Vergleich des Einflusses organischer Nitrate auf endotheliale Progenitorzellen und die Endothelfunktion in Patienten mit symptomatischer koronarer Herzerkrankung

Institut für Molekulare und Translationale Therapiestrategien der

Medizinischen Hochschule Hannover

Vergleich des Einflusses organischer Nitrate auf endotheliale Progenitorzellen und die

Endothelfunktion in Patienten mit

symptomatischer koronarer Herzerkrankung

Dissertation

zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin in der

Medizinischen Hochschule Hannover

vorgelegt von

Volker Andreas Wiebking

aus Hannover

Angenommen vom Senat

der Medizinischen Hochschule Hannover am 22.03.2011

Gedruckt mit Genehmigung

der Medizinischen Hochschule Hannover

Präsident: Prof. Dr. Dieter Bitter-Suermann Betreuer der Arbeit: Prof. Dr. Dr. med. Thomas Thum Referent: PD Dr. med. Jan Kielstein

Korreferent: Prof. Dr. rer. nat. Dimitrios Tsikas

Tag der mündlichen Prüfung: 22.03.2011

Prüfungsausschussmitglieder: Prof. Dr. Johannes Wilhelm Bigalke Prof. Dr. Gerhard Schumann

Prof. Dr. Michael Gebel

Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis ...III Verwendete Abkürzungen ... V

Einleitung ... 1

Die Blutgefäße und ihre Erkrankungen ... 1

Atherosklerose und endotheliale Dysfunktion ... 1

Myokardinfarkt, Remodelling und Neovaskularisation ... 3

Fernziel ... 4

Endotheliale Progenitorzellen und zirkulierende angiogene Zellen... 5

Ursprung und Phänotyp ... 5

Klinische Bedeutung ... 6

Regulation ... 8

Organische Nitrate ... 10

Wirkungen und Indikationen ... 10

Unerwünschte Wirkungen, Toleranz, oxidativer Stress und endotheliale Dysfunktion ... 10

PETN - Sonderrolle durch besondere Eigenschaften?... 11

Oxidativer Stress ... 12

Fragestellung und Hypothese ... 13

Patienten, Material und Methoden ... 15

Ein- und Ausschlusskriterien ... 15

Studiendesign ... 16

Technische Messungen und Labormethoden ... 17

Bestimmung der endothelialen Funktion ... 17

Durchflusszytometrische Bestimmung der EPC-Zahl ... 20

Isolation mononukleärer Zellen ... 21

Immunfluoreszenzmikroskopie und Migrations-Assay (modifiziertes Boyden-Kammer-Assay) ... 21

CFU-Hill-Assay... 23

Statistische Auswertungen ... 23

Ergebnisse ... 23

Zusammenfassung ... 37

Abbildungsverzeichnis ... 38

Tabellenverzeichnis ... 38

Bibliografie ... 39

Verwendete Abkürzungen

ACE Angiotensin-Konversions-Enzym AcLDL Acetyliertes LDL

ASS Acetylsalicylsäure

AT1 Angiotensin-II-Rezeptor-Subtyp-1 BMI “body-mass index” (Körpermasseindex)

BSA „bovine serum albumine“ (bovines Serumalbumin)

CACs „circulating angiogenic cells“ (zirkulierende angiogene Zellen) CD „cluster of differentiation“

CECs „circulating endothelial cells“ (zirkulierende Endothelzellen) CFU “colony forming units” (koloniebildende Einheiten)

Dil 1,1'-Dioctadecyl-1-3,3,3',3'-tetramethyl-indocarbocyanin-perchlorat EBM-2 „Endothelial Basal Medium-2“, Bezeichnung des Herstellers

EDTA Ethylendiamintetraacetat EF Ejektionsfraktion

EPCs Endotheliale Progenitorzellen

FACS “fluorescence-activated cell sorting” (Durchflusszytometrie) FCS „fetal calf serum” (fötales Kälberserum)

FITC Fluoresceinisothiocyanat

FMD “flow-mediated dilation” (durchflussgesteuerte Vasodilatation)

Hb Hämoglobin

HbA1c glykiertes Hämoglobin HDL „high-density lipoprotein“

ISDN Isosorbitdinitrat

KDR „kinase insert domain receptor“

KHK koronare Herzerkrankung LDL “low-density lipoprotein”

MDRD „Modification of Diet in Renal Disease”

PETN Pentaerythrityltetranitrat PETriN Pentaerythrityltrinitrat

ROS “reactive oxygen species” (reaktive Sauerstoffspezies) SOD Superoxiddismutase

TSH Thyreoidea-stimulierendes Hormon UEA-1 Ulex europaeus-Agglutinin-1 VEGF “vascular endothelial growth factor”

Einleitung

Die Blutgefäße und ihre Erkrankungen

Die Organe des menschlichen Körpers sind auf Durchblutung zum Austausch von Gasen und Metaboliten angewiesen. Diese wird durch das Herz als muskuläre Pumpe und die Blutgefäße gewährleistet. Das Herz ist dabei nicht nur für die Organperfusion lebensnotwendig, sondern auch selbst auf eine ausreichende Versorgung angewiesen.

Das Gefäßsystem des Menschen stellt mit einer Gesamtoberfläche von 4000 – 7000 m² ein eigenes Organ des Körpers dar[1]. Seine innerste Schicht wird vom Endothel gebildet, einer einlagigen Zellschicht mit einer Gesamtzellzahl von ca. 1×10¹³ Zellen.

Das Endothel stellt den wesentlichen Regulator der vaskulären Funktion dar, indem es mit endokrinen und parakrinen Mechanismen die Gefäßhomöostase reguliert. Zu seinen Aufgaben gehören die Regulation des vaskulären Tonus und der Gefäßpermeabilität, die Beeinflussung von Blutzellen wie Thrombozyten und Leukozyten sowie die Steuerung von Immunmechanismen, Thrombosebildung und Thrombolyse[2].

Erkrankungen der Blutgefäße und ihre Folgen sind in den westlichen Industrienationen für eine höhere Mortalität und Morbidität verantwortlich als jede andere Gruppe von Erkrankungen[3]. Eine wesentliche Pathologie der Blutgefäße stellt die Atherosklerose dar.

Atherosklerose und endotheliale Dysfunktion

Atherosklerose ist eine fortschreitende Erkrankung der großen Arterien, charakterisiert durch die Ablagerung von Zellen, Lipiden und Fasern in den Gefäßwänden. Ihre frühen Kennzeichen können in der Aorta bereits in der ersten Lebensdekade nachgewiesen werden, die klinischen Folgen manifestieren sich dagegen meist erst in höherem Alter[4]. Zu diesen gehören ischämische Erkrankungen vor allem von Herz, Hirn, den

Variablen, zu denen Störungen im Fettstoffwechsel, arterielle Hypertonie, Diabetes mellitus und Variablen der Lebensführung wie Rauchen, Adipositas, Bewegungsmangel und Ernährungsgewohnheiten gehören. Daneben wurden in den letzten Jahren noch andere Faktoren ermittelt, die das kardiovaskuläre Risiko erhöhen können, z.B.

Lipoprotein(a), Homocystein, Fibrinogen und Infektionen[4-5].

Diese Risikofaktoren beschleunigen die chronische Schädigung des Endothels an Orten hämodynamischer Turbulenzen, die zu einer Dysfunktion dieser Zellschicht und einer chronischen Inflammation der Gefäßwand führt. Diese stellen den Beginn der Bildung atherosklerotischer Läsionen dar (sog. „response to injury“-Hypothese[6-7], Abb. 1).

Die endotheliale Dysfunktion beinhaltet verschiedene reversible Funktionsveränderungen als Reaktion auf externe Stimuli und ist charakterisiert durch eine Einschränkung der endothelabhängigen Vasorelaxation, vor allem aufgrund verminderter NO-Biosynthese, geringerer Endothelin-Spiegel und vermehrter Produktion reaktiver Sauerstoff-Spezies[5]. Weitere Schritte in der Atherogenese sind Einlagerung von Lipoproteinen und deren Oxidation, Adhäsion und Invasion von Zellen wie Monozyten und anderen Leukozyten und deren Umwandlung in Schaumzellen durch exzessive Aufnahme von Lipoproteinen, weiterhin Thrombozytenadhäsion, Einwanderung und Proliferation von glattmuskulären Zellen und deren Produktion von Proteinen der extrazellulären Matrix.

