This work has been digitalized and published in 2013 by Verlag Zeitschrift für Naturforschung in cooperation with the Max Planck Society for the Advancement of Science under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
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Creative Commons Namensnennung 4.0 Lizenz.
398 M. H. ZEN K UND G. M ÜLLER
Biosynthese von p-H ydroxybenzoesäure und anderer B enzoesäuren in höheren Pflanzen
Von M . H . Ze n k und G. Mü l l e r
A us dem Botanischen Institut der Universität M ünchen (Z. Naturforschg. 19 b, 398— 405 [1964] ; eingegangen am 14. Januar 1964)
Feeding experim ents with glucose-(2-14C ), phenylalanine- (3-14C), tyrosine-(3-14C) and p-coumaric acid-(3-14C) showed th at the latter three substances are incorporated in good yields into p-hydroxy- benzoic acid in leaves of Catalpa ovata. K inetic experim ents showed th at p-hydroxybenzoic acid is form ed from phenylalanine via p-coumaric acid and the subsequent /5-oxidation of the side chain.
p-Hydroxybenzoic acid can also be synthetised by hydroxylation of benzoic acid, but this does not seem to be the biosynthetic route in Catalpa.
P henylalanine-(3-14C) is also incorporated into benzoic acid, protocatechuic acid, and vanillic acid by different p lan ts; the radioactivity of the ß-C atom of the amino acid was found in each case to be located in the carboxyl group of the C6 —Cj acid. This suggests th at in higher plan ts the benzoic acids are formed from the corresponding cinnamic acids via /2-oxidation.
Die Benzoesäure und ihre oxydierten Derivate sind im Pflanzenreich weit v e rb reitet1. Uber die Bio
synthese dieser Cg-Q-Körper in der höheren Pflanze ist nur wenig bekannt. Das H ydroxylierungsm uster der natürlich vorkommenden Benzoesäuren läßt je
doch eine biogenetische Verwandtschaft mit den ent
sprechend hydroxylierten und methoxylierten Phenyl- propanen vermuten.
Als ein wahrscheinlicher Mechanismus für die Bio
synthese der Benzoesäuren ist die Entfernung eines C2-Körpers der Seitenkette der Phenylpropane durch /^-Oxydation denkbar. Das Vorkommen dieses Mecha
nismus der /5-Oxydation auch in der höheren Pflanze ist durch die Untersuchung des Abbaus der Indol
und Phenoxy-substituierten Fettsäuren hinreichend nachgewiesen2; so wird z. B. die entsprechende P ropionsäure zur Carboxylsäure abgebaut. Derselbe Mechanismus der /^-Oxydation von kurzkettigen Phenyl-substituierten Fettsäuren konnte bei N o c a rd ia o p a ca nachgewiesen w erd en 3; Phenylpropionsäure wurde durch dieses Bakterium zu Benzoesäure ab
gebaut, wobei sich Zimtsäure eindeutig als Zwischen
produkt fassen ließ.
Bei Untersuchungen über Alkaloidbiosynthesen konnte nun die wichtige Beobachtung gemacht wer-
1 W. K a r r e r , K onstitution und Vorkommen der organischen Pflanzenstoffe, B irkhäuser V erlag, Basel 1958.
2 R. L. W a i n u. F . W i g h tm a n , Proc. Royal Soc. [London], Ser. B, 142, 525 [1 9 5 4 ]; C. H. F a w c e t t , R. L. W a i n u. F . W i g h tm a n , N ature [London] 181, 1387 [1958].
3 D . M. W e b l e y , R. B. D u f f u. V. C. F a r m e r , J. gen. M icro
biol. 13,361 [1955].
4 R. J. S u h a d o l n i k , A. G . F i s c h e r u. J. Z u l a l i a n , J. Amer.
chem. Soc. 84. 4348 [1961].
den, daß Phenylalanin-(3-14C) in die C6-C1-Einheit von L y co rin 4 und B ellad in 5 eingelagert wird. Be
sonders schön ließ sich der Einbau dieser Am ino
säure in die estergebundene Benzoesäurekomponente des Cocains in E r y th r o x y lo n zeigen 6.
W ährend unserer Arbeiten erschien eine V er
öffentlichung von Gr i s e b a c h und Vo l l m e r 7, in der gezeigt wurde, daß durch Verfütterung von Zim t
säure-(3-14C) an Blätter von G au lth eria p ro c u m b e n s spezifisch in der Carboxylgruppe m arkierte Salicyl- säure gebildet wird. Die Autoren nahmen dabei ebenfalls den Abbau der Seitenkette der Zimtsäure durch /^-Oxydation an. Ob jedoch die Hydroxylie
rung des Phenylringes auf der Stufe der Zimtsäure erfolgt oder erst durch Hydroxylierung der m ög
licherweise aus der Zim tsäure entstandenen Benzoe
säure, konnte noch nicht entschieden werden. Daß die höhere Pflanze die Möglichkeit besitzt, Benzoesäure in eine Vielzahl von mono-, di- und auch trihydroxy- lierten Verbindungen überzuführen, ist klar er
wiesen 8> 9.
Es war das Ziel dieser Arbeit, die Biosynthese der Q -Q -K ö rp er besonders am Beispiel der p-Hydroxy- benzoesäure und einiger anderer Benzoesäuren zu untersuchen.
5 W . C. W i ld m a n , A. R. B a t t e r s b y u. D. B r e u e r , J. Amer.
chem. Soc. 84,4 5 9 9 [1962].
