Nach Beendigung der Experimente erfolgte die Einbettung in Paraffin. Hierzu wurden 4 µm dicke Schnitte angefertigt und auf Objektträger (Polysine Slides) über 20 Minuten in einem Wärmeschrank bei 60°C fixiert.
Zur Färbung wurde das in 4%igem Paraformaldehyd fixierte Gewebe, zunächst entparaffi-niert. Die Dehydration erfolgte durch Alkoholbäder in aufsteigenden Konzentrationen. Hierzu wurden die Objektträger in nacheinander in folgende Lösungen gestellt. Zunächst in Xylene
2 Material und Methoden 17 (mixture of Isomers, VWR Chemicals) für 3x5min, dann für 2x 5min in EtOH 100%, 3min in EtOH 96%, und schließlich in EtOH 70% für 3 Minuten.
Im Anschluss erfolgte die Färbung mit Hämatoxylin und Eosin nach Standardprotokoll (siehe Anhang). Hierzu wurde eine fertige Hämalaunlösung nach Mayer (ROTH) verwendet. Nach 3 Minuten und anschließendem bläuen unter fließendem Wasser für 15 Minuten verwendeten wir Eosin G-Lösung (ROTH) 0,5% für 5 Minuten. Die Einbettung erfolgte nach Alkoholbä-dern in aufsteigenden Konzentrationen unter Verwendung eines Einschlussmittels (Roti®-Histokitt II Firma ROTH) mit jeweils 400µl pro Präparat.
Mithilfe der Immunhistochemie fanden Färbungen zur Analyse von proliferierenden, apopto-tischen und sich differenzierenden Zellen statt. Eine Auflistung der jeweils benutzten Anti-körper ist in Tabelle 5 dargestellt.
Zur Detektion apoptotischer Zellen, inkubierten wir mit einem Kaninchenantikörper gegen Caspase-8. Zur Identifizierung proliferierender Zellen, daher mitotisch aktiver Zellen, ver-wendeten wir einen Kaninchenantikörper gegen humanes Ki67. Ein monoklonaler Kanin-chenantikörper gegen Zytokeratin-14 und 10 wurde eingesetzt, um die Ausprägung der Zell-differenzierung der Keratinozyten in unterschiedlichen Tiefen zu visualisieren.
Zur Detektion von Myofibroblasten verwendeten wir einen Antikörper gegen Vimentin. Zur Vorbereitung für die immunhistochemischen Färbungen von Ki67, Caspase-8, Vimentin, Ke-ratin-10 und Keratin-14 erfolgte nach Entparaffinierung folgende Vorbehandlung. Zunächst wurden die Schnitte für 60min mit Citratpuffer pH 6 bei 99°C inkubiert und anschließend mit aq. dest. und dann zweimal mit PBS-Lösung gespült. Die Antikörper wurden dann in 0,1%
BSA-CMF-PBS in einer Konzentration von 1:200 auf die Schnitte gegeben und für 30 Minu-ten bei Raumtemperatur inkubiert. Nach zweimaliger Spülung mit PBS-Lösung erfolgte die Inkubation mit einem 2-Schritt-Polymersystem HRP-konjugiert (DCS DetectionLine), daher zunächst mit dem Enhancer für 20 Minuten und im nächsten Schritt mit dem HRP-Polymer für weitere 20 Minuten bei 37°C.
Im nächsten Schritt erfolgte die Inkubation für 10 Minuten mit Diaminobenzidine-tetrahydrochloride (DAB). Hierzu wurde das 2-Komponenten-Kit, bestehend aus DAB-Konzentrat und einem DAB-Substratpuffer der Firma DCS ChromoLine verwendet. Nach einer erneuten Spülung mit PBS-Lösung erfolgte die Applikation von Mayers Hämalaun 1:10 mit Aqua-dest verdünnt, die Inkubation für 5 Minuten und anschließendem erneuten Spülvor-gang mit Waschpuffer für weitere 5 Minuten. Abschließend erfolgten erneute Alkoholbäder in aufsteigenden Konzentrationen und schließlich mit Xylene jeweils 3x2 Minuten. Die
Einde-2 Material und Methoden 18 ckung erfolgte unter Verwendung des Einschlussmittels (Roti®-Histokitt II Firma ROTH) mit jeweils 400µl pro Präparat.