Das Resultat ist eine atheromatöse Plaque mit einer fibrösen Kappe, die entweder stabil ist oder rupturieren kann, was durch Freisetzung von hoch-thrombogenem Material zum rapiden Verschluss des Gefäßbetts führt [5].

Abbildung 1 - Progression der Atherosklerose: von der endothelialen Dysfunktion zu kardiovaskulären Komplikationen (aus [8])

Die Prävention der Atherosklerose beinhaltet die strenge Kontrolle von Risikofaktoren, sowohl durch Änderung im Lebensstil als auch mit pharmakologischen Mitteln.

Allgemeine Maßnahmen sind Rauchverzicht, körperliche Aktivität und gesunde Ernährung, die medikamentöse Therapie beinhaltet eine adäquate Einstellung des Blutdrucks und des Blutzuckers, Senkung erhöhter Blutfette und Hemmung der Thrombozytenaggregation[3].

Myokardinfarkt, Remodelling und Neovaskularisation

Neben der chronisch-ischämischen Herzkrankheit ist der akute Myokardinfarkt eine gefürchtete Folge der Atherosklerose. Dieser steht in Deutschland an zweiter Stelle der häufigsten Todesursachen und ist für ca. 70% der Fälle von Herzinsuffizienz verantwortlich[9]. Die weitaus häufigste Ursache für dieses Ereignis ist die akute Veränderung der atherosklerotischen Plaque. Die Plaqueruptur unter Freilegung von hoch-thrombogenem Material führt zu Thrombozytenaktivierung und Aktivierung der Gerinnungskaskade mit konsekutivem Verschluss der betroffenen Koronararterie durch den Thrombus[3].

Die Folgen für das Myokard sind der irreversible Zelltod von Kardiomyozyten mit anschließender Degradation von Matrix und Gefäßen parallel zum Beginn einer inflammatorischen Reaktion. Diese erste Phase ist nach ca. vier Wochen abgeschlossen und wird gefolgt von Fibrosierung unter Ausbildung einer Narbe[10].

Die kardialen Anpassungsreaktionen nach einem Infarkt, die auch das nicht-infarzierte Myokard betreffen, werden unter dem Begriff „ventrikuläres Remodelling“

zusammengefasst. In der Frühphase kann es zu einer Expansion des Infarktgebietes kommen. Dies bewirkt eine erhöhte mechanische Belastung des übrigen Myokards, was eine ventrikuläre Dilatation und Hypertrophie hervorruft. Die dadurch verursachte Einschränkung der linksventrikulären Funktion kann zu Herzinsuffizienz führen[11].

Die Verschlechterung der Prognose, die dieses Remodelling bewirkt[12] hat zu

vermindern kann[14]. Aber auch eine späte Reperfusion beeinflusst das Remodelling positiv[15]. Die etablierte medikamentöse Therapie beinhaltet ACE-Hemmer bzw.

Angiotensin-Rezeptor-Antagonisten kombiniert mit einem Betablocker, in einigen Fällen, die mit dem Auftreten von Herzinsuffizienz einhergehen, außerdem die Aldosteron-Rezeptor-Blockade[16]. Daneben existieren verschiedene weitere Ansätze, mit denen das Remodelling positiv beeinflusst werden kann, bis hin zu chirurgischen Verfahren[17].

Diese Therapien verbessern die Symptome und wirken lebensverlängernd, jedoch kann (außer einer Herztransplantation) keine die kausale Ursache des Gewebsverlustes rückgängig machen. Daher wurden in den letzten Jahren große Hoffnungen auf neue Ansätze der regenerativen Medizin gesetzt, unter anderem auf zell-basierte Therapien mit Hilfe von Progenitorzellen aus dem Knochenmark[18]. Eine hierdurch stattfindende Kardiomyogenese ist umstritten[19], jedoch ist die Verbesserung der Neovaskularisation ein viel versprechender Ansatz[20], und tatsächlich führen die Therapien mit aus dem Knochenmark stammenden Zellen zu einer Zunahme der Vaskularisierung und einer Verbesserung der kardialen Funktion[21].

Fernziel

Die große klinische Bedeutung der Atherosklerose und ihrer Folgekrankheiten machen es notwendig, nach neuen Präventions- und Therapieansätzen zu suchen. Mögliche Ansatzpunkte sind unter anderem:

 die Korrektur einer endothelialen Dysfunktion und Reparatur endothelialer Schäden um den Beginn der Plaque-Bildung zu verzögern

 oder auch die therapeutische Verhinderung des Remodelling und die Verbesserung der Neovaskularisation nach einem Herzinfarkt um seine Folgen abzumildern.

In den letzten Jahren wurde gezeigt, dass endotheliale Progenitorzellen für diese Ziele eine wichtige Rolle spielen können. Diese Arbeit möchte einen Beitrag leisten bei der Aufklärung, wie diese Zellen auf Hormone oder Medikamente reagieren und wie man ihre Mobilisation und ihre Funktion beeinflussen kann um die positiven Eigenschaften dieser Zellen klinisch nutzbar zu machen.

Endotheliale Progenitorzellen und zirkulierende angiogene Zellen

Ursprung und Phänotyp

Endotheliale Progenitorzellen (EPCs) stellen eine heterogene Zellpopulation dar, die aus dem Knochenmark stammt und im Blutstrom zirkuliert[22-23]. Diese Zellen haben eine wichtige Funktion bei der Bildung neuer Blutgefäße beim Erwachsenen, indem sie angiogene Wachstumsfaktoren bilden und sezernieren und Vorläuferzellen darstellen, die in reife Endothelzellen differenzieren können[24]. Es wird angenommen, dass EPCs mit den Zellen der Hämatopoese aus einem gemeinsamen Vorläufer hervorgehen, dem Haemangioblasten[25]. Eine Vielzahl von Nachweismethoden stellt dabei teilweise ganz unterschiedliche Subpopulationen mit eigenen Eigenschaften dar, für die in der Literatur jedoch der Begriff EPC als Oberbegriff verwendet wird.

Es existieren sowohl funktionelle als auch immunologische Assays. Üblich sind sowohl der Nachweis von Oberflächenantigenen wie CD34, CD133 und KDR[26-28], wobei die Co-Expression aller drei Oberflächenmarker auf Zellen einer unreiferen Differenzierungsstufe hinweist, welche mit Verlust des CD133-Antigens in CD34⁺/KDR⁺-Zellen differenzieren[27]. Daneben ist die Markierung durch Bindung des Ulex europaeus-Agglutinin-1 (UEA-1) und die Aufnahme von acetyliertem LDL (AcLDL), das mit dem Fluoreszenzfarbstoff 1,1-Dioctadecyl-3,3,3,3-tetramethyl- indocarbocyaninperchlorat (Dil) konjugiert wurde, üblich[27]. Ein weiterer Standard ist die Bestimmung der Anzahl der in Zellkultur gebildeten Kolonien (CFU) als Marker für Anzahl und Funktionalität der EPCs[29].

Die mit diesen Methoden dargestellten Zellen werden „frühe“ EPCs genannt, die von der myeloischen Linie der Hämatopoese abstammen, endotheliale Eigenschaften annehmen und angiogene Zytokine produzieren. Daneben wurden sogenannte „späte“

EPCs beschrieben, deren Zellzahl in der Zirkulation sehr gering ist, die erst nach 3

EPCs stellen diese wahrscheinlich keine wirklichen Vorläufer von Endothelzellen dar, sondern fördern die Angiogenese durch Bildung parakriner Faktoren[28, 31] und haben erhebliche prognostische Bedeutung[32], daher werden sie auch als zirkulierende angiogene Zellen (CACs) bezeichnet[33].

Unterschieden werden diese Zellpopulationen von reifen Endothelzellen, die den Kontakt zur Gefäßwand verloren haben und im Blutstrom zirkulieren, sogenannten zirkulierenden Endothelzellen (CECs)[34], welche die für EPCs beschriebenen Wirkungen (wie z.B. die Verbesserung der Neovaskularisation in vivo, s.u.) nicht zeigen[35].