8 D. G r o s s u. H. R. S c h ü t t e , Arch. Pharm az. Ber. dtsch. p h a r
maz. Ges. 296. 1 [1963].
7 H. G r i s e b a c h u. K . 0 . V o l l m e r , Z . N aturforschg. 18 b , 753 [1963].
8 R. K . I b r a h i m u. G . H. N. T o w e r s , N ature [London] 184, 1803 [1959] ; H. D. K l ä m b t , N ature [London] 196. 491
[1962],
9 M. H. Z e n k , Z . N aturforschg. 19 b , 83 [1964].
p-Hydroxybenzoesäure wurde gewählt, weil sie wohl die am weitesten verbreitete Benzoesäure ist (bei einer Untersuchung von 122 Gefäßpflanzen konnte sie in allen 122 Arten nachgewiesen wer
den 10) . Sie tritt außerdem in einigen Pflanzen (C a ta lp a ) in sehr hoher K onzentration (5 0 mg/g Fgew.) auf. Die p-Hydroxybenzoesäure kommt in dieser Pflanze jedoch nicht frei, sondern als 1-p- Hydroxybenzoyl-/?-D-glucose-Ester vor n .
W ährend für die Biosynthese der p-Hydroxy
benzoesäure in M ikroorganism en die direkte Syn
these aus S h ik im isäu re12 über C horism insäure13 nachgewiesen werden konnte, läßt sich für die Bil
dung dieser Säure im T ier der Weg über Tyrosin, p-Cum arsäure zur p-Hydroxybenzoesäure anneh
men 14.
M aterial und M ethoden
D ie Untersuchungen zur Klärung der Biosynthese der p-Hydroxybenzoesäure in höheren Pflanzen wurde an C atalpa ovata und C. bignonioides durchgeführt. Das Pflanzenmaterial wurde großenteils nach Angaben von Ibrahim und Towers 15 gewählt, die das Vorkommen der betreffenden Benzoesäuren in den entsprechenden Pflanzenarten beschrieben hatten.
Die Versuche wurden hauptsächlich mit Phenylalanin durchgeführt, da sich in Vorversuchen gezeigt hatte, daß bei Verfütterung von Zimtsäure, dem Desaminierungs
produkt des Phenylalanins, der größte T eil dieser Ver
bindung als Zinnamoyl-glucoseester festgelegt und kaum weiter umgebaut wird, wodurch sehr schlechte Einbauraten in die entsprechenden Benzoesäuren er
reicht werden. D agegen wird Phenylalanin, wenn es auch ein recht entfernt stehender Vorläufer ist, in man
dien F ällen weitaus besser in die entsprechenden Ver
bindungen eingebaut. D ies erklärt sich dadurch, daß der geschwindigkeitsbegrenzende Schritt wohl in der Aktivierung der Zimtsäuren (über Coenzym-A-Ester) liegt und die aktivierten Zwischenprodukte die wahren Vorstufen sind, während ein Überschuß an zugeführter freier Säure durch Glucosidierung festgelegt wird 16.
Die Untersuchungen über den zeitlichen Verlauf der Biosynthese wurden mit jungen Blättern von Catalpa ovata während der Vegetationsperioden 1962 und 1963 durchgeführt. Jeweils 2 g ± 5 mg ausgestanzte Blatt
stücke (1,1cm Durchmesser) wurden in 25 ml einer 10 _4-m. DL-Phenylalanin-(3-14C)-Lösung, die 2,5 ml
10 M. T o m a s z e w s k i , B u l l . A c a d . p o l o n . S e i . C l . II, VIII, 6 1 [ I 9 6 0 ] ,
11 L. B i r k h o f e r , C . K a i s e r , W. N o u v e r t n e u. U. T h o m a s , Z.
N a t u r f o r s d i g . 1 6 b , 2 4 9 [ 1 9 6 1 ] .
12 E. W. B a s s e t t u. S . W. T a n e n b a u m , B i o c h i m . b i o p h y s i c a A c t a [ A m s t e r d a m ] 2 8 , 2 4 7 [ 1 9 5 8 ] .
13 F. G i b s o n u. L. M. J a c k m a n , N a t u r e [ L o n d o n ] 1 9 8 , 3 8 8 [ 1 9 6 3 ] .
10_1-m. Citrat-Phosphatpuffer ph 5,3 enthielt, im Dun
keln unter leichtem Schütteln bei 21 °C inkubiert. Nach den entsprechenden Zeiten wurde das Gewebe zweimal mit 80-proz. Äthanol am Rückfluß extrahiert und der äthanolische Auszug auf ein bestimmtes Volumen ge
bracht. Nach der Bestimmung der Gesamtaktivität wurde der Auszug eingedampft und mit 3-n. NaOH bei Raumtemperatur 3 Stdn. hydrolysiert, um die Säure aus der Esterbindung frei zu machen. Nach Ansäuern mit H3P O4 und anschließend 5-stdg. kontinuierlichen Ausäthern wurde mit gesättigter Bicarbonatlösung rüde
extrahiert, abermals angesäuert und die Wasserphase weitere 5 Stdn. ausgeäthert. Der Äther wurde abge
dampft, der Rückstand mit Äthanol auf ein bestimmtes Volumen gebracht und die Gesamtaktivität der Säure
fraktion bestimmt.
