Pulmonale und kardiale Effekte neuer Kinaseinhibitoren zur Therapie der pulmonalen arteriellen Hypertonie

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Tierärztliche Hochschule Hannover

Pulmonale und kardiale Effekte neuer

Kinaseinhibitoren zur Therapie der pulmonalen arteriellen Hypertonie – differentielle Analyse

durch gezielte tierexperimentelle Ansätze

INAUGURAL – DISSERTATION

zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -

( Dr. med. vet. )

vorgelegt von Wiebke Janssen

aus Göttingen

Hannover 2009

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Wissenschaftliche Betreuung:

Herr Univ.-Prof. Dr. Hansjoachim Hackbarth

Institut für Tierschutz und Verhalten der Tierärztlichen Hochschule Hannover

Herr PD Dr. Stefan Schäfer

Cardiology Research BayerHealthCare, Bayer Schering Pharma, Wuppertal

1. Gutachter: Prof. Dr. Hansjoachim Hackbarth 2. Gutachter: Prof. Dr. Manfred Kietzmann

Tag der mündlichen Prüfung: 23.03.2009

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Meinen Eltern

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Teilergebnisse dieser Arbeit wurden an folgenden Stellen veröffentlicht:

JANSSEN, W., P.ELLINGHAUS, H. HACKBARTH, S. SCHÄFER u. M. KLEIN (2008):

Combined inhibition of tyrosine and serine/threonine kinases ameliorates myocardial fibrosis and diastolic dysfunction in the pressure overloades right heart

Clin Res Cardiol 97, Suppl. 1

(Posterpräsentation ECC Mannheim)

KLEIN, M., W. JANSSEN, P. ELLINGHAUS, R. KAST u. S. SCHÄFER (2008):

Effects of PDE5-inhibition by Sildenafil on myocardial function and hypertrophy in right ventricular pressure load

Clin Res Cardiol 97, Suppl. 1

(Posterpräsentation ECC Mannheim)

SCHÄFER, S., P. ELLINGHAUS, W. JANSSEN u. M. KLEIN (2008):

Sildenafil prevents right ventricular remodeling in monocrotaline induced pulmonary hypertension. Effect of right ventricular unloading

Cardiovascular Research [in Review]

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Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung... 1

2 Literaturteil... 4

2.1 Pulmonale arterielle Hypertonie (PAH)... 4

2.1.1 Einführung in die Thematik... 4

2.1.2 Definition und Vorkommen... 5

2.1.3 Prognose... 6

2.1.4 Gegenwärtige Therapiestrategien der PAH... 6

2.1.5 Physiologische Besonderheiten des Lungenkreislaufes und pulmonalvaskuläres Remodelling... 9

2.1.6 Kardiale Effekte der pulmonalen arteriellen Hypertonie... 12

2.1.6.1 Cor pulmonale... 12

2.1.6.2 Rolle von Raf-Proteinen bei Herzhypertrophie... 12

2.1.7 Kinaseinhibitoren... 14

2.1.7.1 Imatinib... 14

2.1.7.2 Sorafenib... 15

2.2 Tiermodelle für pulmonale arterielle Hypertonie... 16

2.2.1 Hypoxie-Modell... 17

2.2.2 Tiermodell für Rechtsherzinsuffizienz... 20

2.2.2.1 Stenosemodell der Arteria pulmonalis... 20

2.3 Ziel der Arbeit... 22

3 Materialien und Methoden... 23

3.1 Materialien... 23

3.1.1 Versuchstiere... 23

3.1.2 Injektionslösungen und Substanzen... 24

3.1.3 Verbrauchsmaterial... 24

3.1.4 Operationsbesteck... 25

3.1.5 Nahtmaterial... 25

3.1.6 Geräte... 25

3.2 Methoden und Modelle... 27

3.2.1 Hypoxie-Modell... 27

3.2.2 Stenosemodell der Arteria pulmonalis... 29

3.2.3 Medikamentöse Intervention... 33

(6)

3.2.4 Invasive hämodynamische Messungen... 34

3.2.4.1 Narkose... 34

3.2.4.2 Tracheotomie... 35

3.2.4.3 Beatmung und EKG... 36

3.2.4.4 Hämodynamische Messung... 36

3.2.4.5 Hämodynamische Parameter... 36

3.2.4.6 Bestimmung des Herzindex (CI)... 37

3.2.5 Proben... 38

3.2.5.1.Blutproben... 38

3.2.5.2 Organproben... 39

3.2.5.3 Präparation der Organe... 39

3.2.6 RNA Extraktion und qualitative Echtzeit-Polymerase-Ketten-Reaktion (RT-PCR)... 40

3.3 Statistik... 42

4 Ergebnisse... 43

4.1 Übersicht der bestimmten Parameter... 43

4.2 Ergebnisse Hypoxie Studie 1: Zeitverlauf... 44

4.2.1 Überleben... 44

4.2.2 Systemisch-arterieller Blutdruck... 44

4.2.3 Herzfrequenz... 45

4.2.4 Rechtsventrikulärer systolischer Druck... 46

4.2.5 Rechtsventrikulärer enddiastolischer Druck... 47

4.2.6 Herzindex... 48

4.2.7 Rechtsherzhypertrophie... 49

4.3 Ergebnisse Hypoxie Studie 2: Dosis-Wirkungs-Studie mit Sorafenib... 50

4.3.1 Überleben... 50

4.3.6 Herzindex... 54

4.4 Ergebnisse Hypoxie Studie 3: Direkter Vergleich von Sorafenib 10 mg/kg zu Imatinib 50 mg/kg... 56

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4.4.1 Überleben... 56

4.5 Ergebnisse Stenosemodell der Arteria pulmonalis... 61

4.5.1 Überleben... 61

4.5.6 Herzindex... 66

4.5.8 ANP und r-BNP mRNA-Expressionslevel im rechten Ventrikel... 68

4.5.9 r-Typ 3 Kollagen α1 mRNA-Expressionslevel im rechten Ventrikel.... 69

4.5.10 rCTGF und r-Fibronectin mRNA-Expressionslevel im rechten Ventrikel... 70

4.5.11 rMMP-2 mRNA-Expressionslevel im rechten Ventrikel... 71

4.5.12 Expressionslevel verschiedener Marker im rechten Ventrikel... 72

5 Diskussion... 73

5.1 Kinaseinhibitoren und PAH... 73

5.2 Experimentelles Modell der Hypoxie-induzierten pulmonalen arteriellen Hypertonie bei der Ratte... 75

5.3 Experimentelles Modell der Stenose-induzierten Rechtsherzinsuffizienz bei der Ratte... 77

5.4 Kombination zweier Tiermodelle... 79

5.5 Diskussion der Ergebnisse... 79

5.6 Klinische Relevanz und Ausblick... 82

6 Zusammenfassung... 84

7 Summary... 86

8 Literaturverzeichnis... 88

9 Abbildungsverzeichnis... 98

10 Tabellenverzeichnis... 100

(8)

11 Danksagungen... 101 12 Lebenslauf... 103

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Abkürzungsverzeichnis

% Prozent

ANOVA Analysis of Variance, Varianzanalyse ANP Atriales natriuretisches Peptid

Bcr-Abl Breakpoint cluster region - Abelson

BMPR-2 Bone morphogenetic protein receptor type II BNP Brain natriuretic peptide

°C Grad Celsius

Ca²⁺ Calciumion

cAMP Zyklisches Adenosinmonophosphat

CI Herzindex

c-kit Stammzellfaktor

cm Zentimeter

CML Chronische myeloische Leukämie COL3A1 Kollagen Typ 3 α 1

CTGF Connective Tissue Growth Factor EGF Epidermal Growth Factor

ERK Extracellular Signal-Regulated Kinase ETA Endothelinrezeptor A

ETB Endothelinrezeptor B ET-1 Endothelin-1

FGF Fibroblast Growth Factor

g Gramm

GIST Gastrointestinale Stromatumoren GTP Guanosintriphosphat

HCC Hepatozelluläres Karzinom

HR Heartrate

IGF Insulin-like Growth Factor i.v. Intravenös

K⁺ Kaliumion

kg Kilogramm

l Liter

LV+S Linker Ventrikel + Septum

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mm Millimeter

MAPK Mitogen-activated Protein Kinase MCT Monocrotalin

MEK Mitogen-activated Protein Kinase Kinase

mg Milligramm

min Minute

ml Milliliter µl Mikroliter

µm Mikrometer

mmHg Millimeter Quecksilbersäule MMP-2 Matrix metallopeptidase 2 mRNA messenger Ribonukleinsäure

nM Nanomolar

NO Stickoxid

NYHA New York Health Association

O2 Sauerstoff

PAH Pulmonale Arterielle Hypertonie PDE Phosphodiesterase

PDGF Platelet-derived Growth Factor

PDGFR Platelet-derived Growth Factor Receptor

PE Polyethylen

PI3K Phosphatidyl-inositol-3-phosphat-kinase p. os Per os

Raf-1 Mitogen-activated Protein Kinase Kinase Kinase RCC Nierenzellkarzinom

RNA Ribonukleinsäure

RT-PCR Real-time Polymerase Chain Reaction RV Rechter Ventrikel

RVEDP Rechtsventrikulärer enddiastolischer Druck RVSP Rechtsventrikulärer systolischer Druck SAP Systemisch-arterieller Druck

s.c. Subkutan

SEM Standard Error of the Mean TGF Transforming Growth Factor

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USA United States of America

VEGF Vascular Endothelial Growth Factor

VEGFR Vascular Endothelial Growth Factor Receptor WHO World Health Organisation

z.B. Zum Beispiel z.Z. Zur Zeit

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1 Einleitung

Die pulmonale arterielle Hypertonie (PAH) ist eine lebensbedrohende Erkrankung, welche durch eine progressive Vaskulopathie der pulmonalen Arterien und einem daraus entstehenden, meist tödlich endenden Rechtsherzversagen gekennzeichnet ist. Pathomorphologisch finden sich langfristige Umbauvorgänge, die in ihrer Gesamtheit als Remodelling bezeichnet werden. Dieses Remodelling ist im Einzelnen gekennzeichnet durch eine Umstrukturierung der Gefäßwände in der Lungenstrombahn, welche durch eine endotheliale Schädigung mit Endothelzellproliferation, Thrombosierungen, Neomuskularisierung und Mediahypertrophie charakterisiert ist. Die endotheliale Dysfunktion der pulmonalen Arterien führt u.a. zu einer Freisetzung von Wachstumsfaktoren, woraus letztlich eine fortschreitende progressive vaskuläre Obstruktion und Obliteration resultiert. Darüber hinaus sind in den Gefäßen vor allem Hypertrophie, Fibrose und interstitielle Entzündung zu beobachten. Aber auch am rechten Herzen finden aufgrund der erhöhten Druckbelastung durch die pulmonale Zirkulation langfristige Umbauprozesse in Form von Myokardhypertrophie, Fibrose und interstitieller Entzündung (myokardiales Remodelling) statt.

