischen Prozess, der offensichtlich inflammatorische Reaktionen hervorrufen kann.
Aus diesem Grunde sind humane, allogene Matrices interessanter, da sich die Verarbeitungs- prozesse weniger aufwendig und mit weniger Reaktion beim Empfänger darstellen [5].
Humanes Amnion findet bereits heute breite Verwendung in der Ophthalmologie für zahlrei- che Erkrankungen und ist bekannt für seine antimikrobiellen und anti-inflammatorischen Ei- genschaften [6, 7]. In Bezug auf die Haut wurde Amnion bereits erfolgreich zur Behandlung von chronischen Ulzerationen eingesetzt [8]. Dabei unterstützt es die Neovaskularisation so- wie die Wundheilung [9]. Trotz der beobachteten positiven Eigenschaften der Amnionmemb- ran in Bezug auf die Wundheilung, ist wenig über die Migration und Differenzierung von Hautzellen auf dieser biologischen Matrix bekannt.
1 Einleitung 3 faktoren wie z.B. Transforming growth factor-beta (TGF-β), Interleukinen sowie von Entzün- dungsmediatoren wie Tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) die die umgebenden Zellen aus ihrem ruhenden Zustand aktivieren, um über die Wunde zu migrieren und diese mit provisori- scher Matrix zu füllen [13]. Die genannten Mediatoren bewirken eine rasche Einwanderung von Leukozyten und Makrophagen. Granulozyten phagozytieren eingedrungene Mikroben und setzen Zytokine und Proteasen wie beispielsweise Matrix Metalloproteinasen (MMP) frei. Zell-Matrix-Kontakte als auch Zellverbände werden so gelöst und begünstigen somit eine keratinozytäre Migration und Reepithelialisierung.
Bei ungestörtem Ablauf und ausbleibendem Infekt nimmt die Zahl der Leukozyten nach 1-2 Tagen in der Wunde schließlich ab und die der Makrophagen steigt, die dann ab dem 3-5 posttraumatischen Tag die häufigste Immunzellart in der Wunde darstellen [14]. Als zentrale Regulatoren der Wundheilung sind Makrophagen in jeder Phase vertreten. Simultan stimulie- ren die von den Makrophagen ausgeschütteten pro-angiogenetischen Wachstumsfaktoren wie VEGF (vascular endothelial growth factor) die Angiogenese und damit den Wundheilungs- prozess. Die freigesetzten Wachstumsfaktoren initiieren die Proliferation und Migration von Keratinozyten und Fibroblasten, womit die Proliferationsphase beginnt, wobei sowohl die Reepithelialisierung (Keratinozyten) als auch die Wundkontraktion (Fibroblasten) maßgeblich zum Wundverschluss beitragen. Die angeregten Fibroblasten beginnen mit der Bildung einer aus Fibrin, Fibronektin und Hyaluronsäure bestehenden provisorischen Matrix, die auch Gra- nulationsgewebe genannt wird. [15]
Um die Grundvoraussetzung der epithelialen Migration zur Reepithelialisierung zu schaffen, müssen mechanische Kontakte in Form von Hemidesmosomen, die die Keratinozyten an der Basalmembran fixieren und der Desmosomen die die seitlichen Verbindungen der Zellen im Gewebeverbund darstellen, gelöst werden. Durch Ausbildung von neuen Adhäsionsproteinen und Kontraktion von Aktinomyosin kommt es zur zellulären Vorwärtsbewegung von Kera- tinozyten, die gleichzeitig die Separation von avitalem Gewebe unterstützt [16, 17].
Beim Gewebeumbau oder Remodeling füllen Myofibroblasten die Wunde mit Kollagen und Proteinen der extrazellulären Matrix und vernetzen die genannten Komponenten miteinander.
Durch TGF-β aktiviert, werden in die Wunde eingewanderte Fibroblasten in Myofibroblasten umgewandelt. Sie bauen die provisorische Matrix im weiteren Verlauf in kollagenreiches, dermales Gewebe um, woraus später nach umfangreicher Vernetzung und Reifung das Nar- bengewebe entsteht [16].
1 Einleitung 6 ten für die aufwendige und oft langwierige Behandlung dieser Patienten nicht selten mehrere hunderttausend Euro [32]. Dies liegt vor allen Dingen daran, dass tiefreichende Verbren- nungsverletzungen mit vollschichtigem Hautweichteilverlust in 36% bis 91 % zu hypertro- phen Narben führen, die mit Narbenkontrakturen und Einschränkungen der Gelenkbeweg- lichkeit assoziiert sind [23]. Diese Narben zeichnen sich weiterhin durch eine hohe Rezidiv rate trotz adäquater konservativer und chirurgischer Behandlung aus [23].
Bei ca. 40% der Patienten werden die Grenzverweildauern überschritten, was meist eine un- terfinanzierter Folgetherapie nach sich zieht [33]. Eine ausschließlich auf Fallpauschalen- basierte Vergütung würde damit zur Unterfinanzierung der Verbrennungszentren führen. Der Einsatz innovativer Hautersatzverfahren wäre gefährdet, da diese aktuell im DRG-System erfasst, jedoch nicht entsprechend vergütet werden [34].
1.4.1 Pathogenese der Verbrennungsverletzung und hypertrophen Narbenbildung Bei Temperaturen von über 55°C beginnt die Blasenbildung der Haut, ab 60°C droht der end- gültige Struktur- und Funktionsverlust der Bau- und Funktionseiweiße durch Denaturierung und Ausbildung von Koagulationsnekrosen [29].
Der Schweregrad einer Verbrennung richtet sich nach den betroffenen Hautschichten sowie dem Anteil der geschädigten Körperoberfläche.
Eine Verbrennung ersten Grades ist gekennzeichnet durch eine vollständig reversible Rötung und Schwellung der Haut. Hierbei ist nur die Epidermis betroffen. Bei einer Verbrennung Grad 2a ist die Epidermis und superfiziell die Dermis zerstört. Diese Wunden heilen in der Regel narbenfrei ab. Die Reepithelialisierung erfolgt aus den Basalzellen der unverletzten Hautanhangsgebilde. Eine Verbrennung des Grades 2b heilt nicht mehr narbenfrei ab, da die Epidermis und auch die tiefe Dermis fast vollständig zerstört sind. Hierdurch sind keine loko- regionären Basalzellen mehr vorhanden, so dass die Reepithelialisierung vom Wundrand her erfolgen muss und dadurch die Reepithelialisierung stark verzögert abläuft (Tabelle 1).
Eine Verbrennung des Grades 3 ist definiert als vollständige Zerstörung aller Hautschichten mit Beteiligung des Subkutangewebes.[29] Der menschliche Organismus ist hier nur in der Lage, kleine Läsionen durch Narbenkontraktion zur Abheilung zu bringen (Tabelle 1).
Eine Brandwunde kann histologisch nach Jackson in chirurgisch relevante Zonen eingeteilt werden. Das Zentrum bildet die Nekrosezone bzw. Koagulationszone in der das Gewebe irre- versibel geschädigt ist. Diese Zone muss wie o.g. chirurgisch entfernt werden. Umgeben wird
1 Einleitung 7 diese Zone von der teilweise reversiblen Stasezone. Den äußeren Rand einer Brandwunde bildet die vollständig reversible Hyperämiezone [35, 36].
