Die Ausprägung von Tinnitus und Hörverlust in mongolischen Wüstenrennmäusen in circadianer Abhängigkeit des Schalltraumas
Aus der
Klinik für Hals-, Nasen- und Ohrenheilkunde - Kopf- und Halschirurgie Erlangen Direktor: Prof. Dr. med. Dr. h. c. Heinrich Iro
Der Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg zur
Erlangung des Doktorgrades Dr. med. dent.
vorgelegt von Jannik Klaus Grimm
aus Nördlingen
Als Dissertation genehmigt von der Medizinischen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Tag der mündlichen Prüfung: 22.06.2021
Vorsitzender des Promotionsorgans: Prof. Dr. med. Markus Neurath Gutachter/in: Prof. Dr. Holger Schulze
Prof. Dr. Dr. Ulrich Hoppe
Meinen Eltern in Liebe und Dankbarkeit
gewidmet
Inhaltsverzeichnis
1 Abstract/Zusammenfassung ... 1
2 Einleitung ... 5
2.1 Tinnitus ... 5
2.2 Der circadiane Rhythmus ... 7
2.3 Akustisch evozierte Hirnstammpotentiale ... 8
2.4 Die akustische Schreckreaktion ... 8
2.5 Fragestellung ...10
3 Material und Methoden ...11
3.1 Versuchstiere ...11
3.2 Narkose ...11
3.3 Schreckreaktionsmessung ...12
3.4 Hirnstammaudiometrie ...13
3.5 Akustisches Trauma ...15
3.6 Zeitlicher Versuchsablauf ...16
3.7 Statistische Analyse ...18
4 Ergebnisse ...19
4.1 Untersuchung des Hörverlustes ...19
4.1.1 Vergleich des maximalen und minimalen Hörverlust beider Ohren durch eine zweifaktorielle ANOVA mit den Faktoren Frequenz und Zeitpunkt des Traumas ...19
4.1.1.1 Maximaler Hörverlust über beide Ohren ...19
4.1.1.2 Minimaler Hörverlust über beide Ohren ...21
4.1.1.3 Mittlerer Hörverlust über beide Ohren ...23
4.2 Untersuchung des Verhaltens in Abhängigkeit des Traumazeitpunkts ...25
4.2.1 Untersuchung der Effektstärke durch eine zweifaktorielle ANOVA (Zeitpunkt/Gruppe und Frequenz) ...25
4.2.2 Effektstärke in absoluten Zahlen ...26
4.3 Korrelation zwischen Hörverlust und Verhalten ...27
4.3.1 Korrelation zwischen der individuellen Effektstärke und dem individuellen mittlerem Hörverlust beider Ohren der verschiedenen Gruppen ...27
4.3.1 Korrelation zwischen der individuellen Effektstärke und dem individuellen minimalen und maximalen Hörverlust beider Ohren der verschiedenen Gruppen...29
5 Diskussion ...31
5.1 Interpretation der Ergebnisse ...32
5.2 Hormoneller Einfluss auf die circadiane Rhythmik ...35
5.2.1 Einfluss des Cortisolspiegels auf die akustische Schreckreaktion ...35
5.2.2 Einfluss des Cortisolspiegels auf den Hörverlust ...37
5.3 Mortalität der Versuchstiere beim Nachttrauma ...38
5.4 Ausblick ...39
6 Literaturverzeichnis ...40
7 Tabellenverzeichnis ...45
7.1 Versuchstiere ...45
7.2 Narkose ...45
7.3 Traumasetup ...45
7.4 Schreckreaktionsmessung ...46
7.5 Hirnstammaudiometrie ...46
7.6 Statistische Auswertung ...46
8 Anhang ...47
8.1 Cortisolmessung im Urin von mongolischen Wüstenrennmäusen ...47
9 Danksagung ...48
10 Lebenslauf ...49
1
1 Abstract/Zusammenfassung
Summary
Background and objectives
Tinnitus and hearing loss are highly prevalent in modern society. The pathological noise of tinnitus is a substantial burden for patients which can lead to depression and even suicide.
Currently, the mechanisms causing tinnitus are controversially discussed: The model of stochastic resonance hypothesizes that tinnitus is a byproduct of continuous optimization of the threshold of hearing after acoustic trauma. Such traumatic events are common causes of tinnitus and hearing loss. Mouse experiments have shown different degrees of hearing loss and tinnitus percept depending on the time of day of the acoustic trauma. As mice are nocturnal animals and have optimal hearing frequencies distinct from humans, they do not represent an ideal experimental model. Therefore, recent studies used Mongolian gerbils which are intermittently diurnal and possess hearing frequencies more similar to humans to achieve a higher degree of comparability. The aim of this study is to investigate the degree of hearing loss and tinnitus in circadian dependence of acoustic trauma in Mongolian gerbils.
Method
A total of 34 male Mongolian gerbils were separated into four groups. First, all animals underwent auditory brainstem response (ABR) audiometry to assess their hearing threshold at baseline. Moreover, behavioral signs of tinnitus percept were detected by measuring the pre-pulse inhibition of the acoustic startle response in a gap-noise paradigm before trauma.
Several days later, the animals were subjected to mild acoustic trauma (115dB SPL for 75minutes) at a specific time of day depending on the respective group (9am, 1pm, 5pm, 0am).
ABR was performed on day 5 post-trauma and acoustic startle reflex measurement was performed day 7 post-trauma at the same time of day as the baseline measurements. The differences between pre- and post-trauma measurements were used to assess the degree of hearing loss and tinnitus.
Results
There were no significant differences in acoustic startle reflex amplitudes and hearing loss between the different groups. However, when correlating tinnitus percept and hearing loss there was a significant effect in the evening and night group: The smaller the degree of hearing loss, the larger was the observed tinnitus percept. Furthermore, the night group had a significantly higher mortality rate than the other groups.
2 Conclusion
The time of day of acoustic trauma has no significant effect on the degree of tinnitus and hearing loss in Mongolian gerbils. Interestingly, we found that lower levels of hearing loss were associated with higher degrees of tinnitus percept in the evening and night group when correlating the two variables. This is in line with the hypothesis of stochastic resonance. An explanation for this observation is the increased level of activity and the resulting increase in cortisol levels in gerbils in the evening and nighttime. The elevated cortisol levels seem to additionally lead to a higher mortality rate in animals that were subjected to acoustic trauma at night.
3 Hintergrund und Ziele
Hörverlust und Tinnitus sind in unserer heutigen Gesellschaft eine Volkskrankheit. Das Ohrgeräusch kann bei den Betroffenen einen hohen Leidensdruck, der in Depression oder Suizid enden kann, auslösen. Der Mechanismus der Tinnitusentstehung wird aktuell kontrovers diskutiert: so gibt beispielsweise das Modell der Tinnitusentstehung durch die stochastische Resonanz eine Hypothese wieder, bei der sich das Ohrgeräusch als ein Nebenprodukt der ständigen Optimierung der Hörschwelle nach einem Schalltrauma darstellt.
Ein schalltraumatisches Ereignis gilt als eine häufige Ursache für Tinnitus und Hörverlust. Bei Hausmäusen zeigen sich hierbei unterschiedliche Ausprägungen von Hörverlust und Tinnitusperzept in Abhängigkeit der Tageszeit des traumatischen Ereignisses. Da sich Mäuse aufgrund ihres nachtaktiven Verhaltensmusters und ihres Hörsinnes, dessen Optimum in anderen Frequenzbereichen als beim Menschen liegt, nur als bedingt geeignete Versuchstiere darstellen, wurde die phasenweise auch tagaktive Mongolische Wüstenrennmaus, die zudem noch in ähnlichen Frequenzbreiten wie der Mensch hört, als Versuchstier der Wahl herangezogen, um eine Vergleichbarkeit zum Menschen zu erreichen.
In dieser Arbeit wird die Ausprägung von Hörverlust und Tinnitus in circadianer Abhängigkeit des Schalltraumas bei mongolischen Wüstenrennmäusen untersucht.
Methoden
Dazu wurden insgesamt 34 männliche mongolische Wüstenrennmäuse in vier Gruppen unterteilt. Zunächst wurden eine Hirnstammaudiometrie (ABR), zur Bestimmung der Hörschwellen, und eine Schreckreaktionsmessung, die der Tinnitusdiagnostik dient, durchgeführt. Wenige Tage später wurden die Tiere durch ein mildes Schalltrauma (115 Dezibel [dB] Schalldruckpegel/Sound pressure level [SPL] für 75 Minuten) zu einem je nach Gruppe fest definiertem Zeitpunkt (morgens 9 Uhr, mittags 13 Uhr, abends 17 Uhr, nachts 0 Uhr) vertäubt. Fünf Tage posttraumatisch wurde eine Hirnstammaudiometrie und sieben Tage posttraumatisch eine Schreckreaktionsmessung zu den gleichen Tageszeiten wie prätraumatisch durchgeführt. Durch die Differenz der Ergebnisse vor und nach dem Schalltrauma konnte der Hörverlust und die Tinnitusausprägung der Tiere ermittelt werden.