Die PAH hatte in den 1980iger Jahren mit einer mittleren Überlebensrate von 2,8 Jahren ab Diagnosestellung (TAICHMANN u. MANDEL 2007) noch eine sehr schlechte Prognose. Auch wenn in den letzten Jahrzehnten große Fortschritte bei der Behandlung von PAH gemacht wurden, existiert bis heute keine Heilung. Der Fokus lag zunächst auf der Suche nach einem selektiven pulmonalen Vasodilatator. Das erste Medikament, welches 1995 in den USA speziell für die Therapie der PAH zugelassen wurde, war Epoprostenol. Je mehr die Forschung in den späten 90igern über die Pathogenese von PAH erfahren konnte, desto mehr wurde offensichtlich, dass alternative Wirkstoffe entwickelt werden müssen, um die zugrunde liegende Vaskulopathie zu behandeln.

Einen wichtigen Baustein zum Verständnis der Pathogenese der PAH und zur Beurteilung der Wirkung neuer therapeutischer Interventionen stellen geeignete Tiermodelle dar. Für PAH wurden zwei verschiedene in-vivo-Modelle bei der Ratte

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charakterisiert - das Monocrotalin-Modell und das Hypoxie-Modell (MARSBOOM u.

JANSSENS 2004). Diese in-vivo-Modelle imitieren dabei fast alle typischen Charakteristiken der Pathophysiologie von humaner PAH, wie z.B.

Neomuskularisierung (HUBER 2007), in-situ-Thombosierung (HIGHLAND 2008) sowie Hypertrophie der Media und Adventitia der Lungenarterien (FARBER u.

LOSCALZO 2004). Lediglich die Endothelzellproliferation (plexiforme Läsionen) ist histologisch nicht nachweisbar (MARSBOOM u. JANSSENS 2004). Das bei der PAH beim Menschen zum Tode führende Rechtsherzversagen ist ebenfalls ein Charakteristikum der oben genannten Tiermodelle. Bei der Entwicklung neuer Therapieoptionen für PAH kann bei diesen beiden in-vivo-Modellen jedoch nicht zwischen einer, sekundär durch die Verbesserung der vaskulären Umbauprozesse in der Lungenstrombahn bedingten, verminderten rechtsventrikulären Hypertrophie bzw. Fibrose und einem möglichen direkten myokardialen anti-remodelling Effekt auf das (rechte) Herz unterschieden werden.

Neben primären vasodilatatorischen Therapien haben in der letzten Zeit solche Ansätze vermehrt Interesse gefunden, welche die dem Remodelling zugrunde liegenden Mechanismen direkt adressieren. Rezeptor-Tyrosin-Kinasen scheinen hierbei eine besondere Bedeutung zu haben. Tierexperimentell konnte kürzlich durch die Hemmung von Tyrosinkinasen, wie zum Beispiel des Platelet-derived growth factors (PDGF-) -Rezeptors, die abnormale Proliferation und Migration von pulmonalen glatten Gefäßmuskelzellen verringert werden (SCHERMULY, et al.

2005). Tyrosinkinasen gehören zu der Gruppe der Proteinkinasen, die die Funktion haben, die Aktivität von Enzymen oder Transkriptionsfaktoren zu regulieren. Sie regulieren die Proliferation, Migration und Apoptose von Zellen und spielen daher eine wichtige Rolle bei der Zelldifferenzierung und dem Zellwachstum. So ist eine Fehlregulation von Tyrosinkinasen häufig mit tumorösen Veränderungen verbunden.

Inhibitoren von Proteinkinasen werden erfolgreich in der Therapie verschiedener tumoröser Erkrankungen eingesetzt.

Im Bezug auf PAH konnte jedoch noch nicht gezeigt werden, inwieweit eine zusätzliche Hemmung von Serin-/Threonin-Kinasen einen weiteren positiven Nutzen im Vergleich zu einem reinen Tyrosin-Kinase-Inhibitor haben könnte. Vor allem die Serin-/Threonin-Kinase Raf-1 ist nicht nur an der Proliferation der glatten

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Gefäßmuskelzellen in der Lunge, sondern auch an den Prozessen des kardialen Remodellings maßgeblich beteiligt (HARRIS, et al. 2004). Daraus entwickelt sich die Hypothese, dass kombinierte Tyrosin- und Serin/Threonin-Kinase-Inhibitoren nicht nur die Zellproliferation in den pulmonalen Gefäßen hemmen, sondern auch die Veränderungen am Myokard, wie z. B. Hypertrophie, Fibrose und interstitielle Entzündung, bei PAH positiv beeinflussen können.

Der Schwerpunkt dieser Arbeit war, einen tierexperimentellen Versuchsaufbau zu entwickeln, mit dem separat die pulmonalen und myokardialen Effekte von neuen Substanzen zur Behandlung der pulmonalen Hypertonie auf das pulmonale und myokardiale Remodelling untersucht werden können. Dies erfolgte durch die gemeinsame Betrachtung zweier relevanter Tiermodelle, zum einen die hypoxie- induzierte PAH und zum anderen die rechtsventrikuläre Druckbelastung. Der Nutzen der kombinierten Betrachtung dieser beiden Tiermodelle wurde beispielhaft an der dualen vaskulären und kardialen Wirkung von einem kombinierten Tyrosin- und Serin/Threonin-Kinase Inhibitor gegenüber einem reinen Tyrosin-Kinase Inhibitor mit alleiniger vaskulärer Wirkung gezeigt.

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2 Literaturteil

2.1 Pulmonale arterielle Hypertonie (PAH)

2.1.1 Einführung in die Thematik

Eine „Sklerosierung der pulmonalen Arterien“ ohne eine ersichtliche Erklärung wurde erstmals 1891 von Ernst von Romberg (ROMBERG 1891) dokumentiert. Erst in den 1950iger Jahren, als die Anfänge der Herzkatheterisierung eine Untersuchung der hämodynamischen Veränderungen bei dieser Erkrankung ermöglichten, beschrieben David Dresdale und Kollegen eine hypertensive Vaskulopathie der pulmonalen Zirkulation (DRESDALE, et al. 1951). Diese war charakterisiert durch Vasokonstriktion, eine Erhöhung der pulmonalarteriellen Drücke und eine Antwort auf eine Injektion von Tolazoline, einem Vasodilatator mit sowohl pulmonalen als auch systemischen Effekten. Da diese Form der Erkrankung ätiologisch unklar war, wurde sie zunächst als „primäre pulmonale Hypertonie“ bezeichnet. Fälle von pulmonaler Hypertonie bei denen eine eindeutige Ursache festgestellt werden kann (z.B.

Linksherzerkrankungen, chronischen Erkrankungen des respiratorischen Systems), wurden entsprechend als „sekundäre pulmonale Hypertonie“ benannt.

Seit 1973 wurden von der WHO mehrere Versuche unternommen, klinisch brauchbare Klassifizierungsschemata für pulmonal-hypertensive Erkrankungen zu finden. Die derzeitige Klassifizierung gemäß der PAH-Weltkonferenz in Venedig 2003 basiert auf einer hämodynamischen Definition von pulmonaler Hypertonie, verbunden mit klinischen und assoziierten Charakteristiken und umfasst fünf Gruppen (SIMONNEAU, et al. 2004) (Tabelle 1):

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1. Pulmonal arterielle Hypertonie (PAH)

• idiopathisch

• familiär

• assoziiert mit Kollagenosen, kongenitalen systemisch-pulmonalen Shuntvitien, portaler Hypertension, HIV- Infektion, Drogen oder Medikamente

• andere Erkrankungen (Schilddrüsenerkrankungen, Glykogenspeicherkrankheiten, M. Gaucher, hereditäre Teleangieektasie, Hämoglobinopathien, myeloproliferative Erkrankungen, Splenektomie)

• assoziiert mit signifikanter venöser/kapillärer Beteiligung: pulmonale venookklusive Erkrankung, pulmonal kapilläre Hämangiomatose

• persistierende pulmonale Hypertonie der Neugeborenen 2. Pulmonale Hypertonie bei Linksherzerkrankungen

• linksatriale oder linksventrikuläre Erkrankungen

• linksseitige Klappenerkrankungen

3. Pulmonale Hypertonie assoziiert mit Lungenerkrankungen und/oder Hypoxie

• chronisch obstruktive Lungenkrankheit

• interstitielle Lungenkrankheit

• Schlafapnoesyndrom

• Erkrankungen mit alveolärer Hypoventilation

• Höhenbewohner

• pulmonale Entwicklungsstörungen

4. Pulmonale Hypertonie aufgrund chronischer thrombotischer und/oder embolischer Erkrankungen

• Thromboembolie der proximalen Lungenarterien

• Obstruktion der distalen Lungenarterien

• Lungenembolie (Tumor, Parasiten, Fremdkörper) 5. Sonstige

• Sarkoidose, Histiozytosis X, Lymphangioleimyomatose, Gefäßkompression von außen (Lymphknoten, Tumor, fibrosierende Mediastinitis)

(nach SIMONNEAU, et al. 2004)

Tabelle 1: Klinische Klassifikation der Pulmonalen Hypertonie (Venedig 2003)

Die vorliegende Arbeit befasst sich ausschließlich mit der pulmonalen arteriellen Hypertonie (PAH), weil sich diese besonders im Fokus der derzeitigen Forschung befindet und, weil alle derzeit für eine Therapie zugelassenen Substanzen nur für die Behandlung von PAH-Patienten zugelassen sind.