Grad Verbrennungstiefe Therapie Narbenbildung
I Epidermis Konservativ Keine
IIa Epidermis und oberflächli- che Dermis
Antiseptische Verbände Ggf. Pigmentierungsstö- rung
IIb Epidermis und tiefe Dermis Tangentiale Nekrosektomie Ja und ggf. Kontrakturen III Vollständige Zerstörung der
Haut
Epifasziale Nekrosektomie Narbenbildung und Kon- trakturen
Tabelle 1: Verbrennungsgrade
1.4.2 Therapie bei Verbrennungen
Bei Verbrennungen ersten Grades ist nach initialer Kühlung unter fließendem Wasser eine konservative Therapie mit kühlenden Externa ausreichend. Therapeutischer Standard bei Ver- brennungen ab Grad 2 ist derzeit eine chirurgische Wundreinigung [30]. Die Behandlung soll- te stets unter aseptischen Bedingungen und ausreichender Analgesie erfolgen. Primär erfolgt die Reinigung der Wunde und eine Blasenabtragung, im Anschluss ist eine Beurteilung der Verbrennungstiefe möglich. Bei Verbrennungen des Grades 2a ist eine konservative Therapie mit engmaschigen Wundkontrollen und Applikation von antiseptischen Salbenverbänden möglich. Um die Wundheilung zu unterstützen kommen bei dieser Verbrennungstiefe auch zunehmend temporäre Hautersatzmaterialien wie z.B. Suprathel®, ein Milchsäurepolymer zum Einsatz.
Eine zeitnahe operative Therapie durch eine tangentiale Exzision der Nekrosezone und antei- lig der Stasezone ist ab einer Verbrennung Grad 2b indiziert, da das avitale Gewebe einen optimalen Nährboden für eine Keimbesiedlung bietet. Teile der Dermis sind bei dieser Ver- brennungstiefe noch intakt. Bei tieferen Verbrennungen mit vollständiger Zerstörung des Ko- riums (ab Grad 3) erfolgt eine epifasziale Nekrosektomie mit Abtragung der kompletten Haut und des geschädigten Unterhautfettgewebes bis auf die Muskelfaszie. Eine Spalthauttrans- plantation auf Fettgewebe ist nur bei Kindern oder im Bereich der Mamma erfolgverspre- chend [29]. Nach Erreichen eines sauberen, gut durchbluteten Wundgrundes ist ggf. die De- fektdeckung mittels autologer Spalthauttransplantation möglich.
Ist eine zeitnahe Defektdeckung beispielsweise bei großflächigen Verbrennungen und man- gelnden Donorarealen nicht möglich, stehen alternative Methoden zur Verfügung, um die zeitlichen Abstände zwischen Debridement und Spalthauttransplantation zu überbrücken. Zur
1 Einleitung 9 Die Unterschiede in der Anwendung beziehen sich auf einen temporären oder permanenten Gewebeersatz. Ein wesentlicher Vorteil bei der Verwendung dieser Matrices besteht in der fehlenden Hebedefektmorbidität beim Patienten, wenn eine konservative Therapie bei chroni- schen Wunden nicht anspricht oder eine Hauttransplantation bei ungeeignetem Wundgrund sowie bei limitierenden Komorbiditäten nicht realisierbar ist [39].
Als Beispiel für die synthetisch hergestellten Matrices auf Kollagenbasis sei hier Matriderm® genannt. Matriderm® ist eine mit humaner Dermis vergleichbare synthetisch hergestellte Mat- rix aus bovinem Kollagen und Elastin-Hydrolysat. Diese relativ dünnen Kollagenfleece wur- den bislang zur Behandlung von Verbrennungswunden eingesetzt. Hier ist eine ein zeitige, definitive Defektdeckung in Kombination mit einem autologen Spalthauttransplantat möglich.
Im postoperativen Verlauf zeigen die entstehenden Narben ein hohes Maß an Elastizität und Zugfestigkeit [37].
Biologische, azelluläre Matrices werden bislang als Bindegewebsersatz in der Abdominal- und plastischen Chirurgie eingesetzt. Epiflex® und die xenogene porcine Dermis Strattice™
sind beispielsweise für Bauchdecken- oder Brustrekonstruktionen zugelassen und in klini- scher Verwendung.
Epiflex® wird aus humaner Dermis gewonnen. MHC Antigene und Zellreste werden mithilfe chemischer Verfahren entfernt, so dass eine gute Vaskularisierung und Zellintegration nach Implantation bei geringer Autoimmunreaktion ermöglicht wird. Epiflex® wird von der Deut- schen Gesellschaft für Zell- und Gewebeersatz (DIZG) vertrieben und ist seit 2005 in Deutschland zugelassen [40].
Ersatzmatrices Herstellung Hauptbestandteil Firma Land Preis pro cm2 Suprathel® synthetisch Polymilchsäure Poly Medics Inno-
vations GmbH
BRD Ca. 0,50 € Integra® biologisch Rinderkollagen Typ1,
Glykosaminoglykan
LifeSciences Hol- dings Corporation
USA Ca. 15€
Matriderm® biologisch Bovines Kollagen Typ I, III,V, Elastin
Suwelack Skin &.
Health Care AG
BRD Ca. 23,99€
Apligraf® biologisch Allogene Keratinozy- ten und Fibroblasten
Organogenesis Inc USA Ca. 46,12€
Strattice™ biologisch Azelluläre porcine dermale Matrix
Lifecell Inc. USA Ca. 25,71€
Epiflex® biologisch Azelluläre allogene Dermis
Deutsches Institut für Zell- und Ge- webeersatz (DIZG)
BRD Ca. 79€
Tabelle 2: Einteilung gängiger Ersatzmatrices nach Herstellung, Hauptbestandteilen und Kosten
2 Material und Methoden 12 nehmen eine flache, migratorische Morphologie an und beginnen, die Wunde zu verschließen.
Diese zelluläre Migration auf feuchtem Untergrund mit Kontakt zur Luft simuliert somit in dem hier verwendeten Hautorgankulturmodell die physiologische Situation bei der Reepithe- lialisierung einer Wunde [24].
In unserem Versuchsaufbau werden vitale Hauttransplantate an der Air-Liquid- Interphase auf unterschiedlichen Matrices kultiviert. Zu diesen verschiedenen Matrices gehörten zum einem DED´s, die aus humaner Haut gewonnen wurden, Epiflex® und Matriderm®. Die Hauttrans- plantate wurden in einem Spezialmedium („Classic medium“, siehe unten) für 10 Tage kulti- viert. In einer zweiten experimentellen Serie wurden diese Matrices zusätzlich mit Amnion als Zwischenschicht bedeckt und die epitheliale Migration auf der Amnionmembran unter- sucht. Ab dem vierten Tag des Experiments, erfolgte alle zwei Tage eine Messung der zellulä- ren Migration unter einem hierfür speziell geeigneten Auflicht-Fluoreszenz-Mikroskop mit anschließendem Mediumwechsel.
2.3.1 Herstellung der de-epidermalisierter Dermis (DED)
Die Haut der Gewebereduktionsplastiken wurde zunächst entfettet. Die mit einer 8 mm Biop- siestanze (Biopsy Punch, GlaxoSmithKline GmbH & Co. KG, München) gewonnenen Schei- ben wurden im Anschluss für 30 Minuten in ein 56°C warmes Wasserbad gegeben und er- hitzt. Im Anschluss ließ sich die Epidermis von der Dermis leicht mit einer Pinzette trennen.
