Dissertation. Untersuchung der Elektrophysiologischen Rolle von TRPC3-Kanälen im Myokard

Dissertation

zur Erlangung des akademischen Grades Doktor der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.)

an der Naturwissenschaftlichen Fakultät der Karl – Franzens – Universität Graz

Untersuchung der

Elektrophysiologischen Rolle von TRPC3-Kanälen im Myokard

vorgelegt von Mag. Zora SAAD

Graz, Dezember 2010

Der experimentelle Teil der vorliegenden Arbeit wurde im Zeitraum von September 2007 bis September 2010 am Institut für Pharmakologie und Toxikologie an der Karl-Franzens-Universität Graz durchgeführt.

Herrn Univ.-Prof. Dr. Bernhard-Michael Mayer, Leiter des Bereiches Pharmakologie und Toxikologie des IPW der Universität Graz, danke ich für die Bereitstellung des Arbeitsplatzes.

Des Weiteren danke ich Herrn A.o. Univ.-Prof. Dr. Klaus Groschner für die Themenstellung und Unterstützung sowie für die Korrektur der Arbeit.

Außerdem danke ich besonders Frau Renate Schmidt und Herrn Dr.

Michael Poteser für die freundliche Unterstützung und Hilfe.

Ebenso möchte ich mich bei allen Institutskollegen für die Hilfsbereitschaft und das angenehme Arbeitsklima bedanken.

Die vorliegende Arbeit wurde aus dem Mitteln des FWF finanziert.

Fonds zur Förderung der wissenschaftlichen Forschung (FWF) Weyringergasse 35

A-1040 Wien

In Dankbarkeit meiner Lebensgefährtin gewidmet.

Inhaltsverzeichnis

1 Zusammenfassung...7

2 Einleitung ...9

3 Material und Methoden ...11

Zellkultur und Transfektion ... 11

DNA & Expressionsvektor ... 12

Elektrophysiologie ... 12

Intrazelluläre Kalzium-Bestimmung... 14

Zusammensetzung der extrazellulären und intrazellulären Lösung ... 16

Chemikalien und andere Testsubstanzen ... 17

Statistik... 18

4 Resultate ...19

Charakterisierung von TRPC3-vermittelten Strömen in kardialer Umgebung unter Standard-Bedingungen... 19

Fura-2-Messung und Ca²⁺-Readditionsbestimmung ... 21

Charakterisierung von TRPC3-vermittelten Strömen in kardialer Umgebung in nominal-kalziumfreier Extrazellulärlösung... 30

Effekte von extrazellulärem Ca²⁺ auf dem TRPC3-vermittelten Strom in TRPC3-HL-1 Zellen... 34

Einfluss vom TRPC3-Protein auf das Aktionspotential... 41

5 Diskussion ...45

Der TRPC3-vermittelte Strom in HL-1 ... 45

Kalziumbedingte Hemmung vom TRPC3-Strom ... 47

Einfluss von TRPC3-Überexpression auf Erregbarkeit und Aktionspotentiale in HL-1 Zellen... 51

Effekte der TRPC3-Überexpression auf das intrazelluläre Kalzium ... 53

Konklusion... 54

6 Literaturverzeichnis ...56

1 Zusammenfassung

Der nukleäre Faktor von aktivierten T-Zellen (NFAT) ist ein Transkriptionsfaktor mit zentraler Rolle in der Entstehung der Herzhypertrophie und wird über Ca²⁺-Signaltransduktionswege reguliert.

Ionenkanäle der TRPC-Familie sind wesentliche an der NFAT-Regulation beteiligt. Ca²⁺-Einstrom durch TRPC-Kanäle führt zur NFAT-bedingten Änderung des kardialen Genexpressionsmusters und gleichzeitiger Erhöhung der TRPC-Proteinexpression. Zytosolisches Ca²⁺ übt im Herzen eine doppelte Funktion aus: (1) Ca²⁺ ist an der Erregung/

Kontraktion des Herzens beteiligt (2) und ist auch an kardialer Signaltransduktion und Kontrolle der Genexpression beteiligt. Bisher war es unklar welche Konsequenzen erhöhte TRPC-Expression und - Leitfähigkeit auf die Erregbarkeit von Kardiomyozyten hat.

In dieser Arbeit wurde die Strom-Spannungs-(I/V)-Charakteristik des TRPC3-vermittelten Stromes in kardialer Umgebung ermittelt und die Auswirkungen auf das Aktionspotential analysiert. Dafür wurde das TRPC3-Protein im kardialen HL-1-Zellsystem überexpremiert und mittels Patch-Clamp-Technik sowie Fura-2-Ca²⁺-Bestimmung der dabei generierte Phänotyp charakterisiert.

Der TRPC3-vermittelte Strom zeigte die zu erwartende TRPC3-I/V- Charakteristik im HL-1-Zellsystem, allerdings mit deutlich gesteigerter Ca²⁺-Hemmbarkeit. Dies hat zur Folge, dass eine eindeutige Stromaktivierung nur unter nominal-Ca²⁺-freier Bedingung möglich erscheint. Überexpression von TRPC3 zeigte keinen Einfluss auf die basale Erregbarkeit und beeinflusste auch nicht die Form des Aktionspotentials von TRPC3-HL-1 Zellen. Hingegen führte TRPC3-

Überexpression in HL-1 Zellen zu einem erhöhten rezeptorvermittelten Ca²⁺-Einstrom bei der Ca²⁺-Readdition. Die Existenz eines TRPC3- abhängigen Ca²⁺-Einstromweges konnte zusätzlich durch den Einsatz einer permeationsdefizienten/dominant-negativen-Mutante bestätigt werden.

Erhöhte Expression des TRPC3-Proteins im HL-1 Zellsystem scheint somit an der Regulierung des intrazellulären Ca²⁺-Haushaltes beteiligt ohne dabei die Erregbarkeit der Zellen zu verändern.

2 Einleitung

Hypertrophes Wachstum des Myokards, wie es auch bei der chronischen Herzinsuffizienz auftritt, ist verbunden mit morphologischen und funktionellen Veränderungen des Herzens, welche ohne Gegenmaßnahmen lebensbedrohlich werden können (Mann et al., 2005).

Die morphologischen / strukturellen Veränderungen des Myokards werden häufig unter dem Begriff „Remodellierung“ („remodeling“) zusammengefasst. In Analogie dazu bezeichnen einige Autoren elektrophysiologische Veränderungen des Herzens bei der Hypertrophie als „electrical remodeling“ (Hill, 2003). Das zu Grunde liegende Konzept ist vereinfacht dargestellt die pathophysiologische Veränderung von Erregungsbildung, -Weiterleitung und Kontraktion in Folge einer veränderten Genexpression.

Im Herzen spielt zytosolisches Ca²⁺ eine doppelte Rolle in Bezug auf Remodellierungsprozesse und speziell im „electrical remodeling“. Ca²⁺ im Herzen ist sowohl an der Erregung und Kontraktion des Herzens beteiligt als auch an der Signaltransduktion und Genexpression (Molkentin, 2006).

Das heißt, dass das Herz trotz regelmäßiger Änderungen in der zytosolischen Ca²⁺-Konzentration während jedes Herzschlages eindeutig zwischen diesen zwei Ca²⁺-Antworten unterscheiden kann, wie zum Beispiel durch eine räumliche Trennung der Ca²⁺-Signalwege (Wu et al., 2006).

Der “nuclear factor of activated T-cells” (NFAT) ist ein Transkriptionsfaktor, welchem eine zentrale Rolle in der Entstehung der Herzhypertrophie zukommt und welcher über Klazium- Signaltransduktionswege reguliert wird (Molkentin et al., 1998). Eine

wesentliche Beteiligung am Anfangspunkt dieses Signaltransduktionsweges, der zur NFAT-Aktivierung führt, haben Ionenkanäle der TRPC-Familie (Transient Receptor Potential Canonical) (Seth et al., 2009; Wu et al., 2010). Die TRPC-Proteine sind noch weiter in dem NFAT-Hypertrophie-Regelkreis integriert, denn NFAT induziert selbst die TRPC-Genexpression und verstärkt zusätzlich seine eigene Aktivierung (Bush et al., 2006).

In diesem Zusammenhang sind die TRPC3/C6-Proteine von besonderem Interesse. Sie können als Schnittstelle für die Signalintegration von pro- und anti-hypertrophen Stimuli angesehen werden. TRPC3/C6-Aktivierung kann durch klassische pro-hypertrophe Stimuli wie Endothelin-1, Angiotensin-II oder alpha-adrenerge Stimulation erfolgen und in Folge zur NFAT-Aktivierung führen (Bush et al., 2006). Anderseits zeigen neueste Studien, dass die Hemmung von TRPC3/6-Proteinen zum antihypertrophen Effekt von natriuretischen Peptiden (ANP / BNP) beiträgt (Kinoshita et al., 2010).

Trotz der zentralen Rolle von TRPC3/6-Proteinen in der Ca²⁺- Signaltransduktion sind die elektrophysiologischen Konsequenzen für Erregbarkeit und Aktionspotentiale im Myokard weitgehend ungeklärt.