Zur Herstellung von Autoradiogrammen wurde je
weils ein Teil des Extraktes auf Schleicher-Schüll-Pa- pier 2043b aufgetragen und in folgenden Lösungsmit
teln entwickelt. 1. Dimension: Isopropanol : NH3 : H20
= 8 : 1 : 1 , 2. Dimension: 2-proz. Eisessig. Die rest
lichen Extrakte wurden zur Reinigung auf Kieselgel G- Na-Molybdat-Platten17 im Fließmittel Benzol : Di
oxan : Eisessig (90 : 25 : 4; p-OH-Benzoesäure R f 0,55) und anschließend noch zweimal auf Papier (S. u. S.
2043 b) in 2-proz. Eisessig (p-OH-Benzoesäure R f 0,63) chromatographiert. Nach Abeluieren der Zone mit H20 wurde die Konzentration der p-OH-Benzoesäure an einem Aliquot mit Hilfe des F o l i n - C i a l t e a u - Reagenz spektrophotometrisch ermittelt und gleichzeitig die Radioaktivität in unendlich dünner Schicht bestimmt
(spezifische Aktivität = ipm/mMol).
In gleicher Weise wurden 2 g Blattgewebe von Catalpa bignonioides in folgenden Lösungen 24 Stdn.
lang inkubiert: 10-4-m. Glucose-(2-14C ), 10_4-m. DL- Phenylalanin-(3-14C ), 10_4-m. DL-Tyrosin-(3-14C), 10~4-m. Benzoesäure-(7-14C) sowie 4 -1 0 _4-m. p-Cumar- säure-(3-14C) ; das Gesamtvolumen betrug in jedem Fall 25,0 ml; die Pufferkonzentration (Citrat-Phosphat- puffer pH 5,3) war 10_2-molar.
Zur Ermittlung des Biosyntheseweges der Benzoe-, Protocatechu- und Vanillinsäure wurde in Parallelver
suchen jeweils 2 g Blattgewebe von Tsuga canadensis, Vaccinium vitis-idea und Populus trem ula in 25 ml einer 10~4-m. DL-Phenylalanin- (3-14C) -Lösung (ph 5,3) wie oben beschrieben inkubiert. Die Alkoholextraktion des Gewebes und die anschließende alkalische Hydro
lyse erfolgte in gleicher Weise wie oben. Zur Herstel
lung der Autoradiogramme wurde diesmal ein Teil der Säurefraktion auf Whatmann 1-Papier aufgetragen und absteigend in folgenden Gemischen chromatogra
ph iert15: 1. Dimension: Benzol : Eisessig : H20 = 14 A. N . B o o t h , M. S . M a s r i , D. J . R o b b in s , O. H. E m e r s o n ,
F. J. J o n e s u. F. De E d s , J. biol. Chemistry 235, 2649 [I960].
15 R. K. I b r a h i m u. G. H. N . T o w e r s , Arch. Biochem. Bio
physics 87, 125 [I960].
16 A. C. N e i s h , Ann. Rev. P lan t Physiol. 11, 55 [I960].
17E . S t a h l , D ünnschidit-C hrom atographie, Berlin-Göttingen-
H eidelberg, Springer 1962, S. 396.
4 0 0 M. H. ZEN K UND G. M ÜLLER
6 : 7 : 3 (obere Phase), 2. Dimension: Na-Formiat : Ameisensäure : H20 = 10 : 1 : 200. Die Chromato
gramme wurden nach 50-tägiger Exposition auf Rönt
genfilmen mit dem Großflächenzählrohr ausgemessen.
Zur Isolierung der verschiedenen Phenolcarbonsäuren fügte man jeder Säurefraktion genauestens 3 mg in
aktive Träger-Benzoesäure, -Protocatechusäure, -Vanil
linsäure und -Syringasäure zu und trennte auf Kiesel
gel G-Na-Molybdat-Platten in Benzol : Dioxan : Eisessig (90 : 25 : 4) vor; die R f -Werte betrugen für Proto
catechusäure R f 0,32, für Vanillinsäure R f 0,54, für Syringasäure R f 0,53 und für Benzoesäure R f 0,69. Auf S. u. S.-2043 b-Papier wurde in 2-proz. Eisessig Proto
catechusäure ( R f 0,30) von Kaffeesäure ( R f 0,60) ge
trennt und anschließend auf Kieselgel G-Platten in Chlo
roform :Äthylacetat: Ameisensäure (50:40:10, R f 0,47) nochmals gereinigt. Vanillin- und Syringasäure wurden auf Kieselgel G-Platten in Isopropanol : Methylacetat : NH3 (35 : 45 : 20, Vanillinsäure R f 0,15, Syringasäure
R f 0,0) und anschließend in H20-gesättigtem Butyl- äther : Eisessig (91 : 9; Vanillinsäure R f 0,40, Syringa
säure R f 0,25) gereinigt, während Benzoesäure erst auf G-Platten im letztgenannten Lösungsmittel von Zimt
säure abgetrennt wurde und dann nach Papierchromato
graphie auf S. u. S. 2043 b in 2-proz. Eisessig ( R f 0,73) in reiner Form isoliert werden konnte. Daß sich ein Umkristallisieren der auf diese Weise chromatogra
phisch gereinigten Säuren erübrigte, zeigt der folgende Versuch. 10 //Mol p-Hydroxybenzoesäure, aus Catalpa nach Phenylalanin-(3-14C)-Fütterung isoliert, wurden mit 150 //Mol inaktiver Säure verdünnt und 4-mal aus Wasser umkristallisiert. Es ergaben sich folgende spe
zifische Aktivitäten: Ausgangsaktivität: 1,70-IO5; (lx) 1,68 • 105; (2x) 1,74 • 105; (4x) 1,79 * 105; ipm/mMol.