Nach Transfer des Gewebes in Kryoröhrchen, erfolgte das Einfrieren der Präparate mit flüssi- gem Sticksoff für 10 Minuten, gefolgt von einem 20 minütigem Auftauprozess bei Raumtem- peratur. Dies diente zur Abtötung aller ortsständigen Zellen. Die Präparate durchliefen insge- samt 10 dieser Einfrier-Auftau-Zyklen. Die Lagerung der DEDs erfolgte bis zur weiteren Verarbeitung bei -80°C.
2.3.2 Epiflex®
Das verwendete Epiflex® wurde vom Deutschen Institut für Zell- und Gewebeersatz (DIZG) zur Verfügung gestellt. Es handelt sich hierbei um eine azelluläre allogene Dermis. Epiflex® wird aus der Haut eines serologisch gescreenten Spenders durch ein validiertes Verfahren bestehend aus Dezellularisierung, Sterilisation und anschließender Konservierung hergestellt.
Das Material ist in Form von sterilen, rehydratisierbaren, gefriergetrockneten Sheets in unter- schiedlichen Größen verfügbar. Anatomisch kann man die Dermis in die papilläre, also weiter epidermal gelegene Dermis und die retikuläre, also näher zum Subkutangewebe gelegene Dermis unterteilen. Architektonische Unterschiede in der Struktur und Anordnung der extra- zellulären Matrix beider dermaler Anteile waren der Hintergrund, dass epitheliale Verhalten
2 Material und Methoden 13 auf dermalen Matrices unterschiedlicher Schichttiefe zu untersuchen. Aus unterschiedlichen dermalen Schichten wurden Epiflex®-Sheets für einen Vergleichstest zur Verfügung gestellt.
Epiflex®-Sheets sowohl aus den oberen, papillären Anteilen der Dermis als auch aus den unte- ren, retikulären Anteilen dieser wurden miteinander bezüglich der epithelialen Migration ver- glichen. Experiment und Analyse erfolgten ohne Kenntnis darüber, um welchen Dermisanteil es sich dabei handelte. Die Rehydratisierung des Epiflex® vor Verwendung im Experiment erfolgte exakt nach Herstellerempfehlung.
2.3.3 Matriderm®
Das verwendete Matriderm® wurde von der Firma Suwelack Skin &. Health Care AG erwor- ben. Matriderm® ist eine biologisch synthetisierte Matrix aus gefriergetrocknetem bovinem Kollagen Typ I, III und V sowie Elastin. Die Rehydratisierung des Matriderm® vor Verwen- dung im Experiment erfolgte exakt nach Herstellerempfehlung.
2.3.4 Composite Herstellung und Inkubation
Die folgenden Prozesse erfolgten unter sterilen Bedingungen unter einer mikrobiologischen Sicherheitswerkbank. Mit 8 mm Biopsiestanzen wurden wie bei den DED auch vom Epiflex®, Matriderm® und gefriergetrocknetem Amnion passende Scheiben exzidiert. Die Epiflexschei- ben wurden für 30 Minuten in steriler PBS-Lösung eingeweicht. Die Matridermscheiben wur- den für 10 Minuten in steriler NaCl 0,9% eingeweicht.
Für die Hauttransplantation auf die Composites wurden ebenfalls Resektate nach Straffungs- operationen verwendet, die allerdings sofort am OP-Tag verwendet wurden. Zwei mm große Hauttransplantate wurden mittels einer Biopsiestanze gewonnen und auf die Dicke eines Spalthauttransplantates getrimmt, indem die Subkutan- und retikuläre Dermisschicht entfernt wurde. Anschließend erfolgte die Befestigung auf den jeweiligen Matrices.
Ein „Composite“ besteht aus einer die Basis bildenden Matrix (mit oder ohne Amnion) und dem darauf festgeklebten Hauttransplantat (Abbildung 1 und 2). Nach Exzision aller Kompo- nenten erfolgte am Ende das Zusammensetzen der Composites für das Hautorgankulturmo- dell, indem die vitalen Hauttransplantate mit Fibrinkleber (Tissuecol Duo S, Baxter, Germa- ny) auf die Oberfläche der Matrices fixiert wurden.
Da das Amnion sich nur schlecht mit Fibrinkleber auf den Matrices zu fixieren ließ, wurde es mithilfe von 4 Mikroclips (#005200; Teleflex® Inc., Morrisville, NC) befestigt (Abbil- dung 3). Auf die Composite mit Amnion wurden dann gleichermaßen die 2 mm Hauttrans- plantate mit Fibrinkleber mittig fixiert.
2 Material und Methoden 16 fläche des auswachsenden, fluoreszierenden Epithels minus der Fläche des Hauttransplanta- tes. Die Färbung der Zellen erfolgte mittels Fluoreszein-di-Acetat (FDA), dass von vitalen Zellen aufgenommen wurde. Nach Entnahme der 6-Well Platte aus dem Inkubator wurde das Nährmedium abgesaugt und die Composites mit einer Lösung von 2.4 µmol/l FDA in PBS beträufelt.
Die Aufnahme der Bilder erfolgte mit einem Olympus SZX16 Stereomikroskop welches über eine 120W Quecksilberdampflampe (X-Cite Series 120 Q, Expo), einen koaxialen Fluores- zenzilluminator mit eingebautem grünen Fluoreszenzprotein Würfel (Olympus Optical, Ham- burg) und eine Olympus DP72 Digitalkamera, verfügt.
Zur Bestimmung der Auswachsfläche des Epithels jedes einzelnen Bildes wurde die Bildana- lysesoftware Cell-F-Life Science Imaging verwendet.
Jedes der Bilder wurde mithilfe der Bildanalysesoftware (Sicon ®Image, Frederic, MD, USA) zweimal ausgemessen.
Am 10. Beobachtungstag erfolgte die letzte Fluoreszenzmessung. Im Anschluss wurden die Präparate wie folgt asserviert:
Präparat Histologie Freezer -80°C Proben für die MMA-Analyse (eben-
falls Freezer -80°C)
Flüssiger Stickstoff
DED 3 0 6 3
DED + 3 0 6 3
Epiflex® 3 0 6 3
Epiflex®+ 3 6 0 3
Matriderm® 3 6 0 3
Matriderm®+ 3 6 0 3
Tabelle 4: Aufteilung und Asservierung der Präparate nach Beendigung der Kultivierung (+ = mit Amnion als Zwischenschicht)
2.4.2 Histologische und immunhistochemische Untersuchungen
Nach Beendigung der Experimente erfolgte die Einbettung in Paraffin. Hierzu wurden 4 µm dicke Schnitte angefertigt und auf Objektträger (Polysine Slides) über 20 Minuten in einem Wärmeschrank bei 60°C fixiert.
Zur Färbung wurde das in 4%igem Paraformaldehyd fixierte Gewebe, zunächst entparaffi- niert. Die Dehydration erfolgte durch Alkoholbäder in aufsteigenden Konzentrationen. Hierzu wurden die Objektträger in nacheinander in folgende Lösungen gestellt. Zunächst in Xylene
2 Material und Methoden 17 (mixture of Isomers, VWR Chemicals) für 3x5min, dann für 2x 5min in EtOH 100%, 3min in EtOH 96%, und schließlich in EtOH 70% für 3 Minuten.
Im Anschluss erfolgte die Färbung mit Hämatoxylin und Eosin nach Standardprotokoll (siehe Anhang). Hierzu wurde eine fertige Hämalaunlösung nach Mayer (ROTH) verwendet. Nach 3 Minuten und anschließendem bläuen unter fließendem Wasser für 15 Minuten verwendeten wir Eosin G-Lösung (ROTH) 0,5% für 5 Minuten. Die Einbettung erfolgte nach Alkoholbä- dern in aufsteigenden Konzentrationen unter Verwendung eines Einschlussmittels (Roti®- Histokitt II Firma ROTH) mit jeweils 400µl pro Präparat.
