Suberase: Eine biotechnologische Möglich- keit Korken zu reinigen

WOLF-RÜDIGERSPONHOLZ, FORSCHUNGSANSTALTGEISENHEIM, FACHGEBIETMIKROBIOLOGIE UNDBIOCHEMIE, GEISENHEIM/RHEIN

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Diese werden aus dem sekundären Abschlussgewebe der Korkeiche Quercus suber L. gewonnen. Die

Korkeiche ist im westlichen Mittelmeergebiet (Portu- gal, Spanien, Frankreich, Italien und Nordafrika) be- heimatet. Sie liefert nach 25 Jahren den Primärkork, der bedingt durch seine Struktur nicht für Flaschen- korken benutzt werden kann. Auch eine Verwendung als Granulat für Sekt- oder Agglokorken sollte vermie- den werden, da dieser Kork geruchliche und ge- schmackliche Unsauberkeiten hat. Die Eigenart der Korkeiche ist, dass bei der Wundheilung, also nach der Entfernung der primären Rinde, durch das Kork- kambium (Phellogen) nach aussen ein sekundäres

Abschlussgewebe, der eigentliche Kork, produziert wird (Abb. 1). Er dient der Pflanze als Schutz gegen die Witterung sowie gegen tierische und pflanzliche Parasiten. Aus diesem etwa alle 8 bis 15 Jahre abge- nommenen Material entsteht der für die Flaschen- korkherstellung geeignete Kork.

Da das Gewebe aus nach aussen abgegebenen Zel- len besteht, die dicht gepackt, tot und mit Luft gefüllt sind, sind sie auch leicht und elastisch und daher ein ideales Isolationsmaterial.

Es liegt in der chemischen Natur

Die chemische Struktur des Korks, seine Zusammen- setzung aus Zellulose, Lignin, inkrustriert mit Suberin und Wachs machen ihn wasserabweisend. Man hat es an sich mit einem idealen Material für den Verschluss von Flaschen zu tun: Es ist wasserabweisend, luftun- durchlässig und elastisch.

Man sollte sich aber daran erinnern, wozu die Pflanze den Kork ausgebildet hat: als Abschlussgewe- be gegen Witterung und Parasiten. Dazu werden durch die Pflanze sekundäre Stoffwechselprodukte in das Korkmaterial mit eingelagert. Es handelt sich dabei um Substanzen, die Eiweiss denaturieren kön- nen oder um solche, die gegen Eindringlinge als Frass- gifte wirken können. Es sind eine Vielzahl von Phe- nolen und daraus abgeleitete Substanzen, zu denen auch Lignin, einige Seitenketten des Suberins, aber auch viele Inhaltsstoffe des Weins wie Phenole und deren Derivate zählen. Dazu gehören auch die Anthocyane, die roten Farbstoffe der Rotweine. Bei der Korkeiche sind die Phenole und ihre Derivate gehäuft in den Lenticellen lokalisiert.

Atmungsporen, Aufenthaltsort für Mikro- organismen

Die Lenticellen sind die Atmungsorgane des Baumes.

Durch sie wird Sauerstoff aufgenommen, CO2 und Wasserdampf abgegeben. Diese Poren bestehen aus locker gepackten, meist rundlichen Zellen, ein Kork- material, welches stark mit Phenolen und deren Poly-

Suberase: Eine biotechnologische Möglich- keit Korken zu reinigen

Weine werden nach wie vor von den Verbrauchern dann als hochwertig angesehen, wenn sie mit einem Naturkork verschlossen sind. Naturkorken werden aus dem Abschlussgewebe der Korkeiche Quercus suber L. gewonnen und sind während ihres Wachstums und im Laufe des Produktionsprozesses den vielfältigsten Einflüssen ausgesetzt, von denen sich einige negativ dem Produkt Wein mitteilen können. Auslöser sind in vielen Fällen natürliche, aber auch syn- thetische Phenole. Diesen soll mit Hilfe einer Enzymbehandlung der negative Einfluss auf die Korken und dann auf die Weine genommen werden.

Abb. 1: Schnitt durch eine Korkeiche A = Kork oder Phellem

B = Phellogen oder Korkkambium C = Sekundärschicht

D = Holzkambium E = Sekundärholz

merisaten inkrustriert ist. Es sind die Löcher in den Korken, die bedingt durch die lockere Struktur und dem hohen Gehalt an Phenolen und deren Derivaten dunkelbraun bis schwarz gefärbt sind. Diese Lenticellen enthal- ten Nährstoffe wie Proteine, Zucker und Feuchtigkeit. Auch andere Sub- stanzen (Schmutz) sammeln sich da- rin an, sie sind daher ein idealer Le- bensraum für Mikroorganismen. Es ist daher verständlich, dass sich in diesen Hohlräumen nicht nur Stoffwechsel- produkte des Baumes, sondern auch die von Mikroorganismen ansammeln können. Bei lipophilen Substanzen kann von hier aus besonders über die Jahre, die der Kork am Baum ver- bringt, eine Diffusion in das angren- zende kompakte Material, insbeson- dere in das Suberin, erfolgen.