Die Bestimmung der Konzentration erfolgte bei der Benzoesäure gravimetrisch, bei Protocatechusäure, Vanillinsäure und Syringasäure photometrisch mit dem F o l i n - C i a l t e a u - Reagenz. Gleichzeitig wurde die Radioaktivität eines Aliquots der betreffenden gereinig
ten Säuren bestimmt; dabei ergab sich eine 90- bis 100-proz. Übereinstimmung zwischen den aus der T rä
germethode ermittelten und den aus den Chromato
grammen errechneten Gesamtaktivitäten der einzelnen Phenolcarbonsäuren. Da nur die L-Formen der aromati
schen Aminosäuren von den entsprechenden Enzymen desaminiert werden, die D-Formen in höheren Pflanzen zwar metabolisch aufgenommen, aber nicht oder kaum racemisiert werden können 18> 19, wurde der Aufnahme
wert zur Berechnung der Einbaurate halbiert. Bei Catalpa jedoch erübrigte sich, wegen des hohen Gehalts an p-OH-Benzoesäure und p-Cumarsäure im Blatt
gewebe, ein Zusatz inaktiver Trägersubstanz. Der Nach
weis der Phenolcarbonsäuren auf den Chromatogram
men erfolgte durch Sprühen mit diazotierter Sulfanil- säure.
18 D. R. M c C a l l a u. A. C. N e i s h , Canad. J. Biochem. Physiol.
37, 537 [1959],
19 M. H. Z e n k u. H. S c h e r f , Biochim. biophysica A cta [Am
sterdam ] 71, 737 [1963].
Zur Bestimmung der Radioaktivität des C7-Atoms der Benzoesäuren wurden die Säuren auf folgende Weise thermisch decarboxyliert: 1 0 0 //M ol der betref
fenden in Äthanol gelösten Säure wurden in einem Spitz
kölbchen zusammen mit 40 mg Kupferchromit zur Trockne eingedampft. Das Kölbchen wurde danach an eine Verbrennungsapparatur nach Stutz und Burris 20 angeschlossen, ein langsamer N 2-Strom durch die A p
paratur geleitet und die Temperatur vorsichtig21 auf 270 C gebracht. Das C 0 2 wurde in B a (O H )2 absor
biert, die Radioaktivität des B a C 0 3 gem essen und auf unendlich dünne Schicht korrigiert. D ie Ausbeute an C 0 2 betrug durchschnittlich 70 Prozent.
Die Bestimmung von Phenylalanindeam inase und Tyrase erfolgte nach N e i s h 22, wobei das Acetonpulver aus jungen Blättern von C atalpa ovata bereitet wurde.
p-Cumarsäure-(3-14C) wurde enzymatisch aus Tyro- sin-(3-14C) mittels Tyrase nach N e i s h2 2 dargestellt.
E rg eb n isse
Als mögliche Vorstufen der p-Hydroxybenzoe- säure wurden an Blätter von C a ta lp a b ig n o n io id e s Glucose, Phenylalanin, Tyrosin, p-Cumarsäure und Benzoesäure verfüttert. In Vorversuchen hatte sich gezeigt, daß eine 1 0 - 4 -/?i. Lösung der Substanzen durchaus genügte, um einen guten metabolischen Umsatz zu erreichen. Werden drastisch höhere Men
gen geboten, läuft man Gefahr, den Stoffwechsel der Pflanze zu sehr zu belasten und Sekundärreaktionen zu induzieren.
In den in Tab. 1 dargestellten Versuchen wurde je 1 , 2 5 //M ol der markierten V orstufe pro g Fgew.
Blätter angeboten. Eine Ausnahme bildete lediglich p-Cumarsäure, die sich nur mit niedriger spez. A kti
vität gewinnen ließ.
Vergleicht man die Einbauraten der verschiedenen angebotenen Substanzen m iteinander, so zeigt sich, daß Tyrosin am besten in p-Hydroxybenzoesäure eingelagert wird, gefolgt von Phenylalanin; in b ei
den Fällen ließ sich auch p-Cumarsäure im Hydro- lysat nachweisen. Die U m wandlung von Glucose in die Benzoesäure ist bei dieser und einer zehnfach höheren Konzentration im Außenm edium sehr klein.
Die hohe Konzentration von p-H ydroxybenzoe
säure im Gewebe läßt die spezifische Einbaurate sehr gering erscheinen, aber auch hier zeigt sich, daß Tyrosin besser als Phenylalanin in die Benzoesäure umgewandelt wird.