Mithilfe der Immunhistochemie fanden Färbungen zur Analyse von proliferierenden, apopto- tischen und sich differenzierenden Zellen statt. Eine Auflistung der jeweils benutzten Anti- körper ist in Tabelle 5 dargestellt.
Zur Detektion apoptotischer Zellen, inkubierten wir mit einem Kaninchenantikörper gegen Caspase-8. Zur Identifizierung proliferierender Zellen, daher mitotisch aktiver Zellen, ver- wendeten wir einen Kaninchenantikörper gegen humanes Ki67. Ein monoklonaler Kanin- chenantikörper gegen Zytokeratin-14 und 10 wurde eingesetzt, um die Ausprägung der Zell- differenzierung der Keratinozyten in unterschiedlichen Tiefen zu visualisieren.
Zur Detektion von Myofibroblasten verwendeten wir einen Antikörper gegen Vimentin. Zur Vorbereitung für die immunhistochemischen Färbungen von Ki67, Caspase-8, Vimentin, Ke- ratin-10 und Keratin-14 erfolgte nach Entparaffinierung folgende Vorbehandlung. Zunächst wurden die Schnitte für 60min mit Citratpuffer pH 6 bei 99°C inkubiert und anschließend mit aq. dest. und dann zweimal mit PBS-Lösung gespült. Die Antikörper wurden dann in 0,1%
BSA-CMF-PBS in einer Konzentration von 1:200 auf die Schnitte gegeben und für 30 Minu- ten bei Raumtemperatur inkubiert. Nach zweimaliger Spülung mit PBS-Lösung erfolgte die Inkubation mit einem 2-Schritt-Polymersystem HRP-konjugiert (DCS DetectionLine), daher zunächst mit dem Enhancer für 20 Minuten und im nächsten Schritt mit dem HRP-Polymer für weitere 20 Minuten bei 37°C.
Im nächsten Schritt erfolgte die Inkubation für 10 Minuten mit Diaminobenzidine- tetrahydrochloride (DAB). Hierzu wurde das DAB-2-Komponenten-Kit, bestehend aus DAB- Konzentrat und einem DAB-Substratpuffer der Firma DCS ChromoLine verwendet. Nach einer erneuten Spülung mit PBS-Lösung erfolgte die Applikation von Mayers Hämalaun 1:10 mit Aqua-dest verdünnt, die Inkubation für 5 Minuten und anschließendem erneuten Spülvor- gang mit Waschpuffer für weitere 5 Minuten. Abschließend erfolgten erneute Alkoholbäder in aufsteigenden Konzentrationen und schließlich mit Xylene jeweils 3x2 Minuten. Die Einde-
2 Material und Methoden 18 ckung erfolgte unter Verwendung des Einschlussmittels (Roti®-Histokitt II Firma ROTH) mit jeweils 400µl pro Präparat.
Antikörper Konzentration Firma Katalog-Nr.
Rabbit anti-Ki67/MKI67 1:200 Novus Biologicals (Littleton, Col- orado, USA)
NB110- 89717 Rabbit anti-Caspase-8 1:200 Novus Biologicals (Littleton, Col-
orado, USA)
NB100- 56116 Rabbit anti-Vimentin 1:200 Cell Signalling Technology (Dan-
vers, Massachusetts, USA )
5741S Rabbit anti-Cytokeratin-14 1:200 Abcam® (Cambridge, GB) ab108417 Rabbit anti- Cytokeratin-10 1:200 Abcam® (Cambridge, GB) ab76318
Rabbit anti- MMP-3 1:200 Abcam® (Cambridge, GB) ab52915
Sheep anti-human MMP-10 1:200 Eigenproduktion ---
Tabelle 5: Verwendete Antikörper für immunhistochemische Analysen
Unter dem Lichtmikroskop erfolgte die Auszählung der immunpositiven Zellen für Ki67. Bei der Auswertung der mit Ki67 gefärbten Präparate wurde die Länge der Neoepidermis links und rechts vom Hauttransplantat und die Tiefeninvasion in mm gemessen, wobei der tiefste Punkt der zellulären Ausbreitung als längste Strecke angesehen und gemessen wurde. Entlang der genannten Strecken wurden die Ki67 immunpositiven Zellen gezählt (Abbildung 4). Zur Auswertung der übrigen immunohistochemischen Färbungen wurde die Immunopositivität anhand eines Scorings evaluiert (Abbildung 5). Dabei wurde die Skalierung aus Tabelle 6 verwendet:
Skalierung der immunpositiven Zellen:
1 2 3 4
0 + ++ +++
keine wenige mäßig viele
Tabelle 6: Evaluation der Immunopositivität bei immunhistochemischen Färbungen mithilfe einer Skalierung von 1 bis 4.
3 Resultate 29 3.3.3 Analyse der zellulären Differenzierung mit immunhistochemischen Färbungen
für Zytokeratin-10 und Zytokeratin-14
Die Verwendung von Antikörpern gegen die Zytokeratine 10 und 14 erlaubt Rückschlüsse über die zelluläre Differenzierung von Keratinozyten. Beide Zytokeratine fungieren als epitheliale Marker und geben Auskunft über die epitheliale Reifung.
Unter physiologischen Bedingungen, beginnt die Zelldifferenzierung im Stratum basale. Noch undifferenzierte Zellen im Stratum basale synthetisieren Zytokeratin 14. Ist der Differenzie- rungsprozesses fortgeschritten synthetisieren die Keratinozyten zunehmend Zytokeratin 10.
Eine positive Färbung der Zytokeratine 10 und 14 zeigte sich in allen Gruppen. Hochpositiv für Zytokeratin 10 stellte sich die Neoepidermis auf den DED´s bei fortgeschrittener epithelia- ler Reifung dar.
Sowohl beim Matriderm® und auch beim Epiflex® aus oberen Dermisanteilen war eine ausge- prägte vertikale Invasion in die jeweilige Matrix zu verzeichnen. Offensichtlich handelte es sich hierbei um epitheliale Zellen, die durch Immunopositivität für Zytokeratin-14 imponier- ten (Abbildung 16).
Im Vergleich zum DED zeigen sich signifikant (p=0,0054) weniger Zytokeratin-14 positive Zellen beim Epiflex® aus unteren Dermisanteilen. Das höchste Aufkommen an Zytokeratin- 14 war in den Gruppen von DED und Matriderm® nachweisbar. Auffällig ist das hohe Auf- kommen von epithelialen Zellen im inneren der Kollagen-Elastin-Matrix des Matriderm® mit kompletter epithelialer Durchbauung dieser Matrix im Vergleich zu den anderen Matrices (Abbildung 17).
4 Diskussion 43 in der ECM befindlichen Wachstumsfaktoren ebenso verändert wie die chemischen Prozesse bei der Herstellung von Epiflex®. Bekannterweise sind verschiedene Wachstumsfaktoren, z.B.
TGF-β an Decorin, FGF-BP an Heparin und Perlekan und das EGF an Heparansulfat- Proteoglykane gebunden. Durch diese Bindung an ECM Proteine bilden Wachstumsfaktoren ein natürliches Reservoir [56]. Unterschiedliche Verfahren zur Dezellularisierung und Sterili- sation können zu einem Abbau und Verlust von Matrix gebundenen, pro-migratorischen Wachstumsfaktoren und damit zu einer unterschiedlichen Epithelialisierung geführt haben.
