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Archiv "Patch-clamp-Technik und Ionenkanäle: Bedeutung in der Medizin" (31.01.1992)

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(1)

Hans Scherübl, Jürgen Hes cheler

A

ls „Revolution für die ge- samte Zellbiologie" hat das Karolinische Institut der schwedischen Akademie der Wissenschaften in Stockholm die Arbeit der beiden deutschen Wissen- schaftler Erwin Neher (Physiker) und Bert Sakmann (Mediziner) be- zeichnet, die Anfang Dezember 1991 mit dem Nobelpreis für Medizin aus- gezeichnet wurden.

Der Preis belohnt die Entwick- lung des extrem empfindlichen Ver- fahrens der Patch-clamp-Technik (Membranfleckklemme) (1, 2), mit der sich extrem kleine elektrische Ströme (billionstel Ampere) an Ein- zelzellen nachweisen lassen (Abbil- dung 1). Es geht dabei um Ionenströ- me, die durch schleusenartige Kanä- le in den Zellmembranen fließen und dadurch den Informationsaus- tausch zwischen den Zellen herstel- len. Da der menschliche Körper aus 50 Billionen Einzelzellen besteht, bedarf es schneller und umfassender Kommunikation, um die vielfältigen und komplexen Aufgaben in dem Gesamtorganismus arbeitsteilig ab- zustimmen. Diese interzelluläre

DEUTSCHES ÄRZTEBLATT

AKTUELLE MEDIZIN

Patch-clamp-Technik und Ionenkanäle:

Bedeutung in der Medizin

Kommunikation geschieht unter an- derem mittels sogenannter Ionenka- näle. Das sind besondere, fest in die Zellmembran eingebaute Proteine, die ähnlich wie Schleusen funktio- nieren. Auf bestimmte äußere Reize (Hormone, Neurotransmitter, physi- kalische und chemische Stimuli) und/oder bei Änderung des Mem- branpotentials öffnen oder schließen sich diese Poren. So führt zum Bei- spiel der Einstrom von Natriumio- nen in Nervenzellen innerhalb von Tausendsteln von Sekunden zur Membrandepolarisation. Das dabei erzeugte elektrische Signal wird dann rasch entlang der Nervenfasern fortgeleitet. Ionenkanäle als wesent- liche Grundbausteine des interzellu- lären Informationsaustausches fin- den sich aber nicht nur in den „klas- sischen" Organsystemen der Signal- übertragung, dem Nervensystem und dem endokrinen System, sondern in allen Körperzellen. So spielen zum Beispiel Kalziumkanäle eine ent- scheidende Rolle nicht nur für die Stimulus-Sekretion-Kopplung in neuronalen und endokrinen Zellen (3, 4), sondern auch für die Stimulus- Kontraktion-Kopplung in Muskelzel- len, die Regulation von Enzymaktivi- täten und für allgemeine Wachs- tums- und Differenzierungsvorgän- ge. Bahnbrechend war die Entdek- kung, daß der molekulare Wirkme- chanismus vieler wichtiger, bereits lange verwendeter Pharmaka, wie zum Beispiel oraler Antidiabetika, Antiepileptika, Lokalanästhetika und selbstverständlich der Kalzium- kanalblocker in einem direkten Ef- Pharmakologisches Institut (Geschäftsfüh- render Direktor: Prof. Dr. med. Günter Schultz) der Freien Universität Berlin

fekt auf Ionenkanäle besteht (Tabel- le 1). Dadurch gelangten Ionenkanä- le als Angriffspunkt neu zu entwik- kelnder Pharmaka ins Blickfeld der klinischen Forschung. Trotz der Vielfalt der Ionenkanäle weisen die verschiedenen Zell- und Gewebety- pen charakteristische Ionenkanal- muster auf und bieten so die Mög- lichkeit, Pharmaka für gewebsspezi- fische Ionenkanäle zu entwickeln.