Eine Voraussetzung zur Beantwortung dieser Frage ist die Charakterisierung der TRPC-vermittelten Ströme in kardialer Umgebung.

Ziele dieser Arbeit sind; (1) Charakterisierung von TRPC3-vermitteltem Strom in kardialer Umgebung und (2) Einfluss von TRPC3 auf Zellerregbarkeit und Aktionspotentiale. Zur Beantwortung dieser Fragen wurde ein „gain of function“ Model gewählt um die TRPC3-I/V- Charakteristik, Strom-Aktivierung und die Folgen auf die Zellerregbarkeit sowie auf den rezeptorvermittelten Ca²⁺-Einstrom im HL-1-kardialen Zellsystem zu analysieren.

3 Material und Methoden

Zellkultur und Transfektion

HL-1 Zellen wurden von Dr. Claycomb zur Verfügung gestellt und nach veröffentlichtem Verfahren kultiviert (Claycomb et al., 1998). HL-1 Zellen wurden auf Gelatine-Fibronectin beschichteten Zellkulturschalen bei 37° C, mit 5% CO₂ angereicherter und sterilgefilterter Raumluft, bei einer relativen Luftfeuchtigkeit von 90% im Brutschrank gezüchtet. Wie veröffentlicht wurden HL-1 Zellen in „Claycomb-Medium“ gezüchtet, ergänzt mit folgenden Zusätzen: 10% fetales Rinderserum (Chargennummer: 8A0177), 4 mM L-Glutamin, 100 µM Noradrenalin, 10⁴ U/mL Penicillin and 10⁴ µg/mL Streptomycin.

Lipofectamin 2000 wurde für die Transfektion von HL-1 Zellen verwendet, dabei wurde nach der Herstelleranleitung vorgegangen. HL-1 Zellen wurden am Tag eins auf 60 mm großen mit Gelatine-Fibronectin beschichteten Zellkulturschalen in normalem Medium ausgesät, so dass die Zellen in etwa 60 – 90 % „confluent“ vorlagen. Am Tag zwei wurde das Medium durch 3 mL fertiger Transfektionsmischung (1 mL OptiMEMI, 5 µg Plasmid-DNA und 12 µL Lipofectamin 2000, sowie 2 mL ergänztem Claycomb-Medium) ersetzt und für 18 - 20 h im Brutschrank inkubiert.

Für die elektrophysiologischen Untersuchungen sowie intrazellulären Ca²⁺- oder Na⁺-Messungen wurden die Zellen enzymatisch von den Zellkulturschalen abgelöst und auf Gelatine-Fibronectin beschichteten 6x6-mm Glasplättchen ausgesetzt. Nach einer Ruhezeit von etwa 3 h in ergänztem Claycomb-Medium wurden die Zellen zur Untersuchung herangezogen.

DNA & Expressionsvektor

Verwendet wurde das mit YFP am N-Terminus markierte hTRPC3, subkloniert in den eYFP-C1-Expressionsvektor (Invitogen). Eine permeationsdefiziente-Mutante wurde durch Austausch von Gluaminsäure (

−

+

Elektrophysiologie

Elektrophysiologische Untersuchungen wurden mit der Patch-Clamp Methode durchgeführt. Dabei wurden die Zellen in der „whole-cell“ bzw. in der „perforated-patch“ Konfiguration vermessen (Hamill et al., 1981; Rae et al., 1991). Die Versuchsanordnung bestand aus einem Invertmikroskop (Eclipse TE200, Nikon, Österreich), Perfusionssystem mit Gravitationsantrieb und Perfusionskammer (Harvard Apparatus, Deutschland), Patch-Clamp-Verstärker (Axopatch 200B, Molekular Devices, Deutschland), Analog-Digital-Wandler (Digidata 1322A, Molekular Devices, Deutschland), hydraulischer Mikromanipulator (Narishige, Großbritannien), Metallhalid-Lampe (HXP-120, Visitron Systems, Deutschland) und einem Standard-PC zur Datenerfassung mit Clampex 8.2 Software (Molekular Devices, Deutschland). Die Daten wurden mit einer Abtastrate von 8 kHz erfasst. Alle Experimente sind bei Raumtemperatur (21-24° C) durchgeführt worden.

Als Patch-Clamp-Pipetten wurden dünnwandige Glaskapillaren (GC150TF-7.5, Havard Apparatus, Deutschlad) verwendet. Diese wurden mittels Mikropipettenziehapparat (Sutter Instruments, U.S.A.) gezogen und poliert (Mikroforge NF-F, Narishige, Großbritannien), so dass nach Füllung der Pipetten mit intrazellulärer Lösung ein Pipettenwiderstand von 3-4 MΩ resultierte.

Aktionspotentiale wurden in Whole-Cell-Konfiguration im Current-Clamp- Modus aufgezeichnet. Dabei wurden die Zellen auf annähernd -80 mV polarisiert und mit einem kurzen Reiz wurden Aktionspotentiale ausgelöst, wie in Abb. 1 gezeigt wird. Nach spätestens zwanzig Stimulationen in Folge, stellte sich ein „steady-state“ für die Aktionspotentiale ein, das heißt diese waren dann gleichförmig. Nach dem Erreichen des „steady- state“ wurden die Experimente gestartet. Für die Datenanalyse wurden pro Zelle und pro Bedingung die Parameter von 5 - 7 Aktionspotentialen durch Clampfit (Version 9.2, Molekular Devices, Deutschland) erhoben und gemittelt.

0 200 400 600

-80 -60 -40 -20 0 20

Spannung (mV)

Zeit (ms)

Abbildung 1. Stimulationsprotokoll zur Bestimmung der Reizschwelle für Aktionspotentiale in HL-1 Zellen.

HL-1 Zellen wurden im Current-Clamp-Modus gehalten und auf -75 mV bis -85 mV polarisiert. Mit 10-ms-langen Rechteck-Reizströmen wurde die Zellmembran alle 5 Sekunden (0.2 Hz) depolarisiert. Die Stromstärke des Reizstromes wurde in 0.07 nA Schritten erhöht (schematische Darstellung, links) bis das Schwellpotential der Zelle erreicht worden ist und sich Aktionspotentiale zeigten (Beispiel, rechts). In Folge wurden Aktionspotentiale mit jener Stromstärke ausgelöst, die die Zellmembran auf das 1.2-fache des Schwellpotentials depolarisiert.

Kardiale Ströme wurden im Voltage-Clamp-Modus mittels rampenförmiger Spannungsprotokolle registriert. Bei Experimenten in whole-cell-Konfiguration reichte die Spannungsrampe von +80 mV bis - 100 mV bei einem Haltepotential von -80 mV, wogegen in perforated- patch-Konfiguration Experimenten reichte die Spannungsrampe von -120 mV bis +80 mV und hatte ein Haltepotential von 0 mV. Die Länge beider Rampen betrug 400 ms. Die Spannungsprotokolle waren softwaregesteuert (Clampex 8.2) und wurden alle 5 Sekunden ausgelöst (Frequenz: 0.2 Hz).

Stromamplituden (pA) aus Voltage-Clamp-Experimenten wurden auf die jeweiligen Zelloberflächen (pF) normiert und als Stromdichten (pA/pF) angegeben. Die Zelloberflächen wurden automatisch, mittels eingebautem „Seal-Test-Tool“ der Clampex-Software, gemessen.

Bei Experimenten mit chloridarmen Pipettenlösungen wurde das resultierende „Liquid-Junction“-Potential nachträglich rechnerisch korrigiert. Hierfür wurde das Liquid-Junction-Potential mit dem „Junction- Potential-Calculator“ aus der Clampex-Software berechnet (Barry, 1994).

Intrazelluläre Ca

-Bestimmung

Die intrazelluläre Ca²⁺ Konzentration wurde ratiometrisch mittels Fura-2 Farbstoff bestimmt (Grynkiewicz et al., 1985). Hierfür wurden die Zellen auf 6 x 6 mm Glasplättchen ausgesetzt, so dass diese in einem Zustand von 60 - 90%-iger „confluence“ vorlagen. Diese wurden mit 2 µM Fura- 2/AM (AcetoxyMethylester von Fura-2) in Opti-MEMI im Brutschrank bei 37° C, 5% CO₂ und 90% relativer Luftfeuchtigkeit 45 Minuten lang beladen. Nach der Beladung wurden die Zellen zweimal mit Opti-MEMI gewaschen. Die Ca²⁺-sensitive Fluoreszenz wurde ratiometrisch bei 350 nm / 380 nm angeregt und die Emission bei 510 nm Wellenlänge

gemessen. Die Versuchsanordnung bestand aus einem Invertmikroskop (Diaphot TMD, Nikon, Österreich), Perfusionssystem mit Gravitationsantrieb und Perfusionskammer (Harvard Apparatus, Deutschland), Polychromator (Polychrom V, Till Photonics, Deutschland) gesteuert durch einen Standard-PC mittels Imaging Workbench Software (Indec BioSystems, U.S.A).