Antikörper Konzentration Firma Katalog-Nr.
Rabbit anti-Ki67/MKI67 1:200 Novus Biologicals (Littleton, Col-orado, USA)
NB110-89717 Rabbit anti-Caspase-8 1:200 Novus Biologicals (Littleton,
Col-orado, USA)
NB100-56116 Rabbit anti-Vimentin 1:200 Cell Signalling Technology
(Dan-vers, Massachusetts, USA )
5741S Rabbit anti-Cytokeratin-14 1:200 Abcam® (Cambridge, GB) ab108417 Rabbit anti- Cytokeratin-10 1:200 Abcam® (Cambridge, GB) ab76318
Rabbit anti- MMP-3 1:200 Abcam® (Cambridge, GB) ab52915
Sheep anti-human MMP-10 1:200 Eigenproduktion ---
Tabelle 5: Verwendete Antikörper für immunhistochemische Analysen
Unter dem Lichtmikroskop erfolgte die Auszählung der immunpositiven Zellen für Ki67. Bei der Auswertung der mit Ki67 gefärbten Präparate wurde die Länge der Neoepidermis links und rechts vom Hauttransplantat und die Tiefeninvasion in mm gemessen, wobei der tiefste Punkt der zellulären Ausbreitung als längste Strecke angesehen und gemessen wurde. Entlang der genannten Strecken wurden die Ki67 immunpositiven Zellen gezählt (Abbildung 4). Zur Auswertung der übrigen immunohistochemischen Färbungen wurde die Immunopositivität anhand eines Scorings evaluiert (Abbildung 5). Dabei wurde die Skalierung aus Tabelle 6 verwendet:
Tabelle 6: Evaluation der Immunopositivität bei immunhistochemischen Färbungen mithilfe einer Skalierung von 1 bis 4.
3 Resultate 29 3.3.3 Analyse der zellulären Differenzierung mit immunhistochemischen Färbungen
für Zytokeratin-10 und Zytokeratin-14
Die Verwendung von Antikörpern gegen die Zytokeratine 10 und 14 erlaubt Rückschlüsse über die zelluläre Differenzierung von Keratinozyten. Beide Zytokeratine fungieren als epitheliale Marker und geben Auskunft über die epitheliale Reifung.
Unter physiologischen Bedingungen, beginnt die Zelldifferenzierung im Stratum basale. Noch undifferenzierte Zellen im Stratum basale synthetisieren Zytokeratin 14. Ist der Differenzie-rungsprozesses fortgeschritten synthetisieren die Keratinozyten zunehmend Zytokeratin 10.
Eine positive Färbung der Zytokeratine 10 und 14 zeigte sich in allen Gruppen. Hochpositiv für Zytokeratin 10 stellte sich die Neoepidermis auf den DED´s bei fortgeschrittener epithelia-ler Reifung dar.
Sowohl beim Matriderm® und auch beim Epiflex® aus oberen Dermisanteilen war eine ausge-prägte vertikale Invasion in die jeweilige Matrix zu verzeichnen. Offensichtlich handelte es sich hierbei um epitheliale Zellen, die durch Immunopositivität für Zytokeratin-14 imponier-ten (Abbildung 16).
Im Vergleich zum DED zeigen sich signifikant (p=0,0054) weniger Zytokeratin-14 positive Zellen beim Epiflex® aus unteren Dermisanteilen. Das höchste Aufkommen an Zytokeratin-14 war in den Gruppen von DED und Matriderm® nachweisbar. Auffällig ist das hohe Auf-kommen von epithelialen Zellen im inneren der Kollagen-Elastin-Matrix des Matriderm® mit kompletter epithelialer Durchbauung dieser Matrix im Vergleich zu den anderen Matrices (Abbildung 17).