Ergebnisse und Beobachtungen
Sowohl in den Amplituden der Schreckreaktionsmessung und im Hörverlust zeigt sich kein signifikanter Unterschied zwischen den einzelnen Gruppen. In der Korrelation von Effektstärke der Schreckreaktionsmessung und Hörverlust zeigt sich ein signifikanter Effekt in Abend- und Nachtgruppe: Je geringer der Hörverlust in diesen Gruppen wird, desto größer zeigt sich die Tinnitusausprägung.
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Außerdem zeigt sich in der Nachtgruppe eine höhere Mortalitätsrate als in den anderen Gruppen.
Schlussfolgerungen
Die Tageszeit eines Schalltraumas hat bei mongolischen Wüstenrennmäusen keinen signifikanten Einfluss auf die resultierende Tinnitusausprägung und den Hörverlust. In der Korrelation der beiden Variablen zeigt sich in der Abend- und Nachtgruppe ein Effekt, der mit der Tinnitushypothese der stochastischen Resonanz, bei der ein geringerer Hörschwellenverlust mit einer erhöhten Tinnitusausprägung einhergeht, vereinbar ist. Ein Erklärungsansatz dafür ist das höhere Aktivitätsprofil und der daraus resultierende höhere Cortisolspiegel der Versuchstiere zu diesen Tageszeitpunkten. Außerdem scheint ein höherer Cortisolspiegel zu einer erhöhten Mortalitätsrate unter den Versuchstieren zu führen.
5
2 Einleitung
2.1 Tinnitus
Das Wort Tinnitus kommt vom lateinischen Verb ‚tinnire‘, was so viel bedeutet wie klingeln oder klimpern. Das beschreibt das Krankheitsbild des Ohrgeräusches ohne externe akustische Quelle ganz treffend: ein Rauschen oder Pfeifen.
Tinnitus als Volkskrankheit zu betiteln, belegt die Studienlage sehr deutlich. Einer Studie aus England zufolge beträgt die Prävalenz 10,1% der Erwachsenen, außerdem zeigen sich keine Unterschiede aufgrund des Geschlechts (1). Auch andere Studien zeigen ähnliche Prävalenzen (2-4) für die erwachsene Bevölkerung. Eine systematische Analyse aller Studien im Zeitraum von 1980-2015 zeigt eine Prävalenz von 5,1-42,7%, die mit zunehmendem Alter der Patienten ansteigt (5). Die Inzidenz beträgt jährlich in Deutschland ca. 270.000 Neuerkrankte (6).
Das störende Phantomgeräusch kann erheblichen Leidensdruck auf die Betroffenen ausüben, der sich in Angstzuständen, Schlaflosigkeit und Depression manifestieren kann. In Extremfällen kann Tinnitus die Erkrankten bis in den Suizid führen (7-9). Auch ein wirtschaftlicher Schaden, der durch die Krankheit entsteht, ist nicht von der Hand zu weisen:
eine erhöhte Anzahl an Krankheitstagen (8) und berechneten volkswirtschaftlichen Schaden von 6,8 Mrd. € allein in den Niederlanden sprechen für sich (10). Hochrechnungen auf die Bundesrepublik Deutschland gehen sogar von Kosten bis zu ca. 32,8 Mrd. € aus (11).
Da die neurophysiologischen Mechanismen, die die Entstehung und Ursache des Tinnitus erklären noch kontrovers diskutiert werden (12), gibt es derzeit kein erfolgversprechendes Behandlungsverfahren zur Heilung des chronischen Tinnitus (13).
Im Folgenden werden kurz verschiedene Modelle der Tinnitusentstehung dargestellt, die auf das primäre Auftreten maladaptiver neuronaler Aktivität im Hörsystem zurückzuführen sind.
Das Modell der veränderten lateralen Inhibition ist auf das Prinzip der Hemmung der benachbarten Neurone im Hörsystem zurückzuführen. Je aktiver ein Neuron selbst ist, desto stärker hemmt es die benachbarten Neurone. Liegt jedoch ein Hörschaden (beispielsweise durch ein Schalltrauma) auf einer bestimmten Frequenz der Cochlea vor, entsteht ein Ungleichgewicht des Inputs des auditorischen Systems. Durch den pathologisch verminderten Input auf einer geschädigten Frequenz, würden die benachbarten Neurone nicht mehr inhibiert werden, wodurch deren Aktivität indirekt gesteigert wird. Diese Disinhibition würde für eine erhöhte Spontanaktivität sorgen, die als Tinnitus wahrgenommen werden wird. Das Problem
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hierbei ist, dass durch die laterale Inhibition zwei benachbarte Frequenzen der geschädigten Frequenz enthemmt werden. Hierdurch müsste das Tinnitusperzept aus zwei Tönen (oberhalb und unterhalb der geschädigten Frequenz) bestehen, was sich allerdings mit den klinischen Befunden nicht deckt (14).
Ein weiteres Modell ist die homöostatische Plastizität, deren Prinzip auf adaptive Mechanismen der Erregbarkeitsschwelle der Neurone zurückzuführen ist. Nach einer Schädigung der Cochlea ist (wie bei der lateralen Inhibition) der Input einer Frequenz vermindert. Dadurch kommen über einen längeren Zeitraum weniger Reize in das Hörsystem.
Als Reaktion auf den verminderten Input würden sich die Neurone durch einen Verstärkungsfaktor anpassen, wodurch ihre Erregbarkeitsschwelle vermindert werden würde.
Hierdurch würde die mittlere Aktivität wieder so hoch wie vor dem Hörverlust werden.
Allerdings wäre die Spontanaktivität durch den neuronalen Verstärkungsfaktor erhöht, was das Tinnitusperzept auf dem Frequenzband der Schädigung darstellt. Eine Anpassung der Neurone und die Verringerung der Erregbarkeitsschwelle benötigt allerdings einen langen Zeitraum, weshalb dieses Modell keine Erklärung für einen Tinnitus unmittelbar nach einem Schallereignis liefern kann (15).
Auch das Modell der Tinnitusentstehung durch die stochastische Resonanz beruht auf der initialen Schädigung der Cochlea, wodurch ein ungleicher Input ins auditorische System besteht. Die reduzierte Eingangsaktivität würde dann nicht mehr ausreichen, um auf der Ebene der zweiten Synapse der Hörbahn im Nucleus cochlearis dorsalis (DCN) eine überschwellige Erregung zu erreichen. In dieser Station würde dann Rauschen beigemischt werden, um schwache Signale soweit zu verstärken, um eine überschwellige Erregung der Neurone zu gewährleisten. Die Quelle des Rauschens, das in den DCN projiziert, wird im somatosensorischen System vermutet, da hier eine ständige Aktivität vorherrscht (16, 17). Das Rauschen führt zu neuronaler Überaktivität, die das Tinnitusperzept darstellt.
Tinnitus ist im Modell der stochastischen Resonanz keine Maladaptation, sondern ein Nebenprodukt der ständigen Optimierung des Hörsystems. Nach einer Schädigung kann die stochastische Resonanz den Hörverlust durch das Beimischen des Rauschens teilweise ausgleichen. Auch weitere Daten zeigen, dass Patienten mit Tinnitus bessere Hörschwellen im Sprachbereich aufweisen als Patienten ohne Tinnitus (2).
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2.2 Der circadiane Rhythmus
Der Begriff circadianer Rhythmus wird abgeleitet aus dem lateinischen von „circa diem“ was so viel bedeutet wie „ungefähr ein Tag“. Der Zweck dieses Rhythmus ist die zeitliche Regulation verschiedenster Verhaltens- und Körperfunktionen, wie unter anderem der Schlaf/Wach-Zyklus, der Metabolismus, die Immunantwort, der Blutdruck und die Hormonausschüttung (18, 19). Unser Tagesablauf wird von sogenannten Zeitgebern wie beispielsweise dem Hell/Dunkel-Zyklus, der Nahrungsaufnahme oder der Temperatur beeinflusst und immer wieder neu angepasst. Ohne Zeitgeber stellt sich der natürliche Rhythmus auf ca. 24 Stunden ein (20). Diese Zeitgeber werden von genetisch festgelegten Mechanismen gesteuert, was erstmalig in der Fruchtfliege Drosophila melangoster nachgewiesen werden konnte (21). In Säugern wird der zelluläre Prozess über autoregulatorische transkriptionelle und translationale Rückkopplungsschleifen (feedback loops) geregelt (22-24). An der Spitze des circadianen Rhythmus steht der Suprachiasmatische Nucleus im Hypothalamus, was durch systematische Läsionen an Ratten schon 1972 festgestellt werden konnte (25). Dieser bekommt über retinohypothalamatische Fasern direkten Input aus dem Auge, die von dort aus in andere Teile des Gehirns wie den Hippocampus (26) und in die Peripherie wie die Leber, Muskeln oder die Nebenniere geleitet werden (27). Neben Licht kann auch ein auditorischer Stimulus Einfluss auf den circadianen Rhythmus ausüben, wodurch beispielsweise die Melatoninproduktion oder die Körpertemperatur Phasenverschoben zum normalen Rhythmus sein kann (28). Zudem spielt der Nucleus inferior der Vierhügelplatte durch Expression von mRNA und verschiedenen Proteinen eine tragende Rolle als circadianer Taktgeber im auditorischen System (29).