2.1.2 Definition und Vorkommen

Die pulmonale arterielle Hypertonie (PAH) wird definiert als eine chronische Erhöhung des mittleren pulmonalarteriellen Druckes (PAP) auf über 25 mmHg in Ruhe und auf über 30 mmHg unter Belastung (TAICHMANN u. MANDEL 2007). Ein erhöhter Vasotonus in den pulmonalen Gefäßen, eine qualitative und quantitative Umstrukturierung der Gefäßwände (vaskuläres Remodelling) und eine Hypertrophie

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des rechten Herzens (Vergrößerung des rechten Herzens aufgrund einer erhöhten Nachlast: Cor pulmonale) charakterisieren die PAH.

Die PAH ist eine seltene Erkrankung mit einer geschätzten Inzidenz von einem bis zwei Fällen pro 1 Million Einwohner pro Jahr in Industriestaaten. Die Erkrankung tritt sowohl bei Frauen als auch bei Männern auf, wobei Frauen häufiger betroffen sind (im Verhältnis von 1,6:1). Der Häufigkeitsgipfel in der Altersverteilung liegt für Frauen zwischen 21 und 40 Jahren und für Männer zwischen 31 und 40 Jahren. Meistens werden die Patienten mit Dyspnoe vorgestellt. Die mittlere Zeit vom Auftreten der ersten Symptome bis zur Diagnosestellung liegt aufgrund der Diversität der Anzeichen und Symptome bei durchschnittlich 2 Jahren (TAICHMANN u. MANDEL 2007).

2.1.3 Prognose

Die Prognose der PAH ist aufgrund des Fehlens einer adäquaten und effektiven Therapie schlecht. Die mittlere Überlebensdauer ohne Therapie liegt bei ca. 2,8 Jahren. Der größte Teil der Patienten verstirbt aufgrund eines Rechtsherzversagens (TAICHMANN u. MANDEL 2007). Unter Therapie mit den derzeit zugelassenen Substanzen, wie z. B. Prostanoide, Endothelinrezeptor-Antagonisten oder Phosphodiesterase-Inhibitoren, lassen sich Überlebensraten zwischen 85% nach einem Jahr und 60% nach drei Jahren erreichen (HUBER, et al. 2007). Die derzeit zugelassenen Substanzen zur Therapie der PAH erreichen jedoch nur eine Senkung des pulmonalen Gefäßwiderstandes und eine Verbesserung der Leitungsfähigkeit sowie der Lebensqualität der betroffenen Patienten.

2.1.4 Gegenwärtige Therapiestrategien der PAH

Die medikamentösen Therapien der PAH zielen derzeit nur auf zwei der drei pathogenetisch wichtigsten Faktoren ab: Vasodilatation und Anti-Aggregation. Der dritte und scheinbar auch wichtigste Faktor, die fortschreitende Proliferation der pulmonalen Gefäßzellen, wird von keiner der heute zugelassenen Substanzen direkt antagonisiert (GHOFRANI, et al. 2006). Die verwendeten Medikamente können die Krankheit zwar nicht heilen, sind aber in der Lage, die Belastungstoleranz und die

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Lebensqualität der Patienten deutlich zu verbessern und die Letalität zu reduzieren (HUBER, et al. 2007).

Derzeit werden für die Therapie der PAH Prostanoide, Endothelinrezeptor- Antagonisten und Phosphodiesterase-5-Inhibitoren eingesetzt. Allen diesen Substanzen ist ihre vasodilatative Eigenschaft gemeinsam. Die Blockade von Calciumkanälen war das erste pharmakologische Therapieprinzip, welches zur Behandlung von PAH-Patienten eingesetzt wurde. Auf die sogenannten Calciumkanalblocker (z.B. Diltiazem, Nifedipin oder Verapamil) reagieren allerdings nur ca. 20% aller PAH-Patienten positiv, daher kommt auch nur bei diesen sogenannte „Respondern“ eine derartige Therapie infrage (BRUCH, et al. 2002). Als Ursache dafür wird diskutiert, ob bei den Respondern eine starke, aber reversible Vasokonstriktion als Hauptursache für die PAH vorliegt, und nicht so sehr die strukturellen vaskulären Veränderungen mit einem chronischen Gefäßumbau (HUBER, et al. 2007).

Im Jahr 1976 wurde das vasodilatative und antiaggregatorische Prostazyklin, welches von allen Endothelien sezerniert wird, entdeckt und 1980 erstmals bei PAH eingesetzt (OLSCHEWSKI, et al. 2005). Es war das erste Medikament, welches für die Indikation PAH in den USA (intravenöses Epoprostenol) und in mehreren europäischen Ländern (intravenöses Iloprost) zugelassen wurde. Prostazykline wirken im Gefäßendothel relaxierend auf die glatten Gefäßmuskelzellen, indem sie die intrazelluläre Produktion von cAMP anregen. Aufgrund seiner kurzen Plasmahalbwertszeit kann Epoprostenol nur kontinuierlich intravenös infundiert werden, was zu schwerwiegenden Nebenwirkungen aufgrund des Verabreichungssystems (z.B. Infektion, Sepsis oder Unterbrechung der Medikamentenzufuhr aufgrund einer Verlegung des Katheters) führen kann. Daher wurde ein stabiles Prostazyklin-Analogon (Trepostinil) zur subkutanen Infusion über eine Minipumpe entwickelt. Außerdem wurde Iloprost zugelassen, welches über Inhalation verabreicht wird und daher möglicherweise eine pulmonal selektive Aktivität besitzt. Inhalatives Iloprost hat damit weniger ausgeprägte systemische Wirkungen auf die Gefäße, als intravenös oder subkutan applizierte Prostanoide (HUBER, et al. 2007). Ein großer Nachteil der Therapie mit Prostazyklinen sind die

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nach einiger Zeit eintretende Toleranz, was eine kontinuierliche Dosissteigerung nötig macht, und die nicht erwünschte systemische Blutdrucksenkung.

Endotheline sind potente vasokonstriktorische Proteine, von deren Isoformen das Endothelin-1 (ET-1) in der Pathogenese der PAH die wichtigste Rolle zu spielen scheint. Die Plasmakonzentration von ET-1 ist bei PAH-Patienten erhöht, zudem ist eine vermehrte Expression von ET-1 im Lungengewebe nachweisbar (GIAID, et al.

1993). Es gibt zwei Rezeptorsubtypen, über die ET-1 seine vasokonstriktorische Wirkung ausübt: ETA und ETB. Bei einer Aktivierung von ETA durch ET-1 kommt zu einem Influx von extrazellulären Calciumionen und somit zur Vasokonstriktion. Die Funktion des ETBs wird im Rahmen der PAH derzeit noch diskutiert. Zurzeit ist ein oral aktiver, nicht-selektiver Endothelinrezeptor-Antagonist (Bosentan) zugelassen, welcher beide Rezeptorsubtypen antagonisiert, und sowohl systemisch als auch pulmonal vasodilatativ wirkt. Zudem scheint Bosentan auch die Proliferation der glatten Gefäßmuskelzellen zu hemmen. Sitaxentan bzw. Ambrisentan sind ebenfalls oral aktive, aber selektive ETA-Rezeptor-Antagonisten, die seit 2006 (Sitaxentan) bzw. 2008 (Ambrisentan) in Europa und seit 2007 (Ambrisentan) in den USA zur Therapie von PAH zugelassen sind. Gegenüber einer unselektiven Blockade scheinen sie allerdings keine Überlegenheit zu besitzen (HUBER, et al.

2007). Sowohl Sitaxentan als auch Ambrisentan weisen im Vergleich zu Bosentan eine geringere Lebertoxizität auf.

Stickoxid (NO) übt seine vasodilatatorischen Effekte über den second-messenger cGMP aus. cGMP wird durch die Aktivität der Phosphodiesterase-5 (PDE-5) schnell inaktiviert, so dass eine Inhibierung der PDE-5 entsprechend zu einer gesteigerten Vasodilatation führt (OLSCHEWSKI, et al. 2005). PDE-5 ist in pulmonalen Geweben unter physiologischen Bedingungen hoch exprimiert und wird bei PAH weiter heraufreguliert. Damit bot sich die Inhibition der PDE-5 als pharmakologisches Target zur Therapie der PAH an (GHOFRANI u. GRIMMINGER, 2006). Sildenafil wurde 2006 in Deutschland zur Behandlung der PAH zugelassen und ist in der Lage, den mittleren pulmonalarteriellen Druck und den pulmonalen Gefäßwiderstand zu senken, während der kardiale Index erhöht wird (BULL 2005). In der derzeitigen Erprobungsphase befindet sich neben Vardenafil auch Tadalafil, welches im Gegensatz zu Sildenafil und auch Vardenafil eine deutlich längere Halbwertszeit

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besitzt und somit eine nur einmal tägliche orale Einnahme notwendig macht (KONORZA, et al. 2005).