20 R. E. S t u t z u. R. H. B u r r i s , P lan t Physiol. 26. 226 [1951].
21 S . A. B r o w n , G. H. N . T o w e r s u. D. W r i g h t , Canad. J. Bio chem. Physiol. 38, 143 [I960].
22 A. C. N e is h , Phytochem. 1, 1 [1961].
Glucose- (2-14C)
DL-Phenyl- alan in - (3-14C)
DL-Tyrosin- (3-14C)
p -C u m ar- säu re- (3-14C)
B en zo e
sä u re - (7-14C) A k tiv itä t a n g e b o te n [ipm ]
A k tiv itä t au fg en o m m en
6,30 • 106 10.89 •106 8,94 •106 2,0 ■ 105 5,69 • 106 [ipm ]
A k tiv itä t in d e r S ä u re
1.91 • 106 3,6 •106 1,58 •106 1.05 • 105 4,24 • 106 fra k tio n [ipm ]
G e s a m ta k tiv itä t in
COO
O©«o 3,97 •105 5,07 •104 8,0 • 103 1,46 • 106
^j-O H -B enzoesäure [ipm ] S pezifische A k tiv itä t
— 1,29 •104 1,27 •104 — 2,78 • 104
[ipm /m M ol]
A k tiv itä t in d e r C arb o x y l- g ru p p e d. ^j-O H - B en zo esäu re [% ]
6,36 • IO2 4,50 •
96
105 9,30 •105 3,45 • 104 2,20 • 106
E in b a u ra te [% ] — 7,16 •i o - 1 1,61 — 6,55 • IO"1
Spezifische E in b a u r a te [% ] 2,52 • IO“ 5 2,06 •i o - 2 5,19 •1 0 -2 1,73 • 10- 1 9.65 • IO“2
Tab. 1 . E inbau verschiedener Vorstufen (p-C um arsäure: 1 0 ,mMo1 /2 g Fgew .; alle übrig en : 2,5 jWMol/2 g Fgew.) in p-Hydr- oxybenzoesäure durch C. bignonioides.
Der relativ niedrige Einbau von p-Cumarsäure erklärt sich dadurch, daß ein Großteil der p-Cumar- säure als Glucoseester festgelegt wird und auf diese Weise der /^-Oxydation entgeht. Doch beweist der er
zielte Einbau und die im Vergleich mit den anderen V orstufen hohe spezifische E inbaurate die V orläufer
funktion dieser Zim tsäure in der Biosynthese der p-Hydroxybenzoesäure. Die E inbaurate der Benzoe
säure selbst in ihr parahydroxyliertes Derivat be
trägt etwa 0,7 Prozent. Es handelt sich dabei wohl um ein in Bezug auf die Säurekom ponente unspezi
fisches Enzymsystem, das aber spezifisch nur die Parastellung hydroxyliert. So w ird z. B. nicht nur Zim tsäure und Benzoesäure, sondern auch die nicht natürlich vorkommende Phenoxyessigsäure para- hydroxyliert.
Das /?-C-Atom des Phenylalanins wird zur Carb- oxylgruppe der p-Hydroxybenzoesäure, wie durch D ecarboxylierung und Radioaktivitätsbestim m ung erm ittelt werden konnte. Der Einbau des Phenyl
alanins in die p-Hydroxybenzoesäure erfolgt also ohne V eränderung des Kohlenstoffgerüstes der Aminosäure.
Erstaunlich ist der hohe Einbau von Tyrosin in die p-Hydroxybenzoesäure, die — wie wir anneh
men — aus p-Cum arsäure entsteht. Diese Tatsache steht im Gegensatz zu der Beobachtung, daß nur Gramineen in der Lage sind, Tyrosin in phenolische Zim tsäure umzuwandeln, da den übrigen Dikotylen
pflanzen das zur Um wandlung nötige Enzym Tyrase zu fehlen scheint16.
W ir versuchten daher Phenylalanin, Deaminase und Tyrase in einer A cetonpulver-Präparation aus C. ovaZa-Blättern nachzuweisen. Als Test bedienten wir uns der D eam inierung von 14C-markiertem Phenylalanin und Tyrosin 22, 23.
Tab. 2 zeigt das Ergebnis dieser Untersuchung.
Die Identität der entstandenen Zimtsäuren wurde Chrom atographie in m ehreren Laufm itteln geprüft.
ein g esetzte M enge
[t*M]
U m sa tz [xM /Std/g
V e rh ä ltn is j9-C um ar-
sä u re/
Z im tsä u re P h e n y l
a la n in
0,8 D L —14C 19,2 L —12C
1,13
3.3 T y ro sin 0,3 D L —14C
19,7 L —12C
0,34
Tab. 2. Vergleich der P henylalanindeam inase- und Tyrase- A ktivität im Acetonpulver aus C. Ofafa-Blättern. Der T est
ansatz en th ielt: 20 «M ol der betr. A m inosäure ( = 2 juC) , 400 aM ol B oratpuffer p h 8,8, 11,2 mg P rotein (entspr. l g A cetonpulver). Totalvolum en 5 M illiliter. Temp. 40 °C. R eak tionszeit 3 Stunden. A ufarbeitung des Ansatzes nach 1. c. 22.
Es konnte somit in C a ta lp a sowohl Phenylalanin
deaminase als auch Tyrase nachgewiesen werden.
Bemerkenswert erscheint das Bildungsverhältnis von p-Cum arsäure: Zimtsäure von 3,3. Ein so niederes Verhältnis wurde ausschließlich bei Gräsern gefun
den; C a talpa scheint daher die einzige Pflanze außer
halb der Fam ilie der Gramineen zu sein, die eine derartig hohe Tyrase-Aktivität, im Vergleich zur Phenylalanindeaminase-Aktivität, besitzt.
23 J. K o u k o l u. E. E. C o n n , J . biol. Chemistry 2 3 6 , 2692 [1961].
4 0 2 M. H. ZEN K UND G. MÜLLER
Mit Tyrosin als V orläufer ist für die Biosynthese der p-Hydroxybenzoesäure somit die Schlüsselstel
lung der p-Cum arsäure erwiesen. Ob jedoch im Falle der Fütterungsversuche mit Phenylalanin der Weg Zim tsäure —>■ p-Cum arsäure —>■ p-Hydroxybenzoe- säure eingeschlagen wird oder aber Zimtsäure —>
Benzoesäure — p-Hydroxybenzoesäure, ließ sich aus den bisherigen Ergebnissen nicht entscheiden. Es wurde daher versucht, durch kinetische Beobachtung der Einlagerung von Phenylalanin in den organi
schen Säure-pool der CaZa/pa-Blätter Aufschluß über die Reaktionsfolge zu gewinnen.