Ca²⁺-Readditionsbestimmung erfolgte nach publizierter Vorgabe (Wu et al., 2010; Zhu et al., 1996). Die Bestimmung in Übersicht: Nach der Beladung der Zellen mit dem Fura-2-Farbstoff wurden die Glassplättchen samt Zellen in der Perfusionskammer befestigt. Die Zellen wurden dabei kontinuierlich mit extrazellulärer Lösung bei Raumtemperatur (21-24° C) perfundiert. Für die Dauer der ersten 300 Sekunden wurden diese mit nominal-Ca²⁺-freier Lösung perfundiert und als 0 Ca gekennzeichnet.

Anschließend wurde auf Ca²⁺-haltige Lösung gewechselt (gekennzeichnet als 2 Ca²⁺, Abb. 2). Für die Ca²⁺-Freisetzung aus dem intrazellulären Speicher wurde Endothelin-1-Stimulation (ET-1, 100 nM) gewählt. ET-1 aktiviert auch die TRPC3-Kanäle. Diese Aktivierung zeigt sich beim Wechsel auf Ca²⁺-haltige Lösung als vermehrter Ca²⁺-Einstrom.

Bei Experimenten mit HL-1 Zellen zeigten sich funktionelle Subpopulationen. Diese waren:

1) Zellen, die sowohl Ca²⁺-Freisetzung als auch Ca²⁺-Einstrom aufwiesen

2) Zellen, die weder Ca²⁺-Freisetzung noch Ca²⁺-Einstrom aufwiesen 3) Zellen, die entweder Ca²⁺-Freisetzung oder Ca²⁺-Einstrom

aufwiesen

Für die Datenanalyse wurden Subpopulation 1 und 3 herangezogen.

Allerdings waren die Subpopulationen nicht gleich groß verteilt, so dass bei manchen ausgewiesenen Analysen nur einzelne Gruppen betrachtet worden ist.

Abbildung 2. Fura-2-Signalanalyse von Ca²⁺-Freisetzung und Ca²⁺-Einstrom bei der Ca²⁺-Readditionsbestimmung.

Das erste Maximum nach Applikation von 100 nM Endothelin-1 (ET-1) zeigt die Ca²⁺-Freisetzung aus dem intrazellulären Speicher. Berechnet wurde die Ca²⁺- Freisetzung als Differenz von

d

c

d

c

f

höchste Wert zwischen 300 Sek.-Messende und

e

Zusammensetzung der extrazellulären und intrazellulären Lösung

Extrazelluläre Lösung folgender Zusammensetzung wurde, sowohl für die patch-clamp-Messungen als auch für Fura-2-Messungen, verwendet:

ƒ In (mM): NaCl (140), KCl (5.4), D-Glucose (10), MgCl₂ (1), CaCl₂ (2), HEPES (10); pH 7.4 mit NaOH eingestellt

Die Zusammensetzungen der intrazellulären Lösungen, das heißt der Pipettenlösungen, sind wie folgt:

ƒ Für Whole-Cell-Voltage-Clamp Messungen (mM): Cs- Methansulfonat (130), CsCl (15), NaCl (1), MgCl₂ (1), CaCl₂ (1), HEPES (10), EGTA (5), Mg-ATP (5); pH 7.2 mit CsOH eingestellt

ƒ Für Perforated-Patch-Voltage-Clamp Messungen (mM): K-Aspartat (70), KCl (50), NaCl (7), MgCl2 (5), CaCl2 (1), HEPES (10), EGTA (0.1), Amphotericin B (80 µg/mL); pH 7.2 mit KOH eingestellt

ƒ Für Whole-Cell-Current-Clamp Messungen (mM): K-Aspartat (130), KCl (15), NaCl (1), MgCl₂ (1), CaCl₂ (1), HEPES (10), EGTA (5), Mg-ATP (5); pH 7.2 mit KOH eingestellt

Mg-ATP wurde am Versuchstag frisch zu den entsprechenden Lösungen hinzugefügt, anschließend wurde der pH-Wert der Lösungen wieder auf 7.2 eingestellt. Amphotericin B wurde in DMSO gelöst (0.03 mg/mL DMSO-Stocklösung), bei -20° C im Tiefkühlschrank gelagert und frisch zur intrazellulären Lösung hinzugefügt.

Chemikalien und andere Testsubstanzen

Sofern nicht ausdrücklich darauf hingewiesen wird, wurden alle Chemikalien von Sigma-Aldrich (Österreich) bezogen. Das gilt auch für das „Claycomb-Medium“. Fetales Rinderserum wurde von SAFC Biosciences (Großbritannien). Lipofectamin 2000, OptiMEMI, Fura-2 und SBFI wurden von Invitrogen (Österreich) bezogen.

Statistik

Sofern nichts Gegenteiliges im Text steht stellen alle Werte Mittelwerte ± Variatioskoeffizienten dar. Variationskoeffizienten werden in dieser Arbeit, wie im Englischen üblich als SEM (standard error of the mean) abgekürzt.

Unter n wird in der Arbeit eine Zelle unter einer experimentellen Bedingung verstanden. Um den statistischen Unterschied zweier Gruppen zu testen wurde der t-Test nach Student verwendet. Als statistisch signifikant wurde ein Wert von P < 0.05 angesehen.

4 Resultate

Charakterisierung von TRPC3-vermittelten Strömen in kardialer Umgebung unter Standard-Bedingungen.

Hierfür wurde das mit YFP-markierte hTRPC3-Protein in HL-1 Zellen (von hier an als TRPC3-HL-1 bezeichnet) überexpremiert und in Whole-Cell- Konfiguration gehalten. Die Zellen wurden in einer auf 2 mM [Ca²⁺]_o modifizierten physiologischen Badlösung gehalten. Um Kaliumströme zu blocken wurde eine Cs-haltige Pipettenlösung (145 mM [Cs⁺]_i) verwendet.

TRPC3-Stimulierung erfolgte mit 100 nM Endothelin-1 (Peppiatt-Wildman et al., 2007). Diese Patch-Clamp-Anordnung hat sich bereits vielfach für die Ableitung von TRPC3-vermittelten Strömen bewährt (Graziani et al., 2006; Hurst et al., 1998; Onohara et al., 2006). Jedoch war keine durch die Überexpression bedingte TRPC3-vermittelte Stromaktivierung zu beobachten (Abb. 3A und B). Einzig ein stetig-steigender und ET-1- unabhängiger Strom mit Nullstrompotential (E_rev) von -17 mV war zu messen (Abb. 3C und D). Dieser Strom war im gleichen Ausmaß, sowohl in den Leervektorkontrollzellen (Vektor-HL-1), als auch in den TRPC3-HL- 1 Zellen zu finden. Dieser Strom war jedoch in nicht-transfizierten Wildtyp-HL-1 Zellen abwesend (Daten nicht gezeigt). Folglich lassen sich TRPC3-vermittelte Ströme unter Standard-Patch-Clamp-Bedingungen in HL-1 Zellen nicht charakterisieren.

Abbildung 3. Stromcharakteristik von Endothelin-induzierten Strömen unter Standard-TRPC3-Bedingungen in TRPC3-HL-1 Zellen.

Mit Standard-TRPC3-Bedingungen sind Ableitungen mit 2 mM [Ca²⁺]o, 145 mM [Cs⁺]i und Whole-Cell-Konfiguration gemeint. A und B, zeigen die Verläufe der Strom/Spannungs-(I/V)-Kurven bei +70 mV (•) und -90 mV (U) von HL-1 Zellen transfiziert mit dem YFP-hTRPC3-Protein (TRPC3) bzw. Scheintransfizierte HL-1 Zellen (Vektor, leerer Vektor) — jeweils vor und während Endothelin-1 (100 nM, ET- 1) Stimulation. C, repräsentative I/V-Kurve für den ET-1-induzierten Strom (ET-1 (max) ) und dazugehörige Kontroll-Kurve (vor ET-1, Rampe unmittelbar vor ET-1- Applikation) in TRPC3-HL-1 Zellen. In D werden die mittleren ET-1-induzierten Ströme ± SEM von 17 TRPC3-HL-1 und 10 Vektor-HL-1 Zellen statistisch zusammengefasst; P = NS (nicht signifikant) gegen Vektor anhand von t-Test. Zu Beachten:. ET-1-induzierte Ströme in TRPC3-HL-1-Zellen unterscheiden sich nicht von ET-1-induzierten Strömen in Vektor-HL-1-Zellen.

Fura-2-Messung und Ca

-Readditionsbestimmung

Ein funktionelles Merkmal für die Überexpression von TRPC3-Proteinen in einem Zellsystem ist erhöhter Ca²⁺-Einstrom bei einer Ca²⁺- Readditionsbestimmung (Nakayama et al., 2006; Wu et al., 2010; Zhu et al., 1996). TRPC3-HL-1 Zellen wurden gleich transfiziert wie für die Whole-Cell Patch-Clamp-Experimente. Auch die Kontrolle (Scheintransfektion mit Leer-Vektor) und TRPC3-Aktivierung mit 100 nM Endothelin-1 waren identisch. Abbildung 4A zeigt den Verlauf zweier Ca²⁺-Readditionsexperimente. Ca²⁺-Einstrom bei den TRPC3-HL-1 Zellen war im Mittel um 61 % höher als bei den Vektor-HL-1 Zellen, Ca²⁺- Freisetzung jedoch war unverändert (Abb. 4B). Demzufolge wird der Ca²⁺-Einstrom durch TRPC3-Protein-Überexpression und nach TRPC3- Aktivierung mit ET-1 in HL-1 Zellen wie vorhergesagt erhöht.