Abbildung 2 zeigt Sektkorken unterschiedlicher Qualität, bei denen im Querschnitt die Anzahl der

Lenticellen sehr deutlich wird. Da Korken bisher stets nach dem Aussehen, der Schönheit beurteilt werden, nimmt die Qualität mit der Anzahl und Grös- se der schwarzen Flecken ab.

Sind Vorstufen vorhanden, entsteht der Korkton

Auch der Korkton, ausgelöst durch sehr geringe Kon- zentrationen von 2,4,6- Trichloranisol, wird durch Mi- kroorganismen hervorgerufen. Viele Organismen sind in der Lage aus Glucose über den Shikimatweg eine grosse Anzahl von Phenolen zu synthetisieren (Abb. 3). Dieses gilt in erster Linie für Pflanzen, aber auch für Mikroorganismen. Die biologische Chlorie- rung von Phenolen kann durch Perchloroxidasen er- folgen, jedoch ist wohl die chemische Chlorierung zur Desinfektion der Korken ebenso in Betracht zu

ziehen. Das resultierende 2,4,6-Trichlorphenol (TCP) wird durch Mikroorganismen zum weniger toxischen 2,4,6-Trichloranisol (TCA) methyliert. Dieses hinter- lässt in so geringen Mengen wie 1 bis 2 ng/l negative Geruchseindrücke besonders im Weisswein, die von uns korkig genannt werden, aber mit dem echten Kork geruchlich, ausser dem Vorkommen in ihm, ei- gentlich nichts zu tun haben.

Gaschromatographisch-massenspektrometrische Analysen belasteter Korken zeigen dann neben dem sehr geruchsaktiven TCA auch hohe Konzentrationen an TCP. Die Verhältnisse von TCP und TCA zueinan- der können stark variieren (Abb. 4), was besonders bei Korken in geruchlichen Grenzfällen oft zu höhe- ren TCA-Verhältnissen führt. Auch eine Kontamina- tion an sich sauberer Korken mit TCA scheint mög- lich zu sein. In diesen Korken, die dem Wein keinen reinen Korkgeschmack mehr übertragen, da die Men- gen oft zu gering sind, zeigen sich zwar immer gerin- ge Mengen TCA, aber kein TCP mehr.

Durch den Befall mit Mikroorganismen kommt es oft auch zu einem gewissen Abbau von Lignin. Dieser wird dadurch deutlich, dass stark mit TCP/TCA be- Abb. 2: Sektkorken

der Qualitäten 1 bis 5.

Abb. 3: Mögliche Bildungswege von TCP und TCA.

15.30 15.35 15.40 15.45 15.50 15.55 15.60 15.65 15.70 15.75 15.80 15.85 15.90 15.95

0 200’000 400’000 600’000 800’000 1’000’000 1’200’000 1’400’000 1’600’000 1’800’000 2’000’000 2’200’000 2’400’000 2’600’000 2’800’000 3’000’000

Time Abundance

Ion 198.00 (197.70 to 198.70): KORK4.D Ion 196.00 (195.70 to 196.70): KORK4.D Ion 210.00 (209.70 to 210.70): KORK4.D Ion 212.00 (211.70 to 212.70): KORK4.D

Abb. 4: Kork mit sehr hohen Konzentrationen von TCP und TCA.

haftete Korken stets auch erhöhte Mengen des Phe- nols Vanillin aufweisen.