Zwei Molekülklassen sind von grundlegender Bedeutung für die epitheliale Migration in der Hautwundheilung, nämlich die zellulären Adhäsionsmoleküle, die Integrine, und die Matrix Metalloproteinasen (MMP) [57]. Die Unterschiede in der zellulären MMP Sekretion der Transplantate auf den unterschiedlichen Matrices waren sehr gering und vor allem Donor- abhängig. Daher ist es unwahrscheinlich, dass eine unzureichende MMP Sekretion die Ursa- che für die reduzierte Migration war. Weiterhin waren diejenigen MMPs, die für die epithelia- le Migration und Wundheilung wichtig sind, ausreichend vorhanden, was wir mithilfe des Sandwich ELISA nachweisen konnten. Individuelle Unterschiede der MMP Sekretion je nach Haut-Donor machen Vergleiche nur innerhalb einer Serie möglich. MMP-1 ist eine Typ I Kollagenase, die natives Kollagen degradieren und damit die Keratinozytenmigration erleich- tern kann [58]. In allen Gruppen war MMP-1 nachzuweisen (in Donor 3 oberhalb der Nach- weisgrenze), so dass die verringerte Epithelialisierung nicht auf einen Kollagenasemangel zurückgeführt werden kann. MMP-3 degradiert das interzelluläre Protein E-cadherin [59] und führt so zu einer Lösung der Keratinozyten aus ihrem Zellverbund im Bereich des Wundran- des [60], während MMP-9 [51, 61] und MMP-10 [60, 62] von migrierenden Zellen exprimiert werden. Sowohl MMP-9 als auch beide Stromelysine (MMP-3 und MMP-10) waren in allen Gruppen in ähnlichen Mengen nachweisbar. Lediglich in Serie 3 war ein erhöhtes MMP-3 mit erniedrigtem MMP-10 in der Epiflex® Gruppe zu bemerken. Trotz bestehender enzymatischer Loslösung der Keratinozyten am Wundrand kam nur eine geringe epitheliale Migration in dieser Gruppe zustande, was sich in dem erniedrigtem MMP-10 in dieser Gruppe widerspie- gelte.
Neben ihren pro-migratorischen Eigenschaften sind MMP-3, MMP-9 und MMP-10 auch pro- inflammatorische MMP [51, 63, 64]. In chronischen entzündlichen Erkrankungen, wie z.B.
Arthritis oder chronischen Beinulzera werden hohe Mengen dieser Proteasen in Gelenke oder das Wundbett sezerniert und tragen zur Destruktion der Matrix bei. Die exzessiven Mengen dieser MMP werden allerdings in chronisch entzündlichen Prozessen zumeist von inflamma- torischen Zellen, z.B. Makrophagen oder Neutrophilen, sezerniert und an den Ort des Ge-
4 Diskussion 44 schehens gebracht. Es kann also davon ausgegangen werden kann, dass in unserem ex vivo experimentellen Aufbau die pro-inflammatorischen Eigenschaften dieser MMPs, die durch Hautzellen produziert wurden, nur eine untergeordnete Rolle gespielt haben.
Eine deutlich plausiblere Erklärungsmöglichkeit für die reduzierte Migration ist die Tatsache, dass Fibroblasten sowohl die Expression von Zell-Matrix-Adhäsionsmolekülen (Integrine), als auch die keratinozytäre Migration und Differenzierung regulieren können [65]. Kera- tinocyte Growth Factor (KGF) ist ein Wachstumsfaktor, der von Fibroblasten gebildet wird und der die keratinozytäre Migration und Adhäsion fördert, indem er ein Clustering von In- tegrinen auf der Zellmembran bewirkt [66]. Weiterhin sezernieren Keratinozyten in Abwe- senheit von Fibroblasten nur Fibronectin, Epiligrin und bestimmte Laminin-Isoformen als Bestandteile der ECM [65] und sind nicht ohne Fibroblasten zur Synthese von pro- migratorischem Typ IV Kollagen und Laminin-5 fähig [54]. Wie bereits erwähnt scheint hier der Mangel der fibroblastären Wachstumsfaktoren ein wichtiger Faktor für die verminderte keratinozytäre Migration auf Epiflex®, das keine promigratorischen Basalmembranreste auf seiner Oberfläche aufweist, gewesen zu sein.
Ein weiteres Indiz für diese Hypothese ist die signifikant reduzierte Proliferation horizontal wachsender, epithelialer Zellen in Epiflex® im Vergleich mit DED. Während die in die Der- mis einwachsenden, fibroblastären Zellen keine Unterschiede zeigten und somit in beiden Gruppen gleichermaßen vorhanden waren. Bekannterweise fördern fibroblastäre Wachstums- faktoren die keratinozytäre Proliferation [67], was ebenfalls kürzlich für ex vivo Organkultu- ren nachgewiesen werden konnte [68]. Komponenten von Basalmembranproteinen [69], wie z.B. Kollagen Typ IV [70], haben offenbar ebenfalls einen proliferativen Effekt auf Kera- tinozyten, womit sie von fibroblastären Mediatoren unabhängig sind. Dies könnte erklären, warum epitheliale Zellen auf DED signifikant mehr proliferieren als die auf Epiflex®.
Ein weiterer Grund für das zelluläre Wachstum der Zellen auf DED´s kann auch darauf beru- hen, dass für die DED Herstellung der obere, also papilläre Teil der Dermis verwandt wird.
Da Epiflex® aus humaner Dermis gewonnen wird, gibt es hier die Möglichkeit, sowohl Sheets aus der oberen, papillären als auch aus der unteren, retikulären Dermis zu produzieren. Wäh- rend bei Epiflex®-Sheets aus der oberen Dermis eine Epithelialisierung stattfand, war auf Epiflex®-Sheets aus unteren Dermisanteilen kaum bis gar kein horizontales Wachstum zu verzeichnen. Diese Beobachtungen stimmen mit vorhergehenden Experimenten überein, in denen die oberen Anteile der DEDs mithilfe eines Mikrotoms entfernt wurden [49]. Im identi- schen experimentellen Setting war hier ebenfalls nur eine reduzierte bis gar keine Epitheliali-
4 Diskussion 46 in einer Studie mit Hautäquivalenten aus selbst-produzierten azellulären Amnionsheets fest- gestellt [80]. Hierbei wurde mit Zellkulturen aus primären humanen Keratinozyten und Fib- roblasten gearbeitet. Dabei zeigten die Keratinozyten eine gute Adhärenz, nachdem sie auf eine de-epithelialisierte Amnionmembran gegeben wurden, die bereits von Fibroblasten be- siedelt war. Auch bestätigt sich die wichtige Funktion der Fibroblasten bei der keratinozytä- ren Besiedelung von biologischen Oberflächen.
Die Epithelialisierung von Amnion in unserer Studie war jedoch stark verlangsamt, zudem mit mangelnder Adhäsion der Hauttransplantate auf dem Amnion und scheint daher im Wi- derspruch zu den zitierten klinischen Studien. Wie auch bei Anwendung der dermalen Matri- ces ohne Amnion wurden die Hauttransplantate mit Fibrinkleber auf dem Amnion fixiert.