Bei der gemeinsamen Auswertung aller Fura-2-Daten, wie in Abbildung 4 dargestellt, ist ein eindeutiger, statistisch signifikanter Zusammenhang zwischen TRPC3-Expression und Ca²⁺-Einstrom in HL-1 Zellen herzustellen. Wie aber eingangs im Methodenteil erwähnt, war die Ca²⁺- Antwort von HL-1 Zellen bei der Ca²⁺-Readditionsbestimmung nicht einheitlich (Zusammenfassung in Tab. 1). Folgende funktionelle Subpopulationen waren abzugrenzen: (1) 36/92 TRPC3-HL-1 Zellen und 60/138 Vektor-HL-1 Zellen zeigten Ca²⁺-Freisetzung und Ca²⁺-Einstrom (Abb. 5A); (2) 47/92 TRPC3-HL-1 Zellen und 46/138 Vektor-HL-1 Zellen zeigten keine Ca²⁺-Freisetzung aber Ca²⁺-Einstrom (Abb. 5C); (3) 0/92 TRPC3-HL-1 Zellen und 9/138 Vektor-HL-1 Zellen zeigten Ca²⁺- Freisetzung aber keinen Ca²⁺-Einstrom (Daten nicht gezeigt); (4) 9/92 TRPC3-HL-1 Zellen sowie 23/138 Vektor-HL-1 Zellen zeigten weder Ca²⁺- Freisetzung noch Ca²⁺-Einstrom (Daten nicht gezeigt). Die gesonderte Analyse der einzelnen funktionellen Subpopulationen ergab, dass nur

TRPC3-HL-1 Zellen der Gruppe 2 (Zellen ohne Ca²⁺-Freisetzung aber mit Ca²⁺-Einstrom) einen signifikant höheren Ca²⁺-Einstrom aufwiesen (Abb.

5). TRPC3-HL-1 Zellen der Gruppe 2 hatten um 63% höheren Ca²⁺- Einstrom als Vektor-HL-1 Zellen derselben Gruppe. Dem entgegen war der Ca²⁺-Einstrom von den TRPC3-HL-1 Zellen in der Gruppe 1 (Zellen mit Ca²⁺-Freisetzung und mit Ca²⁺-Einstrom) nicht von dem Ca²⁺-Einstrom der Vektor-HL-1 Zellen zu unterscheiden (Abb. 5A und B). Auch bezüglich Ca²⁺-Freisetzung unterschieden sich TRPC3-HL-1 und Vektor-HL-1 Zellen der Gruppe 1 nicht, wenn auch die Ca²⁺-Freisetzung in TRPC3-HL- 1 tendenziell niedriger war als bei den Vektor-HL-1 Zellen.

Zusammengenommen verrät die Analyse der funktionellen Subpopulationen, dass erhöhte TRPC3-Expression in HL-1 Zellen nur dann einen Einfluss auf dem Ca²⁺-Einstrom hat, wenn die HL-1 Zellen vorher kein Ca²⁺ freigesetzt haben. Außerdem hat erhöhte TRPC3- Expression auch unter Berücksichtigung von funktionellen Subpopulationen (Abb. 5) keinen Einfluss auf die Höhe der Ca²⁺- Freisetzung.

Weil eine Erhöhung im Ca²⁺-Einstrom von TRPC3-HL-1 Zellen nur in Abwesenheit von Ca²⁺-Freisetzung zu beobachten war, wurde das Potential von HL-1 Zellen zur Ca²⁺-Mobilisierung aus dem sarkoplasmatischen Retikulum (SR) untersucht. Die Abwesenheit einer rezeptorvermittelten Ca²⁺-Freisetzung nach ET-1-Stimulation könnte auf eine Störung des ET_A-Rez. / G_q-Prot. / PLC / IP₃-Rez.

Signaltransduktionsweges in einigen HL-1 Zellen hinweisen (siehe oben Gruppe 2). Um diesen Signaltransduktionsweg zu umgehen wurde der Ca²⁺-Ionophor Ionomycin zur Ca²⁺-Freisetzung verwendet. Denn Ionomycin setzt in submicromolarer Konzentration direkt Ca²⁺ aus dem SR frei unter Umgehung der Plasmamembranrezeptoren (Morgan et al., 1994). Alle 18 TRPC3-HL-1 und alle 15 Vektor-HL-1 Zellen reagierten mit

Ca²⁺-Freisetzung auf die Stimulation mit 200 nM Ionomycin (Abb. 6).

Obwohl TRPC3-HL-1 Zellen gegenüber Vektor-HL-1 Zellen tendenziell mehr Ca²⁺-Freisetzung und Ca²⁺-Einstrom gezeigt haben waren diese Unterschiede nicht signifikant (Abb. 6B). Demnach könnte eine Störung des ET_A-Rez. / G_q-Prot. / PLC / IP₃-Rez. Signaltransduktionsweges in einigen HL-1 Zellen eine mögliche Ursache für die Bildung von funktionellen Subpopulationen sein. Weil bei direkter Ca²⁺-Freisetzung aus dem SR mit Ionomycin alle HL-1 Zellen mit Erhöhung im Fura-2- Signal reagiert haben.

Dass die Überexpression von TRPC3-Proteinen in Säugetierzellen zu vermehrtem rezeptorvermittelten Ca²⁺-Einstrom in den Zellen führt (Abb.

4 und 5), stand im Einklang mit zuvor publizierten Daten (Nakayama et al., 2006; Zhu et al., 1996). Jedoch fehlte eine rezeptorvermittelte TRPC3-Stromantwort im Whole-Cell-Patch-Clamp-Experiment mit den TRPC3-HL-1 Zellen gänzlich (Abb. 3). Dies stellte einen Widerspruch dar, denn das überexpremierte TRPC3-Protein sollte sich funktionell sowohl im Fura-2-Experiment als auch im Patch-Clamp-Experiment zeigen.

Daher wurde der Ca²⁺-Einstrom in TRPC3-HL-1 Zellen weiter untersucht, um den Ca²⁺-Einstrom eindeutig mit der TRPC3-Funktion zu korrelieren.

TRPC3-Ionenkanäle sind dafür bekannt, dass sie durch 1-Oleoyl-2-acetyl- sn-glycerin (OAG) direkt zu aktivieren sind (Hofmann et al., 1999).

Dadurch lässt sich ein TRPC3-assozierter Ca²⁺-Einstrom vom Orai1- vermittelten Ca²⁺-Einstrom unterscheiden. OAG aktiviert keinen zusätzlichen Orai1-vermittelten Ca²⁺-Einstrom, welcher typischerweise mit dem agonisten-aktivierten, TRPC3-vermittelten Ca²⁺-Einstrom überlappen könnte (Liao et al., 2009). TRPC3-HL-1 Zellen zeigten bei OAG- Stimulation gegenüber Vektor-HL-1 Zellen einen um 54% höheren Ca²⁺- Einstrom (Abb. 7B). In Abbildung 7A sind dazugehörige repräsentative

Fura-2-Signale dargestellt. Keine der Zellen in diesem Versuch, weder TRPC3-HL-1 (n=24) noch Vektor-HL-1 (n=34), setzte bei OAG- Stimulation Ca²⁺ frei. Der OAG-stimulierte Ca²⁺-Einstrom belegt, dass dieser Ca²⁺-Einstrom in TRPC3-HL-1 Zellen tatsächlich TRPC3-assoziert ist.

Um die TRPC3-Assoziation im ET-1-stimulierten Ca²⁺-Einstom bei TRPC3-HL-1 Zellen weiter abzusichern, wurde das Fura-2-Signal einer permeationsdefiziente TRPC3-Mutante bei ET-1-Stimulation untersucht.

Diese Mutante (E630K) wurde durch gezielte Punktmutation im porenbildenden Teil des TRPC3-Proteins hergestellt. E630K zeigte sich in HEK Zellen in der Stromantwort und im Fura-2-Signal als nicht aktivierbar (Groschner K., Publikation in Vorbereitung). Auch in HL-1 Zellen, in denen die E630K-Mutante überexpremiert worden war, war der ET-1- stimulierte Ca²⁺-Einstrom auf „Vektor-Niveau“ gehemmt (Abb. 7C und D).

Somit konnte auf Proteinebene ein kausaler Zusammenhang vom ET-1- vermitteltem Ca²⁺-Einstrom mit der TRPC3-Überexpression hergestellt werden. Wie bereits im Methoden-Abschnitt erwähnt, waren funktionelle Subpopulationen bei den HL-1 Zellen zu erkennen. Da nur 1 von 49 E630K-HL-1 Zellen Ca²⁺-Freisetzung gezeigt haben, wurden insgesamt für einen fairen Vergleich, nur Zellen die keine Ca²⁺-Freisetzung aufwiesen für die Datenanalyse in Abbildung 7D herangezogen.

Zusammengenommen ist der ET-1-stimulierte Ca²⁺-Einstom mit der TRPC3-Funktion in TRPC3-HL-1 Zellen assoziiert.