Klinische Bedeutung

Mehrere Studien haben inverse Korrelationen zwischen EPC-Zahlen und kardiovaskulären Risikofaktoren gefunden und nahe gelegt, dass diese als Biomarker für den vaskulären Gesundheitsstatus dienen könnten. Eine höhere Anzahl von Risikofaktoren geht mit niedrigen EPC-Zahlen einher[29, 36-38]. Die Level später EPCs sind mit dem Grad der koronaren Herzerkrankung (KHK) erhöht[39]. Neben diesen Korrelationen stellt eine niedrige EPC-Zahl anscheinend einen unabhängigen Risikofaktor dar, da geringe Zahlen CD34⁺/KDR⁺-Zellen in prospektiven Studien das Auftreten von kardiovaskulären Events vorhersagen können[40-41].

Abbildung 2 - Rolle von EPCs im menschlichen Körper (aus [24])

Sowohl lokal als auch systemisch applizierte EPCs führen zu einer schnelleren Re- Endothelialisierung von künstlich erzeugten Gefäßschäden[42], verbessern eine endotheliale Dysfunktion und konnten in experimentellen Modellen die Progression der Bildung atherosklerotischer Plaques verlangsamen[43]. Auch an Orten von Ischämie wie der Narbe nach einem Myokardinfarkt haben EPCs positive Effekte, indem sie die Neovaskularisation fördern und die kardiale Durchblutung und Funktion verbessern[44- 45] (Abb. 2 und 3).

Abbildung 3 - Beteiligung von EPCs an der Neovaskularisation (aus [46])

Ein weiterer Zusammenhang besteht zwischen der Zahl endothelialer Progenitorzellen und der endothelvermittelten Vasodilatation von Arterien, einem Indikator für die Endothelfunktion[29, 47], wobei der ursächliche Zusammenhang zwischen einer

Regulation

Für die Mobilisation und Funktion von EPC wurde die endotheliale NO-Synthase (eNOS) als ein wichtiger Regulator identifiziert[48-50] (Abb. 4). Ein beteiligter Mechanismus ist die Regulation der Aktivität der Matrix-Metalloproteinase-9 (MMP-9) im Knochenmark, die an der Mobilisation von Progenitorzellen aus ihren Nischen beteiligt ist[48, 51]. Neben Stickstoffmonoxid spielen weitere Hormone und Zytokine eine Rolle, so zum Beispiel Östrogene[52], VEGF und SDF-1[53].

Abbildung 4 - ausbleibende Mobilisierung von EPCs durch VEGF in eNOS- Knockout-Mäusen (aus [48])

Schließlich wurde der Einfluss von Medikamenten auf endotheliale Progenitorzellen untersucht. Einen deutlichen Einfluss haben beispielsweise Statine, die die Anzahl zirkulierender EPCs erhöhen und deren Beitrag zur Neovaskularisation steigern[54].

Ein ähnlicher Effekt wurde für ACE-Inhibitoren nachgewiesen[51] (Abb. 5).

Abbildung 5 - Bekannte medikamentöse und hormonelle Einflüsse auf EPCs (aus [32])

Organische Nitrate

Wirkungen und Indikationen

Organische Nitrate sind potente NO-Donatoren und Vasodilatatoren, die endothel- unabhängig vor allem an Venen, großen Arterien und Kollateralen wirken. Sie führen zu einer Senkung der Vorlast, einer Steigerung der Koronardurchblutung und senken den kardialen Sauerstoffbedarf[55]. Indikationen langwirksamer Nitrate liegen im Bereich der stabilen und instabilen chronischen Angina Pectoris[56] sowie bei der Behandlung der therapierefraktären chronischen Herzinsuffizienz[57].

Die prognostische Bedeutung einer Therapie mit organischen Nitraten bei akutem Koronarsyndrom ist weiterhin umstritten, große prospektive und randomisierte Studien fehlen in diesem Bereich[58]. Sie gelten als sicher in der Anwendung und als neutral in Bezug auf das Auftreten kardiovaskulärer Endpunkte[59]. Dagegen hat die Behandlung der chronischen Herzinsuffizienz mit ISDN und Hydralazin positive Langzeitwirkungen[57].

Unerwünschte Wirkungen, Toleranz, oxidativer Stress und endotheliale Dysfunktion

Unerwünschte Nebenwirkungen einer Nitrat-Therapie sind vor allem Kopfschmerzen, seltener auch Hypotension und Schwindel[60]. Ein Faktor, der die langfristige therapeutische Wirkung wesentlich limitiert ist die schnelle Toleranzentwicklung[61].

Hierfür spielen neben der neurohumoralen Gegenregulation des Körpers (sog.

Pseudotoleranz), die bei jeder Vasodilatantientherapie auftritt, zwei Mechanismen eine wichtige Rolle[62]:

 eine verminderte Aktivierung der Nitrate

 eine vermehrte Produktion reaktiver Sauerstoffspezies

Weiterhin tritt nach Gabe der meisten organischen Nitrate eine endotheliale Dysfunktion auf[63-64] (Abb. 6). Interessanterweise geschieht dies nicht bei Koadministration von Antioxidantien, ein Hinweis dafür, dass oxidativer Stress als Ursache der Dysfunktion eine Rolle spielt[65]. Diese Wirkungen von Nitraten sind von

Bedeutung, da eine endotheliale Dysfunktion mit einer schlechteren Prognose einhergeht[66].

Abbildung 6 - Veränderung der FMD durch ISDN-Therapie (aus [63])

PETN - Sonderrolle durch besondere Eigenschaften?

Eine Sonderstellung scheint das Pentaerythrityltetranitrat (PETN) einzunehmen. Bei chronischer Therapie induziert es keine Toleranzentwicklung und die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies fällt geringer aus[67-68]. Des Weiteren wird im Gegensatz zu einer Therapie mit den meisten anderen Nitraten keine endotheliale Dysfunktion beobachtet.

Im Tierversuch an cholesterolreich-ernährten Ratten wirkte eine Therapie mit PETN sogar atheroprotektiv[69]. Es gibt Hinweise dafür, dass PETN und seine Metaboliten antioxidative Enzyme induzieren, was diese besonderen Eigenschaften erklären könnte[70]. Eine klinische Studie an 324 Patienten konnte zeigen, dass die Belastungstoleranz von Patienten mit stabiler Angina Pectoris unter PETN-Therapie anstieg, während sie sich unter ISDN-Therapie nicht veränderte. Auch traten Kopfschmerzen als wichtigste Nebenwirkung der Nitrate seltener auf[71].

Oxidativer Stress

Die exzessive Produktion reaktiver Sauerstoffspezies, die die Kapazitäten endogener antioxidativer Schutzmechanismen übersteigt, wird als oxidativer Stress bezeichnet[72].

Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) spielen bei der Entwicklung der Atherosklerose und anderer kardiovaskulärer Erkrankungen eine wichtige Rolle[73].

Ein beteiligter Mechanismus bei der zellschädigenden Wirkung von ROS besteht darin, dass Superoxid-Anionen (O₂^-) mit Stickstoffmonoxid-Molekülen (NO) reagieren und dadurch die Verfügbarkeit dieses für die vaskuläre Homöostase wichtigen Signalstoffs verringern. Zusätzlich wirkt das dabei entstehende Peroxynitrit (ONOO^-) oxidativ und zellschädigend[74]. Die Folge für das Gefäßsystem ist sowohl die Entstehung einer endothelialen Dysfunktion[8] als auch die Förderung der Endothelzellapoptose[75].

Daneben werden endotheliale Progenitorzellen in ihrer Funktion eingeschränkt obwohl sie über ausgeprägte antioxidative Kapazitäten verfügen[76] (Abb. 7).

Abbildung 7 - Einfluss oxidativen Stresses auf EPCs (aus [77])

Reaktive Sauerstoffspezies spielen außerdem eine Rolle bei der schädigenden Wirkung vieler kardiovaskulärer Risikofaktoren und in der Pathogenese der Atherosklerose, allerdings konnten bisherige klinische Studien zur Supplementierung von Antioxidantien keine positiven Effekte auf Morbidität und Mortalität zeigen[78].

