Bei zwei Patienten der ISDN-Gruppe und einem Patienten der PETN-Gruppe konnte die Endothelfunktionsmessung nicht durchgeführt werden, da die Okklusion der Oberarmmanschette nicht über einen ausreichend-langen Zeitraum toleriert wurde.
Der fingerplethysmographisch bestimmte reaktive Hyperämieindex (RHI), als Maß für die endothelabhängige Vasodilatation der Patienten, veränderte sich unter einer Therapie mit PETN nicht (+2.7%±10.5%). Dem gegenüber sank der Wert unter einer ISDN-Therapie im Mittel um 14.6±5.6% gegenüber dem Ausgangswert (Abb. 18), was auf die Ausbildung einer endothelialen Dysfunktion hindeutet.
Abbildung 18 - Ergebnisse der Endothelfunktions-Messung
Diskussion
Motivation und Fernziel dieser wissenschaftlichen Arbeit
Atherosklerose ist mit ihren Folgekrankheiten für die häufigsten Todesursachen in der westlichen Welt verantwortlich[85]. Die Entdeckung zirkulierender endothelialer Progenitorzellen 1997[22] weckte die Hoffnungen auf neue Therapieansätze. Hierzu zählen vor allem die Verhinderung der ersten Schritte in der Pathogenese der Atherosklerose, der endothelialen Dysfunktion und der bessere Schutz vor Intimaläsionen, sowie die Verbesserung der Neovaskularisation und die Verhinderung des Remodelling nach einem Herzinfarkt.
An diesen beiden Punkten könnten EPCs ansetzen, deren Zahl und Funktion die
Außerdem verbessern sie nach ischämischen Ereignissen wie einem Herzinfarkt die Neubildung von Blutgefäßen und können die Größe der Infarktnarbe verringern[87].
Die Hypothese
Das Ziel dieser Studie war es, den Einfluss einer Therapie mit organischen Nitraten auf endotheliale Progenitorzellen zu testen. Das von diesen Medikamenten im Körper freigesetzte Stickstoffmonoxid spielt für die Mobilisation und Funktion der EPCs eine wichtige Rolle[48-49]. Da EPCs außerdem zur Aufrechterhaltung der Gefäßhomöostase beitragen wurde zudem die Endothelfunktion bestimmt. Aufgrund des nachteiligen Einflusses reaktiver Sauerstoffspezies auf EPCs[88-89] und die endotheliale Funktion[90] wurde das ROS-freisetzende Nitrat ISDN[79] mit PETN verglichen, welches keinen oxidativen Stress hervorruft[91]. Die bereits vorliegenden, viel versprechenden Ergebnisse aus in-vitro- und Tierversuchen[79] sollten nun im Sinne translationaler Forschung auf den Menschen übertragen werden.
Zusammenfassung der Ergebnisse
Die dargestellten Daten bestätigen im Sinne der Hypothese, dass Zahl und Funktion endothelialer Progenitorzellen von Patienten mit koronarer Herzkrankheit durch eine Therapie mit organischen Nitraten positiv beeinflusst werden können. Allerdings gab es differenzierte Ergebnisse sowohl in Bezug auf das verwendete Nitrat, als auch im Hinblick auf den jeweiligen EPC-Typ und die verwendete Nachweismethode.
Differenzierte Wirkungen – in Bezug auf das verwendete Nitrat
Unterschiede bestehen in der Wirkung zwischen ISDN und PETN, mit deutlich positiveren Effekten von PETN. Dies entspricht den bereits bekannten Beobachtungen aus dem Mausmodell, in dem nur eine ISDN-Infusion zu einer Verschlechterung der EPC-Funktion und einem Anstieg der intrazellulären reaktiven Sauerstoffspezies führte.
Beide Wirkungen konnten durch die Zugabe von Superoxiddismutase wieder rückgängig gemacht werden, was auf eine ursächliche Rolle der ROS hinweist[79].