2.1.5 Physiologische Besonderheiten des Lungenkreislaufes und pulmonalvaskuläres Remodelling

Das Gefäßsystem der Lunge ist im physiologischen Zustand ein Niederdrucksystem.

Nur bis zu einer Gefäßweite von ca. 80 µm besitzen die pulmonalarteriellen Gefäße eine kontinuierliche Media. Weiter distal finden sich partiell muskularisierte Gefäße, die in nicht-muskularisierte Gefäße übergehen.

Neben den anatomischen Besonderheiten existieren in der Lunge autonome Mechanismen der Widerstandsreduktion, die den Druck in der Lungenstrombahn auch bei körperlicher Belastung nahezu konstant halten können. Durch die druckpassive Dehnung der Lungengefäße (Distension) und die zusätzliche druckpassive Perfusion (Recruitment) von in Ruhe kollabierten Gefäßarealen der Lungenspitze resultiert je nach Elastizität der Gefäßwände eine Zunahme des Gefäßquerschnittes. Der Gefäßtonus des pulmonalvaskulären Systems wird bei Belastung zusätzlich durch aktive Vasodilatation vermindert (OLSCHEWSKI, et al.

1999).

Im Lungenkreislauf führt eine Reduktion des alveolären Sauerstoffs im Gegensatz zum Körperkreislauf zu einer Vasokonstriktion der pulmonalen Arterien (CAMPIAN, et al. 2006). Dieser sogenannte Euler-Liljestrand-Reflex stellt einen Mechanismus dar, der ein auftretendes Ungleichgewicht zwischen der Ventilation und der Durchblutung (Perfusion) der Lunge ausgleichen soll und wird auch als hypoxische pulmonale Vasokonstriktion (HPV) bezeichnet (EULER u. LILJESTRAND 1946).

Die Pathomorphologie bei PAH ist charakterisiert durch einen strukturellen Umbau der pulmonalen Gefäßwände, auch bezeichnet als pulmonalvaskuläres Remodelling.

Um einem chronischen Druckanstieg im Lumen standhalten zu können, verdickt sich die Gefäßwand der pulmonalen Arterien und wird stärker, wodurch die vasodilatatorische Kapazität vermindert wird. Bei allen Formen der PAH sind die größeren zentralen Gefäße durch den hohen Druck aufgeweitet, demgegenüber ist

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das Lumen der kleineren Gefäße durch die Umbauprozesse in der Gefäßwand verkleinert (OLSCHEWSKI, et al. 1999). Das Gefäßwand-Remodelling ist histologisch vor allem gekennzeichnet durch eine endotheliale Schädigung mit Endothelzellproliferation und dem Auftreten von plexiformen Läsionen (TUDER, et al.

1994), Intimafibrose, Fragmentierung der Lamina elastica interna und einer Hypertrophie der Media. Es treten zudem Thrombosierungs- und Entzündungserscheinungen innerhalb des pulmonalen Gefäßbettes auf (SEEGER, et al. 2001). Im Rahmen des vaskulären Remodellings kommt es auch zu einer Neomuskularisierung (De-novo-Muskularisierung) auch kleinerer arterieller, distaler, physiologisch nicht-muskularisierter Gefäßabschnitte (Abbildung 1). Dieses Phänomen beruht auf einer distalen Muskelaussprossung aus proximalen Gefäßabschnitten (SEEGER, et al. 2001).

Abbildung 1: Pulmonalvaskuläres Remodelling (links: physiologisch, rechts: pulmonales arterielles Gefäß nach Remodelling, histologisches Bild)

Eine morphologische Besonderheit bei der PAH stellen die plexiformen Läsionen dar.

Diese sind durch endoluminal-multiple, gewundene Kanäle in kleinen, relativ dünnwandigen Ästen der Pulmonalarterien charakterisiert (TUDER, et al. 1994). Die Läsionen bestehen überwiegend aus rasch proliferierenden Endothelzellen. Nach dem Konzept einer fehlgesteuerten Angiogenese sind die plexiformen Läsionen wahrscheinlich das Resultat eines frustranen Neovaskularisationsversuches (OLSCHEWSKI, et al. 1999). Die plexiformen Läsionen bei der PAH bestehen überwiegend aus monoklonal proliferierenden Endothelzellen, im Gegensatz dazu proliferieren die Endothelzellen bei den anderen Formen der pulmonalen Hypertonie vorwiegend polyklonal (LEE, et al. 1998).

(23)

An der abnormalen Zellantwort des pulmonalvaskulären Remodellings sind verschiedene Wachstumsfaktoren, wie z.B. der Platelet-derived growth factor (PDGF), der Fibroblast growth factor (FGF), der Epidermal growth factor (EGF) wie auch der Vascular endothelial growth factor (VEGF), beteiligt (YU, et al 2003, USHIO-FUKAI, et al. 2001, XIN, et al. 1994). Viele dieser Wachstumsfaktoren binden an transmembranständige Rezeptortyrosinkinasen, wodurch wichtige Signaltransduktionswege, einschließlich der Ras-Mitogen activated protein kinase (MAPK), Phosphatidyl-inositol-3-phosphat-Kinase (PI3K) und Phospholipase C, aktiviert werden. Diese Signaltransduktionswege regulieren wichtige physiologische Funktionen in Zellen und sind, wenn sie dysreguliert sind, unter anderem beteiligt an der Onkogenese. Aufgrund dessen wurden verschiedene Substanzen für die Therapie von Krebs entwickelt und zugelassen, welche die an der Entstehung von Krebs beteiligten Rezeptortyrosinkinasen inhibieren (ROBERTS u. DER 2007).

Von besonderem Interesse im Zusammenhang mit der pulmonalen Hypertonie ist der Tyrosinkinase-Inhibitor Imatinib. Im Tierexperiment und in ersten klinischen Untersuchungen konnte der Tyrosinkinase-Inhibitor Imatinib (STI 571, Glivec®), welcher die Tyrosinkinasen PDGF-Rezeptor, das leukämie-spezifische Hybridgen (BCR-ABL) und den Stammzellfaktor-Rezeptor (c-kit) inhibiert, eine Verbesserung der Leistungsfähigkeit von Patienten mit fortgeschrittener PAH erreichen (SCHERMULY, et al. 2005). Dies wurde hauptsächlich auf die Inhibition des PDGFR zurückgeführt, dessen Expression und Aktivität in den Lungen von PAH-Patienten erhöht ist (SCHERMULY, et al. 2005). Erste Fallberichte an einzelnen Patienten zeigen, dass unter der Behandlung mit Imatinib eine deutliche Verbesserung der Leistungsfähigkeit des Patienten und eine Senkung des pulmonalen Gefäßwiderstandes zu erreichen ist (GHOFRANI, et al. 2005, PATTERSON, et al.

2006, SOUZA, et al. 2006).

Auch andere Kinasen, wie z. B. die Serin-/Threonin-Kinasen, sind an der Entstehung von proliferativen Veränderungen in den Pulmonalarterien bei PAH beteiligt. Die Serin-/Threonin-Kinase Raf-1 ist an dieser Stelle besonders interessant, weil sie auch an der myokardialen Hypertrophie beteiligt ist (HARRIS 2004).

(24)

2.1.6 Kardiale Effekte der pulmonalen arteriellen Hypertonie

2.1.6.1 Cor pulmonale

Bei der PAH führt die Druckerhöhung in der pulmonalen Zirkulation zu einer erhöhten Nachlast des rechten Herzens. Hieraus resultieren Umbauprozesse als Reaktion des rechten Ventrikels auf die veränderten Druckverhältnisse in Form von rechtsventrikulärer Hypertrophie und/oder Dilatation sowie interstitielle Fibrose und Entzündung. Treten derartige Veränderungen auf, wird der Begriff Cor pulmonale verwendet. Das Cor pulmonale kann dabei klinisch kompensiert (ohne Rechtsherzinsuffizienz) oder dekompensiert (mit Rechtsherzinsuffizienz) sein.

Morphologisch besteht zunächst eine Vermehrung der Muskelmasse des rechten Ventrikels mit einer Wandverdickung, die im weiteren Krankheitsverlauf mit einer Dilatation und Ausdünnung der Herzkammerwand verbunden ist. Die rechtsventrikuläre Adaptation ist einer der wichtigsten prognostischen Faktoren bei pulmonaler Hypertonie (BRISTOW, et al. 1998).

2.1.6.2 Rolle von Raf-Proteinen bei Herzhypertrophie

Auf der zellulären Ebene sind die Mechanismen, die letztlich zu einer Rechtsherzhypertrophie führen, nicht abschließend aufgeklärt. Werden Kardiomyozyten um 10 bis 20% ihrer Ruhedehnungslänge gedehnt, bewirkt dies eine Steigerung der Proteinsynthese ohne DNA-Synthese (Hypertrophie) (SADOSHIMA u.

IZUMO 1997). Dies deutet darauf hin, dass Kardiomyozyten auch ohne Anwesenheit von neuronalen oder hormonellen Faktoren in der Lage sind, Belastungen in einen Wachstumsreiz zu übersetzen. Durch eine Dehnung werden verschiedene Signaltransduktionswege aktiviert, ähnlich denen, die durch Wachstumsfaktoren aktiviert werden. Zum Beispiel werden in neonatalen Kardiomyozyten von Ratten durch mechanische Dehnung second-messenger-Systeme wie Phosphatidylinositol, Proteinkinase C und extrazelluläre Signal-regulierte Proteinkinasen (ERK) aktiviert (YAMAZAKI, et al. 1998).