Gleichzeitig hat der circadiane Rhythmus auch Einfluss auf das Gehör und damit verbundene Reflexantworten. So zeigen sich im Tagesverlauf unterschiedliche Antworten auf die akustische Schreckreaktion bei Nagern.
Bei Mäusen (Mus musculus) stellt sich die Amplitude der akustischen Schreckreaktion tagsüber größer als nachts dar (30). Bei Ratten (Rattus norvegicus) ist dieser Effekt umgekehrt (31). Außerdem verändert sich die Hörschwelle bei Mäusen je nach Zeitpunkt des Schalltraumas unterschiedlich. Zwei Wochen nach dem Schalltrauma erholt sich die Hörschwelle der Gruppe, die das Trauma am Tag erhalten hat, auf ein Niveau vor dem Trauma. Die Tiere, die das Trauma nachts erhalten haben, entwickeln, besonders bei höheren Frequenzen, eine permanente Hörschwellenverschiebung (30). Zudem zeigen Taktgeber des circadianen Rhythmus in Cochlea und im Colliculus inferior der Vierhügelplatte verschiedene Antworten auf Schalltraumata zu unterschiedlichen Tageszeiten (32).
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Der Mensch selbst zeigt aufgrund seiner Tagaktivität ein ähnliches Verhalten wie die Maus, nur um ca. 12 Stunden phasenverschoben (33).
2.3 Akustisch evozierte Hirnstammpotentiale
Um Hörschwellen objektiv ermitteln zu können, greift man auf akustisch evozierte Hirnstammpotentiale zurück. Bei der sogenannten Hirnstammaudiometrie (ABR = auditory brainstem response) werden dem Testobjekt Töne in festgelegten Frequenzen und Schalldruckpegeln präsentiert. Das darauffolgende Antwortpotential wird mittels einer Elektroenzephalographie (EEG) abgeleitet und die Werte aufsummiert. Die Ableitungselektroden befinden sich hierbei am Mastoid und am Scheitel des Gesichtsschädels. Eine weitere Elektrode befindet sich als Referenzelektrode im Nacken oder beim Tier am Schwanz.
Die akustischen Reize werden kurz hintereinander abgespielt und mehrmals wiederholt. Die Ergebnisse werden aufsummiert und gemittelt, wodurch man die eigentliche Antwort des Hirnstamms auf die Stimuli erhält. Die frühen Hirnstammpotentiale (0-10 ms nach Stimulus) bestehen aus fünf Wellen, die einem bestimmten Punkt in der Hörbahn zugeordnet werden können. Hierbei handelt es sich in chronologischer Abfolge um den peripheren Teil des Nucleus cochlearis, den Nucleus cochlearis dorsalis, den Nucleus olivaris inferior, den Lemniscus lateralis und die Colliculi inferiores (34). Diese frühen Hirnstammpotentiale werden zudem auch im Neugeborenenhörscreening mit Erfolg eingesetzt (35).
2.4 Die akustische Schreckreaktion
Die akustische Schreckreaktion basiert auf der physiologischen Verhaltensreaktion des Zusammenzuckens auf ein plötzliches und unerwartetes Schallereignis. Dabei wird dem Versuchsobjekt ein Schreckreiz, in unserem Fall ein unerwartet lauter Ton, präsentiert, woraufhin das Tier zusammenzuckt. Diese Reaktion wird über einen Piezoforcesensor aufgezeichnet.
Einen weiteren Effekt stellt in diesem Zusammenhang die Präpulsinhibition (PPI) dar (36).
Dabei wird dem Tier 50 ms vor dem Schreckstimulus ein Präpuls in Form von Stille präsentiert, der das Zusammenzucken als Folge des Schreckstimulus vermindern kann. Der Grund hierfür ist, dass sich das Gehirn durch den Präpuls auf weitere Reize einstellt. Im Versuch wird hierbei dem Tier ein kontinuierliches weißes Rauschen (60 dB SPL) präsentiert, wobei ein
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Schreckstimulus eintritt. Wird nun in das Rauschen ein Präpuls in Form von 50 ms Stille genau 50 ms vor dem Schreckstimulus dargeboten (Abb. A), wird die Schreckreaktion vermindert (Präpulsinhibition).
Die Präpulsinhibition wird als Werkzeug verwendet, um einen Tinnitus im Tiermodell nachzuweisen. Hat das Tier einen Tinnitus aufgrund eines Schalltraumas entwickelt, füllt dieser den Präpuls auf und das Tier kann die Stille vor dem Schreckstimulus nicht mehr so gut wahrnehmen. Durch den Tinnitus findet somit die Präpulsinhibition im Vergleich zu Tieren ohne Tinnitus verringert statt. Die genaue Frequenz des Tinnitus lässt sich durch die Varianz des Hintergrundrauschens und den Vergleich der PPI vor und nach dem Tinnitus auslösenden Ereignis festlegen (37).
Abbildung A - Schematische Darstellung des Prinzips der Präpulsinhibition
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2.5 Fragestellung
Ziel dieser Arbeit ist die Untersuchung der Ausprägung von Tinnitus und Hörverlust in circadianer Abhängigkeit des Schalltraumas. Dabei wurden in verschiedenen Studien bei Nagern Effekte auf den Hörsinn in circardianer Abhängigkeit beobachtet (30-32).
Eine Problematik hierbei ist, dass Ratten wie auch Mäuse nachtaktiv sind. Deshalb ist es sinnvoll, um möglichst übertragbare Ergebnisse auf den Menschen zu erhalten, ein Tiermodell zu nutzen, dass ebenfalls tagaktive Phasen zeigt und gleichzeitig im ähnlichen Frequenzbereich optimal hört. Aus diesen Gründen ist die mongolische Wüstenrennmaus (Meriones unguiculatus) eine geeignete Wahl (38).
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3 Material und Methoden
3.1 Versuchstiere
Bei den Versuchstieren handelte es sich um männliche mongolische Wüstenrennmäuse
„Gerbils“ (Meriones unguiculatus). Diese wurden in Standardkäfigen (Bio A.S. Vent light, Ehret Labor- und Pharmatechnik, Emmendingen, Deutschland) in Gruppen von einer bis zu vier Mäusen gehalten, wobei die Tiere bei einer Temperatur von 20-24° Celsius und unter einem 12/12 Stunden Tag/Nacht Rhythmus freien Zugang zu Wasser und Futter hatten. Bei Beginn der Versuche waren die Tiere zwischen 10-12 Wochen alt mit Normalgewicht. Gesamt wurden 34 Tiere verwendet, deren Herkunft sich wie folgt aufteilte: Sechs Gerbils (JG01-JG06) kamen aus den Janvier Labs (Le Genest-Saint-Isle, 53941 Saint Berthevin Frankreich), zehn Tiere (JG07-JG15, JG24) aus dem Leibnitz Institut für Neurobiologie (Brenneckestraße 6, 39118 Magdeburg) und achtzehn Wüstenrennmäuse (JG16-JG23, JG25-34) aus den Charles River Laboratories Research Models and Services Germany GmbH Niederlassung Sulzfeld (Sandhofer Weg 7, 97633 Sulzfeld Deutschland). Diese Tiere wurden in die Morgengruppe (JG01-JG06, JG22,23), in die Mittagsgruppe (JG07-JG12, JG20,21), in die Abendgruppe (JG13-JG19, JG24) und in die Nachtgruppe (JG25-34) eingeteilt.
Die Versuche wurden von der bayerischen Regierung (Regierungspräsidium Unterfranken, Würzburg, Antragsnummer: 55.2.2-2532-2-540) genehmigt.