Polyphenoloxidasen sind das Geheimnis

Zum Aufbau pflanzlicher Substanzen wie etwa Lignin werden polymerisierende und polykondensierende Enzyme dazu gebraucht aus monomeren Phenolen polymere herzustellen. Dabei werden die meisten Phenole verbraucht. In vielen Fällen werden aber auch monomere Phenole in die absterbenden Pflan- zenzellen eingelagert, um als Schutz gegen Parasiten aller Art zu dienen, seien es Insekten oder auch Mik- roorganismen. Was nun für den Schutz der Pflanze unerlässlich ist, ist dem Weingeniesser ein Dorn im Auge. Viele Phenole sind stark bitter und adstringie- rend. Sie belegen die Zunge durch ihre Eiweiss ger- benden Eigenschaften. Viele Phenole werden durch die Mikroorganismen durch Methylierung inaktiviert und manche dieser dann entstehenden Anisole sind für den Menschen in sehr geringer Konzentration ge- ruchlich unangenehm. Phenole lassen sich jedoch mit Phenoloxidasen in Gegenwart von Luftsauerstoff oxidieren und kondensieren. Durch die Kondensa- tion entstehen langkettige Strukturen, die Phloba- phene, die in die Zellstrukturen eingelagert werden und sie schützen. Diese langkettigen Strukturen wei- sen nicht mehr den Geruch und Geschmack der bit- teren, gerbenden und adstringierenden Phenole auf.

Was die Natur in das Korkmaterial zum Schutz einge- lagert hat, ist für den Geschmack und Geruch des Weins in einer unbehandelten natürlichen Beschaf- fenheit meistens aber ungeeignet. Hier hat uns die Natur mit den Polyphenoloxidasen jedoch ein Werk- zeug in die Hand gegeben, um den von ihr «bewusst»

beschrittenen Weg, nicht polymerisierte Substanzen zum Schutz der Pflanzen einzulagern, zu Ende zu ge- hen und diese Polymerisation zu vollenden. Erst durch die Vollendung eines natürlichen Prozesses mit

dem enzymatischen Prozess wird aus dem Rohmate- rial Kork das Flaschenverschlussmaterial, der Kork- stopfen (Abb. 5).

Das Enzymsystem Suberase wurde der Natur abgeschaut

Da die freien Phenole sowohl Präkursor für weitere geruchlich negative Substanzen sind als auch selbst geruchlich wie geschmacklich intensiv sein können und natürlicherweise zum Kork gehören, können sie auch in den Wein übergehen. Die wässrig-alkoholi- sche Lösung Wein vermag die Phenole und auch an- dere Substanzen zu lösen. Diese beeinflussen dann den Wein negativ. Die Beeinflussung wird um so in- tensiver, je mehr Phenole sich in dem Korkmaterial befinden und je besser der Wein in den Kork einzu- dringen vermag. Hier ist dann besonders die Kunst der einwandfreien Füllung und des Verschliessens der Flaschen gefragt. Weine, verschlossen mit Korken mit vielen phenolhaltigen Lenticellen, sind daher dann auch am meisten gefährdet, wenn der Wein in den Korken einzudringen vermag. Ein nasser Kork ist dann stets auch ein Teil des Weins, dessen Inhalts- stoffe durch Extraktion und anschliessende Diffusion die negativen Eindrücke auf den Wein übertragen.

Der Suberaseprozess kombiniert daher eine Ex- traktion des Korks durch eine weinähnliche Flüssig- keit mit einer Polymerisation der freien Phenole durch einen auch in der Natur ablaufenden Vorgang.

Die Extraktion der Phenole erfolgt mit einer 15%igen wässrig/ethanolischen Lösung bei pH 5, um die Phenoloxidase in ihrem Wirkungsoptimum zu halten. Die Ansäuerung erfolgt mit reinem Haushalts- essig, da dieser als Lebensmittel unbedenklich ist. Als zweites Substrat, neben den Phenolen, ist für den Prozess Sauerstoff notwendig. Der Oxidationspro- zess soll durch Abbildung 6 verdeutlicht werden.

Auch das gefürchtete Trichlorphenol wird polymerisiert

Phenole lassen sich durch das Phenolreagenz nach Folin-Ciocalteu photometrisch bestimmen. Dabei wird oft Gallussäure, eine auch im Holz vorkommen-

Abb. 5: Wirkungsweise von Suberase auf Phenole am Beispiel von 2,4,6 Trichlorphenol.

Abb. 6: Reaktion von Phenolen mit Folin- Reagenz und der Umsatz von 2,4,6- TCP durch Suberase.

de bittere und gerbende Substanz als Standard be- nutzt. Das Phenol TCP, der Präkursor für das geruch- lich aktive TCA, wird durch die Phenoloxidase eben- falls oxidiert und ist dann als Phenol nicht mehr nach- weisbar. In Korken entstehen dann gemischte Poly- mere aus allen beteiligten Phenolen. Da das Reagenz die freie phenolische Gruppe zur Farbbildung benötigt, heisst das auch, dass nach einem Phenol- oxidaseeinsatz dieses für eine mikrobiologische Me- thylierung und damit zur Bildung des gefürchteten TCA nicht mehr zur Verfügung steht. Auf diese Weise lassen sich freie Phenole aus den Korken durch Ex- traktion und Polymerisation entfernen. Sie werden dann auch geruchlich und geschmacklich nicht mehr wahrgenommen.