Die durch mechanischen Stress aktivierte Signaltransduktion ist charakterisiert durch eine gleichzeitige Aktivierung verschiedener Second-Messenger-Systeme. Unter

(25)

anderem können Zellwachstumsfaktoren sowie auch verschiedenartiger umweltbedingter Stress Proteinkinase-Kaskaden aktivieren. Diese Proteinkinasen sind u.a. Serin-/Threoninkinasen und phosphorylieren verschiedene zelluläre Substrate, die für Zellwachstum und -differenzierung, einschließlich Herzhypertrophie, wichtig sind (SADOSHIMA u. IZUMO 1997). In tierexperimentellen Versuchen konnte gezeigt werden, dass Raf-1 (Mitogen-Activated Protein Kinase Kinase Kinase), eine Serin-/Threonin-Kinase, eine zentrale Rolle bei Herzhypertrohie spielt (HARRIS 2004).

Die Aktivierung von Raf-1 ist ein komplexer Prozess, welcher zunächst die Aktivierung von Ras, einer kleinen GTPase, erfordert. Die Aktivierung von Ras kann als Antwort auf eine durch Wachstumsfaktoren vermittelte Verlagerung von Proteinkomplexen zur Plasmamembran von Zellen auftreten. Dort wird Raf-1 gebunden, phosphoryliert und somit aktiviert. Im weiteren Verlauf der Proteinkinase- Kaskade phosphoryliert Raf-1 verschiedene MAP-Kinasen (Mitogen-Activated Protein Kinase), wie MEK 1 und 2 (Mitogen-Activated Protein Kinase Kinase) an zwei Serinresten, was zu einer erhöhten MEK-Aktivität führt. Die aktivierte MEK aktiviert wiederum ERK 1 und 2 (Extracellular Signal-Regulated Kinase) an einem Threonin- und einem Tyrosinrest. ERK wiederum phosphoryliert verschiedene zytosolische und nukleäre Zielproteine, wie z. B. Transkriptions- und Translationsfaktoren, Enzyme des Zellzyklus und Apoptoseproteine (MUSLIN 2005) (Abbildung 2).

(26)

KOLCH (2000)

Abbildung 2: Schematische Darstellung der Struktur von MAPK-Signalwegen a) allgemeiner Aufbau von MAPK-Signalwegen

b) der spezielle ERK-Signalweg

2.1.7 Kinaseinhibitoren

2.1.7.1 Imatinib

Imatinib (STI 571, Glivec®) ist ein Inhibitor der Tyrosinkinasen Bcr-Abl und Rezeptor- Tyrosinkinasen von PDGF (Platelet-derived Growth Factor) und C-Kit (Stammzellfaktor-Rezeptor) (Abbildung 3).

Abbildung 3: Strukturformel von Imatinib (STI 571)

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Imatinib ist seit 2001 zur Therapie der chronischen myeloischen Leukämie (CML) und seit 2002 zur Behandlung nicht mehr resezierbarer und/oder metastasierender maligner gastrointestinaler Stromatumoren (GIST) zugelassen. Imatinib hat in präklinischen Tiermodellen und ersten klinischen Fallstudien eine gute Wirksamkeit bei PAH erreichen können (SCHERMULY, et al. 2005).

2.1.7.2 Sorafenib

Sorafenib (BAY 43-9006, Nexavar®) ist ein oral aktiver Multikinaseinhibitor, welcher die Autophosphorylierung der Serin-/Threoninkinasen Raf-1 (auch bezeichnet als C- Raf) und B-Raf (Wildtyp und Mutant V600E), sowie der Tyrosinkinasen Vascular Endothelial Growth Factor Receptor (VEGFR-1, VEGFR-2 und VEGFR-3), Platelet Derived Growth Factor Receptor β (PDGFR-β) und c-Kit inhibiert. Der oral verfügbare Multikinaseinhibitor Sorafenib ist seit Ende Juli 2006 klinisch zugelassen zur Therapie des fortgeschrittenen Nierenzellkarzinoms (RCC), wenn eine Standardtherapie versagt hat, und seit November 2007 beim nicht mehr resezierbaren hepatozellulären Karzinom (HCC) (Abbildung 4).

Abbildung 4: Strukturformel von Sorafenib (BAY 43-9006)

Der Multikinaseinhibitor Sorafenib kann also, aufgrund seines breiten Kinaseinhibitionsprofils, nicht nur die an dem pulmonalvaskulären Remodelling beteiligten (Tyrosin)kinasen, sondern auch die an der Rechtsherzhypertrophie beteiligte Serin-/Threoninkinase Raf-1 inhibieren.

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2.2 Tiermodelle für pulmonale arterielle Hypertonie

Die nicht vollständig aufgeklärte Pathogenese von PAH und die Schwere der humanen Erkrankung mit Fehlen einer effektiven Behandlung machen es notwendig, geeignete Tiermodelle zu generieren, um langfristig auch eine wirksame Therapie finden zu können. Um die pathophysiologischen Mechanismen der PAH möglichst akkurat im Tiermodell widerzuspiegeln, werden u. a. chemische (z.B. Monocrotalin) und (patho)physiologische (z.B. Hypoxie) Stimuli verwendet. Dabei können alle in vivo Modelle die charakteristischen pathophysiologischen Veränderungen bei PAH nur bis zu einem gewissen Grad imitieren (MARSBOOM u. JANSSENS 2004). Im Zentrum der Aufmerksamkeit von experimentellen Modellen stehen hierbei die pathologischen Veränderungen am pulmonalen Gefäßbett, das vaskuläre Remodelling.

Es ist möglich, die für PAH gängigen experimentellen Tiermodelle aufgrund verschiedener Stimuli einzuteilen. Die erste Gruppe umfasst solche Modelle, die (patho)physiologische Stimuli als auslösende Faktoren haben. Bei solchen Faktoren handelt es sich um akute oder chronische Hypoxie und Gefäßobstruktion aufgrund von künstlicher Luftembolie oder Injektion von Mikrokugeln.

Die zweite Gruppe umfasst chemische bzw. toxische Stimuli. Hier ist das Monocrotalin-Modell besonders hervorzuheben, da dieses Modell, neben dem Modell der chronischen Hypoxie, das wichtigste und am meisten verwendete Modell für PAH in der Forschung darstellt. Vor mehr als 40 Jahren wurde zum ersten Mal beschrieben, dass die Gabe von Monocrotalin in Ratten eine PAH auslöst (LALICH u. MERKOW 1961). Monocrotalin (MCT) ist ein Phytotoxin (Pyrrolizidinalkaloid), welches aus den Samen von Crotalaria spectabilis stammt und nach s.c.-Injektion von mischfunktionellen Oxidasen (Cytochrom P450 Monooxygenase-System) in der Leber zu reaktiven alkylierenden Verbindungen (pyrrolische Dehydro-Alkaloide) aktiviert wird. MCT hat einen selektiven toxischen Effekt auf die pulmonalen Gefäße ohne dabei einen Effekt auf die systemischen Blutgefäße zu haben. Dies kommt dadurch zustande, dass das MCT-Pyrrol als erstes die Lunge als das nächste große Gefäßbett distal der Leber nach der dortigen Toxifizierung erreicht (MARSBOOM u.

JANSSENS 2004). Die initiale Schädigung mit dem aktivierten Monocrotalin-Pyrrol

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führt zu einer endothelialen Schädigung, einer erhöhten kapillären Permeabilität, einem interstitiellen Ödem und zu einer Akkumulation von Makrophagen in der Lungenstrombahn (MONNET u. CHACHQUES 2005). Dies resultiert wiederum in einer endothelialen Degeneration oder Hyperplasie, einer Hypertrophie der glatten Muskelzellen der Media und einer Hyperplasie in der Adventitia. Zusammen erhöhen diese Veränderungen den pulmonalvaskulären Widerstand und damit die Druckbelastung des rechten Ventrikels. Der zugrundeliegende Mechanismus ist, trotz der seit Jahren ständigen Verwendung dieses Modells, noch nicht zufriedenstellend aufgeklärt (CAMPIAN, et al. 2006). Im Vergleich zur humanen PAH ist lediglich die Endothelzellprolfieration (plexiforme Läsionen) bei der MCT-induzierten PAH bei der Ratte nicht nachweisbar. Wird jedoch vor der MCT-Gabe bei den Ratten eine Pneumektomie durchgeführt, so konnten White und Kollegen eine schwere Form von PAH bei den Tieren beobachten und auch plexiforme Läsionen nachweisen (WHITE, et al. 2007) Die pathologischen Veränderungen treten bereits 3 Tage nach dem toxischen Stimulus auf und schreiten in den nächsten Wochen fort. Innerhalb von 4 Wochen bildet sich eine manifeste PAH mit klinischen Anzeichen einer Rechtsherzinsuffizienz aus.

Des Weiteren gibt es noch die Möglichkeit der molekularen und genetischen Stimuli;

diese werden jedoch weitaus seltener verwendet, um PAH zu untersuchen.

2.2.1 Hypoxie-Modell

Eine Reduktion des alveolären Sauerstoffpatialdruckes auf weniger als 70 mmHg führt zu einer starken Vasokonstriktion der pulmonalen Arterien (CAMPIAN, et al.

2006). Dieser sogenannte Euler-Liljestrand-Mechanismus beschreibt den Zusammenhang zwischen der Ventilation und der Durchblutung (Perfusion) der Lunge und wird auch als hypoxische pulmonale Vasokonstriktion (HPV) bezeichnet (EULER u. LILJESTRAND 1946).

Es ist bis heute noch nicht abschließend geklärt, welche Mechanismen an der reflektorischen Vasokonstriktion als Reaktion auf eine Hypoxie beteiligt sind. Weder die an der O2-Messung beteiligte(n) Zelle(n), die Sensormechanismen, noch die Signaltransduktionswege, welche zur Konstriktion der pulmonalen Gefäße führen,

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sind bekannt (WEISSMANN, et al. 2001). Eine mögliche Arbeitshypothese ist, dass eine Exposition von pulmonalen glatten Gefäßmuskelzellen mit Hypoxie den K⁺- Strom durch spannungsgesteuerte K⁺-Kanäle und das Membranpotential verringert, und somit die intrazelluläre Ca²⁺-Konzentration und die Phosphorylierung von Myosin-Leichtketten erhöht, und dadurch eine Vasokonstriktion auslöst (WEISSMANN, et al. 2001).