4 Diskussion 43 in der ECM befindlichen Wachstumsfaktoren ebenso verändert wie die chemischen Prozesse bei der Herstellung von Epiflex®. Bekannterweise sind verschiedene Wachstumsfaktoren, z.B.
TGF-β an Decorin, FGF-BP an Heparin und Perlekan und das EGF an Heparansulfat-Proteoglykane gebunden. Durch diese Bindung an ECM Proteine bilden Wachstumsfaktoren ein natürliches Reservoir [56]. Unterschiedliche Verfahren zur Dezellularisierung und Sterili-sation können zu einem Abbau und Verlust von Matrix gebundenen, pro-migratorischen Wachstumsfaktoren und damit zu einer unterschiedlichen Epithelialisierung geführt haben.
Zwei Molekülklassen sind von grundlegender Bedeutung für die epitheliale Migration in der Hautwundheilung, nämlich die zellulären Adhäsionsmoleküle, die Integrine, und die Matrix Metalloproteinasen (MMP) [57]. Die Unterschiede in der zellulären MMP Sekretion der Transplantate auf den unterschiedlichen Matrices waren sehr gering und vor allem Donor-abhängig. Daher ist es unwahrscheinlich, dass eine unzureichende MMP Sekretion die Ursa-che für die reduzierte Migration war. Weiterhin waren diejenigen MMPs, die für die epithelia-le Migration und Wundheilung wichtig sind, ausreichend vorhanden, was wir mithilfe des Sandwich ELISA nachweisen konnten. Individuelle Unterschiede der MMP Sekretion je nach Haut-Donor machen Vergleiche nur innerhalb einer Serie möglich. MMP-1 ist eine Typ I Kollagenase, die natives Kollagen degradieren und damit die Keratinozytenmigration erleich-tern kann [58]. In allen Gruppen war MMP-1 nachzuweisen (in Donor 3 oberhalb der Nach-weisgrenze), so dass die verringerte Epithelialisierung nicht auf einen Kollagenasemangel zurückgeführt werden kann. MMP-3 degradiert das interzelluläre Protein E-cadherin [59] und führt so zu einer Lösung der Keratinozyten aus ihrem Zellverbund im Bereich des Wundran-des [60], während MMP-9 [51, 61] und MMP-10 [60, 62] von migrierenden Zellen exprimiert werden. Sowohl MMP-9 als auch beide Stromelysine (MMP-3 und MMP-10) waren in allen Gruppen in ähnlichen Mengen nachweisbar. Lediglich in Serie 3 war ein erhöhtes MMP-3 mit erniedrigtem MMP-10 in der Epiflex® Gruppe zu bemerken. Trotz bestehender enzymatischer Loslösung der Keratinozyten am Wundrand kam nur eine geringe epitheliale Migration in dieser Gruppe zustande, was sich in dem erniedrigtem MMP-10 in dieser Gruppe widerspie-gelte.
Neben ihren migratorischen Eigenschaften sind MMP-3, MMP-9 und MMP-10 auch pro-inflammatorische MMP [51, 63, 64]. In chronischen entzündlichen Erkrankungen, wie z.B.
Arthritis oder chronischen Beinulzera werden hohe Mengen dieser Proteasen in Gelenke oder das Wundbett sezerniert und tragen zur Destruktion der Matrix bei. Die exzessiven Mengen dieser MMP werden allerdings in chronisch entzündlichen Prozessen zumeist von inflamma-torischen Zellen, z.B. Makrophagen oder Neutrophilen, sezerniert und an den Ort des
Ge-4 Diskussion 44 schehens gebracht. Es kann also davon ausgegangen werden kann, dass in unserem ex vivo experimentellen Aufbau die pro-inflammatorischen Eigenschaften dieser MMPs, die durch Hautzellen produziert wurden, nur eine untergeordnete Rolle gespielt haben.