Neben der zellschädigenden Wirkung dienen ROS auch als intrazelluläre Botenstoffe und sind an der Regulation von Zellerneuerung, Differenzierung, Zellalterung und Apoptose beteiligt[76].

Fragestellung und Hypothese

Die dargestellten Informationen lassen sich wie folgt zusammenfassen:

 EPCs spielen eine Rolle bei der Aufrechterhaltung der vaskulären Homöostase und tragen zur Neovaskularisation bei.

 NO ist ein wichtiger Mediator bei der Mobilisation und Funktion endothelialer Progenitorzellen.

 PETN und ISDN stellen als organische Nitrate NO-Donatoren mit unterschiedlichen Effekten dar, vor allem da ISDN eine endotheliale Dysfunktion hervorruft und zur Bildung von ROS führt.

 ROS schränken Mobilisation und Funktion von EPCs ein.

Die Abbildung 8 fasst diese Wirkungen der Nitrate schematisch zusammen.

Abbildung 8 - Organische Nitrate und ihre bekannten und hypothetischen Wirkungen

Dies wirft folgende Fragen auf:

 Kann eine pharmakologische Bereitstellung von NO durch eine Therapie mit organischen Nitraten EPCs mobilisieren und ihre Funktion beeinflussen?

 Hat dies einen Effekt auf die endotheliale Funktion?

 Existieren dabei Unterschiede in den Wirkungen einer Therapie mit ISDN und PETN?

Obwohl die wichtige Rolle, die NO und die eNOS für EPCs spielen, seit mehreren Jahren bekannt ist, existierten zu Beginn dieser Studie über diese Zusammenhänge lediglich Daten über Modelle in Zellkultur und Ratten. Dabei wurde festgestellt, dass eine Therapie mit Nitraten die Zahl zirkulierender EPCs sowohl im gesunden Tier als auch nach Myokardinfarkt erhöht. Nach einer Behandlung mit ISDN waren die Migrationsfähigkeit der Zellen und die Kapazität, sich in vaskuläre Netzwerke zu integrieren eingeschränkt. Nicht jedoch nach einer PETriN-Therapie (Pentaerythrityltrinitrat, ein experimentell verwendeter Metabolit des PETN), hier stieg

die Integration in Netzwerke sogar deutlich an. Interessanterweise erhöhte auch nur ISDN die intrazelluläre ROS-Produktion. Durch Zugabe von Superoxid-Dismutase (SOD) konnten die negativen Wirkungen von ISDN rückgängig gemacht werden, was auf eine wesentliche mechanistische Rolle von ROS bei der Funktionseinschränkung durch ISDN schließen lässt[79].

Planung und Durchführung der vorliegenden Studie dienten dazu, diese Ergebnisse vom Tiermodell auf den Menschen zu übertragen und festzustellen, ob dort gleiche oder ähnliche Wirkungen existieren.

Patienten, Material und Methoden

Ein- und Ausschlusskriterien

Die Zustimmung der Ethikkommission der Universität Würzburg wurde eingeholt und die Studie im Register für klinische Studien des National Institute of Health, USA registriert (www.clinicaltrials.gov, Identifikations-Nr. NCT01030367).

Eingeschlossen wurden 36 Patienten mit stabiler Angina Pectoris-Symptomatik und koronarangiografisch nachgewiesener koronarer Herzerkrankung ohne Interventionsmöglichkeit, für die ein konservatives Prozedere mit Ausbau der antipektanginösen Therapie durch ein organisches Nitrat vorgesehen war (Tab. 1).

Einschlusskriterien Ausschlusskriterien

 Stabile Angina Pectoris- Symptomatik

 Koronarangiographischer Nachweis von relevanten Stenosen

 Ausschluss einer

Interventionsmöglichkeit

 Bisher keine Therapie mit einem organischen Nitrat

 Akute Infektion

 Bekannte maligne Erkrankung

 Alter < 18 Jahren

 Aktuelle oder vorherige Behandlung (innerhalb der letzten 4 Wochen) mit langwirksamen organischen Nitraten

Tabelle 1 - Ein- und Ausschlusskriterien

Die Patienten wurden ausführlich über die Art der Untersuchungen und die Freiwilligkeit der Teilnahme aufgeklärt und willigten mit einer schriftlichen Einverständniserklärung ein.

Studiendesign

Den Patienten wurde jeweils vor und 14 Tage nach Beginn einer Therapie mit einem organischen Nitrat (2 x 40mg ISDN retard täglich, n=18 oder 2 x 80mg PETN täglich, n=18) venöses Blut zur Bestimmung der EPC-Zahl und –Funktion entnommen und die Endothelfunktion fingerplethysmographisch bestimmt (Abb. 9). Die durchgeführten Untersuchungen erfolgten nach etablierten Protokollen.

Abbildung 9 - Studiendesign

Technische Messungen und Labormethoden

Bestimmung der endothelialen Funktion

Die endotheliale Funktion der Patienten wurde fingerplethysmographisch mit Hilfe des Endo-PAT2000-Systems bestimmt (Itamar Medical, Caesarea, Israel), welches auf der Technik der peripher-arteriellen Tonometrie (PAT, in der Literatur teilweise auch Pulsamplituden-Tonometrie) beruht. Die Messsonden des Endo-PAT2000-Systems applizieren einen gleichmäßigen Druck (ca. 10 mmHg unter dem diastolischen Blutdruck) auf die distale Fingeroberfläche und registrieren so die Puls-Volumenkurve des Fingers (Abb. 10).

Zur Erhebung der Ausgangswerte wurde die Puls-Volumenkurve 5 Minuten lang an beiden Fingern gemessen, bevor ein Ischämiereiz auf einen der Arme ausgeübt wurde

Vasodilatation in Folge einer Verstärkung der NO-Biosynthese des Endothels beruht[80]. Diese Antwort wird als reaktive Hyperämie bezeichnet.

Abbildung 10 - Messung mit dem Endo-PAT2000-System und Schema des Sensors (aus [81])

Der elektronisch registrierte Verlauf der Amplituden wurde nach einem automatisierten Algorithmus des Herstellers ausgewertet. Hierbei wird die durchschnittliche Amplitudenhöhe des Zeitintervalls zwischen einer und zwei Minuten nach Manschettendeflation ins Verhältnis gesetzt mit der durchschnittlichen Amplitudenhöhe vor Okklusion des Blutstroms. Um kurzfristige Störungen und systemische Effekte der Ischämie zu eliminieren wird dieser Wert durch den korrespondierenden Wert des kontralateralen Armes dividiert. Das Ergebnis ist der Reaktive Hyperämieindex (RHI) (Abb. 11 und 12).

Abbildung 11 - Beispiel für PAT-Messung: erhaltene Endothelfunktion

Abbildung 12 - Beispiel für PAT-Messung: eingeschränkte Endothelfunktion

Die so gewonnen Werte korrelieren hochsignifikant mit dem Goldstandard der Endothelfunktionsmessung, der intrakoronaren Acetylcholin-Injektion[82]. In großen Populationsstudien wurde gezeigt, dass eine verringerte Hyperämie-Antwort der PAT-

Durchflusszytometrische Bestimmung der EPC-Zahl

In 5 Ansätzen wurden jeweils 100 µl Vollblut nach dem in Tabelle 2 dargestellten Schema zu Fluoreszenzfarbstoff-konjugierten Antikörpern bzw. PBS pipettiert.

Ansatz 100 µl

Vollblut + Beschreibung

(1) Kontrolle 200 µl PBS (2) Isotyp-kontrolle: 1,5 µl IT-FITC

+ 198,5 µl PBS

FITC-konjugierte monoklonale Maus- Immunglobulin-Isotypkontrolle (IgG1ĸ, Katalog-Nr. 554679), BD Pharmingen, Deutschland

(3) Isotyp-kontrolle: 10 µl IT-PE + 190 µl PBS

PE-konjugierte Maus-Immunglobulin- Isotypkontrolle (IgG1, Katalog-Nr.