Die Aufnahme des DL-Phenylalanins in die mit heißem 80-proz. Äthanol extrahierbare Fraktion des Blattes erfolgt bis zur 14. Stde. streng linear. Die in dieser Fraktion gefundene Radioaktivität entspricht nach dieser Zeit 0,625 //Mol Phenylalanin, davon befinden sich 0,30 //M ol in der Säurefraktion des Blattes. Inkubation für weitere 10 Stdn. führt zu kei
ner weiteren Aufnahme des Phenylalanins, jedoch nehmen die U m w andlungsprodukte des Phenylala
nins in der Säurefraktion w ährend dieser Zeit
spanne um ca. 1/s ab.
Die chromatographische Analyse der m arkierten organischen Säuren des Blattes nach 12-stdg. Inku
bation m it Phenylalanin läßt 5 Säuren erkennen, die etwa 95% der gesamten Radioaktivität auf dem Chrom atogram m ausmachen.
Diese Substanzen konnten identifiziert werden als: p-Hydroxybenzoesäure, cis- und trans-p-C um ar- säure, Zimtsäure und eine noch unbekannte Säure (Z ), die mit keiner der üblichen Phenylpropansäu
ren und auch mit keiner mono-, di- oder trihydroxy- lierten Benzoesäure identisch ist.
Abb. 1. K inetik der B ildung von Phenolcarbonsäuren aus DL-Phenylalanin-(3-14C) ( 2 ,5 //M ol/2 g Fgew. durch C. ovata.
p-Hydroxybenzoesäure
(A---A)>
Jrans-p-Cum arsäure ( • — --- • ) , ds-p-C um arsäure ( o — --- O), Zim tsäure(▲---- A), Säure Z ( X --- X ) .
Die Kinetik des Auftretens der Radioaktivität des gefütterten Phenylalanins in den einzelnen Säuren ist aus Abb. 1 zu ersehen. Besonders fällt das parallele Ansteigen von p-Cum arsäure und p-Hy
droxybenzoesäure auf. W ird nach der 14. Stde. kein weiteres Phenylalanin aufgenommen, so bleibt der Betrag an p-Hydroxybenzoesäure auf einem kon
stanten Niveau. Aber nicht nur diese Säure, sondern auch die einmal gebildete Menge an tra n s-p -Cumar- säure bleibt konstant. Dieser Befund spricht nicht dafür, daß die p-Cum arsäure eine Vorstufe der p- Hydroxybenzoesäure ist. Die chromatographische Analyse zeigte jedoch, daß sowohl die gesamte p-Hydroxybenzoesäure als auch die gesamte p-Cu
m arsäure im Blatt vor der alkalischen Hydrolyse als Glucoseester vorlag. In dieser Form der Bindung an Glucose ist die p-Cum arsäure metabolisch inert und kann nicht weiter umgewandelt werden.
Zimtsäure und cj's-Cumarsäure, die ebenfalls in dem Hydrolysat vorliegen, erreichen ein Maximum in der 4. Stde.; während der Betrag an cts-Cumar- säure während der nächsten 20 Stdn. konstant bleibt, nimmt die Aktivität in der Zim tsäure langsam ab.
Da die Inkubation der Blätter im Dunkeln erfolgte und die A ufarbeitung der E xtraktion im gedäm pf
ten Licht vorgenommen wurde, scheint es unw ahr
scheinlich, daß es sich bei der c/5-p-Cumarsäure um einen Artefakt aus der £rans-Cumarsäure durch Be
strahlung handeln kann. Wie oben erw ähnt wurde, sinkt die Radioaktivität, nachdem die Aufnahme des Phenylalanins in das Blatt nach der 14. Stde. be
endet war, in der Säurefraktion um ca. l /s in den folgenden 10 Stdn. ab. Dies ist der rapiden Ab
nahme der Aktivität in der unbekannten Säure Z zuzuschreiben. Diese Säure steigt nach einer lag- phase von etwa 3 Stdn. nach Beginn der Phenyl
alanin-Fütterung parallel zur p-Cum arsäure an, er
reicht ein Maximum nach der 14. Stde. und verliert dann rasch, nachdem die weitere Phenylalaninzufuhr unterbrochen ist, an Aktivität. Möglicherweise han
delt es sich dabei um eine rasch durchgesetzte L ignin
vorstufe.
Radioaktive Benzoesäure oder Tyrosin konnten in den Experimenten nach Phenylalanin-14C-Fütterung weder chromatographisch noch nach Zusetzen inak
tiver T rägersäuren und anschließender Rückisolie
rung der Substanzen gefunden werden.
Somit scheint nun gesichert, daß die Biosynthese von p-Hydroxybenzoesäure aus Phenylalanin und Tyrosin über p-Cumarsäure mit anschließender
/^-Oxydation der Seitenkette dieser Zimtsäure er
folgt. Die H ydroxylierung erfolgt demnach vor der /^-Oxydation.
W enn es sich h ierb ei um ein en generellen M echa
nism u s für d ie B io sy n th ese von B enzoesäuren h an delt, w as außer unseren V ersuchen auch die von Schütte und Gross für B en zoesäu re und Grisebach
und Vollmer 7 für S a licy lsä u re verm uten lassen, so sollte P h en y la la n in durch d ie h öh ere Pflanze auch in Protocatechu-, V a n illin - und S yrin gasäu re e in g e baut w erden können.