Eine deutlich plausiblere Erklärungsmöglichkeit für die reduzierte Migration ist die Tatsache, dass Fibroblasten sowohl die Expression von Zell-Matrix-Adhäsionsmolekülen (Integrine), als auch die keratinozytäre Migration und Differenzierung regulieren können [65]. Kera-tinocyte Growth Factor (KGF) ist ein Wachstumsfaktor, der von Fibroblasten gebildet wird und der die keratinozytäre Migration und Adhäsion fördert, indem er ein Clustering von In-tegrinen auf der Zellmembran bewirkt [66]. Weiterhin sezernieren Keratinozyten in Abwe-senheit von Fibroblasten nur Fibronectin, Epiligrin und bestimmte Laminin-Isoformen als Bestandteile der ECM [65] und sind nicht ohne Fibroblasten zur Synthese von pro-migratorischem Typ IV Kollagen und Laminin-5 fähig [54]. Wie bereits erwähnt scheint hier der Mangel der fibroblastären Wachstumsfaktoren ein wichtiger Faktor für die verminderte keratinozytäre Migration auf Epiflex®, das keine promigratorischen Basalmembranreste auf seiner Oberfläche aufweist, gewesen zu sein.
Ein weiteres Indiz für diese Hypothese ist die signifikant reduzierte Proliferation horizontal wachsender, epithelialer Zellen in Epiflex® im Vergleich mit DED. Während die in die Der-mis einwachsenden, fibroblastären Zellen keine Unterschiede zeigten und somit in beiden Gruppen gleichermaßen vorhanden waren. Bekannterweise fördern fibroblastäre Wachstums-faktoren die keratinozytäre Proliferation [67], was ebenfalls kürzlich für ex vivo Organkultu-ren nachgewiesen werden konnte [68]. Komponenten von Basalmembranproteinen [69], wie z.B. Kollagen Typ IV [70], haben offenbar ebenfalls einen proliferativen Effekt auf Kera-tinozyten, womit sie von fibroblastären Mediatoren unabhängig sind. Dies könnte erklären, warum epitheliale Zellen auf DED signifikant mehr proliferieren als die auf Epiflex®.
Ein weiterer Grund für das zelluläre Wachstum der Zellen auf DED´s kann auch darauf beru-hen, dass für die DED Herstellung der obere, also papilläre Teil der Dermis verwandt wird.
Da Epiflex® aus humaner Dermis gewonnen wird, gibt es hier die Möglichkeit, sowohl Sheets aus der oberen, papillären als auch aus der unteren, retikulären Dermis zu produzieren. Wäh-rend bei Epiflex®-Sheets aus der oberen Dermis eine Epithelialisierung stattfand, war auf Epiflex®-Sheets aus unteren Dermisanteilen kaum bis gar kein horizontales Wachstum zu verzeichnen. Diese Beobachtungen stimmen mit vorhergehenden Experimenten überein, in denen die oberen Anteile der DEDs mithilfe eines Mikrotoms entfernt wurden [49]. Im identi-schen experimentellen Setting war hier ebenfalls nur eine reduzierte bis gar keine
Epitheliali-4 Diskussion 46 in einer Studie mit Hautäquivalenten aus selbst-produzierten azellulären Amnionsheets fest-gestellt [80]. Hierbei wurde mit Zellkulturen aus primären humanen Keratinozyten und Fib-roblasten gearbeitet. Dabei zeigten die Keratinozyten eine gute Adhärenz, nachdem sie auf eine de-epithelialisierte Amnionmembran gegeben wurden, die bereits von Fibroblasten be-siedelt war. Auch bestätigt sich die wichtige Funktion der Fibroblasten bei der keratinozytä-ren Besiedelung von biologischen Oberflächen.
Die Epithelialisierung von Amnion in unserer Studie war jedoch stark verlangsamt, zudem mit mangelnder Adhäsion der Hauttransplantate auf dem Amnion und scheint daher im Wi-derspruch zu den zitierten klinischen Studien. Wie auch bei Anwendung der dermalen Matri-ces ohne Amnion wurden die Hauttransplantate mit Fibrinkleber auf dem Amnion fixiert.