ATP-abhängige Kaliumkanäle

Besonders anschaulich sind hier- für die sogenannten ATP-abhängi- gen Kaliumkanäle (KATp), die als verschiedene Subtypen in (3-Zellen des Pankreas, Muskel- und Nerven- zellen identifiziert wurden. Diese Io- nenkanäle sind Wirkort zweier wich- tiger Klassen von Pharmaka, zum ei- nen der oralen Antidiabetika der Sulfonylharnstoffgruppe, die den Kanal schließen, und zum anderen der sogenannten Kaliumkanalöffner, wie zum Beispiel Cromokalim, Pina- cidil oder Minoxidil, die den Kanal öffnen. Die Aktivität der KATp ist ab- hängig von dem Quotienten aus ATP und ADP. Steigt zum Beispiel die Blutglukosekonzentration und da- durch der ATP/ADP-Quotient in der [3-Zelle des Pankreas, schließen sich vermehrt KATp und (in der (3-Zelle sowie in vielen anderen Zellen wird das Ruhepotential vor allem von Ka- liumkanälen bestimmt) depolarisie- ren die Zellmembran (5). Die Mem- brandepolarisation aktiviert ihrer- seits spannungsäbhängige Kalzium- kanäle und stimuliert dadurch den transmembranären Kalziumein- strom. Der resultierende Anstieg der Dt. Ärztebl. 89, Heft 5, 31. Januar 1992 (47) A1-289

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Abbildung 1 a: Patch-clamp-Technik. Die von Neher und Sakmann entwickelte Meßpi- pette in Kontakt mit einer Nervenzelle.

Durch Aufsetzen der Glasspipette und mit- tels Sog wird ein Membranfleck („patch") elektrisch abgedichtet (Widerstand im 109-Ohm-Bereich). In dieser Anordnung kann mittels eines elektronischen Rück- kopplungsverstärkers die Zelle auf be- stimmten Membranpotentialen festgehalten („clamp") und der über die Zellmembran fließende Strom gemessen werden. Im Ein- schub ist die polierte Spitze der Glassmeß- pipette stark vergrößert dargestellt (Durch- messer der Öffnung: 1,5 tausendstel Milli- meter). Foto: Max-Planck-Gesellschaft

Abbildung 1 b: Verschiedene Konfiguratio- nen: Das Schaltverhalten einzelner Ionenka- näle im abgedichteten Membranfleck (Ein- zelkanalregistrierung) kann entweder an der intakten Zelle „On-cell" oder nach Herauslö- sen des Membranflecks als „Inside-out", das heißt die Innenseite der Zellmembran ist nach „außen", also der Badlösung zuge- wandt, oder als „Outside-out", das heißt die Zellmembran hat sich umgestülpt (Außen- seite der Zellmembran ist außen), gemes- sen werden. Mit Hilfe der verschiedenen Konfigurationen können Substanzen sowohl an der Innen- als auch Außenseite des Io- nenkanals appliziert und die Wirkungen ex- trazellulärer („first messengers") und intra- zellulärer Signale („second messengers") auf Ionenströme untersucht werden. Um den Ionenstrom über die gesamte Zellmem- bran zu messen, wird in der sogenannten Ganz-Zell-Konfiguration („Whole-cell") der Membranfleck unter der Glasspipette durchgerissen und somit der elektrische Zu- gang zum Zellinneren hergestellt.

freien intrazellulären Kalziumkon- zentration aktiviert schließlich die Insulinsekretion (Abbildung 2). Der gleiche Mechanismus liegt der die Insulinsekretion-stimulierenden Wirkung der Sulfonylharnstoffe Tol- butamid und Glibenclamid (KATp- Blocker) zugrunde. Umgekehrt be- wirkt Diazoxid, ein „Offner" von

KATp, eine Hyperpolarisation und ei- ne Hemmung der Insulinsekretion;

Diazoxid wird deshalb präoperativ oder bei inoperablen Insulinompa- tienten eingesetzt.