3.2 Narkose
Die Messungen der evozierten Hirnstammpotentiale sowie des Schalltraumas wurden unter einer tiefen Narkose durchgeführt. Dabei handelte es sich um eine Ketamin-Xylazin- Anästhesie, die in einer Bolusgabe von 0,4-0,5 ml subkutan verabreicht wurde. Dabei wurde das Mittel in eine Hautfalte im Nacken des Tieres appliziert. Die Anästhesie setzte sich aus Ketaminhydrochlorid (Ketaset: Dosis: 96 mg/kg Körpergewicht; Konzentration: 100 mg/ml), Xylazinhydrochlorid (Rompun: Dosis: 4 mg/kg Körpergewicht; Konzentration: 20 mg/ml), NaCl- Lösung, Atropinsulfat (Atropinum Sulfuricum: Dosis: 1 mg/kg Körpergewicht; Konzentration:
0,5mg/ml) in einem Mischverhältnis von 9:2:16:4 zusammen. Diese Stoffe wurden über das Franz-Penzoldt-Zentrum der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg bezogen.
Wie von Smith und Mills beschrieben, hat diese Anästhesieform nur kleinen Effekt auf die ABR Messung im Vergleich zu wachen Tieren (39). Während der Anästhesie wurden die Tiere auf eine regulierbare Heizmatte gelegt, um eine gleichbleibende Körpertemperatur (37° Celsius)
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zu erreichen. Um ein Austrocknen der gegebenenfalls geöffneten Augen zu verhindern, wurde ein Augengel (Corneregel, Bausch&Lomb) aufgetragen. Die Tiefe der Narkose wurde mittels des Rückzugsreflexes, durch leichten Druck auf den Hinterlauf, kontrolliert.
3.3 Schreckreaktionsmessung
Die akustische Schreckreaktion, die eine weit verbreitete Methode zur Tinnitus-Diagnostik darstellt, basiert auf der von Turner (36) beschriebenen Gap-Pre-Pulse-Inhibition des
„Acoustic Startle Reflex“. Dabei wurde dem Tier ein Hintergrundrauschen mit den Mittelfrequenzen 1 kHz, 2 kHz, 4 kHz und 8 kHz und einer Breite von einer halben Oktave bei einem Schalldruckpegel von 60 dB SPL präsentiert. Durch einen Schreckstimulus – bestehend aus weißem Rauschen mit einem Schalldruckpegel von 115 dB SPL und einer Dauer von 20 ms – wurde das Tier zu einem Schreckreflex, der sich durch Zucken äußerte, angeregt.
Schaltete man nun 100 ms vor dem Schreckstimulus 50 ms Stille (Prä-Stimulus/Gap) in das Hintergrundrauschen, so inhibierte das, in Abhängigkeit davon, wie gut die Lücke wahrgenommen wird, die Amplitude des Schreckreflexes (Prä-Puls-Inhibition). Entwickelte nun der Gerbil, bedingt durch das Schalltrauma, einen Tinnitus auf einer der präsentierten Frequenzen des Hintergrundrauschens, so konnte die Maus die zwischengeschaltete Stille (Gap) nicht mehr wahrnehmen. Dadurch kam eine verringerte Prä-Puls-Inhibition zustande.
Anschließend verglich man, mittels eines Kolmogorov-Smirnov-Tests, die Prä-Puls-Inhibition jeder Frequenz jedes Tieres vor dem Trauma und posttraumatisch. Ergab sich hierbei eine signifikante Abnahme (p < 0,05, korrigiert mit der Bonferroni-Methode) der Präpulsinhibition posttraumatisch zu prätraumatisch, wurde diese negative Amplitude (negative Effektstärke) als Existenz eines Tinnitus auf der jeweiligen Frequenz gewertet.
In diesem Versuchsaufbau wurde das Tier zunächst in eine Acrylröhre gesetzt, die bei einer Länge von 15 cm einen Durchmesser von 42 mm besaß. Das Vorderende wurde durch ein luft- und schalldurchlässiges Drahtnetz verschlossen, wodurch akustische Stimulationen im versuchsrelevanten Frequenzbereich unverzerrt dem Tier präsentiert werden konnten. Das hintere Ende wurde von einem 3D-gedruckten, speziell angepassten Verschluss versperrt.
Diese Röhre wurde 10 cm vom Breitbandlautsprecher (Canton Plus XS.2, Canton Elektronik GmbH, Weilrod, Deutschland), der das Hintergrundrauschen präsentierte, entfernt platziert.
Um die Schreckreaktion in Form eines Zuckens zu detektieren, wurde das Tier in der Röhre auf einer Sensorplattform, in der ein Piezoforcesensor (ADXL 335auf GY 61 board, Robotpark) integriert war, fixiert. Diese wiederum befand sich in einem reflexionsarmen Raum (Industrial Acoustics Company GmbH, Niederkrüchten, Deutschland) auf einem vibrationsisolierten Tisch
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(TMC, Peabody, MA, USA). Ein zweiter Lautsprecher (Neo-25s, Sinuslive) erzeugte den Schreckstimulus. Alle Stimuli wurden via einer Soundkarte (Asus Xonar STX II), die mit zwei Vorverstärkern (Amp 75 für das Hintergrundrauschen, Amp 74 für den Schreckstimulus;
Thomas Wulf, Frankfurt) verbunden war, präsentiert.
Anschließend wurde die Schallkammer geschlossen und dem Tier eine 15-minütige Eingewöhnungsphase gegeben. Die Messung bestand aus 245 Versuchen: die ersten fünf Durchläufe waren stets ohne Prä-Stimulus, um Adaptationseffekte in den Antwortamplituden des Tieres während der anschließenden Versuche zu minimieren. Daraufhin wurde dem Gerbil randomisiert je 120 Versuche mit Prä-Stimulus als auch ohne präsentiert (vier Frequenzen zu je 30 Versuchen). Diese Daten wurden, wie von Schilling et al. beschrieben, in einem eigens dafür geschriebenen Python 3.6 Programm kontrolliert und verarbeitet (40, 41). Bewegte sich das Tier 100ms vor dem Schreckstimulus, wurde der Versuch als ungültig zur weiteren Analyse automatisch durch das Programm ausgeschlossen. Bei den gültigen Messungen wurde die maximale Amplitude der Schreckreaktion in den ersten 50ms nach dem Schreckstimulus in die Auswertung aufgenommen.
Die Schreckreaktionsmessung wurde prätraumatisch und genau sieben Tage posttraumatisch jeweils von 13-15 Uhr durchgeführt.
3.4 Hirnstammaudiometrie
Die Hirnstammaudiometrie ist ein weit verbreitetes Verfahren, um Hörschwellen im Tierversuch festzustellen.
Dazu wurden den Wüstenrennmäusen, in einer tiefen Ketamin-Xylazin-Narkose (wie in 3.2 beschrieben), drei Silberelektroden subkutan angebracht: Eine Erdungselektrode im Schwanzbereich, eine Referenzelektrode zwischen den Ohren des Tieres und eine Messelektrode infraaurikulär, oberhalb der Bulla, an dem zu messenden Ohr.
Als akustischer Stimulus wurde ein Reinton mit den Frequenzen 1, 2, 4, 8 und 16 kHz von 0- 90 dB SPL in 5 dB Schritten pseudorandomisiert präsentiert. Der Stimulus hatte eine Dauer von 6 ms, inklusive 1 ms je Anstiegs- und Abfallszeit. Jede Frequenz wurde 120-mal in Doppelstimuli, zwischen welchen 100 ms Stille lag, gemessen. Bei den Doppelstimuli handelte es sich um zwei identische Reintöne, allerdings mit invertierter Phase. Da angenommen wurde, dass die invertierten Reintöne auch invertierte akustisch evozierte Ableitartefakte jedoch gleichphasige neuronale Signale hervorrufen, konnten die Doppelstimuli genutzt werden, um durch Mittelung der beiden aufgezeichneten Signale das rein neuronale Signal
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herauszurechnen. Induktionsartefakte wurden durch Mittelung eliminiert. Hierzu wurde ein dazu angepasstes Python-Programm verwendet.
Die Stimuli wurden von einem Matlab-Programm generiert und von einem Lautsprecher (Sinus Live NEO), der drei Zentimeter vom zu messenden Ohr entfernt war, dargeboten. Der Potentialunterschied zwischen Referenz- und Messelektrode wurde mittels eines Verstärkers (JHM NeuroAmp 401, J. Helbig Messtechnik, Mainschaff, Deutschland) verstärkt und durch eine analog-digital-converter-card (National Instruments Corporation, Austin, TX,USA) aufgenommen und digitalisiert. Aus den gemittelten und artefaktfreien Daten der ersten 10 ms nach Beginn des Stimulus wurde das quadratische Mittel errechnet, woraus dann die Antwortamplitude und ein Audiogramm, mit Hilfe eines Python 3.6 Programms, wie von Schilling et al. beschrieben, automatisch erstellt wurde (42).