Abbildung 4. Bestimmung des Kalzium-Einstroms nach Readdition bei Überexpression vom TRPC3-Protein in HL-1 Zellen.

A, repräsentative Fura-2-Signale für eine TRPC3-HL-1 Zelle (rot) und eine Vektor- HL-1 Zelle (schwarz). Die extrazelluläre Lösung war anfangs nominal-Kalzium-frei (0 Ca²⁺, weißer Balken), nach 300 Sek. wurde auf kalziumhaltige Lösung gewechselt (2 Ca²⁺, 2 mM [Ca²⁺]o, grauer Balken). Ca²⁺-Freisetzung und TRPC3-Aktivierung erfolgte durch Zugabe von 100 nM Endothelin-1 (ET-1) zur extrazellulären Lösung.

B, mittlere Amplitudenänderungen des Fura-2-Signales bei Ca²⁺-Freisetzung und Ca²⁺-Einstrom von 92 TRPC3-HL-1 (grau) und 138 Vektor-HL-1 (weis) Zellen. Daten stellen Mittelwerte ± SEM dar,* P < 0.05 gegen Vektor anhand von t-Test.

Abbildung 5. Einfluss der funktionellen Subpopulationen auf die Ca²⁺-Readdition in TRPC3-HL-1 Zellen.

Obere Teil der Abbildung (A und B) zeigt die HL-1-Subpopulationsanalyse für Zellen die sowohl Ca²⁺-Freisetzung als auch Ca²⁺-Einstrom gezeigt haben. Der unterer Teil der Abbildung (C und D) zeigt die HL-1-Subpopulationsanalyse für Zellen die nur Ca²⁺-Einstrom aber keine Ca²⁺-Freisetzung gezeigt haben. A und C, repräsentative Fura-2-Signale für eine TRPC3-HL-1 Zelle (rot) und eine Vektor-HL-1 Zelle (schwarz). B und D, mittlere Amplitudenänderungen des Fura-2-Signales bei Ca²⁺- Freisetzung und Ca²⁺-Einstrom von TRPC3-HL-1 (grau) und Vektor-HL-1 (weis) Zellen. Die extrazelluläre Lösung war anfangs nominal-Kalzium-frei (0 Ca²⁺, weißer Balken), nach 300 Sek. wurde auf kalziumhaltige Lösung gewechselt (2 Ca²⁺, 2 mM [Ca²⁺]o, grauer Balken). Ca²⁺-Freisetzung und TRPC3-Aktivierung erfolgte durch Zugabe von 100 nM Endothelin-1 (ET-1) zur extrazellulären Lösung. Daten stellen Mittelwerte ± SEM dar,* P < 0.05 gegen Vektor anhand von t-Test.

Abbildung 6. Einfluss von Ionomycin auf Ca²⁺-Freisetzung und Ca²⁺-Einstrom von TRPC3-HL-1 Zellen.

A, repräsentative Fura-2-Signale für eine TRPC3-HL-1 Zelle (rot) und eine Vektor- HL-1 Zelle (schwarz). B, mittlere Amplitudenänderungen des Fura-2-Signales bei Ca²⁺-Freisetzung und Ca²⁺-Einstrom von TRPC3-HL-1 (grau) und Vektor-HL-1 (weis) Zellen. Die extrazelluläre Lösung war anfangs nominal-Kalzium-frei (0 Ca²⁺, weißer Balken), nach 300 Sek. wurde auf kalziumhaltige Lösung gewechselt (2 Ca²⁺, 2 mM [Ca²⁺]o, grauer Balken). Ca²⁺-Freisetzung erfolgte durch Zugabe von 200 nM Ionomycin (Ionomycin) zur extrazellulären Lösung. Daten stellen Mittelwerte ± SEM dar, P = NS (nicht signifikant) gegen Vektor anhand von t-Test.

Bezeichnung Phenotyp Zellen [n (%)]

Vektor TRPC3 Gruppe 1 (+) Ca²⁺-Freisetzung / (+) Ca²⁺-Einstrom 60 (43%) 36 (39%) Gruppe 2 (–) Ca²⁺-Freisetzung / (+) Ca²⁺-Einstrom 46 (33%) 47 (51%) Gruppe 3 (+) Ca²⁺-Freisetzung / (–) Ca²⁺-Einstrom 9 (7%) 0 (0%) Gruppe 4 (–) Ca²⁺-Freisetzung / (–) Ca²⁺-Einstrom 23 (17%) 9 (10%)

Tabelle 1. Häufigkeit und Verteilung der funktionellen

Subpopulationen von HL-1 Zellen bei den Fura-2-Experimenten.

Die beobachteten funktionellen Subpopulationen bei den Fura-2-Experimenten wurden in vier Gruppen (1-4) eingeteilt. Die Zuordnung erfolgte nach qualitativen Kriterien: Vorhandensein (+) oder Abwesenheit (–) von Ca²⁺-Freisetzung bzw. Ca²⁺- Einstrom. Unter der Spalte (Zellen) ist die Anzahl (n) und relative Häufigkeit (%) der Zellen pro Gruppe und Zelltyp (Vektor, TRPC3) angeführt. Weitere Informationen siehe Text.

Abbildung 7. Ca²⁺-Einstroms in TRPC3-HL-1 Zellen in

Abhängigkeit von OAG-Stimulation und TRPC3-Porenfunktion.

A, repräsentative Fura-2-Singale für eine TRPC3-HL-1 Zelle (rot) und eine Vektor- HL-1 Zelle (schwarz) bei OAG-Stimulation (OAG, 100 µM). B, mittlere Amplitudenänderungen des Fura-2-Signales beim Ca²⁺-Einstrom nach OAG- Stimulation. C, repräsentative Fura-2-Singale für eine TRPC3-HL-1 Zelle (rot), eine Vektor-HL-1 Zelle (schwarz) und eine E630K-HL-1 Zelle (permeationsdefiziente TRPC3-Mutante, E630K, grün) bei ET-1-Stimulation (ET-1, 100 nM). D, mittlere Amplitudenänderungen des Fura-2-Signales beim Ca²⁺-Einstrom nach ET-1- Stimulation (100 nM). B und D, Daten stellen Mittelwerte ± SEM dar,* P < 0.05 gegen Vektor bzw. E630K anhand von t-Test. Zu Beachten: für diese Abbildung/Analyse sind nur Zellen herangezogen worden, die keine Ca²⁺-Freisetzung gezeigt haben (siehe Text).

Charakterisierung von TRPC3-vermittelten Strömen in kardialer Umgebung in nominal-kalziumfreier

Extrazellulärlösung.

Das Vorhandensein funktionsfähiger TRPC3-Kanäle in TRPC3-HL-1 Zellen konnte nur im Fura-2-Experiment belegt werden, nicht aber im Patch-Clamp-Experiment unter Standardbedingungen. Darum wurden die Bedingungen der Patch-Clamp-Experimente den Fura-2-Experiment- Bedingungen angepasst. Die Zellen wurden in Perforated-Patch- Konfiguration gehalten, um möglichst den nativen intrazellulären Zellzustand zu erhalten. Als Perfusionsschema wurde das gleiche Ca²⁺- Readditionsprotokoll wie in den Fura-2-Experimenten verwendet. Das Spannungsprotokoll wurde wie folgt abgewandelt, um einen erwarteten Ca²⁺-Einstrom zu begünstigen: Haltepotential von 0 mV und Spannungsrampe von -120 mV zu +80 mV. Überraschenderweise zeigten TRPC3-HL-1 Zellen einen ET-1-induzierten Ausstrom bei nominal-Ca²⁺- freier Bedingung, welcher von 2 mM [Ca²⁺]o geblockt worden ist (Abb. 8).

Obwohl die Ca²⁺-Readdition Ein- und Ausströme sowohl in TRPC3-HL-1 als auch in Vektor-HL-1 Zellen reduziert, war nur bei den TRPC3-HL-1 Zellen ET-1-induzierter Ausstrom zu sehen. Außerdem zeigten TRPC3- HL1 Zellen zweimal so viel Ausstrom unter basaler (vor ET-1) nominal- Ca²⁺-freier Bedingung als Kontrollzellen (Abb. 8C). Folglich ist ein TRPC3-vermittelter und ET-1-induzierter Strom in TRPC3-HL-1 Zellen unter nominal-Ca²⁺-freier Bedingung nachweisbar.

Strom-Spannungs-(I-V)-Charakteristik des ET-1-induzierten Stromes in TRPC3-HL-1 Zellen in nominal-Ca²⁺-freier Bedingung. Durch Subtraktion von I/V-Kurven unter und unmittelbar vor ET-1-Stimulation lässt sich der netto-ET-1-induzierte Strom berechnen. Abbildung 9 zeigt solch eine repräsentative Analyse für TRPC3-HL-1 und Vektor-HL-1 Zellen. Die

netto-I/V-Charakteristik für TRPC3-HL-1 Zellen entsprach der eines TRPC3-vermittelten Stromes (Hurst et al., 1998; Lichtenegger, 2010;

Yuan et al., 2007) mit typischen Merkmalen, wie Umkehrpotential bei 0 mV, Auswärtsgleichrichtung und Gq-Protein-Abhängigkeit (Abb. 9C und D). Die auswärts-gleichrichtende Stromkomponente fehlte komplett in den Vektor-HL-1 Zellen. Zwar zeigte die netto-I/V-Kurve des TRPC3- vermittelten Stromes eine deutliche Einstromkomponente, doch unterschied sich diese nicht von der netto-I/V-Kurve der Leervektorkontrolle. Demnach entspricht die I/V-Charakteristik des ET-1- induzierten Stromes in TPRC3-HL-1 Zellen bei nominal-Ca²⁺-freier Bedingung einem TRPC3-vermittelten Strom.