ATP-abhängige Kaliumkanäle finden sich zudem in Herz- sowie in

glatten Muskelzellen; sie werden ebenfalls durch antidiabetische Sul- fonylharnstoffe (in hohen Konzen- trationen) gehemmt (6). ATP-Man- gel, wie er zum Beispiel bei einer Myokardischämie auftritt, aktiviert die Kanäle (ST-Strecken-Senkung) und führt zu einer Verkürzung der Aktionspotentialdauer, die einer- seits einer Kalziumüberladung vor- beugt, andererseits aber für Isch- ämie-bedingte Fibrillationen verant- wortlich sein könnte. Analog dem ATP-Mangel verkürzen Kaliumka- nalöffner ebenfalls die Aktionspo- tentiale, sie scheinen im Falle der

Ischämie aber kardioprotektiv zu wirken. KATp werden auch durch endogene Transmitter und Hormone reguliert. Der Wirkmechanismus ei- nes der potentesten endogenen Va- sodilatoren, des Neurotransmitters CGRP (calcitonin-gene related pep- tide), besteht in der Aktivierung ATP-abhängiger Kaliumkanäle in der glatten Muskulatur der Gefäße (Abbildung 3). Die CGRP-induzierte Hyperpolarisation vermindert den Kalziumeinstrom durch spannungs- abhängige Kalziumkanäle, relaxiert die Gefäßmuskulatur und senkt so den Blutdruck (7). Die Wirkung von A1-290 (48) Dt. Ärztebl. 89, Heft 5, 31. Januar 1992

(3)

Tabelle: Beispiele für die pharmakologische Beeinflussung von Ionenkanälen

Haupt- wirkort Nerv Niere Herz

Stoffgruppe (Blocker/Offner) Lokalanästhetika Diuretika

Antiarrhythmika

Vertreter

Lidocain (Xylocain®) Amilorid

(in Moduretik®) Chinidin

(Optochinidin®) Kanaltyp

Natrium- kanal

B B B

Vasodilatoren Antiarrhythmika Antiepileptika

Nifedipin (Adalat®) Verapamil (Isoptin®) Phenytoin

(Zentropil®) Kalzium-

kanal

Gefäß Herz ZNS

B B B (3-Zelle

Gefäß Herz

Antidiabetika Vasodilatoren Antiarrhythmika

Glibenclamid (Euglucon®) Diazoxid

(Hypertonalum®) Amiodaron (CordarexR Kalium-

kanal

B O B Chlorid-

kanal

Antiepileptika Diazepam (Valium®) Phenobarbital (Luminal®)

ZNS 0

0

Repolarisation 00

0 0 00 Insulinsekretion +

K+

Glibenclamid K+ Ca 2+

Depolarisation 0

[Ca r., t ± Glukose Metabolismus [ TP] A

41

CGRP wird von Kaliumkanalöffnern mit hoher Spezifität für Gefäßmus- kelzellen imitiert; die entsprechen- den Präparate befinden sich bereits in klinischer Erprobung als Antihy- pertensiva und Vasodilatoren.

Kalziumkanal

-

Blocker

Seit langem werden Kalziumka- nal-Blocker, meist kurz als Kalzium- antagonisten bezeichnet (8), für die Therapie der koronaren Herzkrank- heit, des arteriellen Hypertonus, von Herzrhythmusstörungen und von zerebralen Durchblutungsstörungen eingesetzt. Kalziumantagonisten, zum Beispiel Nifedipin, relaxieren die vaskulären Myozyten, indem sie direkt den Kalziumeinstrom durch spannungsabhängige Kalziumkanäle hemmen und so die „Kalziumbela- dung" der glatten Muskelzelle min- dern. Als Folge der Kalziumantago- nistentherapie sinkt der periphere Gefäßwiderstand, und die Koronar- gefäße dilatieren. Über die Blockade des Kalziumeinstroms bewirken Kal- ziumantagonisten zudem eine Re- duktion der Schrittmacherfunktion im Vorhof und eine Verlangsamung der atrioventrikulären Überleitung.

Diese Wirkung ist besonders ausge- prägt bei Diltiazem und Verapamil.

funktionen von Ionenkanälen an ei- ner Vielzahl von Krankheiten, zum Beispiel Diabetes mellitus, arteriel- ler Hypertonie, Arrhythmien, Epi- lepsie und Myasthenia gravis, betei- ligt sind. Vermutlich wirken sich aber die meisten der angeborenen

Defekte bereits in utero letal aus.