Abbildung B - Eine Mongolische Wüstenrennmaus im BERA Setup
Beide Ohren jedes Tieres wurden hintereinander getestet. Um einen Vergleich der Hörschwellen zu ermöglichen, wurde das Tier zunächst vor dem Trauma und fünf Tage nach dem Trauma gemessen. Der Tageszeitpunkt hierbei war stets gleich: Die Messungen fanden von 9-12 Uhr statt.
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3.5 Akustisches Trauma
Die Mäuse wurden unter einer tiefen Narkose, wie in 3.2 beschrieben, einzeln oder zu zweit auf eine 37° Celsius regulierte Heizmatte in einer Schallkammer (Industrial Acoustics Company GmbH, Niederkrüchten, Deutschland) gelegt. Zehn Zentimeter vor den Tieren befand sich ein Lautsprecher (Canton Plus XS.2, Canton Elektronik GmbH, Weilrod, Deutschland), der das Schalltrauma über einen Reinton mit der Frequenz von 2 kHz und 115 dB SPL über eine Dauer von 75 Minuten induzierte. Ein Funktionsgenerator (HP 33120A, Hewlett-Packard, Böblingen, Deutschland) erstellte das Signal, das von einem speziell angefertigten Verstärker (AMP 75 Breitbandverstärker, Thomas Wulf, Frankfurt, Deutschland) verstärkt wurde. Ein Messverstärker (B&K Typ 2610, Brüel und Kjaer GmbH, Naerum, Dänemark) in Verbindung mit einem Kondensatormikrofon (B&K Typ 4190, Brüel und Kjaer GmbH, Naerum, Dänemark) und ein Vorverstärker (B&K Typ 2669, Brüel und Kjaer GmbH, Naerum, Dänemark) kontrollierten den Ton. Die Tiere erhielten auf diesem Weg ein beidseitiges mildes Schalltrauma.
Die Traumata wurden je nach Morgen-, Mittags-, Abend-, oder Nachtgruppe von 9-10:15 Uhr, 13-14:15 Uhr,17-18:15 Uhr oder von 0:00-1:15 Uhr gesetzt.
Abbildung C - Zwei Mongolische Wüstenrennmäuse im Trauma-Setup. Das Corneagel auf den Augen ist gut erkennbar.
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3.6 Zeitlicher Versuchsablauf
Allen 34 Tieren wurde eine Eingewöhnungsphase von mindestens einer Woche vor Versuchsbeginn gestattet. Die Wüstenrennmäuse wurden in vier Gruppen mit jeweils acht bzw. zehn Individuen eingeteilt. Dadurch ergab sich eine Morgen-, Mittags-, Abend- und Nachtgruppe. Die prätraumatischen Versuche wurden maximal sieben Tage vor dem Trauma durchgeführt. Zunächst erfolgten die prätraumatischen Versuche der akustischen Schreckreaktion, die aufgrund der circadianen Fragestellung der Arbeit immer von 13-15 Uhr stattfanden. Dabei wurde die Präpulsinhibition auf akustische Stimuli gemessen, die in Verbindung mit den späteren posttraumatischen Versuchen zur Tinnitusdiagnostik dient.
Zudem führte man Messungen der akustisch evozierten Hirnstammpotentiale durch. Hierbei wurden Audiogramme beider Ohren, stets im Zeitraum von 9-12 Uhr, aufgezeichnet. Zwischen Experimenten unter Narkose war immer eine Erholungsphase von mindestens 24 Stunden gewährleistet. Anschließend erhielten die Gerbils ein mildes Schalltrauma (2 kHz, 115 dB SPL, 75 min). Die Morgengruppe erhielt das Trauma von 9-10:15 Uhr, die Mittagsgruppe von 13- 14:15 Uhr, die Abendgruppe von 17-18:15 Uhr und die Nachtgruppe von 0-1:15 Uhr. Das Trauma stellte somit die einzige zeitliche Variable dar.
Abbildung D - Schematische Darstellung des zeitlichen Ablaufs der Versuche
Genau fünf Tage nach dem Schalltrauma erfolgte eine Postmessung der akustisch evozierten Hirnstammpotentiale an beiden Ohren (vgl. Abb. B). Diese wurde zur gleichen Tageszeit wie die Prämessung (9-12 Uhr) durchgeführt.
Sieben Tage nach dem Schalltrauma erfolgte eine weitere Messung der akustischen Schreckreaktion (vgl. Abb. B). Hierbei wurde ebenfalls die Messzeit an die Präversuche angepasst (13-15 Uhr). Dadurch war es nun möglich, durch den Vergleich mit den Daten der
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Präversuche, zu ermitteln, welche Tiere einen Tinnitus entwickelt hatten. Anschließend wurden die Versuchstiere in der CO²-Kammer getötet.
Abbildung E - Schematische Darstellung der Tageszeiten der Versuche
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3.7 Statistische Analyse
Für die Hörschwellenänderung wurde zunächst die Hörschwellenänderung für alle Frequenzen des linken und rechten Ohres pro Tier ermittelt (post-prä). Daraus wurde dann der Mittelwert beider Ohren gebildet.
Zudem wurde für jedes individuelle Tier der kleinste und größte Hörverlust berechnet, woraus der minimale und maximale Hörverlust für jedes Ohr bei jedem Tier gebildet wurde.
Mittels des Programms Statistica 8, StatSoft, Hamburg, Deutschland wurde durch zweifaktorielle ANOVAs einerseits der Hörverlust beider Ohren im Mittel als auch der maximale und minimale Hörverlust mit den Faktoren Zeitpunkt des Traumas und Frequenz analysiert. Zudem erfolgte die Untersuchung des Verhaltens der Tiere (Schreckreaktionsamplitude/Effektstärke) über eine ANOVA mit den Faktoren Zeitpunkt des Traumas und Frequenz. Abschließend wurde die Korrelation der individuellen Effektstärke und dem individuellen mittleren Hörverlust der einzelnen Traumagruppen analysiert.
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4 Ergebnisse
4.1 Untersuchung des Hörverlustes
4.1.1 Vergleich des maximalen und minimalen Hörverlust beider Ohren durch eine zweifaktorielle ANOVA mit den Faktoren Frequenz und Zeitpunkt des Traumas 4.1.1.1 Maximaler Hörverlust über beide Ohren
Abbildung F - i) Darstellung des Maximalen Hörverlusts gegen den Zeitpunkt des Traumas; ii) Darstellung des Maximalen Hörverlusts gegen die Frequenz in [kHz]; iii) Darstellung des Maximalen Hörverlusts der einzelnen Gruppen gegen die Frequenz in [kHz].
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Zunächst wurde der maximale Hörverlust (vgl. 3.7) im Hinblick auf Zeitpunkt des Traumas, Frequenz und Interaktion der beiden Faktoren durch eine zweifaktorielle ANOVA untersucht.
In Abbildung F, i) zeigt der maximale Hörverlust zum Zeitpunkt des Traumas keinen signifikanten Effekt (p=0,47106).
Außerdem findet sich in Abbildung F ii) ein Trend (p=0,06764) für unterschiedliche maximale Hörverluste in beiden Ohren über die verschiedenen getesteten Frequenzen.
In der Interaktion der Faktoren Frequenz und Zeitpunkt des Traumas auf den maximalen Hörverlust (Abbildung F, iii)) zeigt sich kein signifikanter Effekt (p=0,60823), was bedeutet, dass es keinen Unterschied im maximalen Hörverlust in den einzelnen Frequenzen zwischen den unterschiedlichen Traumagruppen gibt.
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4.1.1.2 Minimaler Hörverlust über beide Ohren
Abbildung G - i) Darstellung des Minimalen Hörverlusts gegen den Zeitpunkt des Traumas; ii) Darstellung des Minimalen Hörverlusts gegen die Frequenz in [kHz]; iii) Darstellung des Minimalen Hörverlusts der einzelnen Gruppen gegen die Frequenz in [kHz].
Zudem muss zur späteren Berechnung des Mittelwertes auch der minimale Hörverlust auf gleiche Weise wie der maximale Hörverlust beleuchtet werden.
Beim minimalen Hörverlust beider Ohren (vgl. 3.7) zeigt sich in der zweifaktoriellen ANOVA mit den Faktoren Zeitpunkt des Traumas und Frequenz, im Faktor Zeitpunkt keine Signifikanz (p=0,47106) (Abbildung G, ii)) und im Faktor Frequenz ein Trend (p=0,067) (Abbildung G, ii)) für unterschiedliche minimale Hörverluste in beiden Ohren über die verschiedenen getesteten
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Frequenzen. In der Interaktion (Abbildung G, iii)) zeigt sich, wie beim maximalen Hörverlust kein signifikanter Effekt (p=0,60823). Damit gibt es auch hier keinen Unterschied zwischen den Traumagruppen beim minimalen Hörverlust der einzelnen Frequenzen.