Abbildung 8. Kinetik von Endothelin-induzierten Strömen unter nominal-Ca²⁺-freier Bedingung in TRPC3-HL-1 Zellen.

HL-1 Zellen wurden in Perforated-Patch-Konfiguration gehalten. Perfundiert wurde zuerst mit nominal-Ca²⁺-freier Lösung (0 Ca²⁺) und anschließend mit 2 mM Ca²⁺- haltiger Lösung (2 Ca²⁺). Stimulation erfolgte mit 100 nM Endothelin-1 (ET-1). A und B, zeigen die Verläufe der Strom-Spannungs-Kurven bei +70 mV (•) und -60 mV (U) von TRPC3-HL-1 Zellen (TRPC3) bzw. Vektor-HL-1 Zellen (Vektor). C, Statistische Analyse der Ströme vor der Stimulation ohne Kalzium 0 Ca²⁺, bei maximalen ET-1-Aktivierung ohne Kalzium 0 Ca²⁺ (ET-1) beziehungsweise mit Kalzium 2 Ca²⁺ (ET-1); Daten stellen Mittelwerte ± SEM dar,* P < 0.05 gegen Vektor anhand von t-Test.

Abbildung 9. Strom-Spannungs-Charakteristik des TRPC3- vermittelten Stromes bei nominal-Kalzium-freier Bedingung in TRPC3-HL-1 Zellen.

A und B, repräsentative Kurven von TRPC3-HL-1 Zellen (TRPC3) und Vektor-HL-1 (Vektor) Zellen in Perforated-Patch-Konfiguration; dazugehörig zur Abb. 8A und B.

Gezeigt wird jeweils die Kurve vor Stimulation mit 100 nM Endothelin-1 (vor ET-1) und die Kurve bei maximaler ET-1 Stimulation (ET-1 (max) ). C, korrespondierende netto-ET-1-induzierte Ströme, Erhalten durch Subtraktion von ET-1 (max) und vor ET-1. D, Mittelwertskurven ± SEM von netto-ET-1-induzierten Strömen für 13 TRPC3-HL-1 und 8 Vektor-HL-1 Zellen, *P = 0.05 gegen Vektor anhand von t-Test.

Effekte von extrazellulärem Ca

auf dem TRPC3- vermittelten Strom in TRPC3-HL-1 Zellen.

TRPC3-Strom Hemmung bei physiologischer Ca²⁺ konzentration in TRPC3-HL-1 Zellen. Für die Fura-2-Experimente wurde eine extrazelluläre Ca²⁺ Konzentration von 2 mM gewählt um einen möglichst hohen Ca²⁺ Gradienten für die Readdition zu erzeugen. Jedoch konnte bei dieser Ca²⁺ Konzentration kein ET-1-induzierte TRPC3-Strom in HL-1 gezeigt werde (Abb. 9). Ein ET-1-induzierter TRPC3-Strom war nur bei nominal-Ca²⁺-freier Bedingung zu beobachten. Darum wurde der Einfluss der Ca²⁺ Konzentration auf den ET-1-induzierten TRPC3-Strom untersucht. Hierfür wurde der gleiche Versuch wie in Abbildung 9 wiederholt, jedoch mit 0.8 mM statt 2 mM Ca²⁺ Readdition. Auch bei einer Ca²⁺ Konzentration von 0.8 mM war der ET-1-induzierte TRPC3-Strom geblockt, Abb 10A und C. Weiters wurde geprüft ob bei Vorbehandlung der Zellen mit ET-1 in 0.8 mM [Ca²⁺]_o und anschließendem Wechsel auf nominal-Ca²⁺-freie Lösung mit ET-1 eine TRPC3-Strom-Aktivierung noch möglich ist. Dafür wurde das Perfusionsschema umgedreht, so dass die Zellen zuerst mit 0.8 mM [Ca²⁺]_o perfundiert wurden, dann folgte die ET-1- Applikation und schließlich wurde auf nominal-Ca²⁺-freier Lösung mit 100 nM Endothelin gewechselt. Es zeigte sich dabei, dass Endothelin-1 in Gegenwart von 0.8 mM [Ca²⁺]o nicht in der Lage ist einen TRPC3-Strom in TRPC3-HL-1 Zellen auszulösen, sondern nur in nominal-Ca²⁺-freier Lösung (Abb. 10B und D). Auch hatte die Ca²⁺ Vorbehandlung keinen Einfluss auf die Form der netto-ET-1-induzierten Ströme (Abb. 10E und F). Demgemäß wird der TRPC3-Strom auch bei physiologischer Ca²⁺

Konzentration in TRPC3-HL-1 Zellen gehemmt und diese Hemmung ist unabhängig von der ET-1 / Ca²⁺ Vorbehandlung.

Ausmaß der TRPC3-Strom-Hemmung durch Ca²⁺ in TRPC3-HL-1 Zellen.

Die I/V-Kurven von TRPC3-HL-1 Zellen nach 0.8 mM oder 2 mM Ca²⁺

Readdition sowie die I/V-Kurven von Vektor-HL-1 Zellen nach 2 mM Ca²⁺

Readdition wurden analysiert. Es wurde weder vermehrter Einstrom noch Ausstrom nach 2 mM Ca²⁺ Readdition in TRPC3-HL-1 Zellen festgestellt (Abb 11B). Die Stromamplituden auf der gesamten Länge der I/V-Kurve von TRPC3-HL-1 Zellen unterschieden sich nicht von Vektor-HL-1 Zellen.

Auch die Stromamplituden von TRPC3-HL-1 Zellen nach 0.8 und 2 mM Ca²⁺ Readdition unterschieden sich auch nicht. Einzig eine Tendenz zu vermehrtem Ausstrom bei TRPC3-HL-1 gegenüber Vektor-HL-1 Zellen war zu erkennen, unabhängig von der Ca²⁺ Konzentration (Abb 11A und B). Demnach blockiert Ca²⁺ bereits ab einer Konzentration von 0.8 mM [Ca²⁺]o den TRPC3-Strom auf der gesamten Länge der I/V-Kurve in TRPC3-HL-1 Zellen.

Zwar konnte ein TRPC3-Strom im Patch-Clamp-Experiment gezeigt werden doch wurde dieser Strom nur in nominal-Ca²⁺-freier Lösung beobachtet und war ab einer Ca²⁺ Konzentration von 0.8 mM [Ca²⁺]_o nicht mehr nachweisbar. Es stellt sich daher die Frage, wie die Erhöhung des Fura-2-Signales nach Ca²⁺-Readdition in TRPC3-HL-1 Zellen zur Stande kommt, wenn unter gleichen Bedingungen kein vermehrter Einstrom im Patch-Clamp-Experiment nachweisbar ist (Abb. 4 und 7). Um die elektrophysiologische Grundlage dieses Befundes weiter zu untersuchen wurden die Nullstrompotentiale der I/V-Kurven analysiert. Durch den Wechsel von nominal-Ca²⁺-freier zu 2 mM [Ca²⁺]_o Lösung in Gegenwart von 100 nM ET-1 wurde das Nullstrompotential von TRPC3-HL1 Zellen nur tendenziell aber nicht signifikant ins positive verschoben (Tab. 2. als c’-a’ gekennzeichnet). Insgesamt aber, nach Endothelin-1-Aktivierung und Ca²⁺ Readdition, war eine positive Verschiebung des Nullstrompotentials in TRPC3-HL-1 Zellen zu sehen, im Vergleich zum unstimulierten und

nominal-Ca²⁺-freien Zustand der Zellen (Tab. 2, als c’-b’ gekennzeichnet;

Abb. 12). In Vektor-HL-1 Zellen war hingegen bei gleicher Betrachtung das Nullstrompotential ins Negative verschoben. Trotz Ca²⁺ bedingte Hemmung des TRPC3-Stromes ist ein TRPC3-assoziierter

„depolarisierender-shift“ im Nullstrompotential von TRPC3-HL-1 Zellen nach ET-1-Aktivierung und Ca²⁺-Readdition festzustellen.

Abbildung 10. Einfluss von Ca²⁺ in physiologischer

Konzentration und Ca²⁺ Vorbehandlung auf den Block des TRPC3-vermittelten Stromes in TRPC3-HL-1 Zellen.