Während der Inkubation war jedoch ein zunehmendes Ablösen der Transplantate von der da- runterliegenden Amnion-Matrix zu verzeichnen, die sich trotz wiederholter Befestigung nicht suffizient fixieren ließen. Das aus einer Lamina rara und einer Lamina densa bestehende Am- nion weist eine Gesamtstärke von bis zu 200nm aus und zählt damit zu den dicksten Memb- ranen im menschlichen Organismus [39]. Gleichzeitig hat Amnion aus biophysikalischer Sicht das geringste Elastizitätsmodul im Vergleich zu dermalen Matrices und bildet dement- sprechend für die Zellen eine sehr harte Auflagefläche [81]. Die apikale Schicht des Amnion besteht aus Typ IV, V und VII Kollagen sowie aus Fibronectin und einem breiten Spektrum an Laminin-Isoformen [82]. Trotz des Vorhandenseins von Laminin-5 [82], an das die Kera- tinozyten mithilfe des α3β1-Integrins anhaften und das die Migration fördert [83], scheint nicht ausreichend Laminin-5 in der Amnionmembran präsent gewesen zu sein, um eine dau- erhafte Adhäsion der Keratinozyten auf der Amnionoberfläche zu gewährleisten.
Sowohl die harte Oberfläche als auch das Fehlen von ECM Proteinen, die für die Migration wichtig sind, können möglicherweise die ausbleibende oder unzureichende Anhaftung der Transplantate und Keratinozyten an das Amnion erklären. Im Gegensatz zu unseren Ergebnis- sen konnten Guo und Ko-Autoren eine gute Anhaftung von humanen epidermalen Kera- tinozyten auf dezellularisiertem Amnion nachweisen [84]. In diesem Experiment ist eine Zell- suspension verwendet worden, die auf einem Brunnenboden fixiertes Amnion, aufgebracht wurde. Sowohl das experimentelle Modell dieser Studie, in dem die Zellen komplett mit Me- dium umspült wurden, als auch die unterschiedlichen Konservierungsprozesse der verwende- ten Amnion-Matrices sind im Gegensatz zu unserem experimentellen Aufbau mit einem Hau- torgankulturmodell an der Luft-Wasser-Grenze durchgeführt. Beides könnte für die beobach- teten Migrationsunterschiede ursächlich sein. Die Ergebnisse einer weiteren in vitro Studie bestätigen wiederum unsere Beobachtungen. So stellten van der Linden und Ko-Autoren fest
4 Diskussion 49 inflammatorische Aktivität und Reepithelialisierung [97]. Das Chemokin IL-8 hat nicht nur pro-migratorische Eigenschaften [98], sondern beeinflusst ebenfalls maßgeblich die Haut- wundheilung durch eine Erhöhung der keratinozytären Proliferationsrate [99].
In unserer Studie wurden unterschiedliche Expressionsmuster der Interleukine 1L-1β, IL-6 und IL-8 wurden in den verschiedenen Gruppen gefunden. Das pro-inflammatorische TNF-α war in allen Gruppen kaum nachweisbar. Donor-abhängig wurde das pro-inflammatorische Interleukin-1β vermehrt bei DED und Matriderm® nachgewiesen. Wie auch in anderen Stu- dien [93, 100] korreliert bei DED das erhöhte IL-1β mit der horizontalen, bei Matriderm® mit der vertikalen epithelialen Migration. Im Gegensatz zu unseren Beobachtungen bemerkten die Wissenschaftler um Basso et al. [101] eine Reduktion der epithelialen Migration und eine vermehrte Apoptosis, wenn verschiedene Zytokine, u.a. IL-1β, IL-6, IL-8 und TNF-α oralen epithelialen Zellen zugesetzt wurden. Offensichtlich steuert die Menge der vorhandenen Zy- tokine das zelluläre Verhalten. Die gesteuerte zelluläre Sekretion dieser Mediatoren scheint, wie in unserem Fall, die epitheliale Migration zu fördern. Εxzessives Vorhandensein simuliert eine überschießende inflammatorische Reaktion und hemmt die Reepithelialisierung [94, 95].
Das von Epithelzellen und Fibroblasten sezernierte pro-inflammatorische Interleukin-8 wurde vor allem in der Epiflex® Gruppe gefunden, konnte jedoch auch in den allen andern Gruppen nachgewiesen werden. IL-8 hat einen maßgeblichen Einfluss auf die keratinozytäre Migration und Proliferation [98, 99, 102], allerdings führt es in hohen Konzentrationen, z.B. in chroni- schen oder diabetischen Wunden, zu einem Migrationsstop mit reduzierter Wundheilung [97, 103, 104]. Genannte Studien beschreiben auch ein unterschiedliches Zeitfenster zwischen der Expression von IL-1β, IL-6 oder TNF-α und IL-8. Möglicherweise ist das erhöhte IL-8 bei Epiflex® in unserer Studie Ausdruck für die unterschiedliche Epithelialiserungsrate zwischen den verschiedenen Gruppen, da gezeigt werden konnte, dass IL-8 ein guter prognostischer Marker für die Reepithelialisierung ist [97, 99, 102]. In Wundflüssigkeiten von Suktionsbla- sen oder Hautentnahmearealen konnten zeitabhängige Unterschiede in der IL-8 Sekretion von ungefähr 170 ng/ml am 1. postoperativen Tag und bis über 2000 ng/ml am 5. postoperativen Tag gemessen werden [99]. In in vitro Experimenten war die größte Proliferationsrate bei Zusatz von 10 ng/ml rekombinantem IL-8 zu verzeichnen [99]. Donor-abhängig fanden wir in unserem ex vivo Experiment Werte zwischen ca. 40 pg (Donor 1) bis maximal 1000 pg (Do- nor 3) pro Probe (ca. 25 mg Feuchtgewicht). Ebenso variierten die intraindividuellen Unter- schiede mit Hinblick auf die IL-8 Sekretion. So unterschieden sich die IL-8 Mengen, die vom Hauttransplantat von Donor 1 sezerniert wurden, nur um ca. das 1,5fache von DED oder Mat- riderm®, während bei Epiflex® mit Haut von Donor 3 ca. 6mal so viel IL-8 gemessen wurde
4 Diskussion 50 wie bei Matriderm®. Unterschiedliche experimentelle Bedingungen erschweren hier den Ver- gleich. Messwerte von in vivo Wunden unterscheiden sich maßgeblich von ex vivo oder in vitro Bedingungen, weiterhin sind interindividuelle Unterschiede bei humanen Proben die Regel, so dass große Stichproben notwendig sind, um eine Vergleichbarkeit zu gewährleisten.
Die von uns gemessenen Werte liegen sowohl unterhalb der in vivo festgestellten Werte als auch unterhalb der Mengen, die in vitro zur Stimulation der Proliferation verwendet wurden [99]. Keratinozyten können offensichtlich diese hohen IL-8 Mengen nicht alleine liefern, so dass externe Quellen von inflammatorischen Zellen oder von Fibroblasten nötig sind, um in vivo Bedingungen zu gewährleisten. Das gleichmäßige Vorhandensein des anti- inflammatorischen Interleukins 10 bei allen Matrix Gruppen, dass die Expression von IL-1ß, IL-2 und IL-6 reduziert, deutet darauf hin, dass dieser regulatorische Weg nicht für die ge- messenen Unterschiede in der Interleukinsekretion verantwortlich gemacht werden kann.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass in allen Matrices pro- und anti-inflammatorische Zytokine und Chemokine produziert wurden, die Unterschiede jedoch vor allem Donor- abhängig waren und die Interleukine IL-1β, IL-6 und IL-8 betrafen mit mehr IL-1β in DED und Matriderm und mehr IL-8 bei Epiflex®.