Da keine signifikanten Effekte im maximalen wie minimalen Hörverlust beider Ohren auftreten, können diese Werte gemittelt und der durchschnittliche Hörverlust errechnet werden, was im Folgenden untersucht wird.
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4.1.1.3 Mittlerer Hörverlust über beide Ohren
Abbildung H - i) Darstellung des Mittleren Hörverlusts gegen den Zeitpunkt des Traumas; ii) Darstellung des Mittleren Hörverlusts gegen die Frequenz in [kHz]; iii) Darstellung des Mittleren Hörverlusts der einzelnen Gruppen gegen die Frequenz in [kHz]
Abschließend wird nun, nach Betrachtung des maximalen und minimalen Hörverlusts, der mittlere Hörverlust beider Ohren gebildet und dargestellt, um neben den Extremwerten auch einen Durchschnittswert zur generieren.
Bei der Untersuchung des mittleren Hörverlustes beider Ohren mittels zweifaktorieller ANOVA mit den Faktoren Zeitpunkt und Frequenz, zeigt sich im Faktor Zeitpunkt (Abbildung H, i)) kein signifikanter (p=0,68208) Unterschied im Hörverlust zwischen den einzelnen Gruppen.
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Abbildung H, ii) zeigt den mittleren Hörverlust beider Ohren zu den Frequenzen (1, 2, 4, 8 kHz). Hier zeigt sich ein signifikanter Effekt (p=0,02). Mittels Tukey-Tests ergibt sich ein signifikanter Unterschied zwischen (p=0,019) 4 kHz und 8 kHz, sowie ein Trend zwischen 1 kHz und 4 kHz (p=0,051). In der Abbildung erkennt man, dass bei 4 kHz der mittlere Hörverlust beider Ohren am höchsten ist. In Abbildung H, iii) zeigt sich keine signifikante Interaktion (p=0,648) der Faktoren Zeitpunkt des Traumas und Frequenz auf den mittleren Hörverlust beider Ohren.
Insgesamt zeigt sich der größte mittlere Hörverlust beider Ohren unabhängig vom Zeitpunkt des Traumas bei 4 kHz.
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4.2 Untersuchung des Verhaltens in Abhängigkeit des Traumazeitpunkts
4.2.1 Untersuchung der Effektstärke durch eine zweifaktorielle ANOVA (Zeitpunkt/Gruppe und Frequenz)
Abbildung I - i) Darstellung der Effektstärke gegen den Zeitpunkt des Traumas; ii) Darstellung der Effektstärke gegen die Frequenz in [kHz]; iii) Darstellung der Effektstärke der einzelnen Gruppen gegen die Frequenz in [kHz]
Die Effektstärke zeigt (Abbildung I, i)) keinen signifikanten Unterschied (p=0,49) zwischen den einzelnen Traumagruppen. Die Effektstärke ist hier immer im positiven Bereich. In Abbildung I, ii) zeigt sich die Effektstärke bei der Frequenz von 2 kHz tendenziell am größten im Vergleich zu den anderen Frequenzen. Es zeigt sich ein signifikanter Effekt (p=0,04921). Im post hoc
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Tukey Test zeigt sich ein Trend zwischen 2 kHz und 8 kHz (p=0,051). Hier bewegen sich die Mittelwerte der Effektstärken ebenfalls ausschließlich im positiven Bereich. Nichtsdestotrotz gibt es auch negative Effektstärken bei einzelnen Tieren und Frequenzen, worauf in Punkt 4.2.2 näher eingegangen wird. In der Interaktion der Effektstärke mit der Frequenz und dem Zeitpunkt des Traumas (Abbildung I, iii)) zeigt sich kein signifikanter Effekt.
Das bedeutet, dass das Tinnitusperzept in allen Gruppen ohne signifikante Unterschiede in den einzelnen Frequenzen ausgeprägt wird.
4.2.2 Effektstärke in absoluten Zahlen
Abbildung J - Darstellung der Anzahl der Versuche gegen die Effektstärke <0 der jeweiligen Gruppen
In absoluten Zahlen zeigt sich, dass die Effektstärke häufiger größer als 0 ist. Im Allgemeinen ist das Tinnitusperzept, das bei einer negativen Effektstärke ausgebildet wird, in der Abendgruppe erhöht, was allerdings nicht signifikant ist. Die anderen Gruppen zeigen niedrigere, ähnliche Zahlen (Abbildung J).
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4.3 Korrelation zwischen Hörverlust und Verhalten
Um nun den Zusammenhang zwischen der Effektstärke und dem Hörverlust der einzelnen Traumagruppen zu untersuchen, werden im Folgenden die beiden Faktoren Effektstärke und Hörverlust der jeweiligen Traumagruppe korreliert.
4.3.1 Korrelation zwischen der individuellen Effektstärke und dem individuellen mittlerem Hörverlust beider Ohren der verschiedenen Gruppen
Abbildung K - Korrelation zwischen der individuellen Effektstärke und dem individuellen mittlerem Hörverlust beider Ohren der verschiedenen Gruppen
In Abbildung K zeigt sich die Korrelation der individuellen Effektstärke und dem individuellen mittleren Hörverlust der einzelnen Traumagruppen.
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In der Morgengruppe und in der Mittaggruppe zeigen sich keine signifikanten Korrelationen (morgens: p=0,77; mittags: p=0,21). Die Abendgruppe zeigt eine signifikante Korrelation (p=0,0004). In der Nachtgruppe ist ein Trend erkennbar (p=0,072).
In der Abendgruppe wird also ersichtlich, dass ein geringerer Hörverlust oder sogar eine Hörschwellenverbesserung (negative Hörschwellenwerte) mit einem gesteigerten Tinnitusperzept (negative Effektstärke) zusammenhängt.
Gesamt betrachtet erkennt man, anhand des r-Werts (Morgengruppe: r=-0,0599;
Mittagsgruppe: r=0,2446; Abendgruppe: r=0,6117), im Tagesverlauf bis zur Abendgruppe eine Zunahme der Korrelation zwischen dem Hörverlust und der Effektstärke.
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4.3.1 Korrelation zwischen der individuellen Effektstärke und dem individuellen minimalen und maximalen Hörverlust beider Ohren der verschiedenen Gruppen
Abbildung L - Korrelation zwischen der individuellen Effektstärke und dem individuellen minimalen Hörverlust beider Ohren der verschiedenen Gruppen
Abbildung M - Korrelation zwischen der individuellen Effektstärke und dem individuellen maximalen Hörverlust beider Ohren der verschiedenen Gruppen
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Geht man bei der Analyse der Daten nun weiter ins Detail, zeigen sich ähnliche Effekte in der Korrelation der individuellen Effektstärke und dem individuellen minimalen (Abbildung L) und maximalen (Abbildung M) Hörverlust der einzelnen Traumagruppen.
Besonders die Korrelation der individuellen Effektstärke und dem individuellen maximalen Hörverlust (Abbildung M) der Traumagruppen zeigt, neben der Abendgruppe, auch in der Nachtgruppe einen signifikanten Effekt.
In der Rang-Korrelation ergaben sich keine signifikanten Unterschiede der Effektstärke weder im Mittel über alle Frequenzen noch bei den einzelnen Frequenzen. Zudem ergaben sich beim Hörverlust weder im Mittel noch bei den einzelnen Frequenzen signifikante Unterschiede.
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5 Diskussion
In dieser Studie wurde der Hörverlust und die Tinnitusausprägung bei monoglischen Wüstenrennmäusen in circadianer Abhängigkeit eines milden Schalltraumas untersucht. Für die Bestimmung der Hörschwellen, der Wiedergabe des Tinnitusperzepts und der Vertäubung der Tiere wurde auf etablierte Konzepte wie die Hörstammaudiometrie und Schreckreaktionsmessung zurückgegriffen. Ein circadianer Einfluss auf das Gehör und die Cochlea zeigt sich in verschiedenen Studien (20).
So zeigt sich bei Mäusen, die einem Schalltrauma tagsüber ausgesetzt waren, kein permanenter Hörverlust. Die Tiere erholten sich nach zwei Wochen völlig vom Schalltrauma.
Wurde das Trauma allerdings nachts gesetzt, entwickelten die Tiere eine permanente Schwellenverschiebung. Zudem zeigt sich bei Mäusen eine über den Tag unterschiedliche Amplitude der Schreckreaktion: Um 9 Uhr, also in der inaktiven Phase der Maus, zeigt sich die Schreckreaktionsamplitude größer als um 21 Uhr in der aktiven Phase des nachtaktiven Tieres. Es wird also postuliert, dass Erholung und die Ausprägung von Hörverlust eine Abhängigkeit vom Zeitpunkt des Schalltraumas haben (30).