Die ersten Versuche

Das Suberaseverfahren wurde experimentell zuerst mit Scheiben für Sektkorken ge- testet. Bei diesen Scheiben tre- ten die Phenole enthaltenden Lenticellen in direkten Kon- takt mit dem Wein und damit auch mit dem Suberase-En- zym. Es wurde mit den Qua- litäten 1, 3 und 5 experimen- tiert, wobei 1 die beste Qua- lität war. Je 300 Scheiben je- der dieser drei Qualitäten wur- den getrennt in je 2 l 15%igem Wasser/Ethanolgemisch bei pH 5 mit und ohne Enzymzu- satz 30 Minuten lang bei Raumtemperatur gehalten.

Die Scheiben wurden dann zweimal mit Wasser gespült, getrocknet und wie üblich zur Produktion von Sektkorken benutzt. Es wurden 6 ҂ 100 Flaschen Sekt gefüllt und die- ser nach drei Monaten verkos-

tet. Die Verkostungsergebnisse sind in der Tabelle festgehalten. Das Ergebnis war sehr vielverspre- chend. Die mit Suberase behandelten Korken waren stets besser als die unbehandelten Korken. Ausser- dem erwiesen sich die mit Suberase behandelten Kor- ken geringerer Qualität stets als besser als solche mitt- lerer Qualität, d. h. eine behandelte 5. Qualität erwies sich stets als besser als eine unbehandelte 3. Qualität.

Im Aussehen der Scheiben lässt sich jedoch aus einer 5. Qualität keine bessere Stufe erreichen. Die negati- ven geruchlichen und geschmacklichen Einflüsse auf den Sekt werden jedoch beseitigt.

Multipliziert man die Anzahl der Sekte je Platz mit der Platzziffer und addiert dann die erhaltenen Wer- te, so bekommt man eine absolute Zahl. Der Sekt mit der geringsten Summe ist geschmacklich der Beste, der mit der höchsten somit der Schlechteste.

● Die mit Suberase behandelten Korken sind stets besser als die unbehandelten.

● Mit Suberase behandelte Korken geringerer Qua- lität sind stets besser als solche mittlerer Qualität.

Die Optimierung der Enzymmenge bei Flaschenkorken

Mit Korken verschiedener Qualitäten wurde die benötigte Menge an Enzym optimiert. Dazu wurden Korken mit unterschiedlichen Mengen Enzymzusatz behandelt, danach zweimal mit Wasser gespült und dann für zehn Minuten in der Mikrowelle gekocht.

Mit dem Kochwasser wurde der Folintest durchge- führt. Wie Abbildung 7 zeigt, nahm die Menge an Folin-positiven Substanzen mit steigender Enzymzu- gabe ab. Bei einer Menge von 0,5 mu/Kork war keine weitere Abnahme mehr zu verzeichnen. Dieses gilt für alle untersuchten Korkqualitäten.

Geschmackliche Beurteilung von Sekten verschlossen mit Korken mit und ohne Suberase- Behandlung

Korkenqualität

+/– Enzym – 1+ 1– 3+ 3– 5+ 5–

Behandlung

1. Platz 3 1

2. Platz 1 2 1

3. Platz 1 2 1

4. Platz 1 1 2

5. Platz 3 1

6. Platz 4

Summe 5 8 12 19 16 24

Platz 1 2 3 5 4 6

Abb. 7: Abnahme der Folin-positiven Substanzen in Korken behandelt mit unterschiedlichen Mengen Enzym.

Der Einsatz der Suberase bei Flaschen- korken

Jeweils 20’000 Flaschenkorken wurden in 100 l Was- ser, versetzt mit 15 l Ethanol und mit Essig auf pH 5 eingestellt, gegeben. Es wurden 110 ml Enzym zuge- geben, die Dosis, die sich durch die vorherigen Ex- perimente als am besten geeignet herausgestellt hat- te.

Es erfolgte eine Behandlung in einer Drehtrommel für 60 Minuten bei etwa 30 °C. Danach wurde zwei- mal mit je 100 l Wasser intensiv gewaschen. Die Kor- ken wurden getrocknet und wie sonst auch üblich behandelt. Sie wurden dann zum Verschluss ver- schiedener Weine eingesetzt. Diese Versuchsweine wurden nach einer vierwöchigen Lagerung bei er- höhter Temperatur verkostet. Zwei Serien von je- weils 48 «deutschen Weissweinen» wurden jeweils in Gruppen zu sechst verkostet, um die Einheitlichkeit festzustellen, wobei stets einer aus der Gruppe als erster der nächsten Gruppe diente. Beide Sorten er- wiesen sich als frisch im Geschmack und zeigten kei- ne Fehltöne. Dabei waren alle Weine von jeder Sorte im Geschmack gleich. Suberase bewirkt demnach, dass die Weine in den Flaschen gleich schmecken und dadurch der gewünschte Weincharakter erhalten bleibt.