Während der Inkubation war jedoch ein zunehmendes Ablösen der Transplantate von der da-runterliegenden Amnion-Matrix zu verzeichnen, die sich trotz wiederholter Befestigung nicht suffizient fixieren ließen. Das aus einer Lamina rara und einer Lamina densa bestehende Am-nion weist eine Gesamtstärke von bis zu 200nm aus und zählt damit zu den dicksten Memb-ranen im menschlichen Organismus [39]. Gleichzeitig hat Amnion aus biophysikalischer Sicht das geringste Elastizitätsmodul im Vergleich zu dermalen Matrices und bildet dement-sprechend für die Zellen eine sehr harte Auflagefläche [81]. Die apikale Schicht des Amnion besteht aus Typ IV, V und VII Kollagen sowie aus Fibronectin und einem breiten Spektrum an Laminin-Isoformen [82]. Trotz des Vorhandenseins von Laminin-5 [82], an das die Kera-tinozyten mithilfe des α3β1-Integrins anhaften und das die Migration fördert [83], scheint nicht ausreichend Laminin-5 in der Amnionmembran präsent gewesen zu sein, um eine dau-erhafte Adhäsion der Keratinozyten auf der Amnionoberfläche zu gewährleisten.
Sowohl die harte Oberfläche als auch das Fehlen von ECM Proteinen, die für die Migration wichtig sind, können möglicherweise die ausbleibende oder unzureichende Anhaftung der Transplantate und Keratinozyten an das Amnion erklären. Im Gegensatz zu unseren Ergebnis-sen konnten Guo und Ko-Autoren eine gute Anhaftung von humanen epidermalen Kera-tinozyten auf dezellularisiertem Amnion nachweisen [84]. In diesem Experiment ist eine Zell-suspension verwendet worden, die auf einem Brunnenboden fixiertes Amnion, aufgebracht wurde. Sowohl das experimentelle Modell dieser Studie, in dem die Zellen komplett mit Me-dium umspült wurden, als auch die unterschiedlichen Konservierungsprozesse der verwende-ten Amnion-Matrices sind im Gegensatz zu unserem experimentellen Aufbau mit einem Hau-torgankulturmodell an der Luft-Wasser-Grenze durchgeführt. Beides könnte für die beobach-teten Migrationsunterschiede ursächlich sein. Die Ergebnisse einer weiteren in vitro Studie bestätigen wiederum unsere Beobachtungen. So stellten van der Linden und Ko-Autoren fest
4 Diskussion 49 inflammatorische Aktivität und Reepithelialisierung [97]. Das Chemokin IL-8 hat nicht nur pro-migratorische Eigenschaften [98], sondern beeinflusst ebenfalls maßgeblich die Haut-wundheilung durch eine Erhöhung der keratinozytären Proliferationsrate [99].
In unserer Studie wurden unterschiedliche Expressionsmuster der Interleukine 1L-1β, IL-6 und IL-8 wurden in den verschiedenen Gruppen gefunden. Das pro-inflammatorische TNF-α war in allen Gruppen kaum nachweisbar. Donor-abhängig wurde das pro-inflammatorische Interleukin-1β vermehrt bei DED und Matriderm® nachgewiesen. Wie auch in anderen Stu-dien [93, 100] korreliert bei DED das erhöhte IL-1β mit der horizontalen, bei Matriderm® mit der vertikalen epithelialen Migration. Im Gegensatz zu unseren Beobachtungen bemerkten die Wissenschaftler um Basso et al. [101] eine Reduktion der epithelialen Migration und eine vermehrte Apoptosis, wenn verschiedene Zytokine, u.a. IL-1β, IL-6, IL-8 und TNF-α oralen epithelialen Zellen zugesetzt wurden. Offensichtlich steuert die Menge der vorhandenen Zy-tokine das zelluläre Verhalten. Die gesteuerte zelluläre Sekretion dieser Mediatoren scheint, wie in unserem Fall, die epitheliale Migration zu fördern. Εxzessives Vorhandensein simuliert eine überschießende inflammatorische Reaktion und hemmt die Reepithelialisierung [94, 95].