Als Beispiele für Krankheiten, deren Pathogenese mittels der Patch- clamp-Technik geklärt werden konn- te, möchten wir die zystische Fibrose (Mukoviszidose) und das Lambert- Eaton-Myasthenie-Syndrom anfüh- Ionenkanäle in

der Pathogenese von

Krankheiten

Die zentrale Bedeutung der Io- nenkanäle in der Physiologie und Pharmakologie spiegelt sich auch in der Pathophysiologie wider. Es wird vermutet, daß Über- oder Unter- Abbildung 2: ß-Zelle des Pankreas: Konzer- tiertes Schalten von Ionenkanälen reguliert die Insulinsekretion. Ein Anstieg der Gluko- sekonzentration im Blut führt zu einer Erhö- hung der intrazellulären ATP-Konzentration.

Hohes ATP schließt die ATP-abhängigen Kaliumkanäle [1]. Dadurch depolarisiert die Zellmembran, und Kalzium strömt durch spannungsabhängige Kalziumkanäle ein [2]. Der Anstieg der freien intrazellulären Kalziumkonzentration stimuliert schließlich die Insulinsekretion. Zugleich werden Kalzi- um-abhängige Kaliumströme aktiviert, die die Zelle wieder repolarisieren [3].

A1 -292 (50) Dt. Ärztebl. 89, Heft 5, 31. Januar 1992

(4)

Spannungsabhängiger Kalziumkanal

offen Y

Geschlossen > eteiVeMMeie eNieit-40 mV

2 pA 20 ms ATP-abhängiger Kaliumkanal

4 3 2 1 G

CGRP

1

5 pA

1 min Kanal 1 >

Geschlossen Kanal 1 >

Kanal 2 >

mr

, -20 mV

ren. Die zystische Fibrose ist eine multisystemische Erkrankung here- ditären Ursprungs, die durch eine gestörte Funktion exokriner Drüsen charakterisiert ist. Als Ursache des gestörten Elektrolyt- und Wasser- transports konnte ein Defekt in der Regulation cAMP-abhängiger Chlo- ridkanäle nachgewiesen werden (9).

Klinisch stehen die bronchopulmo- nalen und gastrointestinalen Manife- stationen dieses genetisch bedingten Ionenkanaldefektes im Vorder- grund. Das Lambert-Eaton-My- asthenie-Syndrom ist dagegen eine erworbene Autoimmunkrankheit.

Die nachgewiesenen Autoantikörper hemmen die Funktion spannungsab- hängiger Kalziumkanäle an den mo- torischen Nervenendplatten und da- durch die Acetylcholinfreisetzung (10). Klinisch imponieren vor allem die proximale Muskelschwäche, ab- geschwächte Reflexe, trockener Mund und Obstipation.

Obwohl die Patch-clamp-Tech- nik in den medizinischen Grundla- genwissenschaften und der Arznei- mittelforschung breit angewandt wird, nehmen sich die Ansätze, sie auch für die klinische Diagnostik zu nutzen, noch bescheiden aus. Wäh- rend in den Grundlagenwissenschaf- ten in Deutschland rund 50 Arbeits- gruppen mit der Patch-clamp-Tech- nik arbeiten, sind es in der Klinik

erst einige wenige. Dies ist überra- schend angesichts der Vielzahl an klinischen Fragestellungen zu Stö- rungen der Ionenkanäle und der Si- gnalübertragung an zum Beispiel Muskel-, Nieren-, Nerven-, Epithel-, Blut-, Knochen- und endokrinen Zellen. Erfreulicherweise wurde aber vor kurzem begonnen, Untersu- chungen an isolierten Muskelzellen von Myopathiepatienten vorzuneh- men. Interessant erscheint auch die Möglichkeit der Antiarrhythmikate- stung an isolierten Kardiomyozyten bei Patienten mit hochgradigen Rhythmusstörungen.