TRPC3-HL-1 Zellen wurden entweder zuerst mit nominal-Ca²⁺-freier (0 Ca²⁺) extrazellulärer Lösung und anschließend mit Ca²⁺-haltiger Lösung (0.8 Ca²⁺, 0.8 mM [Ca²⁺]o) perfundiert (A, C und E ) oder in verkehrter Reihenfolge perfundiert (B, D und F ). A und B, Verläufe der Strom-Spannungs-Rampen bei +70 mV (•) und -60 mV (U). C und D, Stromkurven vor (a’) und bei maximaler 100 nM ET-1 Stimulation (b’ und c’’) in 0 mM [Ca²⁺]o, sowie Stromkurven vor (a’’) und bei maximaler 100 nM ET-1 Stimulation (b’’) in 0.8 mM [Ca²⁺]o. E und F, korrespondierende netto-ET-1- induzierte Ströme; berechnet wie angezeigt.

Abbildung 11. Zusammenfassung des Ca²⁺ Blocks auf dem TRPC3-vermittelten Strom in TRPC3-HL-1 Zellen.

A, Perfusionsschema; Pfeilkopf zeigt den betrachteten Messzeitpunk an (j, 460 s).

B, mittlere Stromkurven ± SEM für TRPC3-HL-1 (C3, rot und blau) und Vektor-HL-1 (Vek, schwarz) Zellen zum Messungzeitpunk (460 s) in Gegenwart von 100 nM ET- 1 in 2 mM bzw. 0.8 mM [Ca²⁺]o Lösung; C, statistische Analyse der Stromdichten bei +70 mV und -60 mV von TRPC3-HL-1 (TRPC3) und Vektor-HL-1 (Vektor) Zellen bei 100 nM ET-1-Stimulation in Gegenwart von 2 mM bzw. 0.8 mM [Ca²⁺]o. Alle Daten stellen Mittelwerte ± SEM dar, P = NS (nicht signifikant) gegen Vektor anhand von t-Test. Die Zellen wurden in Perforated-Patch-Konfiguration gehalten gleich wie in Abb. 8A und B, sowie 10A gezeigt.

Vektor TRPC3

Bedingung Abkz. Erev (mV)

vor ET-1 a’ -29.6 ± 9.89 -41.3 ± 5.16

ET-1 (max) b’ -25.4 ± 9.67 -27.5 ± 4.46

2 Ca²⁺ + ET-1 c’ -38.7 ± 12.79 -25.0 ± 4.00

Erev Verschiebung Δ-Erev (mV)

ET-1 Sensitivität b’-a’ 4.1 ± 3.99 13.8 ± 3.54

Ca²⁺ Sensitivität c’-b’ -13.3 ± 7.82 2.5 ± 3.97 ET-1 & Ca²⁺ Sensitivität c’-a’ -9.1 ± 8.72 16.3 ± 4.77 *

Tabelle 2. Einflüsse von Ca²⁺ und Endothelin-1 auf das Nullstrompotential von TRPC3-HL-1 Zellen.

Werte stellen Mittelwerte ± SEM dar für 12 TRPC3- und 7 Vektor-HL-1 Zellen. Erev, Nullstrompotential; Δ-Erev, Nullstrompotential-Verschiebung; * P < 0.05 gegen Vektor durch t-Test.

Abbildung 12. Endothelin- und Ca²⁺-abhängige Verschiebung des Nullstrompotentials in TRPC3-HL-1 Zellen.

A und B, exemplarische Verschiebung der Nullstrompotentiale von TRPC3-HL-1 (TRPC3) Zellen und Vektor-HL-1 (Vektor) Zellen in Perforated-Patch-Konfiguration;

insert, Stromkurven in voller Darstellung. Gezeigt werden jeweils Ströme in nominal- kalziumfreier Lösung (vor ET-1, schwarz) ohne Stimulation sowie Ströme in 2 mM [Ca²⁺]o bei 100 nM Endothelin-1-Stimulation (2 Ca²⁺ + ET-1, grau). Rote Pfeile weisen auf die Richtung der Verschiebung hin. C, individuelle Werte für die Verschiebung des Nullstrompotentials von vor ET-1 zu 2 Ca²⁺ + ET-1 Bedingung.

Jeder Datenpunkt repräsentiert eine Zelle (TRPC3, ◊, n= 12; Vektor, {, n= 7), Mittelwerte ± SEM („) für die jeweiligen Gruppen sind rechts dargestellt, * P < 0.05 gegen Vektor anhand von t-Test.

Einfluss vom TRPC3-Protein auf das Aktionspotential

Untersucht wurde zuerst ob TRPC3-Überexpression in HL-1 Zellen einen Einfluss auf die Erregbarkeit im basalen Zustand der Zellen hat. HL-1 Zellen wurden in Whole-Cell-Current-Clamp-Konfiguration gehalten und Aktionspotentiale wurden mit einem Reizstrompuls ausgelöst. Die basalen Aktionspotentialparameter von TRPC3-HL-1 Zellen unterschieden sich nicht von Vektor-HL-1 Zellen (Abb. 13 und Tab. 3).

Um den depolarisierenden Einfluss einer TRPC3-Überexpression in HL-1 Zellen zu untersuchen wurden TRPC3-Proteine wie in den Spannungs- klemm Experimenten mit 100 nM Endothelin-1-Stimulation aktiviert. Eine geringfügige Depolarisation des diastolischen Potentials der TRPC3-HL-1 Zellen war zwar zu beobachten, doch war diese Depolarisation nicht höher als bei den Vektor-HL-1 Zellen (Abb. 13 und 14). Ansonsten verkürzt Endothelin-1 Aktionspotentiallänge und erniedrigt die Amplidude des Aktionspotentials in beiden HL-1 Gruppen. Letztlich hat Überexpression vom TRPC3-Protein weder basal noch bei akuter TRPC3-Aktivierung einen Einfluss auf das Aktionspotential von HL-1 Zellen.

Abbildung 13. Einfluss von TRPC3-Überexpression auf

Aktionspotential in HL-1 Zellen unter basaler und stimulierter Bedingung.

HL-1 Zellen wurden in Whole-Cell-Konfiguration im Current-Clamp-Modus gehalten.

Aktionspotentiale (AP) wurden mit 0.2 Hz Frequenz durch Reizpulse ausgelöst.

Gezeigt werden repräsentative APs von TRPC3-HL-1 (B) und Vektor-HL-1 Zellen (A).

Mit vor ET-1 (schwarz) gekennzeichnet sind APs im stady-state unmittelbar vor Endothelin-1 Stimulation und mit ET-1 (rot) gekennzeichnet sind APs bei akuter Stimulation mit 100 nM Endothelin-1. Schwarze Querbalken markieren das Membranpotential bei 0 mV. HL-1 Zellen wurden 5 Minuten lang mit ET-1 stimuliert.

Bedingung /

Parameter Vektor TRPC3

Vor ET-1 (basal)

Vek vs TRPC3

Basislinie (mV) -82.6 ± 1.55 -80.4 ± 1.51 NS

APD90 (ms) 145.5 ± 23.99 98.2 ± 9.59 NS

APD50 (ms) 43.7 ± 5.98 34.5 ± 2.81 NS

AAP (mV) 97.1 ± 4.65 79.2 ± 4.73 NS

ET-1 (stimuliert)

Basislinie (mV) -79.9 ± 1.42 -77.3 ± 1.84 NS APD90 (ms) 104.5 ± 17.72 86.1 ± 10.62 NS

APD50 (ms) 35.1 ± 4.65 31.6 ± 3.59 NS

AAP (mV) 79.5 ± 6.05 71.6 ± 4.32 NS

Tabelle 3. Elektrophysiologische Konsequenzen der TRPC3- Überexpression im HL-1 Zellsystem.

Werte stellen Mittelwerte ± SEM dar für 17 TRPC3- und 15 Vektor-HL-1 Zellen.

Basislinie, diastolisches Membranpotential unmittelbar vor dem Auslösen eines Aktionspotentials; APD90, Aktionspotentialdauer nach 90%ige Repolarisation; APD50, Aktionspotentialdauer nach 50%iger Repolarisation; AAP, Amplitude von Aktionspotentialen. Vor ET-1 und ET-1 entsprechen der Bezeichnung in Abb. 13. NS, nicht signifikant, TRPC3 gegen Vektor durch t-Test.

Abbildung 14. Endothelin-1-induzierte Änderungen des Aktionspotentials in HL-1 Zellen.

Zusammenfassung der Werte aus Tab. 3. Relative Änderungen wurden nach folgender Formel berechnet: (ET-1 – vor ET-1 / vor ET-1). Mit Depolarisation ist die Verschiebung des diastolischen Membranpotentials (also der Basislinie, Tab. 3) gemeint. Weitere Abkürzungen siehe Tab. 3. Daten stellen Mittelwerte ± SEM, P = NS (nicht signifikant) gegen Vektor anhand von t-Test dar.

5 Diskussion

Mit dieser Arbeit wurden erstmals die Charakteristika einer TRPC3- vermittelten Membranleitfähigkeit mittels einer „gain of function“ Strategie in kardialer Umgebung gezeigt. Der durch TRPC3 Überexpression generierte Strom im HL-1-kardialen Zellsystem zeigte einerseits die bekannte und zu erwartende I/V-Charakteristik, anderseits eine bislang noch unbekannte gesteigerte Sensitivität gegenüber einer Blockade durch Ca²⁺. Trotz dieser Hemmung durch Ca²⁺ wird die HL-1-Zellmembran in Gegenwart von Ca²⁺ TRPC3-abhängig geringfügig depolarisiert. Weiters zeigt diese Arbeit, dass die Überexpression vom TRPC3-Protein letztlich keine Auswirkungen auf die basale Erregbarkeit und auf die Aktionspotentiale von HL-1 Zellen hat.