51
5 Zusammenfassung
Im Rahmen von Verbrennungen, Unfällen oder Tumorresektionen kann es zum tiefschichti- gen Hautweichteilverlust kommen. Bei diesen tiefschichtigen Defekten gehen häufig Anteile oder sogar die komplette Dermis verloren. Heutzutage werden bereits allogene, azelluläre dermale Matrices als biologischer Wundverschluss eingesetzt, die großes Potenzial als derma- ler Hautersatz haben oder aber auch als Grundlage für ein Hautkonstrukt fungieren könnten, um damit das Repertoire an Rekonstruktionsmöglichkeiten erheblich zu erweitern.
Ziel dieser Studie war die Erprobung azellulärer, biologischer und synthetischer Matrices als dermaler Ersatz in einem etablierten ex vivo Hautorgankulturmodell. Dabei wurden Spalthaut- transplantate auf humaner, de-epithelialisierte Dermis (DED), auf azellulärer, humaner Der- mis (Epiflex®) und auf einer synthetischen Kollagen-Elastin Matrix (Matriderm®) aufgebracht und die zelluläre Migration analysiert. Ergänzend hierzu kam humanes azelluläres Amnion als Matrix für die zelluläre Migration zum Einsatz.
Die mit Abstand größte epitheliale Ausbreitung und Differenzierung fand auf DED statt, was auf das Vorhandensein von pro-migratorischen Basalmembranresten auf der apikalen Fläche des DED sowie von Zellfragmenten in der dermalen Matrix zurückzuführen ist. Dies und das fehlende parakrine Signaling von Fibroblasten in unserem ex vivo Kulturmodell sind Erklä- rungsmöglichkeiten für die eingeschränkte horizontale Epithelialisierung auf Epiflex® und Matriderm®. Interessanterweise hatte der Ursprungsort der dermalen Matrix maßgeblichen Einfluss auf die keratinozytäre Migration mit deutlich mehr Epithelialisierung auf Epiflex® aus der oberen (papillären) Dermis im Vergleich mit Epiflex® aus der unteren (retikulären) Dermis. Das Sekretionsprofil pro- und anti-inflammatorischer Mediatoren war Donor- abhängig, wobei mehr IL-1β in DED und Matriderm® und mehr IL-8 bei Epiflex® nachweis- bar waren. Im Gegensatz zu den biologischen Matrices fand bei Matriderm® eine vollständige horizontale Durchwanderung der Matrix mit epithelialer Differenzierung statt. Auch hier spielte die Matrixbeschaffenheit eine maßgebliche Rolle für die epitheliale Migration, da die grobe Porengröße dieses synthetischen Substrats offensichtlich zwar eine vertikale aber nicht eine horizontale Migration begünstigte.
Die unzureichende technische Möglichkeit der Befestigung der Hauttransplantate auf dem Amnion schränkte die horizontale Epithelialisierung dieser Matrix erheblich ein. Auch die harte Oberflächenbeschaffenheit dieser Matrix und das Fehlen von ECM Proteinen, die für die Migration wichtig sind, können für die eingeschränkte Keratinozytenmigration auf Amni- on verantwortlich sein. Unsere ex vivo Studien deuten darauf hin, dass azelluläres Amnion nur
5 Zusammenfassung 52 bedingt als dermaler Ersatz geeignet ist, was aber keine Aussage über dessen Einsatz als bio- logischer Wundverband zulässt.
Zusammenfassend ist festzustellen, dass die biochemische und physikalische Beschaffenheit der Oberfläche einer Hautersatzmatrix von großer Bedeutung für die epitheliale Migration und Differenzierung ist, wobei Basalmembranreste und ECM Proteine der papillären Dermis einen positiven Effekt auf die Epithelialisierung haben in Abwesenheit von Fibroblasten ha- ben, die in vivo über parakrines Signaling die Hautwundheilung unterstützen und beschleuni- gen. Für die klinische Anwendung azellulärer dermaler oder bioartifizieller Matrices bedeutet dies, dass eine Präkonditionierung in vivo mit Einwachsen von Bindegewebszellen und Ge- fäßeinsprossung in die Matrix von Vorteil ist, um eine suffiziente Adhäsion und ein langfris- tiges Überleben eines Haut- oder Keratinozytentransplantats zu gewährleisten. Ein zweizeiti- ges operatives Setting mit Aufbringen der Matrix in den Weichteildefekt nach Debridement, mit einer Konditionierungszeit von ca. einer Woche und anschließendem Wundverschluss mit einem Hauttransplantat wäre das optimale Szenario, wie diese biologischen Matrices effektiv klinisch eingesetzt werden könnten. Klinische Studien mit Langzeitbeobachtung sind notwen- dig, um den Vorteil azellulärer dermaler Matrices als Hautersatz gegenüber dem derzeitigen klinischen Standard der Spalthauttransplantation mit Hinblick auf Hautqualität, Elastizität und Narbenbildung nachweisen zu können.
53
Literaturverzeichnis
1. Auger, F.A., et al., Tissue-engineered skin substitutes: from in vitro constructs to in vivo applications. Biotechnol Appl Biochem, 2004. 39(Pt 3): p. 263-75.
2. Kolokythas, P., et al., [Dermal subsitute with the collagen-elastin matrix Matriderm in burn injuries: a comprehensive review]. Handchir Mikrochir Plast Chir, 2008. 40(6):
p. 367-71.
3. Wisser, D., H.O. Rennekampff, and H.E. Schaller, Skin assessment of burn wounds covered with a collagen based dermal substitute in a 2 year-follow-up. Burns, 2004.
30(4): p. 399-401.
4. Breuing, K.H. and A.S. Colwell, Immediate breast tissue expander-implant reconstruction with inferolateral AlloDerm hammock and postoperative radiation: a preliminary report. Eplasty, 2009. 9: p. e16.
5. Mirastschijski, U., et al., Complete horizontal skin cell resurfacing and delayed vertical cell infiltration into porcine reconstructive tissue matrix compared to bovine collagen matrix and human dermis. Plast Reconstr Surg, 2013. 132(4): p. 861-9.
6. Dua, H.S., et al., The amniotic membrane in ophthalmology. Surv Ophthalmol, 2004.
49(1): p. 51-77.
7. Hao, Y., et al., Identification of antiangiogenic and antiinflammatory proteins in human amniotic membrane. Cornea, 2000. 19(3): p. 348-52.
8. Serena, T.E., et al., Dehydrated human amnion/chorion membrane treatment of venous leg ulcers: correlation between 4-week and 24-week outcomes. J Wound Care, 2015. 24(11): p. 530-4.
9. Maan, Z.N., et al., Cell recruitment by amnion chorion grafts promotes neovascularization. J Surg Res, 2015. 193(2): p. 953-962.
10. Lorena, D., et al., Normal scarring: importance of myofibroblasts. Wound Repair Regen, 2002. 10(2): p. 86-92.
11. Li, J., J. Chen, and R. Kirsner, Pathophysiology of acute wound healing. Clin Dermatol, 2007. 25(1): p. 9-18.
12. Jahoda, C.A. and A.J. Reynolds, Hair follicle dermal sheath cells: unsung participants in wound healing. Lancet, 2001. 358(9291): p. 1445-8.
13. Martin, P., Wound healing--aiming for perfect skin regeneration. Science, 1997.
276(5309): p. 75-81.