Dies passt zu Ergebnissen, nach denen auch andere organische Nitrate wie Glyceroltrinitrat (GTN) und Isosorbitmononitrat (ISMN) zur Bildung reaktiver Sauerstoffspezies führen, PETN dagegen antioxidative Enzyme induziert[90]. Obwohl
einige EPC-Subtypen über ausgeprägte antioxidative Eigenschaften verfügen[92] wird ihre Funktion durch ROS eingeschränkt[77].
Differenzierte Wirkungen – in Bezug auf die untersuchte Zellart
Außer vom verwendeten Nitrat hing die beobachtete Wirkung auch vom untersuchten Zelltyp ab. Der Begriff EPC ist in der wissenschaftlichen Literatur weiterhin nicht einheitlich definiert und wird als Oberbegriff für mehrere mit unterschiedlichen Methoden nachgewiesene Subtypen verwendet, die zum Teil individuelle Eigenschaften haben[93]. Erschwert wird die Definition durch die geringe Spezifität der verwendeten Differenzierungsmerkmale[44]: So findet sich der häufig verwendete Marker CD34 sowohl auf hämatopoetischen Progenitorzellen als auch auf reifen Endothelzellen[94], und auch zwischen endothelialen und monozytären Oberflächenmarkern existieren Überlappungen[95]. Dazu kommen neue Erkenntnisse, nach denen zirkulierende Monozyten möglicherweise in mehr Richtungen differenzieren können als früher angenommen[96-97]. Dennoch besteht Konsens, dass die Koexpression von CD34 und KDR, zusammen mit oder ohne CD133, zirkulierende Vorläufer endothelialer Zellen identifiziert. Daneben haben auch Dil-AcLDL+/UEA1+-Zellen sowie die früh in Zellkultur entstehenden CFU (early outgrowth CFU) große prognostische Bedeutung und verbessern die Neovaskularisation[44, 98]. Trotz der deutlichen Verbesserung der Vaskularisierung und Perfusion inkorporiert nur eine geringe Zahl von EPCs in die Gefäßwände, was eine wichtige Rolle parakriner Mechanismen nahe legt[99].
Auch in dieser Studie ergaben sich in Bezug auf die mit verschiedenen Methoden nachgewiesenen EPC-Subtypen unterschiedliche Ergebnisse. PETN, nicht jedoch ISDN steigerte die Zahl der durchflusszytometrisch anhand der Stamm- und Progenitorzellmarker CD34 und CD133 sowie des endothelialen Markers KDR nachgewiesenen Zellen, was auf eine verstärkte EPC-Mobilisation aus ihren Knochenmarks-Nischen hindeutet. Für die Zellen, die nach Kultivierung Dil-AcLDL und UEA-1 binden, konnte dieser Effekt nicht nachgewiesen werden, und das, obwohl
Neben der EPC-Zahl ist die Funktion dieser Zellen für ihre Rolle von großer Bedeutung, was verschiedene Schritte beinhaltet, angefangen bei der Bildung und Mobilisation aus dem Knochenmark bis hin zur Ausdifferenzierung oder der Bildung angiogener Zytokine[27]. Im CFU-Assay steigerte PETN die Zahl der gebildeten Kolonien, nicht jedoch ISDN. Diese Zahl der gebildeten Kolonien repräsentiert dabei nicht nur die Fähigkeit dieser Zellen zu kultureller Expansion und Differenzierung, sondern ist sicherlich auch von ihrer Zahl im peripheren Blut und damit der Mobilisation abhängig. Etwas spezifischer prüft das Migrationsassay die Reaktion der EPCs auf Chemoattraktion, wobei hier die beobachteten Unterschiede keine statistische Signifikanz erreichten. Hier könnte eine zu geringe Patientenzahl die Ursache sein, da ISDN in der Mausstudie die Migrationsfähigkeit deutlich einschränkte. Andererseits liegt dieser Befund in einer Linie mit einer weiteren kürzlich erschienen Studie über die Wirkung organischer Nitrate auf EPCs, die den Effekt einer kontinuierlichen GTN-Therapie in vitro und im Menschen untersuchte[100]. Auch in dieser hatte GTN nur in vitro einen negativen Einfluss auf die Migrationsfähigkeit, während im Menschen nach 7-tägiger Therapie keine Veränderung auftrat. Allerdings gab es auch Unterschiede zur vorliegenden Arbeit, so stieg die Zahl CD34+-mononukleärer Zellen und ihre Apoptoserate nach GTN-Therapie an, wohingegen sich die Zahl der CD34+/CD133+ -Zellen nicht veränderte. Ob diese Differenzen durch die Unterschiede im Bezug auf das verwendete Nitrat oder den untersuchten Zelltyp erklärt werden können bleibt spekulativ.