IC002P), R&D SYSTEMS, USA (4) Isotyp-kontrolle: 10 µl IT-APC

+ 190 µl PBS

APC-konjugierte monoklonale Maus- Immunglobulin-Isotypkontrolle (IgG2b, Katalog-Nr. 130-092-217) Miltenyi Biotec GmbH, Deutschland (5) Messprobe: 20 µl CD34-FITC

+ 10 µl CD133-APC + 10 µl KDR-PE + 160µl PBS

FITC-konjugierter anti-human-CD34- Antikörper (Katalog-Nr. 555821), BD Pharmingen, Deutschland;

APC-konjugierter monoklonaler

humaner CD133/2 (293C3)-Antikörper (Katalog-Nr. 130-090-854), Miltenyi Biotec GmbH, Deutschland;

PE-konjugierter monoklonaler anti- human-VEGF-R2(KDR)-Antikörper (Katalog-Nr. FAB357P), R&D SYSTEMS, USA

Tabelle 2 - Pipettierschema zur FACS-Analyse

Um Fehlmessungen durch zelluläre Autofluoreszenz zu verringern wurde Probe (1) als Leerkontrolle genutzt. Die Ansätze 2-4 dienten als Isotypkontrollen um falsch-positive Signale durch unspezifisch gebundene Antikörper zu eliminieren. Die eigentliche

Suspension in PBS suspendiert und die gefärbten Zellen abzentrifugiert. Nach Verwerfen des Überstandes wurden die Zellen zur hypoosmolaren Depletion der Erythrozyten mit 2 ml FACS-Lysing-Solution (Katalog-Nr. 349202, BD Biosciences) bei Raumtemperatur für 5 min. inkubiert.

Nach einer weiteren Zentrifugation und erneutem Verwerfen des Überstandes wurde das Zellpellet in 500 µl PBS resuspendiert. Die Proben wurden mit Hilfe eines FACSCalibur Durchflusszytometers (BD Biosciences) analysiert, hierzu wurden pro Messdurchlauf von 100.000 mononukleären Zellen die Seit- und Vorwärtsstreuung des Lasers sowie die Fluoreszenz analysiert. Die Ergebnisse der CD34⁺-, CD133⁺-, CD34⁺/KDR⁺/CD133⁺- und CD34⁺/KDR⁺-Zellen wurden mit Hilfe der Software Cellquest Pro (BD Biosciences) analysiert und als Zellzahlen pro 100.000 mononukleärer Zellen angegeben.

Isolation mononukleärer Zellen

Aus den Blutproben (20 ml in EDTA-Röhrchen) wurde mittels Ficoll-Dichtegradienten- Zentrifugation die Schicht der mononukleären Zellen isoliert (Ficoll Paque®, GE Healthcare). Dazu wurde die Blutprobe vorsichtig über das vorgelegte Ficoll geschichtet ohne die Phasen miteinander zu vermischen. Nach Zentrifugation bei 1200 G für 20 min. mit ausgeschalteter Bremse wurde die entstandene Schicht mononukleärer Zellen (Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMCs) isoliert und nach zweimaligem Waschen in PBS resuspendiert und in einer Neubauer-Zählkammer gezählt.

Immunfluoreszenzmikroskopie und Migrations-Assay (modifiziertes Boyden-Kammer-Assay)

Jeweils 3×10⁶ PBMCs wurden in 2 ml EBM-2-Medium mit fötalem Kälberserum (FCS) und EGM-2 SingleQuot-Zusätzen (Lonza) auf Fibronectin-beschichteten 6-Well- Platten (Fibronectin human, Harbor BioProducts) ausgesät und für 3 Tage im Brutschrank bei 37°C und 5% CO inkubiert. Die Wells mit den adhärierenden Zellen

Zellen am Boden der Wells unter dem Fluoreszenz-Mikroskop fotografiert (Carl Zeiss AG). Es wurden von 3 Wells jeweils 3 Fotos angefertigt und die doppelt-positiven Zellen mit Hilfe der Software AxioVision LE (Carl Zeiss MicroImaging GmbH) in zufällig ausgewählten Bildfeldern gezählt.

Um die bereits gefärbten Zellen für das Migrations-Assay (nach der von Vasa et. al.

beschriebenen Methode[54]) weiterverwenden zu können wurden sie im folgenden Schritt von der Platte mithilfe von Trypsin gelöst und diese enzymatische Reaktion durch Zugabe von EBM-2-Medium mit FCS und Zusätzen abgeblockt. Die Zellen wurden durch Zentrifugation vom Trypsin getrennt und in EBM-2-Medium mit 1%

Rinderserum-Albumin (BSA) resuspendiert und gezählt. 2 Kammer-Einsätze (HTS Fluoro Blok Inserts, 8 µm Porengröße, Falcon) wurden in 2 Wells, in denen jeweils 700 µl EBM-2-Medium mit SDF-1 (100 ng/ml) und VEGF (50 ng/ml) vorgelegt waren, gehängt. Ein Volumen der Zellsuspension, das einer Zellzahl von 1x10⁵ entsprach, wurde in 1 ml EMB-2-Medium mit 1% BSA in zwei Ansätzen in die Kammern gegeben (Abb. 13).

Abbildung 13 - Schema der modifizierten Boyden-Kammer

Nach Inkubation bei 37°C und 5% CO₂ über 24 Stunden wurde die Unterseite der Einsätze fluoreszenzmikroskopisch fotografiert und mit der Software AxioVision LE ausgewertet. Pro Ansatz wurde von je 3 zufällig ausgewählten Bildausschnitten die mittlere Zellzahl bestimmt.

CFU-Hill-Assay

Es wurde ein CFU-Assay nach der von Hill et. al. beschriebenen Methode[29]

durchgeführt, für das kommerzielle Test-Sätze angeboten werden. Hierzu wurden jeweils 5×10⁶ PBMCs in EndoCult-Medium mit Zusätzen (StemCell Technologies) auf Fibronectin-beschichteten 6-Well-Platten kultiviert. Zur Trennung von ausdifferenzierten zirkulierenden Endothelzellen wurden nach 48 Stunden die nicht- adhärierenden Zellen abgenommen, gezählt und in doppelten Ansätzen zu je 1×10⁶ Zellen in Fibronectin-beschichteten 24-Well-Platten über 72h bebrühtet. Dann wurden die entstehenden Kolonien mikroskopisch identifiziert und gezählt, wobei eine Kolonie definiert war als ein Zellhaufen, bestehend aus einer Ansammlung zentraler runder Zellen mit daraus heraussprossenden spindelförmigen Zellen.

Statistische Auswertungen

Wenn nicht anders angegeben, werden die Daten als Mittelwert und Standard-Fehler des Mittelwertes angegeben. Die Datenanalyse erfolgte mittels StatView (Version 5.0.1, SAS Institute Inc.) und SPSS (Version 16.0.1, SPSS Inc.). Zum Gruppenvergleich zweier Gruppen wurde der gepaarte oder ungepaarte zweiseitige t-Test, zum Vergleich von 3 oder mehr Gruppen die univariate Varianzanalyse (ANOVA) verwendet.

Unterschiede zwischen Gruppen wurden als signifikant erachtet, wenn der P-Wert unterhalb 0,05 lag.