14. Leibovich, S.J. and R. Ross, The role of the macrophage in wound repair. A study with hydrocortisone and antimacrophage serum. Am J Pathol, 1975. 78(1): p. 71-100.
15. Bugdahl, R., Epitheliale Regeneration biotechnisch hergestellter Hautkonstrukte, in Zentrum für Chirurgie Klinik für Plastische, Hand- und Wiederherstellungschirurgie.
2010, Medizinische Hochschule Hannover.
16. Grinnell, F., Wound repair, keratinocyte activation and integrin modulation. J Cell Sci, 1992. 101 ( Pt 1): p. 1-5.
17. Mitchison, T.J. and L.P. Cramer, Actin-based cell motility and cell locomotion. Cell, 1996. 84(3): p. 371-9.
Literaturverzeichnis 54 18. Longaker, M.T., et al., Studies in fetal wound healing: II. A fetal environment
accelerates fibroblast migration in vitro. J Pediatr Surg, 1989. 24(8): p. 793-7;
discussion 798.
19. Walraven, M., et al., Healthy human second-trimester fetal skin is deficient in leukocytes and associated homing chemokines. Wound Repair Regen, 2016. 24(3): p.
533-41.
20. Bush, J.A., et al., Recommendations on clinical proof of efficacy for potential scar prevention and reduction therapies. Wound Repair Regen, 2011. 19 Suppl 1: p. s32-7.
21. Tredget, E.E., et al., Hypertrophic scars, keloids, and contractures. The cellular and molecular basis for therapy. Surg Clin North Am, 1997. 77(3): p. 701-30.
22. Bloemen, M.C., et al., Prevention and curative management of hypertrophic scar formation. Burns, 2009. 35(4): p. 463-75.
23. Mirastschijski, U., et al., The cost of post-burn scarring. Ann Burns Fire Disasters, 2015. 28(3): p. 215-22.
24. van der Veer, W.M., et al., Potential cellular and molecular causes of hypertrophic scar formation. Burns, 2009. 35(1): p. 15-29.
25. Aarabi, S., et al., Mechanical load initiates hypertrophic scar formation through decreased cellular apoptosis. FASEB J, 2007. 21(12): p. 3250-61.
26. Tredget, E.E., et al., Transforming growth factor-beta in thermally injured patients with hypertrophic scars: effects of interferon alpha-2b. Plast Reconstr Surg, 1998.
102(5): p. 1317-28; discussion 1329-30.
27. Wang, J., et al., Deep dermal fibroblasts contribute to hypertrophic scarring. Lab Invest, 2008. 88(12): p. 1278-90.
28. Germann, G. and H.U. Steinau, [Current aspects of burn treatment]. Zentralbl Chir, 1993. 118(5): p. 290-302.
29. M.Vogt, P., Praxis der Plastischen Chirurgie. 2011: Springer-Verlag Berlin Heidelberg.
30. Verbrennungsmedizin, D.D.G.f. Empfehlungen der Deutschen Gesellschaft für Verbrennungsmedizin e. V. zur Rehabilitation Brandverletzter. 2018; Available from:
https://www.verbrennungsmedizin.de/leitlinien-rehabilitation-brandverletzter.php.
31. Buttemeyer, R., et al., Establishing a baseline for organisation and outcome in burn care-basic data compiled by German burn centres, 1991-2000. Burns, 2004. 30(2):
p. 115-20.
32. Mirastschijski, U., et al., Rehabilitation of burn patients: an underestimated socio- economic burden. Burns, 2013. 39(2): p. 262-8.
33. Vogt, P.M., et al., [Centers for severely burned patients in Germany--management structure and needs]. Chirurg, 2007. Suppl: p. 411-3.
34. Oestreich, K., et al., [Survival strategy of burn centers in the context of the German DRG system: reimbursement]. Unfallchirurg, 2006. 109(6): p. 505-10.
35. A. Berger, R.H., Plastische Chirurgie: Band I Grundlagen Prinzipien Techniken.
2011: Springer-Verlag Berlin Heidelberg.
Literaturverzeichnis 55 36. Hüllmann, K., Retrospektive Analyse von 45 Patienten mit suizidaler
Selbstverbrennung, in Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum. 2010, Universität Bochum.
37. Ryssel, H., et al., The use of MatriDerm in early excision and simultaneous autologous skin grafting in burns--a pilot study. Burns, 2008. 34(1): p. 93-7.
38. Zajicek, R., et al., Experience with Integra(R) at the Prague Burns Centre 2002-2016.
Acta Chir Plast, 2017. 59(1): p. 18-26.
39. Kerzel, C., Migration und Differenzierung humaner Haut auf bioartifiziellen Matrices, in Zentrum für Chirurgie, Klinik für Plastische, Hand- und Wiederherstellung- schirurgie. 2012, Medizinische Hochschule Hannover.
40. Rossner, E., et al., Epiflex((R)) a new decellularised human skin tissue transplant:
manufacture and properties. Cell Tissue Bank, 2011. 12(3): p. 209-17.
41. Gärtner, H., Biologie Grundwissen und Gesetze 2009: Compact Verlag.
42. Resch, M.D., et al., Adhesion structures of amniotic membranes integrated into human corneas. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2006. 47(5): p. 1853-61.
43. Demtröder, C.R.D., Experimentelle Untersuchungen zur Immunogenität xenogen transplantierter kryopreservierter humaner Amnionmembran auf Bauchwand- muskulatur von Sprague-Dawley Ratten in Mono- und Multilayer- Technik, in Klinik für Mund-, Kiefer- und Plastische Gesichtschirurgie Klinikum rechts der Isar. 2011, Universität München.
44. Heiligenhaus, A., et al., Improvement of HSV-1 necrotizing keratitis with amniotic membrane transplantation. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2001. 42(9): p. 1969-74.
45. Li, W., et al., Amniotic membrane induces apoptosis of interferon-gamma activated macrophages in vitro. Exp Eye Res, 2006. 82(2): p. 282-92.
46. Li, W., et al., Reversal of myofibroblasts by amniotic membrane stromal extract. J Cell Physiol, 2008. 215(3): p. 657-64.
47. Seomun, Y. and C.K. Joo, Lumican induces human corneal epithelial cell migration and integrin expression via ERK 1/2 signaling. Biochem Biophys Res Commun, 2008.
372(1): p. 221-5.
48. Kjaergaard, N., et al., Antibacterial properties of human amnion and chorion in vitro.
Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol, 2001. 94(2): p. 224-9.
49. Mirastschijski, U., et al., Epithelial regeneration from bioengineered skin explants in culture. Br J Dermatol, 2006. 154(1): p. 42-9.
50. Kim, J.P., et al., Human keratinocyte migration on type IV collagen. Roles of heparin- binding site and alpha 2 beta 1 integrin. Lab Invest, 1994. 71(3): p. 401-8.
51. Mirastschijski, U., et al., Ectopic localization of matrix metalloproteinase-9 in chronic cutaneous wounds. Hum Pathol, 2002. 33(3): p. 355-64.
52. Momota, Y., et al., Laminin alpha3 LG4 module induces keratinocyte migration:
involvement of matrix metalloproteinase-9. J Recept Signal Transduct Res, 2005.
25(1): p. 1-17.
53. Trosan, P., et al., The enzymatic de-epithelialization technique determines denuded amniotic membrane integrity and viability of harvested epithelial cells. PLoS One, 2018. 13(3): p. e0194820.