Wirkungen auf die Endothelfunktion
Parallel zur Bestimmung der EPC-Zahlen und –Funktionsparameter wurde die Endothelfunktion der Patienten nicht-invasiv bestimmt. Das hierfür eingesetze EndoPAT-System ist ein viel versprechender Kandidat zur Verbesserung der Standardisierung gegenüber anderen nicht-invasiven Methoden der Endothelfunktionsbestimmung wie der FMD („flow-mediated dilatation“, durchflussgesteuerte Vasodilatation). Seine klinische Bedeutung wurde kürzlich erneut in einer prospektiven Studie nachgewiesen[101].
Die deutliche Einschränkung der Endothelfunktion unter laufender ISDN-Therapie wurde in der PETN-Gruppe nicht beobachtet. Die Verschlechterung der
Endothelfunktion durch die meisten klinisch eingesetzten organischen Nitrate wie GTN[102], ISMN[65] und ISDN[63] ist ausführlich beschrieben. Dagegen gab es schon vor Beginn der Planung dieser Studie Hinweise, dass dies für PETN nicht gilt[103], was ganz aktuell durch die randomisierte und kontrollierte, sogenannte „PENTA“-Studie an 80 Patienten bestätigt wurde[104](Abb. 19). Klinische Relevanz erhalten diese Erkenntnisse durch die Bedeutung der endothelialen Dysfunktion für die Pathogenese der Atherosklerose[7] und die schlechtere kardiovaskuläre Prognose, die mit einer endothelialen Dysfunktion einhergeht[86, 105].
Abbildung 19 - Einfluss einer PETN-Therapie auf die Endothelfunktion (aus [104])
Ursachen für die Einschränkung der Endothelfunktion: Oxidativer Stress und EPCs
Obwohl ISDN und PETN beide mit Stickstoffmonoxid ein Molekül freisetzen, welches für die Endothelfunktion essentiell ist, hat demnach nur ISDN nachteiligen Einfluss auf
Peroxynitrit bewirkt zudem eine Oxidation von Tetrahydrobiopterin, einem wichtigen Kofaktor der endothelialen NO-Synthase, und führt dadurch zu einer Entkopplung der eNOS. In diesem Zustand produziert dieses sonst vasoprotektive, NO-freisetzende Enzym Hydroxid-Ionen[107] und verschlechtert die endotheliale Funktion[108]. Für PETN wurde dagegen gezeigt, dass es zu keiner vermehrten ROS-Produktion[109], sondern zu einer Aktivierung antioxidativer Enzyme wie der Hämoxygenase-1 (HO-1) und der extrazellulären Superoxiddismutase (ecSOD) führt[55, 110].
Ein weiterer Faktor, der die differenzierte Wirkung der Nitrate auf die Endothelfunktion mit verursacht, ist die festgestellte unterschiedliche Beeinflussung der EPCs. Wie bereits erwähnt haben diese eine wichtige Bedeutung für die vaskuläre Funktion[29, 111] und die Reparatur endothelialer Läsionen[112], auch wenn ihre Rolle in der Progression der Atherosklerose noch nicht endgültig geklärt ist[113-114]. Wichtig hierfür ist die Produktion vasoaktiver Zytokine und die Expression der eNOS mit NO-Produktion durch diese Zellen[115]. Oxidativer Stress schränkt die Funktion einiger EPC-Subtypen ein, wie bereits oben dargelegt[76]. Doch auch wenn die Ergebnisse, die EPC-Zahl und -Funktion mit der endothelialen Funktion verbinden, überzeugend sind, ist ein kausaler Zusammenhang nicht endgültig bewiesen und erfordert weitere mechanistische Studien.