Ergebnisse

Eigenschaften des Patientenkollektivs

PETN ISDN

Parameter Einheit Mittel-

wert

SEM Mittel- wert

SEM P- Wert

N= 18 18

Alter Jahre 65.33 2.47 65.89 2.47 0.88

BMI 26.43 0.85 28.66 1.29 0.19

Geschlecht % männlich 72.22 72.22 1.00

Kardiovaskuläre Funktionsparameter

Mittlerer art. Blutdruck mmHg 91.72 3.78 99.62 3.01 0.08

Ejektionsfraktion % 65.69 3.65 68.31 2.07 0.54

Stenosierte Koronargefäße

(1-3) 2.17 0.25 1.67 0.20 0.12

Blutwerte

Hämoglobin g/dl 14.01 0.28 14.69 0.21 0.06

Leukozyten n*10³/µl 7.43 0.48 7.42 0.44 0.99

CRP mg/dl 0.64 0.30 0.36 0.09 0.38

TSH mIU/l 0.98 0.15 1.59 0.44 0.17

HbA1c % 6.12 0.33 6.22 0.26 0.83

Gesamt-Cholesterin mg/dl 166.75 8.63 164.73 6.75 0.86

LDL mg/dl 89.94 6.69 86.60 5.48 0.71

HDL mg/dl 44.94 3.25 46.73 2.97 0.69

Harnsäure mg/dl 6.78 0.38 6.00 0.21 0.08

Serum-Kreatinin mg/dl 0.97 0.08 0.84 0.05 0.17

Harnstoff mg/dl 39.10 4.14 34.20 1.45 0.27

MDRD ml/min/1.73m² 85.44 6.77 95.28 6.07 0.29

PETN ISDN

Kardiovaskuläre Risikofaktoren Ja Nein Ja Nein

Arterielle Hypertonie 18 0 18 0 1.00

Adipositas 9 5 15 2 0.10

Diabetes mellitus 3 14 4 13 0.91

Medikation Ja Nein Ja Nein

ASS/Clopidogrel 18 0 18 0 1.00

ACE-Inh./AT1-Antag. 16 2 15 3 0.63

Statin 18 0 18 0 1.00

Orales Antidiabetikum 1 17 3 15 0.29

Insulin /-Analogon 1 17 1 17 1.00

Betablocker 18 0 18 0 1.00

Diuretikum 16 2 14 4 0.37

Digitalis 3 15 1 17 0.29

Calcium-Antagonist 5 13 7 11 0.48

Tabelle 3 - Charakteristika der Ausgangsgruppen

Beeinflussung der Progenitorzellzahl

Die Zahlen der hämatopoetischen und endothelialen Progenitorzellen wurden mittels Durchflusszytometrie und in Zellkultur aus PBMCs bestimmt.

In der Gruppe der Patienten, die mit ISDN behandelt wurden fand sich kein Unterschied in der Zahl von CD34⁺- oder CD133⁺-hämatopoetischen Progenitorzellen (CD34⁺- Zellen: p=0,96; CD133⁺-Zellen: p=0,63). Ebenso führte eine Behandlung mit PETN zu keiner signifikanten Veränderung dieser Zellen (CD34⁺-Zellen: p=0,23; CD133⁺-Zellen:

p=0,17).

Dagegen ergab sich bei der durchflusszytometrischen Untersuchung der EPC-Zahlen

Werten unter PETN-Therapie erkennbar (p=0,11) (Abb. 14). Auch im Vergleich der relativen Veränderungen zeigte sich bei beiden Zellarten ausschließlich unter PETN- Therapie ein signifikanter Anstieg (CD34⁺/KDR⁺/CD133⁺-Zellen: p=0,025;

CD34⁺/KDR⁺-Zellen: p=0,0075, Abb. 14 und 15)

Abbildung 14 - Beeinflussung CD34⁺/KDR⁺/CD133⁺-Zellen

Abbildung 15 - Beeinflussung CD34⁺/KDR⁺-Zellen

Die ebenfalls durchgeführte Bestimmung der Zahl Dil-AcLDL-aufnehmender und UEA- 1-bindender Zellen, eines weiteren Subtyps endothelialer Progenitorzellen, ergab weder unter Behandlung mit ISDN (587.7±79.2 Zellen vor und 678.4±82.3 Zellen nach Behandlung, p=n.s.) noch unter PETN-Gabe (556.4±45.6 Zellen vor und 533.7±37.2 Zellen nach Behandlung, p=n.s.) eine signifikante Veränderung.

Beeinflussung der EPC-Funktion

Zur Bestimmung von funktionellen Eigenschaften der EPCs wurde ihre Fähigkeit zu Wachstum und Differenzierung im CFU-Hill-Assay sowie ihre Migrationsfähigkeit unter Chemoattraktion durch die Wachstumsfaktoren VEGF und SDF-1 bestimmt.

Es zeigte sich, dass nach Therapie mit PETN die Fähigkeit der EPCs, in Zellkultur Kolonien zu bilden, signifikant anstieg (p=0,04), gemessen an der Anzahl der Koloniebildenden Einheiten im CFU-Hill-Assay. In der Gruppe, die mit ISDN behandelt wurde war die Zahl unverändert (p=0,97, Abb. 16).

Im Migrations-Verhalten der EPCs zeigte sich kein signifikanter Unterschied nach einer Therapie mit einem der organischen Nitrate (p=n.s., Abb. 17).

Abbildung 17 - Ergebnisse des Migrations-Assays

Veränderung der Endothel-Funktion

Bei zwei Patienten der ISDN-Gruppe und einem Patienten der PETN-Gruppe konnte die Endothelfunktionsmessung nicht durchgeführt werden, da die Okklusion der Oberarmmanschette nicht über einen ausreichend-langen Zeitraum toleriert wurde.

Der fingerplethysmographisch bestimmte reaktive Hyperämieindex (RHI), als Maß für die endothelabhängige Vasodilatation der Patienten, veränderte sich unter einer Therapie mit PETN nicht (+2.7%±10.5%). Dem gegenüber sank der Wert unter einer ISDN-Therapie im Mittel um 14.6±5.6% gegenüber dem Ausgangswert (Abb. 18), was auf die Ausbildung einer endothelialen Dysfunktion hindeutet.

Abbildung 18 - Ergebnisse der Endothelfunktions-Messung

Diskussion

Motivation und Fernziel dieser wissenschaftlichen Arbeit

Atherosklerose ist mit ihren Folgekrankheiten für die häufigsten Todesursachen in der westlichen Welt verantwortlich[85]. Die Entdeckung zirkulierender endothelialer Progenitorzellen 1997[22] weckte die Hoffnungen auf neue Therapieansätze. Hierzu zählen vor allem die Verhinderung der ersten Schritte in der Pathogenese der Atherosklerose, der endothelialen Dysfunktion und der bessere Schutz vor Intimaläsionen, sowie die Verbesserung der Neovaskularisation und die Verhinderung des Remodelling nach einem Herzinfarkt.

An diesen beiden Punkten könnten EPCs ansetzen, deren Zahl und Funktion die

Außerdem verbessern sie nach ischämischen Ereignissen wie einem Herzinfarkt die Neubildung von Blutgefäßen und können die Größe der Infarktnarbe verringern[87].

Die Hypothese

Das Ziel dieser Studie war es, den Einfluss einer Therapie mit organischen Nitraten auf endotheliale Progenitorzellen zu testen. Das von diesen Medikamenten im Körper freigesetzte Stickstoffmonoxid spielt für die Mobilisation und Funktion der EPCs eine wichtige Rolle[48-49]. Da EPCs außerdem zur Aufrechterhaltung der Gefäßhomöostase beitragen wurde zudem die Endothelfunktion bestimmt. Aufgrund des nachteiligen Einflusses reaktiver Sauerstoffspezies auf EPCs[88-89] und die endotheliale Funktion[90] wurde das ROS-freisetzende Nitrat ISDN[79] mit PETN verglichen, welches keinen oxidativen Stress hervorruft[91]. Die bereits vorliegenden, viel versprechenden Ergebnisse aus in-vitro- und Tierversuchen[79] sollten nun im Sinne translationaler Forschung auf den Menschen übertragen werden.

Zusammenfassung der Ergebnisse

Die dargestellten Daten bestätigen im Sinne der Hypothese, dass Zahl und Funktion endothelialer Progenitorzellen von Patienten mit koronarer Herzkrankheit durch eine Therapie mit organischen Nitraten positiv beeinflusst werden können. Allerdings gab es differenzierte Ergebnisse sowohl in Bezug auf das verwendete Nitrat, als auch im Hinblick auf den jeweiligen EPC-Typ und die verwendete Nachweismethode.

Differenzierte Wirkungen – in Bezug auf das verwendete Nitrat

Unterschiede bestehen in der Wirkung zwischen ISDN und PETN, mit deutlich positiveren Effekten von PETN. Dies entspricht den bereits bekannten Beobachtungen aus dem Mausmodell, in dem nur eine ISDN-Infusion zu einer Verschlechterung der EPC-Funktion und einem Anstieg der intrazellulären reaktiven Sauerstoffspezies führte.