Da das Mausmodell nur eine eingeschränkte Übertragbarkeit auf den Menschen besitzt, da die Maus in einem anderen Frequenzbereich als der Mensch optimal hört und zudem noch nachtaktiv ist, fiel die Wahl auf die mongolische Wüstenrennmaus, deren Gehör Töne unter anderem auch in ähnlichen Frequenzbreiten wie der Mensch wahrnimmt (43). Außerdem zeigt der Gerbil in seinem Aktivitätsprofil neben nachtaktiven auch tagaktive Phasen. Refinetti und Kenagy zählen ihn im Allgemeinen zu den tagaktiven Tieren, was Sie auf sein Verhalten im natürlichen Umfeld zurückführen. Allerdings zeigen Sie auch auf, dass sich der Aktivitätsrhythmus im Labor als nicht robust darstellt und je nach Methode der Aktivitätsbestimmung ein tagaktives wie auch nachtaktives Verhalten wiedergegeben werden kann (38). Andere Autoren schreiben den Gerbil aufgrund von Auffälligkeiten in der Herzfrequenz, Körpertemperatur und allgemeinem Verhalten klar den nachtaktiven Tieren zu (44-46). Roper, auf dessen Ergebnisse sich im Folgenden bezogen wird, zeigte bereits 1976, dass selbst das Geschlecht mit einem unterschiedlichen Aktivitätsrhythmus einhergeht. So zeigen weibliche Tiere nur nachts Aktivität, männliche hingegen zeigen eine deutliche Aktivität nachts gegen 3 Uhr und entwickeln eine weitere Aktivitätsspitze gegen 17 Uhr (47).
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Abbildung N - Aktivitätsdarstellung von weiblichen und männlichen Gerbils im 12/12 h Hell/Dunkel Rhythmus (47)
Die Hörschwelle und die Schreckreaktionsmessung wurden demnach immer zur gleichen Zeit gemessen, wohingegen das Trauma je nach Gruppe zu unterschiedlichen Tageszeiten durchgeführt wurde. Im Folgenden werden die Ergebnisse diskutiert.
5.1 Interpretation der Ergebnisse
Im Vergleich zu den Ergebnissen der oben genannten Studie zeigt sich hier sowohl im maximalen als auch im minimalen Hörverlust kein signifikanter Unterschied zwischen den einzelnen Zeitgruppen. Im mittleren Hörverlust präsentiert sich ebenfalls zwischen den Gruppen kein signifikanter Unterschied. Auffällig ist hier, dass sich der größte mittlere Hörverlust bei 4 kHz befindet, was sich mit der Studienlage bei Tier und Mensch (2, 48) deckt.
Außerdem legen andere vergleichbare Arbeiten eine gesamt höhere Tinnitusanzahl (ca. 74 %) dar, die sich in dieser Arbeit nicht widerspiegelt (ca. 6,5 % Tinnitusausprägung).
Zurückzuführen kann das auf individuelle Unterschiede der Tiere im Hinblick auf die neuronale Aktivität sein. Ist diese generell gering, so stellt das eine Prädisposition für Tinnitus dar (48, 49). Weiterhin findet sich kein signifikanter Unterschied zwischen den einzelnen
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Traumagruppen und der Effektstärke. Bei 2 kHz ist die Effektstärke bei allen Gruppen am größten. Das steht im Gegensatz zu Ergebnissen von Ahlf et al., die die geringste Effektstärke und damit das stärkste Tinnitusperzept bei der Frequenz des Traumas (oder eine Oktave höher) zeigen (49). Ein weiterer Erklärungsansatz über die geringere Tinnitusausprägung kann das niedrige Aktivitätsprofil (47) und der damit zusammenhängende geringe Cortisolspiegel zum Zeitpunkt der Schreckreaktionsmessung darstellen. Ein geringerer Cortisolspiegel sorgt für eine höhere Amplitude der Schreckreaktion und damit für eine geringere Ausprägung des Tinnitusperzepts (31, 50, 51).
Betrachtet man die Effektstäke in absoluten Zahlen, so erkennt man, dass in der Abendgruppe am häufigsten negative Effektstärken gemessen wurden. Die anderen Gruppen verhalten sich untereinander ähnlich. Das deckt sich wiederum mit den Daten von Meltser et al., die - bei Mäusen ohne schalltraumatisches Ereignis - gegen 21 Uhr eine geringere Schreckreaktionsamplitude (reine ASR ohne PPI) als 12 Stunden früher darstellen (30).
Zusammenfassend gibt es keinen signifikanten Unterschied zwischen den einzelnen Traumagruppen, dem Hörverlust und dem Tinnitusperzept. Der Zeitpunkt des Traumas beim Gerbil hat also keinen Einfluss auf die Hörschwellenverschiebung sowie auf die Tinnitusausprägung.
Korreliert man allerdings den mittleren Hörverlust und das Tinnitusperzept jeder einzelnen Gruppe, so zeigt sich im Tagesverlauf bis zur Abendgruppe eine Zunahme der Korrelation. In der Abendgruppe findet sich eine signifikante Korrelation zwischen Hörverlust und Tinnitusperzept. In der Betrachtung der Korrelation des maximalen Hörverlustes und des Tinnitusperzepts gibt auch die Nachtgruppe einen signifikanten Zusammenhang wieder. Das bedeutet: Je später man das Schalltrauma durchführt, desto stärker tritt ein geringerer Hörverlust (oder eine Hörschwellenverbesserung) in Zusammenhang mit einer geringeren Effektstärke, was letztlich ein höheres Tinnitusperzept darstellt, auf. Dieser Zusammenhang zwischen Tinnitusausprägung und geringerem Hörverlust untermauert die Tinnitushypothese der stochastischen Resonanz, da eine Hörschwellenoptimierung mit einer Tinnitusausprägung einhergeht (16, 17). Berücksichtigt man hierbei die circadiane Aktivität der männlichen Gerbils, die gegen 9 Uhr ihr Minimum erreicht und dann ansteigt, bis sie um ca. 17 Uhr ihren Höhepunkt erreicht, so lässt sich ein Zusammenhang zwischen Aktivität und Korrelation aus Hörverlust und Tinnitusperzept erkennen. Zeigt die Maus eine hohe Aktivität, ist der Effekt der stochastischen Resonanz größer als zu Zeiten geringerer körperlicher Aktivität.
In der Gesamtbetrachtung lässt sich zwischen Maus und Gerbil ein ähnliches Verhalten erkennen. Beide zeigen gegen Abend geringere Schreckreaktionsamplituden und verhalten sich im Hinblick auf den Hörverlust ähnlich, aber phasenverschoben: die Maus entwickelt nach
34
einem Schalltrauma nachts einen permanenten Hörverlust. Beim Gerbil hingegen präsentiert sich in der Mittags- und Abendgruppe vor allem im Hinblick auf den maximalen Hörverlust ein stärkerer Hörverlust, der allerdings nicht signifikant anders ist als in der Nachtgruppe. Damit verhalten sich die Tiere entsprechend ihrer Aktivität beim Hörverlust phasenverschoben, beim Tinnitusperzept allerdings gleich (30).
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5.2 Hormoneller Einfluss auf die circadiane Rhythmik
5.2.1 Einfluss des Cortisolspiegels auf die akustische Schreckreaktion
Der Cortisolspiegel gilt im Menschen wie auch im Tiermodell als klassisches Beispiel einer gut messbaren circadianen Rhythmik. Die Cortisolausschüttung wird durch die Hypthalamus- Hypophysen-Nebennierenrinde-Achse gesteuert. Hierbei wird zunächst im Hypothalamus CRH (Corticotropin Releasing Hormone) aufgrund von Reizen aus dem Nucleus suprachiasmaticus aus dem limbischen System ausgeschüttet, das wiederum die Sezernierung von ACTH (Adrenocorticotropes Hormon) aus der Hypophyse in Gang bringt.
Über verschiedene Zwischenschritte wird dann durch ACTH in der Nebennierenrinde Cholesterin freigesetzt. Daraus entsteht dann im Mitochondrium Cortisol. Das Cortisol hemmt wiederum die Ausschüttung von CRH im Hypothalamus. Der höchste Cortisolspiegel im Menschen ist morgens gegen 9 Uhr und flacht im Verlauf des Tages ab (52).