Dieser für die negativen Wirkungen von ISDN dargelegte Mechanismus, dass oxidativer Stress sowohl direkt als auch indirekt über die Einschränkung der EPC-Funktion eine endotheliale Dysfunktion verursacht, spielt auch bei anderen Erkrankungen und kardiovaskulären Risikofaktoren eine wichtige Rolle, so z.B. bei Insulinresistenz und Diabetes mellitus[89, 116-117].
Einschränkungen und Ausblick
Diese Arbeit untersuchte den Einfluss organischer Nitrate auf endotheliale Progenitorzellen im Menschen, ein Gebiet, zu dem es zuvor noch keine Untersuchungen gab. Daher stellt sie vorerst nur eine erste Pilotstudie dar und enthält die entsprechenden Limitationen. Hier ist zunächst die relativ geringe Patientenzahl (n=36) zu nennen. Zudem wurden zwar die Auswertungen ohne Wissen des Untersuchers über die jeweilige Gruppe durchgeführt, die Gabe der Medikamente durch die Ärzte und die
Studien auf dem Gebiet der EPCs sind weiterhin dadurch erschwert, dass keine einheitliche Definition dieser Zellen existiert. Da es bisher so scheint, dass verschiedene Typen für unterschiedliche Wirkungen verantwortlich sind ist es üblich, mehrere EPC-Subtypen nachzuweisen und verschiedene Assays zu verwenden.
Allerdings ist es kaum möglich, alle relevanten Typen zu untersuchen, sodass auch in dieser Arbeit beispielsweise auf den Nachweis der „late outgrowth“-EPCs trotz ihrer Relevanz verzichtet werden musste.
Bei der Endothelfunktionsmessung wurde soweit wie möglich versucht, die Bedingungen an beiden Messpunkten anzugleichen. Allerdings erfolgte die erste Messung im Rahmen eines stationären Aufenthaltes und innerhalb weniger Stunden nach Koronarangiografie, während die zweite Messung während einer ambulanten Wiedervorstellung stattfand, sodass davon auszugehen ist, dass nicht alle Störeinflüsse eliminiert werden konnten. Die Daten muss man also vor diesem Hintergrund interpretieren, vor allem wenn man bedenkt, wie viele Faktoren die Endothelfunktion kurz- und langfristig beeinflussen[118]. Daher ist hier der relative Vergleich der beiden Gruppen miteinander viel wichtiger als die absoluten Werte, auch wenn die Ähnlichkeit der dargestellten Daten mit denen anderer Studien ihre Validität nahe legt[63, 104].
In dieser Studie wurde die Veränderung der Endothelfunktion als primärer Endpunkt genutzt, ein validierter und prognostisch bedeutsamer Parameter. Doch letztendlich kann man über die klinische Relevanz für den Patienten nur eingeschränkte Aussagen machen, da keine harten Endpunkte wie Hospitalisationen oder Mortalität untersucht wurden. Beispiele wie die Hormonersatztherapie, durch die trotz Verbesserung der Endothelfunktion keine Senkung der Mortalität gezeigt werden konnte, erinnern daran, dass eine Verbesserung der Endothelfunktion nicht immer auch in einem Überlebensvorteil für die Patienten resultiert[119].
Trotz dieser Einschränkungen konnte diese Studie die Hypothese bestätigen, dass endotheliale Progenitorzellen durch organische Nitrate positiv beeinflusst werden
und seiner positiven Wirkungen zu klären sind größere, randomisierte und doppelblinde Studien notwendig, wie sie bereits auf dem Weg sind[120].