Beide Wirkungen konnten durch die Zugabe von Superoxiddismutase wieder rückgängig gemacht werden, was auf eine ursächliche Rolle der ROS hinweist[79].

Dies passt zu Ergebnissen, nach denen auch andere organische Nitrate wie Glyceroltrinitrat (GTN) und Isosorbitmononitrat (ISMN) zur Bildung reaktiver Sauerstoffspezies führen, PETN dagegen antioxidative Enzyme induziert[90]. Obwohl

einige EPC-Subtypen über ausgeprägte antioxidative Eigenschaften verfügen[92] wird ihre Funktion durch ROS eingeschränkt[77].

Differenzierte Wirkungen – in Bezug auf die untersuchte Zellart

Außer vom verwendeten Nitrat hing die beobachtete Wirkung auch vom untersuchten Zelltyp ab. Der Begriff EPC ist in der wissenschaftlichen Literatur weiterhin nicht einheitlich definiert und wird als Oberbegriff für mehrere mit unterschiedlichen Methoden nachgewiesene Subtypen verwendet, die zum Teil individuelle Eigenschaften haben[93]. Erschwert wird die Definition durch die geringe Spezifität der verwendeten Differenzierungsmerkmale[44]: So findet sich der häufig verwendete Marker CD34 sowohl auf hämatopoetischen Progenitorzellen als auch auf reifen Endothelzellen[94], und auch zwischen endothelialen und monozytären Oberflächenmarkern existieren Überlappungen[95]. Dazu kommen neue Erkenntnisse, nach denen zirkulierende Monozyten möglicherweise in mehr Richtungen differenzieren können als früher angenommen[96-97]. Dennoch besteht Konsens, dass die Koexpression von CD34 und KDR, zusammen mit oder ohne CD133, zirkulierende Vorläufer endothelialer Zellen identifiziert. Daneben haben auch Dil-AcLDL⁺/UEA1⁺-Zellen sowie die früh in Zellkultur entstehenden CFU (early outgrowth CFU) große prognostische Bedeutung und verbessern die Neovaskularisation[44, 98]. Trotz der deutlichen Verbesserung der Vaskularisierung und Perfusion inkorporiert nur eine geringe Zahl von EPCs in die Gefäßwände, was eine wichtige Rolle parakriner Mechanismen nahe legt[99].

Auch in dieser Studie ergaben sich in Bezug auf die mit verschiedenen Methoden nachgewiesenen EPC-Subtypen unterschiedliche Ergebnisse. PETN, nicht jedoch ISDN steigerte die Zahl der durchflusszytometrisch anhand der Stamm- und Progenitorzellmarker CD34 und CD133 sowie des endothelialen Markers KDR nachgewiesenen Zellen, was auf eine verstärkte EPC-Mobilisation aus ihren Knochenmarks-Nischen hindeutet. Für die Zellen, die nach Kultivierung Dil-AcLDL und UEA-1 binden, konnte dieser Effekt nicht nachgewiesen werden, und das, obwohl

Neben der EPC-Zahl ist die Funktion dieser Zellen für ihre Rolle von großer Bedeutung, was verschiedene Schritte beinhaltet, angefangen bei der Bildung und Mobilisation aus dem Knochenmark bis hin zur Ausdifferenzierung oder der Bildung angiogener Zytokine[27]. Im CFU-Assay steigerte PETN die Zahl der gebildeten Kolonien, nicht jedoch ISDN. Diese Zahl der gebildeten Kolonien repräsentiert dabei nicht nur die Fähigkeit dieser Zellen zu kultureller Expansion und Differenzierung, sondern ist sicherlich auch von ihrer Zahl im peripheren Blut und damit der Mobilisation abhängig. Etwas spezifischer prüft das Migrationsassay die Reaktion der EPCs auf Chemoattraktion, wobei hier die beobachteten Unterschiede keine statistische Signifikanz erreichten. Hier könnte eine zu geringe Patientenzahl die Ursache sein, da ISDN in der Mausstudie die Migrationsfähigkeit deutlich einschränkte. Andererseits liegt dieser Befund in einer Linie mit einer weiteren kürzlich erschienen Studie über die Wirkung organischer Nitrate auf EPCs, die den Effekt einer kontinuierlichen GTN- Therapie in vitro und im Menschen untersuchte[100]. Auch in dieser hatte GTN nur in vitro einen negativen Einfluss auf die Migrationsfähigkeit, während im Menschen nach 7-tägiger Therapie keine Veränderung auftrat. Allerdings gab es auch Unterschiede zur vorliegenden Arbeit, so stieg die Zahl CD34⁺-mononukleärer Zellen und ihre Apoptoserate nach GTN-Therapie an, wohingegen sich die Zahl der CD34⁺/CD133⁺- Zellen nicht veränderte. Ob diese Differenzen durch die Unterschiede im Bezug auf das verwendete Nitrat oder den untersuchten Zelltyp erklärt werden können bleibt spekulativ.

Wirkungen auf die Endothelfunktion

Parallel zur Bestimmung der EPC-Zahlen und –Funktionsparameter wurde die Endothelfunktion der Patienten nicht-invasiv bestimmt. Das hierfür eingesetze EndoPAT-System ist ein viel versprechender Kandidat zur Verbesserung der Standardisierung gegenüber anderen nicht-invasiven Methoden der Endothelfunktionsbestimmung wie der FMD („flow-mediated dilatation“, durchflussgesteuerte Vasodilatation). Seine klinische Bedeutung wurde kürzlich erneut in einer prospektiven Studie nachgewiesen[101].

Die deutliche Einschränkung der Endothelfunktion unter laufender ISDN-Therapie wurde in der PETN-Gruppe nicht beobachtet. Die Verschlechterung der

Endothelfunktion durch die meisten klinisch eingesetzten organischen Nitrate wie GTN[102], ISMN[65] und ISDN[63] ist ausführlich beschrieben. Dagegen gab es schon vor Beginn der Planung dieser Studie Hinweise, dass dies für PETN nicht gilt[103], was ganz aktuell durch die randomisierte und kontrollierte, sogenannte „PENTA“-Studie an 80 Patienten bestätigt wurde[104](Abb. 19). Klinische Relevanz erhalten diese Erkenntnisse durch die Bedeutung der endothelialen Dysfunktion für die Pathogenese der Atherosklerose[7] und die schlechtere kardiovaskuläre Prognose, die mit einer endothelialen Dysfunktion einhergeht[86, 105].

Abbildung 19 - Einfluss einer PETN-Therapie auf die Endothelfunktion (aus [104])

Ursachen für die Einschränkung der Endothelfunktion: Oxidativer Stress und EPCs

Obwohl ISDN und PETN beide mit Stickstoffmonoxid ein Molekül freisetzen, welches für die Endothelfunktion essentiell ist, hat demnach nur ISDN nachteiligen Einfluss auf

Peroxynitrit bewirkt zudem eine Oxidation von Tetrahydrobiopterin, einem wichtigen Kofaktor der endothelialen NO-Synthase, und führt dadurch zu einer Entkopplung der eNOS. In diesem Zustand produziert dieses sonst vasoprotektive, NO-freisetzende Enzym Hydroxid-Ionen[107] und verschlechtert die endotheliale Funktion[108]. Für PETN wurde dagegen gezeigt, dass es zu keiner vermehrten ROS-Produktion[109], sondern zu einer Aktivierung antioxidativer Enzyme wie der Hämoxygenase-1 (HO-1) und der extrazellulären Superoxiddismutase (ecSOD) führt[55, 110].

Ein weiterer Faktor, der die differenzierte Wirkung der Nitrate auf die Endothelfunktion mit verursacht, ist die festgestellte unterschiedliche Beeinflussung der EPCs. Wie bereits erwähnt haben diese eine wichtige Bedeutung für die vaskuläre Funktion[29, 111] und die Reparatur endothelialer Läsionen[112], auch wenn ihre Rolle in der Progression der Atherosklerose noch nicht endgültig geklärt ist[113-114]. Wichtig hierfür ist die Produktion vasoaktiver Zytokine und die Expression der eNOS mit NO- Produktion durch diese Zellen[115]. Oxidativer Stress schränkt die Funktion einiger EPC-Subtypen ein, wie bereits oben dargelegt[76]. Doch auch wenn die Ergebnisse, die EPC-Zahl und -Funktion mit der endothelialen Funktion verbinden, überzeugend sind, ist ein kausaler Zusammenhang nicht endgültig bewiesen und erfordert weitere mechanistische Studien.