Die Biosynthese dieser Säuren wurde mit der Trägerm ethode untersucht. Zu den hydrolysierten A lkoholextrakten aus Phenylalanin-(3-14C) gefütter
ten Blättern wurde jeweils eine konstante Menge Benzoe-, Protocatechu-, Vanillin- und Syringasäure zugesetzt und nach der oben beschriebenen Methode die Säuren in reiner, kristalliner Form zurückgewon
nen. Die spezifische Aktivität wurde an einem Ali
quot bestim m t und die Gesamtaktivität der betref
fenden Säure im G esam thydrolysat durch Umrech
nung auf den eingesetzten Betrag an Säure ermittelt.
Da die endogene Konzentrationen der Benzoesäuren in den Blättern sehr gering war, wurde sie bei der Berechnung nicht berücksichtigt. Die mittels der T rä
germethode erzielten Ergebnisse über die Verteilung der Aktivitäten in den Benzoesäuren der Blatthydro-
lysate stimmten mit W erten, die mit Hilfe von zwei
dimensionalen Chrom atogram m en und Bestimmung der prozentualen Aktivitäten erzielt wurden, gut überein.
Wie aus Tab. 3 hervorgeht, wurde Phenylalanin am besten in die Benzoesäure eingebaut. W ir kön
nen somit die von Gr o s s und Sc h ü t t e an E ry th r o x y - lon erzielten Ergebnisse auch für andere Pflanzen
arten bestätigen; die Decarboxylierung der aus T suga gewonnenen Benzoesäure zeigte, daß auch hier das /?-C-Atom des Phenylalanins zur Carboxyl- gruppe der Benzoesäure geworden war.
Vaccinium zeigte gute Einlagerungen der Amino
säure in Protocatechusäure. Gleichzeitig konnte die Vorstufe der Protocatechusäure, nämlich Kaffee
säure, ohne Zusatz von Trägerm aterial kristallin mit einer spez. Aktivität von 1 ,4 'IO 6 (ipm/mM ol) isoliert werden.
M arkierte Vanillinsäure wurde nach Phenylala
ninfütterung in Blättern der Zitterpappel gefunden.
Auch hier zeigte die Decarboxylierung wie im Falle der Benzoesäure und Protocatechusäure, daß P he
nylalanin direkt und ohne Umbau des Kohlenstoff
gerüstes in die Benzoesäuren eingebaut wird.
In keinem der Fälle (bei 6 untersuchten Pflan
zen) ist es jedoch gelungen, weder nach saurer noch nach alkalischer Hydrolyse, radioaktive Syringa-
Tsuga canadensis
V accinium vitis-idea
P o p u lu s trem ula A k tiv itä t a n g e b o te n [ipm] 6,0 • 106 6,0 • 106 6,0 • 106 A k tiv itä t au fg en o m m en [ipm]
A k tiv itä t in d e r S ä u re
3,0 • 106 2,9 • 106 2,5 • 106 fra k tio n [ipm ]
G e s a m ta k tiv itä t in B enzoe
6,4 • 105 6,1 • 105 5,8 • 105 s ä u re [ipm ]
A k tiv itä t i. d. K a rb o x y lg ru p p e
9.3 • 104 2,1 • 104 5,1 • 104 d . B en zo esäu re [% ]
E in b a u r a te in die
93 — —
B en zo esäu re [% ] G e s a m ta k tiv itä t in P ro to
6,2 1,4 4,1
c a te c h u sä u re [ipm ]
A k tiv itä t i. d. K a rb o x y lg ru p p e
7,7 • IO2 1,8 • 104 0
d . P ro to c a te c h u s ä u re [% ] E in b a u r a te in die P ro to
89 —
c a te c h u sä u re [% ] G e s a m ta k tiv itä t in
5,1 • IO- 2 1,2 —
V a n illin sä u re [ipm ] A k tiv itä t i. d. K a rb o x y lg ru p p e
0 1,2 • 103 2,1 • 104 d . V a n illin sä u re [% ]
E in b a u r a te in die
— — 96
V a n illin sä u re [% ] G e s a m ta k tiv itä t in
— 8,3 • IO“2 1,7
S y rin g a sä u re [ipm ] 0 0 o
Tab. 3. E inbau von DL-Phenylalanin-(3-14C) (2,5 ^M ol/2 g Fgew.) in verschiedene Benzoesäuren durch Tsuga canadensis, Vac
cinium vitis-idea und Populus tremula.
4 0 4 M. H. ZEN K UND G. M ÜLLER
säure zu erhalten, obwohl im Falle von P o p u lu s auf den Chrom atogram m en endogene Syringasäure in Spuren festzustellen war. Jedoch wäre es unw ahr
scheinlich, daß die Biosynthese dieser Säure nicht auch nach dem obigen Schema der /^-Oxydation aus Sinapinsäure erfolgen würde.
D iskussion
D urch d ie V ersuche b eson d ers von Gross und Schütte6, desgleich en von Grisebach und Vollmer ' ist gezeig t w orden, daß P h en ylp rop an e als V o rstu fen für B enzoesäuren in höheren Pflanzen in F rage kom m en. D ie S eitenkette der P h en ylp rop an e w ird dabei durch /^-Oxydation entfernt. Es war jedoch bisher nicht geklärt, ob d ie H y d ro x y lieru n g der phe- nolischen B en zoesäu ren auf der S tu fe des P h e n y l
propans oder erst au f der S tu fe der B en zoesäure erfolgt.