Die vasokonstriktorische Reaktion der Lungengefäße auf Hypoxie kann in drei Kategorien eingeteilt werden: 1) die Antwort auf eine akute Hypoxie, welche die Lungenperfusion der Lungenventilation anpasst und somit den Gasaustausch optimiert, 2) die Antwort auf eine anhaltende oder längere Hypoxie, welche ebenfalls eine Rolle zur Angleichung Perfusion-Ventilation spielt und vielleicht letztlich auch zu 3) der Gefäßantwort auf eine chronische generalisierte Hypoxie führt, welche in ein ausgedehntes vaskuläres Remodelling, pulmonale Hypertonie und ein Cor pulmonale resultiert (WEISSMANN, et al. 2001).

Das Remodelling betrifft vor allem die distalen Äste der pulmonalen Arterien: sowohl die glatten Gefäßmuskelzellen als auch die Fibroblasten der Adventitia proliferieren unter den hypoxischen Bedingungen. Eine signifikante Endothelzellproliferation tritt jedoch nicht auf (VOELKEL u. TUDER 2000). Auch der zugrundeliegende pathophysiologische Mechanismus für das vaskuläre Remodelling ist nicht vollständig geklärt. Eine Möglichkeit wäre, dass die durch die Hypoxie ausgelöste Vasokonstriktion in den Widerstandsgefäßen der Lunge zu einem erhöhten Shear- Stress (Scherspannung) führt, welcher wiederum eine Hypertrophie und Proliferation der glatten pulmonalen Gefäßmuskelzellen hervorruft (VOELKEL u. TUDER 2000).

Einige der vasokonstriktorischen Substanzen, die in dem hypoxischen Lungengewebe freigesetzt werden, v.a. Endothelin und Serotonin, dienen, auch unabhängig ihres Effektes auf den Vasotonus, als Wachstumsfaktoren für die glatten pulmonalen Gefäßmuskelzellen (Abbildung 5).

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(modifiziert nach VOELKEL u. TUDER 2000)

Abbildung 5: Schematische Darstellung des hypoxie-bedingten pulmonalvaskulären Remodellings

Im Tiermodell kann die Reduktion des Sauerstoffdruckes in der Lunge auf zwei verschiedene Arten geschehen: zum einen können die Tiere einer normalen Luftzusammensetzung unter hypobarischen Bedingungen ausgesetzt werden, zum anderen gibt es die Möglichkeit, die Tiere in sauerstoffarmer (10% O2) Umgebungsluft bei normobarischen Bedingungen zu halten. Sowohl die de-novo- Muskularisierung pulmonaler Arteriolen als auch die Vasokonstriktion als Reaktion auf die chronische Hypoxie sind reversibel, wenn eine Rückführung in normoxische Bedingungen stattfindet.

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2.2.2 Tiermodell für Rechtsherzinsuffizienz

In der Literatur ist eine Vielzahl an Tiermodellen zur Erzeugung einer Herzinsuffizienz (-hypertrophie) beschrieben. Es muss dabei zwischen Modellen, die eine Linksherzinsuffizienz und Modellen, die eine Rechtsherzinsuffizienz induzieren, unterschieden werden. Ein wichtiges Modell zur Erzeugung einer Linksherzinsuffizienz stellt dabei die operativ induzierte Aortenstenose dar, in welchem eine erhöhte Druckbelastung des linken Ventrikels zu seiner Hypertrophie und letztlich auch Insuffizienz führt.

Es gibt verschiedene Tiermodelle, die eine Rechtsherzinsuffizienz induzieren.

Mehrere dieser Modelle werden ebenfalls für die Erzeugung einer PAH verwendet.

Zu diesen Modellen zählen die chronische Hypoxie und das MCT-Modell. Eine Möglichkeit, das rechte Herz isoliert zu belasten, besteht im operativen Induzieren einer Pulmonalarterienstenose.

2.2.2.1 Stenosemodell der Arteria pulmonalis

Eine Stenose der Arteria pulmonalis wurde zum ersten Mal 1924 beschrieben - die dazugehörigen Versuche wurden bereits 1916 durchgeführt. Die Autoren beschrieben, wie sie mit Hilfe eines metallenen Bandes die Pulmonalarterie von mehreren Hunden verengt haben. Nachfolgend konnten sie beobachten, dass der rechte Ventrikel unter der erhöhten Nachlast hypertrophiert, die Herzklappen erschienen ihnen normal (REID 1924). Im Jahr 1936 beschrieb eine andere Arbeitsgruppe die ersten Stenose-Versuche der Arteria pulmonalis an Kaninchen (SHIPLEY, et al. 1936). Seitdem wurde das Modell der Stenose der Arteria pulmonalis verschiedentlich verwendet, um die Vorgänge am rechten Herzen als Reaktion auf eine erhöhte Druckbelastung zu erforschen.

Dabei wurden hauptsächlich größere Labortiere (Hund, Schwein) verwendet, weniger die kleinen Labornager wie Ratte oder Maus, weil sich bei den kleineren Spezies zu dem Problem der Empfindlichkeit der Strukturen im Operationsbereich, zusätzliche (technische) Probleme aufgrund ihrer geringen Größe ergeben (TARNAVSKI, et al.

2004). Auf der anderen Seite sind die kleinen Labornager besonders interessant,

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weil sich durch ihre Verwendung eine Übertragbarkeit auf andere Modelle ergibt, sowie genetische und molekularbiologische Analysen möglich werden. Aufgrund eigener Recherche allerdings wird dieses Tiermodell am kleinen Labornager nur selten verwendet - es gibt wenige Literaturstellen, die sich mit dem Stenosemodell der Arteria pulmonalis an der Ratte befassen. Dabei wäre die Verwendung dieses Modells im Zusammenhang mit der PAH besonders interessant. Vorläufige Ergebnisse zeigen, dass z. B. Sildenafil zwar das myokardiale Remodelling verbessern kann, aber nur über den indirekten Weg der Entlastung des rechten Ventrikels durch eine Senkung der pulmonalarteriellen Drücke und nicht durch eine selektive Wirkung am Myokard (SCHÄFER, et al. 2008).

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2.3 Ziel der Arbeit

Das Ziel der Arbeit war es, ein experimentelles Design zur Untersuchung der PAH im Nager zu entwickeln, in dem die Umbauvorgänge im rechtsventrikulären Myokard unabhängig von den zugrundeliegenden pulmonalen Veränderungen analysiert werden können. Zu diesem Zweck wurde an Ratten chirurgisch eine isolierte Pulmonalstenose induziert. Durch den Vergleich mit einem Standardmodell für PAH (Hypoxiemodell), bei dem Lunge und rechter Ventrikel verändert sind, lassen sich die pulmonalen von den direkten myokardialen Effekten verschiedener Interventionen abgrenzen. Auf diese Weise konnte im Rahmen der vorliegenden Arbeit der duale vaskuläre und myokardiale Wirkmechanismus des kombinierten Tyrosin- und Serin- /Threonin-Kinaseinhibitors Sorafenib im Vergleich zum reinen Tyrosinkinase-Inhibitor Imatinib eindeutig herausgearbeitet werden.

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3 Materialien und Methoden

3.1 Materialien

3.1.1 Versuchstiere

Für alle durchgeführten Versuche wurden männliche Ratten (Rattus norwegicus) des Auszuchtstammes Sprague-Dawley (Fellfarbe: Albino) verwendet. Die Sprague- Dawley-Ratte wurde 1925 von Robert W. Dawley aus einer männlichen Hybridratte (Hooded) und einer weiblichen Wistar-Ratte gezüchtet. Die in den Versuchen verwendeten Tiere stammen aus dem Zucht- und Lieferbetrieb Charles River Laboratories, Sulzfeld, Deutschland und sind unter der Bezeichnung Crl:CD(SD) dort erhältlich.

Das Tieralter (bzw. –gewicht) bei der Anlieferung betrug je nach durchzuführendem Versuch 50-52 Tage, was einem Tiergewicht von 201-225 g entspricht, oder 30-35 Tage, was einem Tiergewicht von 151-175 g entspricht. Das genaue Tiergewicht wurde vor Applikation der jeweiligen Substanzen (Narkose, zu testende Substanzen) ermittelt, um die Substanz exakt nach Gewicht verabreichen zu können.

Für die Dauer der Versuche wurden die Tiere in den Tierräumen des Forschungszentrums von BayerHealthCare, Aprath, Wuppertal unter standardisierten Bedingungen bei einer Umgebungstemperatur von 22,5±2 °C und einer durchschnittlichen relativen Luftfeuchte von 45±10% gehalten. Die Haltung erfolgte entsprechend gesetzlich vorgeschriebenen Kriterien in transparenten 1815 cm² x 20 cm bzw. 800 cm² x 18 cm (Bodenfläche x Höhe) Makrolon Polycarbonat-Käfigen (Typ 4 bzw. Typ 3H) auf ssniff® Lignocel BK 8-15 Einstreu (kubisches Granulat, Gemisch aus Fichte und Tanne), ssniff® Spezialitäten GmbH, Soest. Die Tiere wurden bis zum Versuchsbeginn zunächst in Gruppen von je 5 Ratten pro Käfig (Typ 4) gehalten. Nach Versuchsbeginn wurden die Tiere aus technischen Gründen (Größe der Hypoxiekammern, Gefahr des gegenseitigen Anfressens der Operationsnaht) in kleinere Gruppen à 2 Tiere in die kleineren Käfige (Typ 3H) umgesetzt. Die Hell-Dunkel-Phasen in den Tierräumen betrugen je 12 Stunden am

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Tag (Hell-Phase: 6-18Uhr, Dunkel-Phase: 18-6Uhr). Die Fütterung der Tiere erfolgte mit ssniff® R/M-H Alleinfuttermittel für die Haltung von Ratten und Mäusen, ssniff®

Spezialitäten GmbH, Soest ad libitum. Ein unbegrenzter Zugang der Tiere zu Leitungswasser aus Nippeltränken war jederzeit möglich.