Das von Epithelzellen und Fibroblasten sezernierte pro-inflammatorische Interleukin-8 wurde vor allem in der Epiflex® Gruppe gefunden, konnte jedoch auch in den allen andern Gruppen nachgewiesen werden. IL-8 hat einen maßgeblichen Einfluss auf die keratinozytäre Migration und Proliferation [98, 99, 102], allerdings führt es in hohen Konzentrationen, z.B. in chroni-schen oder diabetichroni-schen Wunden, zu einem Migrationsstop mit reduzierter Wundheilung [97, 103, 104]. Genannte Studien beschreiben auch ein unterschiedliches Zeitfenster zwischen der Expression von IL-1β, IL-6 oder TNF-α und IL-8. Möglicherweise ist das erhöhte IL-8 bei Epiflex® in unserer Studie Ausdruck für die unterschiedliche Epithelialiserungsrate zwischen den verschiedenen Gruppen, da gezeigt werden konnte, dass IL-8 ein guter prognostischer Marker für die Reepithelialisierung ist [97, 99, 102]. In Wundflüssigkeiten von Suktionsbla-sen oder Hautentnahmearealen konnten zeitabhängige Unterschiede in der IL-8 Sekretion von ungefähr 170 ng/ml am 1. postoperativen Tag und bis über 2000 ng/ml am 5. postoperativen Tag gemessen werden [99]. In in vitro Experimenten war die größte Proliferationsrate bei Zusatz von 10 ng/ml rekombinantem IL-8 zu verzeichnen [99]. Donor-abhängig fanden wir in unserem ex vivo Experiment Werte zwischen ca. 40 pg (Donor 1) bis maximal 1000 pg (Do-nor 3) pro Probe (ca. 25 mg Feuchtgewicht). Ebenso variierten die intraindividuellen Unter-schiede mit Hinblick auf die IL-8 Sekretion. So unterUnter-schieden sich die IL-8 Mengen, die vom Hauttransplantat von Donor 1 sezerniert wurden, nur um ca. das 1,5fache von DED oder Mat-riderm®, während bei Epiflex® mit Haut von Donor 3 ca. 6mal so viel IL-8 gemessen wurde
4 Diskussion 50 wie bei Matriderm®. Unterschiedliche experimentelle Bedingungen erschweren hier den Ver-gleich. Messwerte von in vivo Wunden unterscheiden sich maßgeblich von ex vivo oder in vitro Bedingungen, weiterhin sind interindividuelle Unterschiede bei humanen Proben die Regel, so dass große Stichproben notwendig sind, um eine Vergleichbarkeit zu gewährleisten.
Die von uns gemessenen Werte liegen sowohl unterhalb der in vivo festgestellten Werte als auch unterhalb der Mengen, die in vitro zur Stimulation der Proliferation verwendet wurden [99]. Keratinozyten können offensichtlich diese hohen IL-8 Mengen nicht alleine liefern, so dass externe Quellen von inflammatorischen Zellen oder von Fibroblasten nötig sind, um in vivo Bedingungen zu gewährleisten. Das gleichmäßige Vorhandensein des anti-inflammatorischen Interleukins 10 bei allen Matrix Gruppen, dass die Expression von IL-1ß, IL-2 und IL-6 reduziert, deutet darauf hin, dass dieser regulatorische Weg nicht für die ge-messenen Unterschiede in der Interleukinsekretion verantwortlich gemacht werden kann.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass in allen Matrices pro- und anti-inflammatorische Zytokine und Chemokine produziert wurden, die Unterschiede jedoch vor allem Donor-abhängig waren und die Interleukine IL-1β, IL-6 und IL-8 betrafen mit mehr IL-1β in DED und Matriderm und mehr IL-8 bei Epiflex®.