Durch V erfütterung m arkierter potentieller V or
stufen konnte für den Fall der p-Hydroxybenzoe- säure nun gezeigt werden, daß sowohl nach Phenyl
alanin- als auch nach Tyrosin-Fütterung m arkierte p-Cum arsäure au ftritt; sie kann deshalb als direkter V orläufer betrachtet werden.
Daß /rans-p-Cum arsäure und p-Hydroxybenzoe- säure in den C a ta lp a-Blättern gleichzeitig und mit derselben Geschwindigkeit gebildet werden, kann durch zwei um die p-Cum arsäure konkurrierende Reaktionen erklärt werden. Einmal wird die p-Cu
m arsäure via Coenzym A aktiviert und durch die Reaktionen der /^-Oxydation zu p-Hydroxybenzoe- säure abgebaut, die ihrerseits in einen Glucoseester übergeführt wird. Der Überschuß an p-Cumarsäure
wird direkt mit Glucose verestert. Die Reaktions
abläufe sind in Abb. 2 dargestellt.
U nter unseren experimentellen Bedingungen scheint die Bildungsgeschwindigkeit von p-Cuma- royl-glucose und p-Hydroxybenzoyl-glucose gleich groß zu sein (8 m « M ol/S tde.).
Die l-/?-n-Glucoseester werden nicht über die CoA-Thioester gebildet, sondern die Synthese erfolgt via Uridindiphosphoglucose (U D PG ), wie sich durch Umsetzung von p-Hydroxybenzoesäure mit UDPG unter experimentellen Bedingungen nach
Ja c o b e l l i et al. 24 beweisen ließ. Das aus der ß -O x y - dationsspirale austretende p-Hydroxybenzoyl-CoA muß also zunächst deacyliert werden. Eine entspre
chende Deacylase konnte unter Verwendung von Benzoyl-CoA als Substrat nachgewiesen werden. Die Ergebnisse von McCa l l a und Ne i s h 1 8 ,16 haben ge
zeigt, daß sich die Zimtsäuren, die als L igninvorstu
fen in Frage kommen, von dem einfachsten V ertre
ter, nämlich Zimtsäure selbst, durch schrittweise H y
droxylierung und M ethoxylierung in die m ehr kom
plexeren Glieder der Reihe umwandeln lassen. D a
bei ließ sich folgende Sequenz durch Applizierung m arkierter Vorläufer aufstellen: Zim tsäure p-Cu- m arsäure —>■ Kaffeesäure — Ferulasäure -> Sina
pinsäure. Die einzelnen Schritte scheinen irreversibel zu sein. Durch Fütterung von m arkiertem Phenyl
alanin ist es nun möglich geworden, auch die ent
sprechenden hydroxylierten und methoxylierten Ben
zoesäuren radioaktiv zu erhalten, wobei in zwei F äl
len die entsprechende direkte Zimtsäure-Vorstufe ebenfalls gefaßt werden konnte. D araus ergibt sich ein enger Zusammenhang zwischen den Zimtsäure- und Benzoesäure-Biosynthesen, wie er in Abb. 3 schematisch dargestellt ist.
Phenylalanin -> Zimtsäure --- - 1-Zinnamoyl-glucose
I UDPG
Tyrosin -> p-Cumarsäure —* 1-p-Cumaroyl-glucose I
p-Cumaroyl-CoA
•J. /?-Oxydation
p-Hydroxybenzoyl-CoA
•j, Deacylase
p-Hydroxybenzoesäure 1-p-Hydroxybenzoyl-glucose (UDPG = Uridindiphosphoglucose)
(CoA = Coenzym A)
Abb. 2. Schema des Phenylpropanstoffwechsels in Catalpa ovata.
24 G. J a c o b e l l i , M. J . T a b o n e u . D. T a b o n e , Bull. Soc. Chim. biol. 40, 955 [1958].
Phenylalanin -> Zimtsäure ° xydalI0n_> BenzoesäUre
Tyrosin -*■ p-Cum arsäure---* p-Hydroxybenzoesäure I
K a f f e e s ä u r e ---* Protocatechusäure I
Ferulasäure — Vanillinsäure
Lignin
\
1
Sinapinsäure — Syringasäure Abb. 3. Zusamm enhang zwischen Zim tsäure- und Benzoesäure-
Biosynthesen in der höheren Pflanze.
Ebenso ist für die Salicylsäure-Biosynthese der Weg: Zim tsäure — o-Hydroxyzimtsäure —>■ Salicyl- säure diskutiert worden '. Als möglicher Nebenweg zu dem in Abb. 3 gezeigten Schema ist für Gallus
säure führende Pflanzen eine weitere H ydroxylie
rung der Kaffeesäure zu 3.4.5-Trihydroxyzim tsäure und anschließender /9-Oxydation zu Gallussäure er
wogen worden 9.
Eine mögliche physiologische Rolle könnte den Benzoesäuren, zu Zeiten der Wachstumsruhe, durch
die Verm inderung des Pools an Zimtsäure-Lignin- Vorstufen, zukommen. So haben Hö r h a m m e r und
Sc h e r m 25 gezeigt, daß z. B. Protocatechusäure in F a g o p y ru m escu len tu m erst in der ausgewachsenen Pflanze in größerer Menge akkum uliert wird, nicht aber während der Hauptwachstumszeit, wo die Zimt
säuren sicherlich zur Lignin-Synthese verwendet werden.
Der D e u t s c h e n F o r s c h u n g s g e m e i n s c h a f t danken wir für die Gewährung einer Sachbeihilfe.
25 L. Hö r h a m m e r u. A. Sc h e r m, Arch. Pharm az. Ber. dtsch. pharm az. Ges. 288, 441 [1955].