Zusammenfassung
Hintergrund: Neben ihren positiven Wirkungen, die aus der Freisetzung von Stickstoffmonoxid resultieren, rufen einige organische Nitrate wie ISDN, nicht jedoch PETN, eine endotheliale Dysfunktion hervor, wofür oxidativer Stress (ROS) mitverantwortlich ist. Endotheliale Progenitorzellen (EPCs) werden durch NO reguliert und beeinflussen die endotheliale Funktion positiv, ihre Funktion wird jedoch durch ROS eingeschränkt. Diese Arbeit untersucht, ob organische Nitrate EPCs modulieren und welche Auswirkung dies auf die Endothelfunktion in Patienten mit koronarer Herzerkrankung (KHK) hat.
Patienten, Material und Methoden: Es wurden 36 Patienten mit symptomatischer und koronarangiografisch nachgewiesener KHK entweder mit ISDN (n=18) oder PETN (n=18) behandelt und jeweils vor Therapiebeginn und nach 14 Tagen die EPC-Zahl und –Funktion mittels Durchflusszytometrie, CFU-Hill-Assay und DilAcLDL-/UEA-1-Färbung sowie in einem Migrationsassay bestimmt. Parallel dazu wurde die Endothelfunktion der Patienten nicht-invasiv mittels peripher-arterieller Tonometrie (PAT) evaluiert.
Ergebnisse: Unter Therapie mit PETN stieg sowohl die Zahl der CD34+/KDR+/CD133+- und der CD34+/KDR+-EPCs als auch die in Kultur gebildeten Kolonien (CFU) an, während bei den DilAcLDL+/UEA-1+-Zellen und der Migrationsfähigkeit kein Unterschied festgestellt wurde. Die Endothelfunktion war unter ISDN-Behandlung signifikant eingeschränkt, blieb aber unter PETN-Therapie erhalten.
Schlussfolgerung: Die Ergebnisse bestätigen den modulierenden Einfluss organischer Nitrate auf endotheliale Progenitorzellen, zeigen aber auch ihre differenzierten Wirkungen: ISDN verbesserte im Gegensatz zu PETN die EPC-Mobilisation und – Funktion nicht und rief eine endotheliale Dysfunktion hervor, wofür die ROS-Bildung
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1 - Progression der Atherosklerose: von der endothelialen
Dysfunktion zu kardiovaskulären Komplikationen (aus [8]) ... 2
Abbildung 2 - Rolle von EPCs im menschlichen Körper (aus [24]) ... 6
Abbildung 3 - Beteiligung von EPCs an der Neovaskularisation (aus [46]) ... 7
Abbildung 4 - ausbleibende Mobilisierung von EPCs durch VEGF in eNOS-Knockout-Mäusen (aus [48]) ... 8
Abbildung 5 - Bekannte medikamentöse und hormonelle Einflüsse auf EPCs (aus [32]) ... 9
Abbildung 6 - Veränderung der FMD durch ISDN-Therapie (aus [63]) ... 11
Abbildung 7 - Einfluss oxidativen Stresses auf EPCs (aus [77]) ... 12
Abbildung 8 - Organische Nitrate und ihre bekannten und hypothetischen Wirkungen ... 14
Abbildung 9 - Studiendesign... 17
Abbildung 10 - Messung mit dem Endo-PAT2000-System und Schema des Sensors (aus [81]) ... 18
Abbildung 11 - Beispiel für PAT-Messung: erhaltene Endothelfunktion ... 19
Abbildung 12 - Beispiel für PAT-Messung: eingeschränkte Endothelfunktion ... 19
Abbildung 13 - Schema der modifizierten Boyden-Kammer ... 22
Abbildung 14 - Beeinflussung CD34+/KDR+/CD133+-Zellen ... 26
Abbildung 15 - Beeinflussung CD34+/KDR+-Zellen ... 26
Abbildung 16 - Ergebnisse des CFU-Assays ... 27
Abbildung 17 - Ergebnisse des Migrations-Assays ... 28
Abbildung 18 - Ergebnisse der Endothelfunktions-Messung ... 29
Abbildung 19 - Einfluss einer PETN-Therapie auf die Endothelfunktion (aus [104]) ... 33
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1 - Ein- und Ausschlusskriterien ... 16Tabelle 2 - Pipettierschema zur FACS-Analyse ... 20
Tabelle 3 - Charakteristika der Ausgangsgruppen ... 25
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