Der Cortisolspiegel hat beim Menschen einen Einfluss auf den akustischen Schreckreflex. So zeigt sich nach dem Aufwachen eine geringere Reflexamplitude als abends. Korreliert man das mit dem Cortisolspielgel, kann man einen Zusammenhang zwischen Reflexantwort und Hormonspiegel ziehen. Liegt ein hoher Cortisolspielgel vor (beispielsweise direkt nach dem Aufwachen), ist die Schreckreaktionsamplitude geringer. Liegt ein niedriger Cortisolspiegel vor, ist die Reflexantwort erhöht (33). Weiterhin zeigt direkte Glukokortikoidgabe eine Verringerung der akustischen Schreckreaktion, was einen direkten Zusammenhang offenlegt (53).
Auch im Tiermodell bei Nagern ist dieser Effekt ersichtlich. Blockiert man bei Ratten den Glucokotikoidrezeptor, so wird die Wirkung des Cortisols eingeschränkt und die Versuchstiere zeigen eine erhöhte Amplitude der Schreckreaktion (54). Zudem senkt die Gabe von Corticosteroiden bei gesunden Tieren die Amplitude der Schreckreaktion (55). Betrachtet man nun den allgemeinen Cortisolspiegel ohne Eingriffe in Ratten, so wird auch hier der Zusammenhang ersichtlich: bei Schreckreflexmessungen tagsüber (bei Lichteinfluss) ist die Amplitude geringer als bei Messungen im Dunklen. Der Cortisolspiegel verhält sich dazu wiederum gegensätzlich (31, 50, 51).
Aufgrund einer besseren Übertragbarkeit auf den Menschen wurden in dieser Studie mongolische Wüstenrennmäuse verwendet (38, 43). Die mongolische Wüstenrennmaus zeigt abends eine geringere Schreckreflexamplitude als zu den anderen Tageszeiten. Zu dieser Zeit zeigt der Gerbil auch eine Aktivitätsspitze in seiner circadianen Rhythmik (47). Dies ist vergleichbar mit der Maus, die ebenfalls abends geringere Schreckreflexamplituden aufweist
36
(30). Die beiden Nagerarten verhalten sich also im Hinblick auf die Schreckreaktionsamplituden ähnlich, obwohl die Maus nachtaktiv ist und der Gerbil auch tagaktive Phasen besitzt.
Schon frühere Cortisolmessungen im Urin bei Gerbils zeigen keine reproduzierbaren Werte, was auf ein methodisches Problem zurückzuführen ist (vgl. Anhang 8.1). Aufgrund des fehlenden Cortisolspiegels des Gerbils wird der Zusammenhang aus Verhalten und Cortisolspiegel der Maus herangezogen und auf den Gerbil übertragen. Hierbei zeigt sich, dass der Cortisolspiegel der Maus abends hoch ist und in den Morgenstunden niedrig (Abbildung O: (56)), was sich mit der Nachtaktivität (siehe Abbildung: Nahrungs- und Flüssigkeitsaufnahme in den dunklen Phasen (Abbildung P: (57)) und dem Verhalten der Schreckreaktionsamplituden der Maus deckt. Ist die Maus also aktiv, ist ihr Cortisolspiegel hoch und daraus resultiert eine geringere Schreckreaktionsamplitude.
Auf den Gerbil übertragen zeigt sich abends (17 Uhr) zur Aktivitätsspitze, die einen hohen Cortisolspiegel vermuten lässt, ebenfalls eine geringe Schreckreaktionsamplitude.
Abbildung O - Cortisolspiegel der Maus (Mus musculus) im Tagesverlauf (56)
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Abbildung P - Circadianes Aktivitätsverhalten der Maus (Mus musculus) anhand von Nahrungs- und Flüssigkeitsaufnahme (57)
Dementsprechend zeigt sich der Cortisolspiegel wie auch das Verhaltensmuster der Maus und des Gerbils im Vergleich zum Menschen phasenverschoben. Durch die zweite Aktivitätsspitze am Abend gegen 17 Uhr, lässt sich beim Gerbil ein abendlicher Anstieg des Cortisolspiegels vermuten, da hier auch die Schreckreaktionsamplitude geringer ist. Der Gerbil zeigt sich durch diese Daten trotz seiner tagaktiven Phasen im Hinblick auf die Schreckreaktionsamplituden nur als bedingt vergleichbares Tiermodell um eine Übertragbarkeit auf den Menschen zu erhalten.
5.2.2 Einfluss des Cortisolspiegels auf den Hörverlust
Auch bei der Ausprägung von Hörverlusten zeigt sich ein Einfluss von Cortisol. So stellt Cederroth et al. an Mäusen dar, dass die Entfernung der Nebenniere und der damit verbundene niedrige Cortisolspiegel einen protektiven Effekt auf einen Hörschwellenverlust nach einem nächtlichen Trauma hat. Insgesamt postuliert Cederroth et al., dass Mäuse nachts sensibler auf ein Schalltrauma reagieren, da der höhere Cortisolspiegel eine Prädisposition für eine Entzündung der Cochlea darstellt (58).
38
In den Ergebnissen dieser Studie ist allerdings kein signifikanter Unterschied im Hörverlust zwischen den einzelnen Traumagruppen beobachtet worden. Das zeigt, dass sich der Gerbil in diesem Zusammenhang von der Maus unterscheidet.
5.3 Mortalität der Versuchstiere beim Nachttrauma
Auffällig in dieser Studie war zudem die Mortalität der Versuchstiere bei der Vertäubung um Mitternacht.
Grundsätzlich ist bei den Versuchen der Morgens-, Mittags- und Abendgruppe kein Versuchstier verstorben. Bei der Nachtgruppe allerdings fiel eine Mortalität von 30% auf (drei von zehn). Interessant ist hier, dass die Tiere nur nach dem Trauma um Mitternacht verstorben sind. Die Präversuche, die unter anderem mit der gleichen Dosierung der Narkose durchgeführt wurden, wurden ohne Auffälligkeiten von den Tieren toleriert. Damit scheidet eine Unverträglichkeit als Grund der hohen Sterblichkeitsrate aus.
Da sich, wie oben postuliert, der Gerbil wie die Maus verhält, steigt auch sein Cortisolspiegel im Zusammenhang mit seiner Aktivität an. Die höchste Aktivität hat die mongolische Wüstenrennmaus gegen 3 Uhr, dessen Anstieg ab ca 0 Uhr beginnt. Zu den anderen Traumazeiten befindet sich das Cortisolspiegel auf einem niedrigeren Stand. Durch das Trauma in der vergleichsweisen hohen Aktivitätsphase des Tieres kann vermutet werden, dass aufgrund des Stresses vermehrt Glukokortikoide ausgeschüttet werden (59) und damit der ohnehin schon hohe Cortisolspiegel weiter ansteigt. Wie Studien an Ratten zeigen, kann ein chronisch erhöhter Glukokortikoidspiegel wie auch direkte Zugaben von Glukokortikoiden einen negativen Einfluss auf den arteriellen Baroreflex haben. Dieser Reflex dient als Blutdruckregelkreis, der Blutdruck und Herzfrequenz reguliert (60-62). Auch beim Menschen kann eine Cortisolgabe bei physiologischem und pathophysiologischem Stress eine Reduzierung des arteriellen Baroreflexes hervorrufen, was mit einem erhöhten Risiko von akuten kardialen Ereignissen wie Arrhythmien und Myokardinfarkten einhergehen kann (63).
Zusammenfassend lässt sich also vermuten, dass bei den Tieren nachts durch das Trauma und den damit verbundenen Stress der ohnehin schon hohe Glukokortikoidspiegel weiter anstieg und daraufhin möglicherweise ein kardiales Ereignis zum Tod geführt ha
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5.4 Ausblick
Weiterführend zu dieser Studie wäre es sinnvoll das Aktivitätsmuster der Gerbils in den verwendeten Haltungsbedingungen zu untersuchen, da hierdurch die Tag/Nachtaktivität und der damit zusammenhängende Cortisolspiegel präziser dargestellt werden kann. Abhängig vom Verhaltensmuster wäre eine weitere Versuchsreihe mit Traumazeitpunkt um 3 Uhr nachts sinnvoll, da sich hier vermutlich die größte Aktivität zeigt und damit auch hier der größte Cortisollevel vermutet werden kann. Ebenso kann die Messung der Schreckreaktion von 13- 15 Uhr überdacht werden: da sich die Aktivität hier gering zeigt (Minimum um 12 Uhr), kann von einem niedrigen Cortisolspiegel ausgegangen werden. Bei geringem Cortisolspiegel zeigt die Schreckreaktion größere Amplituden, was die allgemein niedrige Tinnitusausprägung über alle Gruppen erklären kann.
Außerdem wäre es in weiteren Studien sinnvoll eine Methodik zu entwickeln, um den Cortisolspiegel der Versuchstiere in circadianer Abhängigkeit zu detektieren. Damit wäre es möglich das Verhalten genau mit der hormonellen Situation zu vergleichen und präzisere Aussagen über das Zusammenspiel beider Faktoren treffen zu können.
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