Der TRPC3-vermittelte Strom in HL-1

Die I/V-Charakteristika des voll aktivierten TPRC3-HL-1 Stromes, gemessen in nominal-Ca²⁺-freier Extrazellulärlösung, entsprechen der den bisher publizierten elektrophysiologischen TRPC3- Charakteristika;

(Abb 9 und 10) sowie (He et al., 2005; Yuan et al., 2007) und (Hurst et al., 1998; Lichtenegger, 2010; Zitt et al., 1997). Diese Charakteristika sind:

(1) Umkehrpotential bei etwa 0 mV, (2) Gq-Protein-(DAG)-vermittelte Aktivierung, (3) ein linearer Stromverlauf der I/V-Kurve von -80 mV bis -20 mV sowie (4) Auswärtsgleichrichtung ab etwa +30 mV. All dies trifft auf dem ET-1-induzierten Strom in TRPC3-HL-1 Zellen zu. Eine basale TRPC3-Aktivität, wie es einige Autoren für TRPC3-Kanäle berichtet haben, wurde auch in den TRPC3-HL1 Zellen bei nominal-Ca²⁺-freier Bedingung festgestellt (Lintschinger et al., 2000; Zitt et al., 1997) sowie (Abb. 8C). Diese basalen Ströme zeigten allerdings keine TRPC3- Merkmale (Daten nicht gezeigt). Zusammengenommen spricht dies dafür,

dass die I/V-Charakteristika der TRPC3-vermittelten Ströme in TPRC3- HL-1 Zellen den zuvor publizierten Merkmalen für TRPC3-Ströme überexpremiert in mamalischen Zellen gleichen.

TRPC3-Ströme lassen sich unter Standard-Patch-Clamp-Bedingungen (Whole-Cell, 145 mM [Cs⁺]_i und physiologischen Ionengradienten (2 mM [Ca²⁺]_o) im TRPC3-HL-1-Überexpressionsmodel nicht charakterisieren (Abb. 3). Wogegen sich TRPC3-Ströme in anderen Überexpressionssystemen unter Standard-Patch-Clamp-Bedingungen charakterisieren lassen (Hurst et al., 1998; Lichtenegger, 2010; Zitt et al., 1997). Dabei entsprechen die TRPC3-Stromcharakteristika aus diesen zitierten Quellen durchaus der Charakteristik von TRPC3-HL-1 Zellen gemessen unter nominal-Ca²⁺-freier Bedingung. Aber die Stromcharakteristika von Endothelin-1-induzierten Strömen in TRPC3-HL- 1 Zellen unter Standard-Patch-Clamp-Bedingungen entsprechen nicht oder zumindest nur sehr bedingt der TRPC3-Stromcharakteristik (Abb.

D). Gründe dafür sind: erstens, es erfolgt keine rasche Aktivierung nach Stimulation. TRPC3-Aktivierung wird meist als schnell-eintretend und transient beschrieben (He et al., 2005; Hurst et al., 1998; Lintschinger et al., 2000). Eine klare Aktivierung war unter diesen Bedingungen nicht zu sehen, sondern nur eine stetig ansteigende Leitfähigkeit mit sehr geringer ET-1-Stromaktivierung. Zweitens, die ET-1-induzierten Ströme in TRPC3- HL-1 Zellen unterschieden sich nicht von der Vektorkontrolle. Drittens, das Nullstrompotential der ET-1-induzierten Ströme in TRPC3-HL-1 Zellen lag bei -17 mV. Viertens, die ET-1-induzierten Ströme in TRPC3- HL-1 Zellen zeigten keine Auswärtsgleichrichtung. Einschränkend muss bemerkt werden, dass unter diesen Bedingungen (Whole-Cell, 2 mM [Ca²⁺]o, 145 mM [Cs⁺]i sowie 5 mM [EGTA]i + 1 mM [Ca²⁺]i) möglicherweise keine Auswärtsgleichrichtung zu beobachten wäre.

Zusammenfassend ist die Standard-Patch-Clamp-Bedingung für die 3

TRPC3-Stromcharakterisierung im HL-1-Überexpressionmodel nicht geeignet.

Kalziumbedingte Hemmung vom TRPC3-Strom

Diese Arbeit zeigt, dass das extrazelluläre Ca²⁺ für die Blockade des TRPC3-vermittelten Stromes in TRPC3-HL-1 Zellen verantwortlich ist. In der vorliegenden Arbeit konnten TRPC3-vermittelte Ströme nur in der Perforated-Patch-Konfiguration abgeleitet werden aber nicht unter Whole- Cell-Konfiguration (Abb. 3 und 9). Der Grund dafür dürfte aller Wahrscheinlichkeit nach die Ca²⁺-vermittelte Hemmung sein, da die Whole-Cell-Patch-Clamp-Experimente in Gegenwart von 2 mM [Ca²⁺]_o durchgeführt worden sind. Auch wenn der direkte Nachweis für diese Theorie in dieser Arbeit nicht erbracht worden ist, nämlich ein Whole-Cell- Patch-Clamp-Experiment unter nominal-Ca²⁺-freier Bedingung, so zeigt sich doch eine eindeutige Beteiligung von Ca²⁺ an der TRPC3- Stromhemmung (Abb. 8). Eine weitere Evidenz dafür, ist das Scheitern der TRPC3-Stromaktivierung mit Endothelin-1 in Gegenwart von 0.8 mM [Ca²⁺]o. Sobald jedoch die TRPC3-HL-1 Zellen mit nominal-Ca²⁺-freier Lösung perfundiert worden sind, zeigte sich ein Strom mit TRPC3-I/V- Charakteristik (Abb. 10B, D und F). Bereits bei einer Ca²⁺-Readdition von 0.8 mM [Ca²⁺]_o sind die TRPC3-assozierten Aus- und Einströme essentiell gehemmt (Abb. 10A).

Weitere Evidenzen für die Ca²⁺-Empfindlichkeit von TRPC3-vermittelten Strömen in kardialer Umgebung zeigen Alvarez et al. (2008). Die Studie beschreibt, wie ATP über P2Y₂-Rezeptoren in adulten Ventrikelmyozyten der Ratte native TRPC3/C7-vermittelte Ströme aktiviert. Der ATP- induzierte Einstrom wurde bei 2 mM [Ca²⁺]o gemessen und konnte allerdings durch Senkung der Ca²⁺-konzentration auf 0.1 mM [Ca²⁺]_o auf das Zweifache gesteigert werden. Die I/V-Charakteristik des ATP-

induzierten Stromes entsprach durchaus der eines TRPC3-Stromes.

Darüber hinaus konnten die Autoren mit einem anti-TRPC3-Antikörper in der Patchpipette diesen Strom überzeugend hemmen. Einschränkend muss bemerkt werden, dass sich die Studie von Alvarez et al. aus vielen Hinsichten von der vorliegenden Arbeit unterscheidet. Diese sind:

Spezies und Gewebe, HL-1 Zellen stammen aus dem Herzvorhof der Maus ab (Claycomb et al., 1998); adulte gegenüber immortalisierten Zellen; und native TRPC-Ionenkanäle, als TRPC3/C7-Heteromultimere vorliegend, gegenüber überexpremiertem TRPC3-Protein, sehr wahrscheinlich als TRPC3-Monomere vorliegend. Trotz der Unterschiede zeigen Alvarez et al. (2008) im Prinzip die Möglichkeit eines Ca²⁺- sensitiven TRPC3-Stromes in kardialer Umgebung.

Diese Ca²⁺-Blockade ist in TRPC3-HL-1 Zellen offenbar besonders stark ausgeprägt. In einer vergleichbaren Studie im TRPC3-HEK- Überexpressionssystem (von den Autoren als HEKTrp3 bezeichnet) wurde ein mit OAG-induzierter TRPC3-vermittelter Strom bei einer Ca²⁺- Readdition von 2 mM [Ca²⁺]_o nicht vollständig gehemmt (Lintschinger et al., 2000). Wurde jedoch die HEKTrp3-Zellen kontinuierlich 2 mM [Ca²⁺]o

ausgesetzt und wurden die Zellen dann mit OAG stimuliert, so war der resultierende Einstrom etwa halb so groß wie der Einstrom unter nominal- Ca²⁺-freier Bedingung. Hingegen war in der vorliegenden Arbeit der Endothelin-1-stimulierte Einstrom in TRPC3-HL-1 Zellen so gut wie nicht vorhanden und auch der Ausstrom war fast auf das Kontrollniveau durch 2 mM [Ca²⁺]_o gehemmt (Abb. 8C). Folglich, ist die Ca²⁺-Hemmung in TRPC3-HL-1 stärker ausgeprägt als in HEKTrp3 Zellen.

Eine weitere Evidenz für die Ca²⁺-abhängige Regulierung der TRPC3- Kanalaktivität zeigen Peppiatt-Wildman et al. (2007) in ihrer Studie an isolierten Myozyten aus Koronararterien. In dieser Arbeit wurden die