Dieser für die negativen Wirkungen von ISDN dargelegte Mechanismus, dass oxidativer Stress sowohl direkt als auch indirekt über die Einschränkung der EPC-Funktion eine endotheliale Dysfunktion verursacht, spielt auch bei anderen Erkrankungen und kardiovaskulären Risikofaktoren eine wichtige Rolle, so z.B. bei Insulinresistenz und Diabetes mellitus[89, 116-117].

Einschränkungen und Ausblick

Diese Arbeit untersuchte den Einfluss organischer Nitrate auf endotheliale Progenitorzellen im Menschen, ein Gebiet, zu dem es zuvor noch keine Untersuchungen gab. Daher stellt sie vorerst nur eine erste Pilotstudie dar und enthält die entsprechenden Limitationen. Hier ist zunächst die relativ geringe Patientenzahl (n=36) zu nennen. Zudem wurden zwar die Auswertungen ohne Wissen des Untersuchers über die jeweilige Gruppe durchgeführt, die Gabe der Medikamente durch die Ärzte und die

Studien auf dem Gebiet der EPCs sind weiterhin dadurch erschwert, dass keine einheitliche Definition dieser Zellen existiert. Da es bisher so scheint, dass verschiedene Typen für unterschiedliche Wirkungen verantwortlich sind ist es üblich, mehrere EPC-Subtypen nachzuweisen und verschiedene Assays zu verwenden.

Allerdings ist es kaum möglich, alle relevanten Typen zu untersuchen, sodass auch in dieser Arbeit beispielsweise auf den Nachweis der „late outgrowth“-EPCs trotz ihrer Relevanz verzichtet werden musste.

Bei der Endothelfunktionsmessung wurde soweit wie möglich versucht, die Bedingungen an beiden Messpunkten anzugleichen. Allerdings erfolgte die erste Messung im Rahmen eines stationären Aufenthaltes und innerhalb weniger Stunden nach Koronarangiografie, während die zweite Messung während einer ambulanten Wiedervorstellung stattfand, sodass davon auszugehen ist, dass nicht alle Störeinflüsse eliminiert werden konnten. Die Daten muss man also vor diesem Hintergrund interpretieren, vor allem wenn man bedenkt, wie viele Faktoren die Endothelfunktion kurz- und langfristig beeinflussen[118]. Daher ist hier der relative Vergleich der beiden Gruppen miteinander viel wichtiger als die absoluten Werte, auch wenn die Ähnlichkeit der dargestellten Daten mit denen anderer Studien ihre Validität nahe legt[63, 104].

In dieser Studie wurde die Veränderung der Endothelfunktion als primärer Endpunkt genutzt, ein validierter und prognostisch bedeutsamer Parameter. Doch letztendlich kann man über die klinische Relevanz für den Patienten nur eingeschränkte Aussagen machen, da keine harten Endpunkte wie Hospitalisationen oder Mortalität untersucht wurden. Beispiele wie die Hormonersatztherapie, durch die trotz Verbesserung der Endothelfunktion keine Senkung der Mortalität gezeigt werden konnte, erinnern daran, dass eine Verbesserung der Endothelfunktion nicht immer auch in einem Überlebensvorteil für die Patienten resultiert[119].

Trotz dieser Einschränkungen konnte diese Studie die Hypothese bestätigen, dass endotheliale Progenitorzellen durch organische Nitrate positiv beeinflusst werden

und seiner positiven Wirkungen zu klären sind größere, randomisierte und doppelblinde Studien notwendig, wie sie bereits auf dem Weg sind[120].

Zusammenfassung

Hintergrund: Neben ihren positiven Wirkungen, die aus der Freisetzung von Stickstoffmonoxid resultieren, rufen einige organische Nitrate wie ISDN, nicht jedoch PETN, eine endotheliale Dysfunktion hervor, wofür oxidativer Stress (ROS) mitverantwortlich ist. Endotheliale Progenitorzellen (EPCs) werden durch NO reguliert und beeinflussen die endotheliale Funktion positiv, ihre Funktion wird jedoch durch ROS eingeschränkt. Diese Arbeit untersucht, ob organische Nitrate EPCs modulieren und welche Auswirkung dies auf die Endothelfunktion in Patienten mit koronarer Herzerkrankung (KHK) hat.

Patienten, Material und Methoden: Es wurden 36 Patienten mit symptomatischer und koronarangiografisch nachgewiesener KHK entweder mit ISDN (n=18) oder PETN (n=18) behandelt und jeweils vor Therapiebeginn und nach 14 Tagen die EPC-Zahl und –Funktion mittels Durchflusszytometrie, CFU-Hill-Assay und DilAcLDL-/UEA-1- Färbung sowie in einem Migrationsassay bestimmt. Parallel dazu wurde die Endothelfunktion der Patienten nicht-invasiv mittels peripher-arterieller Tonometrie (PAT) evaluiert.

Ergebnisse: Unter Therapie mit PETN stieg sowohl die Zahl der CD34⁺/KDR⁺/CD133⁺- und der CD34⁺/KDR⁺-EPCs als auch die in Kultur gebildeten Kolonien (CFU) an, während bei den DilAcLDL⁺/UEA-1⁺-Zellen und der Migrationsfähigkeit kein Unterschied festgestellt wurde. Die Endothelfunktion war unter ISDN-Behandlung signifikant eingeschränkt, blieb aber unter PETN-Therapie erhalten.

Schlussfolgerung: Die Ergebnisse bestätigen den modulierenden Einfluss organischer Nitrate auf endotheliale Progenitorzellen, zeigen aber auch ihre differenzierten Wirkungen: ISDN verbesserte im Gegensatz zu PETN die EPC-Mobilisation und – Funktion nicht und rief eine endotheliale Dysfunktion hervor, wofür die ROS-Bildung

Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1 - Progression der Atherosklerose: von der endothelialen

Dysfunktion zu kardiovaskulären Komplikationen (aus [8]) ... 2

Abbildung 2 - Rolle von EPCs im menschlichen Körper (aus [24]) ... 6

Abbildung 3 - Beteiligung von EPCs an der Neovaskularisation (aus [46]) ... 7

Abbildung 4 - ausbleibende Mobilisierung von EPCs durch VEGF in eNOS- Knockout-Mäusen (aus [48]) ... 8

Abbildung 5 - Bekannte medikamentöse und hormonelle Einflüsse auf EPCs (aus [32]) ... 9

Abbildung 6 - Veränderung der FMD durch ISDN-Therapie (aus [63]) ... 11

Abbildung 7 - Einfluss oxidativen Stresses auf EPCs (aus [77]) ... 12

Abbildung 8 - Organische Nitrate und ihre bekannten und hypothetischen Wirkungen ... 14

Abbildung 9 - Studiendesign... 17

Abbildung 10 - Messung mit dem Endo-PAT2000-System und Schema des Sensors (aus [81]) ... 18

Abbildung 11 - Beispiel für PAT-Messung: erhaltene Endothelfunktion ... 19

Abbildung 12 - Beispiel für PAT-Messung: eingeschränkte Endothelfunktion ... 19

Abbildung 13 - Schema der modifizierten Boyden-Kammer ... 22

Abbildung 14 - Beeinflussung CD34⁺/KDR⁺/CD133⁺-Zellen ... 26

Abbildung 15 - Beeinflussung CD34⁺/KDR⁺-Zellen ... 26

Abbildung 16 - Ergebnisse des CFU-Assays ... 27

Abbildung 17 - Ergebnisse des Migrations-Assays ... 28

Abbildung 18 - Ergebnisse der Endothelfunktions-Messung ... 29

Abbildung 19 - Einfluss einer PETN-Therapie auf die Endothelfunktion (aus [104]) ... 33

Tabellenverzeichnis

Tabelle 2 - Pipettierschema zur FACS-Analyse ... 20

Tabelle 3 - Charakteristika der Ausgangsgruppen ... 25

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