3.1.2 Injektionslösungen und Substanzen

Isofluran Isofluran CP®, cp-pharma, Burgdorf

Buprenorphinhydrochlorid 0,324mg/ml Temgesic®, essex pharma GmbH, München

Isotone Kochsalz-Lösung 0,9% B. Braun Melsungen AG, Melsungen Hautdesinfizienz Cutasept® F, Bode Chemie, Hamburg Neomycinsulfat, Bacitracin Nebacetin®, Yamanouchi Pharma GmbH,

Heidelberg

Pentobarbital Narcoren®, Merial GmbH, Hallbergmoos

D-PBS (CaCl2, MgCl2) GIBEC®, Auckland, Neuseeland Ethanol absolut zur Analyse Merck KGaA, Darmstadt

Solutol® HS 15 BASF Aktiengesellschaft, Ludwigshafen Bepanthen® Augen- und Nasensalbe Bayer Health Care, Leverkusen

3.1.3 Verbrauchsmaterial

Einmalspritze, verschiedene Volumina Injekt Luer®, B. Braun Melsungen AG, Melsungen

Kanüle, verschiedene Größen Sterican®, B.Braun Melsungen AG, Melsungen

Venenverweilkatheter 16G; 1,7x50mm Vasofix Braunüle®, B. Braun Melsungen AG, Melsungen

Zellstofftupfer Purzellin®, Lohmann und Rauscher,

Regensdorf

Dreiwegehahn Discofix®, B. Braun Melsungen AG,

Melsungen

Fixierpflaster, hautfreundlich, 2,5cmx5m Leukosilk®, BSN medical GmbH, Hamburg

S-Monovette® Blutentnahmesystem Li-

Heparin-Gel 4,7ml undvEDTA KE/9ml Sarstedt Aktiengesellschaft & Co, Nümbrecht

Monovette®-Kanüle Nr.1, 20G;

0,9x38mm

Sarstedt Aktiengesellschaft & Co, Nümbrecht

Metalldraht ca. 15cm lang kleine Wattestäbchen Q-Tips

Falconröhrchen 50ml Eppendorf-Tubes, Pipetten Schrumpfschlauch

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3.1.4 Operationsbesteck

kleine spitze Schere Aesculap®, BC1 00R 05020, stainless

Wundhaken Aesculap®, OA 358, stainless

anatomische gebogene Pinzette Aesculap®, BD 313 R 75060, stainless große stumpfe anatomische Pinzette Aesculap®

Wundspreizer Aesculap®, BV 073 R-5G0Q0, stainless

anatomische gebogene Pinzette F.S.T.®,, 110 52-10, Germany, 02r21, stainless

kleiner Nadelhalter martin®, Germany, 20-299-10 CE, S/ZK

Knüpfpinzette Aesculap®, FD 281R, stainless

Nadelhalter Aesculap®, BM1 48R, stainless

kleine spitze gebogene Pinzette moria®, MC 31

3.1.5 Nahtmaterial

Prolene-Faden (Polypropylen), 4-0, nicht resorbierbar, monofil (Ethicon® GmbH, Norderstedt)

Vicryl-Nadel-Faden-Kombination (Polyglactin) , 3-0, polyfil, resorbierbar (Ethicon®

GmbH, Norderstedt)

Seide, USP 3/0 (Polysuture A.G., Weiswampach, Luxembourg)

3.1.6 Geräte

Narkosekasten durchsichtiger Plastikkasten, Eigenbau

Gasmischeinheit Aalborg, Monsey, New York, Serial No.: 080901 Intubationsvorrichtung Eigenbau

Gasmischeinheit FMI Föhr Medical Instruments GmbH, Seeheim/Oberbeerbach, Seriennr.: 061218

Isofluranverdampfer Isoflurane, Vapor 19.3, Drägerwerk AG, Lübeck, Fabr.

Nr.: ARJM-0343

Schwanenhalslampe kalte Lichtquelle, KL 1500, Schott

Beatmungspumpe Small Animal Ventilator, FMI Föhr Medical Instruments GmbH, Seriennr.: 050809, Seeheim/Oberbeerbach

Q-Flow Vögtlin

Wärmeplatte Eigenbau

Thermometer Maximum-Thermometer, Lohmann & Rauscher International GmbH & Co. KG, Regensdorf

Rasierer Contura, Wella

Stereolupe Leica Wild M650

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Powerlab Powerlab System 4/25 AD Instruments FMI (Föhr Medical GmbH)

Pressure control unit Pressure control unit PCU-200

EKG Animal Bio Amp ML 136

Thermosonde

Millar®-Katheter Instruments, Model Spr-320 REF 840-8160, Length 140cm, Size 2F

Polyethylenschlauch PE-50

Druckaufnehmer Computer mit Monitor

Chart®-Programm kleines Glasgefäß

Metallplatte Eigenbau

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3.2 Methoden und Modelle

3.2.1 Hypoxie-Modell

Vor Versuchsbeginn wurden die Ratten randomisiert in die verschiedenen Behandlungsgruppen eingeteilt, gewogen und jeweils zu zweit in die Typ 3H-Käfige gesetzt. Anschließend wurden die Placebotiere und die Behandlungsgruppen in die Hypoxieschränke verbracht und dort unter kontrolliert-hypoxischen Bedingungen bei 10% Sauerstoff in der Umgebungsluft gehalten. Die Hypoxieschränke wurden einmal täglich für ca. eine halbe bis eine Stunde geöffnet (die Tiere atmen normoxische Luft) und Futter und Wasser und der Gesundheitszustand der Tiere kontrolliert. Die Behandlung der Tiere erfolgte in der Zeit, in der die Schränke geöffnet waren. Die Kontrolltiere verblieben in ihrem gewohnten Tierraum in normoxischer Atmosphäre (Abbildung 6).

Abbildung 6: Hypoxieschränke in den Räumen vom Forschungszentrum von BayerHealthCare in Wuppertal

Das Hypoxiemodell wurde in drei nacheinander ablaufenden Studien eingesetzt. In der ersten Studie sollte ein Zeitverlauf über vier Wochen Hypoxie erstellt werden, um

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eine Aussage über die Entwicklung der Hypoxie-bedingten PAH treffen zu können.

Dafür wurden jeweils acht Tiere pro Gruppe für je eine, zwei, drei oder vier Wochen in die Hypoxiekammern verbracht. Parallel dazu gab es eine Kontrollgruppe, welche ebenfalls aus acht Tieren bestand. Diese Kontrolltiere wurden jeweils à zwei Tiere parallel mit den Hypoxietieren ausgewertet. Dieser Vorversuch sollte für die kommenden Versuche einen Zeitrahmen setzen, in dem die PAH vollständig ausgebildet ist. Nach der Auswertung dieser Studie konnte man die Aussage treffen, dass sich die hypoxisch-bedingte PAH nach drei Wochen vollständig ausbildete und, dass nach vier Wochen keine weitere Steigerung der Erkrankung erkennbar war.

Die zweite Hypoxiestudie war eine Dosis-Wirkungs-Studie mit Sorafenib zur Ermittlung der adäquaten Dosierung von Sorafenib. In dieser Studie wurden je 10 Tiere mit 1 mg/kg, 5 mg/kg und 10 mg/kg Sorafenib über drei Wochen behandelt und den hypoxischen Bedingungen ausgesetzt. Diese Studie ergab, dass eine Dosierung von 10 mg/kg Sorafenib ausreichend gute Ergebnisse erreichen konnte.

Die dritte Studie stellte den direkten Vergleich von Sorafenib in einer Dosierung von 10 mg/kg zu Imatinib in einer Dosierung von 50 mg/kg dar. Es wurden 16 Tiere mit Sorafenib und 12 Tiere mit Imatinib über vier Wochen behandelt und den hypoxischen Bedingungen ausgesetzt. Die Placebogruppe umfasste 12 Tiere und die Kontrollgruppe 10 Tiere (Abbildung 7).

Abbildung 7: Studienablauf Hypoxiemodell

Hypoxie

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3.2.2 Stenosemodell der Arteria pulmonalis

Am Operationstag wurden die Tiere zunächst gewogen und anschließend in einen Narkosekasten gesetzt, in den ein Druckluft-Sauerstoff-Isofluran-Gemisch (500 ml/min Druckluft, 300 ml/min Sauerstoff) eingeleitet wurde. Zur Anflutung wurde ein Gemisch von 5% Isofluran verwendet, die spätere Erhaltungsdosis Isofluran während der Operation betrug ca. 2% (leichte Variationen möglich aufgrund tierindividueller Unterschiede). Das Tier wurde 5 Minuten dem Anflutungsgemisch ausgesetzt.