Bei der Beurteilung von «Italienischem Weisswei- nen» wurden drei unterschiedlich behandelte Kor- kenchargen miteinander verglichen.

Die Flaschen wurden verschlossen mit:

● Naturkorken mittlerer Qualität

● Naturkorken gewaschen in 15% Wasser/Ethanol

● Naturkorken Suberase behandelt

Die geruchliche und geschmackliche Beurteilung dieser «Italienischen Weissweine» ergab, dass die Wei- ne, verschlossen mit einem normalen Kork, deutlich dumpf, leicht gerbig und bitter waren. Die nur mit Wasser/Ethanol behandelten waren sehr bitter und gerbig, deutlich schlechter als die unbehandelten, was sicherlich auf die hohe Löslichkeit von Phenolen in Ethanol/Wasser zurückzuführen ist. Die mit Sube- rase behandelten Korken ergaben einen Wein mit deutlichem Sortencharakter und ohne Bitterkeit und Adstringenz.

Beeinflusst das Enzym den fertigen Wein?

Eine wichtige Frage bei Behandlungen ist immer, ob das Behandlungsmittel, hier die Suberase, in den Wein übergeht. Denn als Polyphenoloxidase wäre sie dann auch in der Lage Phenole des Weines zu oxidie- ren. Dieses hätte besonders bei Rotweinen negative Folgen, da dann die Rotweinfarbstoffe, ebenfalls Phenole, polymerisiert würden, was der Farbqualität abträglich wäre.

Die Immunchemische-Analyse hat gezeigt, dass kein Enzym von den Suberase behandelten Korken in den Wein übergeht.

Diese immunchemischen Methoden sind 1 Million mal empfindlicher als normale Nachweismethoden für Enzyme. Ausserdem wird die Polyphenoloxidase bereits durch 15 mg/l freie schweflige Säure in ihrer

Aktivität zu 100% gehemmt. Auch dadurch ist eine Gefahr einer Oxidation der Phenole der Weine nicht gegeben.

Ausblick

Die experimentelle Phase der Anwendung von Sube- rase ist inzwischen schon lange vorbei. Es wurden be- reits einige Millionen so behandelter Korken einge- setzt. Reklamationen, wie sie sonst üblich waren, sind bisher ausgeblieben. Die Suberasebehandlung hat den Kork als Verschluss von Weinen sehr viel si- cherer gemacht.

La subérase: un moyen biotechnologique de nettoyage des bouchons

Les bouchons sont fabriqués à partir de l’écorce du chêne-liège Quercus suber L. Le liège est un tissu de scellement mort qui a pour fonction de protéger l’intérieur vivant de l’arbre contre les lé- sions et les attaques d’organismes. Le tissu n’est pas homogène, mais parcouru de pores respiratoires qui assurent l’échange de gaz de la plante. De préférence dans ces pores, on rencontre fré- quemment des liaisons phénoliques qui favorisent une attaque microbienne. Ces phénols qui ont une importance vitale pour la plante sont indésirables dans le vin, car ils ont un goût tannique et amer. Or, ils passent facilement du bouchon dans le produit. Le 2,4,6-trichlorphénol (TCP), un précurseur du 2,4,6-trichloranisol qui déclenche le goût de bouchon, est un de ces phénols dont on ignore encore actuellement d’où il provient.

Grâce à une polyphénoloxydase, il est possible d’éliminer les phé- nols du bouchon par voie enzymatique. Les produits subissent alors une polycondensation spontanée qui en neutralise le goût.

La subérase est un tel enzyme convenant pour les produits subé- reux. L’application s’effectue dans une solution eau-éthanol. L’al- cool provoque d’une part l’extraction de substances du liège qui normalement parviendraient dans le vin, et d’autre part, il assu- re la pénétration en profondeur et le transport de l’enzyme jus- qu’au point de son intervention. Afin d’éliminer un maximum de TCA dans les bouchons, il faudrait intégrer ce processus dans la production à un stade très précoce. Une fois le rinçage effectué, même les méthodes de mesure analytique les plus sophistiquées ne parviennent plus à déceler l’enzyme dans le liège. Il est donc impossible que les phénols s’altèrent dans le vin.

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