51
5 Zusammenfassung
Im Rahmen von Verbrennungen, Unfällen oder Tumorresektionen kann es zum tiefschichti-gen Hautweichteilverlust kommen. Bei diesen tiefschichtitiefschichti-gen Defekten gehen häufig Anteile oder sogar die komplette Dermis verloren. Heutzutage werden bereits allogene, azelluläre dermale Matrices als biologischer Wundverschluss eingesetzt, die großes Potenzial als derma-ler Hautersatz haben oder aber auch als Grundlage für ein Hautkonstrukt fungieren könnten, um damit das Repertoire an Rekonstruktionsmöglichkeiten erheblich zu erweitern.
Ziel dieser Studie war die Erprobung azellulärer, biologischer und synthetischer Matrices als dermaler Ersatz in einem etablierten ex vivo Hautorgankulturmodell. Dabei wurden Spalthaut-transplantate auf humaner, de-epithelialisierte Dermis (DED), auf azellulärer, humaner Der-mis (Epiflex®) und auf einer synthetischen Kollagen-Elastin Matrix (Matriderm®) aufgebracht und die zelluläre Migration analysiert. Ergänzend hierzu kam humanes azelluläres Amnion als Matrix für die zelluläre Migration zum Einsatz.
Die mit Abstand größte epitheliale Ausbreitung und Differenzierung fand auf DED statt, was auf das Vorhandensein von pro-migratorischen Basalmembranresten auf der apikalen Fläche des DED sowie von Zellfragmenten in der dermalen Matrix zurückzuführen ist. Dies und das fehlende parakrine Signaling von Fibroblasten in unserem ex vivo Kulturmodell sind Erklä-rungsmöglichkeiten für die eingeschränkte horizontale Epithelialisierung auf Epiflex® und Matriderm®. Interessanterweise hatte der Ursprungsort der dermalen Matrix maßgeblichen Einfluss auf die keratinozytäre Migration mit deutlich mehr Epithelialisierung auf Epiflex® aus der oberen (papillären) Dermis im Vergleich mit Epiflex® aus der unteren (retikulären) Dermis. Das Sekretionsprofil pro- und anti-inflammatorischer Mediatoren war Donor-abhängig, wobei mehr IL-1β in DED und Matriderm® und mehr IL-8 bei Epiflex® nachweis-bar waren. Im Gegensatz zu den biologischen Matrices fand bei Matriderm® eine vollständige horizontale Durchwanderung der Matrix mit epithelialer Differenzierung statt. Auch hier spielte die Matrixbeschaffenheit eine maßgebliche Rolle für die epitheliale Migration, da die grobe Porengröße dieses synthetischen Substrats offensichtlich zwar eine vertikale aber nicht eine horizontale Migration begünstigte.
Die unzureichende technische Möglichkeit der Befestigung der Hauttransplantate auf dem Amnion schränkte die horizontale Epithelialisierung dieser Matrix erheblich ein. Auch die harte Oberflächenbeschaffenheit dieser Matrix und das Fehlen von ECM Proteinen, die für die Migration wichtig sind, können für die eingeschränkte Keratinozytenmigration auf Amni-on verantwortlich sein. Unsere ex vivo Studien deuten darauf hin, dass azelluläres AmniAmni-on nur
5 Zusammenfassung 52 bedingt als dermaler Ersatz geeignet ist, was aber keine Aussage über dessen Einsatz als bio-logischer Wundverband zulässt.
Zusammenfassend ist festzustellen, dass die biochemische und physikalische Beschaffenheit der Oberfläche einer Hautersatzmatrix von großer Bedeutung für die epitheliale Migration und Differenzierung ist, wobei Basalmembranreste und ECM Proteine der papillären Dermis einen positiven Effekt auf die Epithelialisierung haben in Abwesenheit von Fibroblasten ha-ben, die in vivo über parakrines Signaling die Hautwundheilung unterstützen und
Zusammenfassend ist festzustellen, dass die biochemische und physikalische Beschaffenheit der Oberfläche einer Hautersatzmatrix von großer Bedeutung für die epitheliale Migration und Differenzierung ist, wobei Basalmembranreste und ECM Proteine der papillären Dermis einen positiven Effekt auf die Epithelialisierung haben in Abwesenheit von Fibroblasten ha-ben, die in vivo über parakrines Signaling die Hautwundheilung unterstützen und