Anschließend wurde das Tier an der Intubationsvorrichtung mit den Schneidezähnen aufgehängt und die Intubation vorbereitet. Eine Schwanenhalslampe wurde auf den Maulbereich des Tieres gerichtet. Mit einer anatomischen Pinzette wurde die Zunge des Tieres vorgelagert und fixiert. In die geöffnete Stimmritze wurde ein ca. 15 cm langer Metalldraht mit einem Durchmesser von ca. 1 mm, dessen Enden abgeschliffen waren, ca. 1 cm tief eingeführt. Als Tubus wurde eine Vasofix Braunüle verwendet, welche zum Injektionsventil hin mit einem Schrumpfschlauch versehen war. Der Tubus wurde über den Metalldraht gestülpt und somit in die Trachea eingeführt. Anschließend wurde das Tier an die Beatmungspumpe gehängt und mit 60 Atemzügen pro Minute und einem Volumen von ca. 10l/min/kg beatmet. Um ein Kollabieren der Alveolen während der maschinellen Expiration zu verhindern, wurde ein positiver endexpiratorischer Druck von 1 cm Wassersäule eingestellt. Zur Analgesie erhielt das Tier Buprenorphinhydrochlorid (Temgesic®), in einer Dosierung von 0,03 mg/kg, welches in einem Mischungsverhältnis von 1,8 ml NaCl und 0,2 ml Temgesic® in einer Dosierung von 0,1 ml/100 g Ratte subkutan injiziert wurde (nach den Empfehlungen zur Schmerztherapie bei Versuchstieren der Gesellschaft für Versuchstierkunde GV-SOLAS 2002).

Während der Operation wurde das Tier, auf der rechten Seite liegend, auf einer Wärmeplatte gelagert, um die physiologische Körpertemperatur zu erhalten. Zum Monitoring der Körpertemperatur wurde in den Anus des Tieres ein Thermometer eingeführt und die Temperatur ca. alle 5 Minuten abgelesen. Die Augen wurden mit Bepanthen® Augen- und Nasensalbe bedeckt (Abbildung 8).

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Abbildung 8: Narkotisierte und intubierte Ratte auf der OP-Wärmeplatte

Danach wurde mit einem Rasierer das Operationsfeld im linken Brustbereich sauber rasiert und die Haut desinfiziert. Die gesamte Operation erfolgte unter einer Stereolupe. Das Operationsfeld lag ca. 0,5 cm kaudal des linken Schulterblattes.

Nach Überprüfung der Narkosetiefe anhand des Reflextestes (Corneal- und Lidreflex, Muskelrelaxation und Zwischenzehenreflex) wurde mit einer kleinen spitzen Schere auf Höhe des linken Ellenbogens ein ca. 1,5 cm langer, vertikal verlaufender Schnitt in die Haut geschnitten. Das Trennen der verschiedenen Muskelschichten erfolgte durch Spreizen in Faserverlauf mit einer anatomischen gebogen Pinzette. Sobald die Rippen und die Interkostalmuskulatur sichtbar waren, wurde die Interkostalmuskulatur des 3. Interkostalraums (kann variieren aufgrund tierindividueller Unterschiede) mit einer anatomisch gebogenen Pinzette kurz durchstoßen und anschließend mit einer großen stumpfen anatomischen Pinzette vertikal gespreizt. In die entstandene Öffnung wurde ein Wundspreizer eingeführt und die Rippen nach kranial und kaudal gespreizt, so dass eine Öffnung von ca. 3 cm² entstand. Jetzt war der Blick frei auf Anteile des Thymus, evtl. Teile des apikalen Lungenlappens, Anteile des rechten Herzens und das rechte Herzohr (Abbildung 9).

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Abbildung 9: Blick ins Operationsfeld

Das Perikard wurde mit zwei kleinen Wattestäbchen eröffnet. Anschließend wurde mit einer anatomisch gebogenen Pinzette die Arteria pulmonalis auf Höhe ihres Austritts aus dem rechten Herzen leicht von ihrer Unterlage und der Aorta ascendens abgehoben, so dass von der anderen Seite aus mit einer zweiten anatomisch gebogenen Pinzette die Arterie aus dem umgebenen Bindegewebe mobilisiert werden konnte. Nach Freipräparieren der Arteria pulmonalis wurde mit einem Nadelhalter ein Prolene-Faden an die anatomisch gebogene Pinzette gereicht und unter der Arterie durchgezogen. Danach wurde eine gebogene und abgeschliffene Vasofix® Braunülen-Nadel (16 G; 1,7 x 50 mm) an die Arteria pulmonalis gelegt und darüber der Faden mit einem chirurgischen Knoten unter zu Hilfenahme von Knüpfpinzetten verknotet; rasch wurde die Braunüle wieder entfernt (der Durchmesser der Arteria pulmonalis betrug nun 1,7 mm). Die Fadenenden wurden auf ca. 2 mm gekürzt (Abbildung 10).

A. pulmonalis

Anteile des apikalen Lungenlappen s

Anteile des Thymus

rechtes Herzohr

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Abbildung 10: Darstellung der Stenose der Arteria

pulmonalis

Der Verschluß der Rippen erfolgte mit einfachen U-Heften mit einer Vicryl-Nadel- Faden-Kombination. Vor dem Zuziehen der Knoten wurde die kollabierte Lunge wieder entfaltet durch ein kurzes Abklemmen des Expirationsluftschlauches für zwei Inspirations- und eine Expirationsdauer. Die einzelnen Muskelschichten wurden ebenfalls mit einer Vicryl-Nadel-Faden-Kombination mit einer doppelten Matratzennaht wieder miteinander verbunden. Die Haut wurde mit derselben Vicryl- Nadel-Faden-Kombination mit einer Subkutannaht und zusätzlich einzelnen U-Heften verschlossen. Zum Nähen wurden ein Nadelhalter und eine gebogene anatomische Pinzette verwendet. Abschließend wurde die Operationswunde mit einer NaCl- Lösung gereinigt und eine Wundversorgung mit antibakteriellem Puder bzw. Salbe (Nebacetin®-Puder Spray bzw. Salbe) durchgeführt.

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Bereits während der Muskelnaht konnte die Narkosetiefe gesenkt werden, nach Abschluß der Hautnaht wurde das Isofluran abgedreht, das Tier aber noch weiterhin beatmet. Sobald alle Reflexe wieder vorhanden waren und das Tier den Tubus abwehrte, konnte dieser entfernt werden. Das Tier wurde dann in einen mit einem Zellstoff ausgelegten Typ 3H-Käfig (2 Tiere pro Käfig) gesetzt, welcher zusätzlich noch für eine gewisse Zeitdauer durch eine Wärmematte beheizt wurde, und bis zum Abschluss der Aufwachphase intensiv beobachtet. Am Ende eines Operationstages konnten die Ratten wieder in den Tierraum gebracht werden. Die Tiere wurden täglich auf ihren Gesundheitszustand und den Zustand der Naht kontrolliert.

Die Einteilung der Tiergruppen erfolgte randomisiert. Dass heißt, die Tiere wurden in einer zufällig gewählten Reihenfolge ihren Ursprungskäfigen entnommen, operiert und über alle Gruppen paarweise in die jeweiligen Behandlungsgruppen verteilt. Die Verteilung in die Behandlungsgruppen post operationem erfolgte in einer möglichst zeitnahen Weise, um eine gegenseitiges Öffnen der Wundnaht durch das bereits

„wachere“ Tier zu verhindern. Auf diese Weise enstanden letztlich Behandlungsgruppen von je 12 Tieren pro Gruppe und Substanz bzw. Placebo (Abbildung 11).

Abbildung 11: Studienablauf Stenosemodell

3.2.3 Medikamentöse Intervention

Die Placebotiere erhielten täglich per os eine Vehikellösung, welche aus einem Solutol-Ethanol-Wasser-Gemisch bestand. Der Solutol-Anteil betrug dabei 40%, der Stenose A. pulmonalis

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Ethanol-Anteil betrug 10% und der Wasser-Anteil 50%. Das Applikationsvolumen betrug 5 ml Applikationsvolumen/kg Tiergewicht. Die Applikation der Tiere erfolgte per Schlundsondierung mittels einer Knopfkanüle.

Sorafenib wurde als Tosylatsalz bereitgestellt. Zur Herstellung einer Applikationslösung zur täglichen per os -Applikation wurde Sorafenib in dem oben genannten Solutol-Ethanol-Wasser-Gemisch in dem oben genannten Applikationsvolumen gelöst. Die Tiere erhielten Sorafenib in einer Dosierung von 5 bzw. 10 mg/kg Tiergewicht, welches exakt nach Gewicht appliziert wurde.

Imatinib wurde als Reinsubstanz aus Glivec®-Tabletten der Firma Novartis extrahiert. Die Applikationslösung für die tägliche per os -Applikation wurde ebenso wie die für Sorafenib hergestellt. Die Tiere erhielten Imatinib in einer Dosierung von 50 mg/kg Tiergewicht, welches ebenfalls exakt nach Gewicht appliziert wurde. Die Dosierung von Imatinib wurde aus der Literatur entnommen, wo sich eine Dosis von 50 mg/kg bei der Ratte bereits im Monocrotalin-Modell als wirksam gezeigt hatte (SCHERMULY, et al. 2005).

3.2.4 Invasive hämodynamische Messungen

Zu Beginn der Messung wurde das Programm Chart® zur Blutdruckmessung gestartet und auf seine Funktionstüchtigkeit überprüft. Der Druckaufnehmer für die Messung des rechtsventrikulären Drücke wurde mit NaCl luftblasenfrei gespült.

Sowohl der Druckaufnehmer als auch der Millarkatheter für die Messung des systemischen Blutdruckes wurden vor jeder Messung auf 0 mmHg eingestellt.

3.2.4.1 Narkose

Am Tag der Messung wurde das zu messende Tier zunächst gewogen und anschließend in einen Narkosekasten gesetzt, in den ein Druckluft-Sauerstoff- Isofluran-Gemisch (500 ml/min Druckluft, 300 ml/min Sauerstoff) eingeleitet wurde.

Zur Anflutung wurde ein Gemisch von 5% Isofluran verwendet, die spätere Erhaltungsdosis Isofluran während der Messung betrug ca. 2% (leichte Variationen möglich aufgrund tierindividueller Unterschiede). Das Tier wurde ca. 3 Minuten dem