So könnte die von Erwin Neher und Bert Sakmann entwickelte Patch-clamp-Technik ähnlich der Zellbiologie die Entwicklung in vie- len Bereichen der klinischen Medi- zin wenn nicht revolutionieren, so doch ihr neue Impulse geben; die Zusammenarbeit von Klinikern und medizinischen Grundlagenwissen- schaftlern wird für eine erfolgreiche Anwendung der Technik unabding- bar sein.

Literatur

1. Hamill, 0.P.; Marty, A.; Neher, E.; Sak- mann, B.; Sigworth, F. J.: Improved patch- clamp techniques for high-resolution cur- rent recording from cells and cell-free mem- brane patches. Pflügers Arch. 391 (1981) 85 2. Sakmann B.; Neher, E.: Single-channel re-

cording. Plenum Press, New York (1983)

Abbildung 3: Regulation des Myotonus von Gefäßmuskelzellen. Der Kalziumeinstrom und damit der Myotonus glatter Muskelzel- len ist abhängig vom Membranpotential. Im oberen Teil sind Öffnungen einzelner Kalzi- umkanäle, wie sie im „On cell" isolierten Membranfleck abgeleitet werden können, dargestellt (Kalziumströme als Einwärtsströ- me öffnen konventionsgemäß nach unten).

Während bei dem Potential von —40 mV der Kalziumkanal überwiegend geschlossen ist, kommt es bei —20 mV zu einem regen Öff- nen von (mindestens 2) Kalziumkanälen (so- genannte Spannungsabhängigkeit der Of- fenwahrscheinlichkeit) und somit zu einem gesteigerten Kalziumeinstrom. Die stimulie- rende Wirkung des potenten vasorelaxieren- den Neurotransmitters CGRP (calcitonin gene related peptide, 5 nM) auf ATP-abhän- gige Kaliumkanäle (in glatten Muskelzellen der A. mesenterica superior) ist im unteren Teil der Abbildung zu sehen. Öffnungen der (mindestens 4) Kaliumkanäle sind nach oben dargestellt. Die resultierende Mem- branhyperpolarisation führt zur Gefäßdilata- tion.

3. Schultz, G.; Rosenthal, W.; Hescheler, J.;

Trautwein, W.: Role of G proteins in calci- um channel modulation. Annu. Rev. Physi- ol. 52 (1990) 275

4. Scherübl, H.; Schultz, G.; Hescheler, J.: A slowly inactivating calcium current works as calcium sensor in calcitonin-secreting cells.

FEBS Letters 273 (1990) 51

5. Trube, G.; Rorsman, P.; Ohno-Shosaku, T.:

Opposite effects of tolbutamide and diazoxi- de an the ATP-dependent K+ channel in mouse pancreatic B-cells. Pflügers Arch.

407 (1986) 493

6. Belles, B.; Hescheler, J.; Trube, G.: Chan- ges of membrans currents in cardiac cells in- duced by long whole-cell recordings and to tolbutamide. Pflügers Arch. 409 (1987) 582 7. Nelson, M. T., Huang, Y., Brayden, J. E., Hescheler, J., Standen, N. B.: Arterial dila- tions in response to calcitonin gene-related peptide involve activation of K+ channels.

Nature 344 (1990) 770

8. Fleckenstein, A.: Calcium antagonism in heart and smooth muscic, John Wiley &

Sons, New York (1983)

9. Chan, J. H., Schulman, H,. Gardner, P.: A cAMP-regulated chloride channel in lym- phocytes that is affected in cystic fibrosis.

Science 243 (1989) 657

10. Sher, E., Biancardi, E., Passafaro, M., Cle- menti, F.: Physiopathology of neuronal vol- tage-operated calcium channels. FASEB J.

5 (1991) 2677

Anschrift für die Verfasser:

Dr. med. Hans Scherübl Pharmakologisches Institut Freie Universität Berlin Thielallee 69-73 W-1000 Berlin 33

Dt. Ärztebl. 89, Heft 5, 31. Januar 1992 (53) A1-293

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