Untersuchungen zur Modulation der Ionenleitfähigkeit von P2X3-und P2X7-Rezeptoren durch extrazelluläre Phosphorylierung und Regulation der Rezeptorexpression in HEK 293-Zellen

Ionenleitfähigkeit von P2X

- und P2X

-Rezeptoren

durch extrazelluläre Phosphorylierung und

Regulation der Rezeptorexpression in

HEK 293-Zellen

Dissertation

zur

Erlangung des Doktorgrades

der Naturwissenschaften

(Dr. rer. nat.)

dem

Fachbereich Pharmazie

der Phillipps-Universität Marburg

vorgelegt von

Doychin Toshev Stanchev

aus Bulgarien

Danksagung

Diese Doktorarbeit entstand am Rudolf-Boehm-Institut für Pharmakologie und Toxikologie der Universität Leipzig unter der Leitung von Herrn Prof. Dr. Dr. Peter Illes. Für seine Unterstützung, die wertvollen Anregungen und seine stetige Diskussionbereitschaft möchte ich meinen herzlichsten Dank aussprechen.

Gleichermaßen danke ich Herrn Prof. Dr. Dr. Josef Krieglstein, der mir die Dissertation an der Universität in Marburg ermöglicht hat.

Für seine großzügige Unterstützung möchte ich mich im besonderen Maße bei Herrn Prof. Dr. Günter Heidemann bedanken. Als Vertrauensdozent der Friedrich Naumann Stiftung half er mir nicht nur, meinen Platz in einem qualifizierten Team einnehmen zu können, sondern sorgte darüber hinaus durch seine Fürsorge dafür, mich mit Hilfe eines Stipendiums der Friedrich-Naumann-Stiftung während der dreijährigen Promotionszeit finanziell abzusichern.

Weiterhin danke ich Frau PD Dr. Kerstin Wirkner für ihre stetige und intensive fachliche Betreuung, sowie die hervorragende praxisnahe Unterstützung mit der Patch-Clamp Technik.

Frau Dipl. Biol. Doreen Milius spreche ich meinen Dank für die Zusammenarbeit bei der Untersuchung P2X7-transfizierter HEK293-Zellen aus.

Mein Dank gilt auch Frau Monika Henschke und Frau Helga Sobottka für die Kultivierung von HEK293-Zellen und DRG-Neuronen.

Ganz besonderen Dank verdient das gesamte Kollegium des Instituts für Pharmakologie und Toxikologie, welches mir meine Arbeit in einem außerordentlich guten Arbeitsklima ermöglicht hat.

1.1. Purine und ATP... 7

1.2. P2-Rezeptoren... 9

1.2.1. P2Y-Rezeptorfamilie ... 9

1.2.2. P2X-Rezeptorfamilie ... 11

1.2.2.1. Lokalisation und Distribution ... 12

1.2.2.2. Struktur der P2X-Rezeptoren ... 12

1.2.2.3. Physiologische Eigenschaften ... 14 1.2.3. P2X3-Rezeptor ... 16 1.2.3.1. Lokalisation... 16 1.2.3.2. Struktur ... 16 1.2.3.3. Physiologische Eigenschaften ... 17 1.2.4. P2X7-Rezeptor ... 20 1.2.4.1. Lokalisation... 20 1.2.4.2. Struktur ... 20 1.2.4.3. Physiologische Eigenschaften ... 21

1.2.4.4. Membranporenbildung, morphologische Änderungen und Einfluss von Hypoxie auf den P2X7-Rezeptor ... 23

1.3. Aufgaben und Zielstellungen... 24

2. Materialen und Methoden ... 26

2.1. Chemikalien ... 26

2.2. Material und Methoden zu den P2X

-Rezeptorexperimenten... 28

2.2.1. Material... 28

4

2.2.2.1. Nukleinsäure-Methoden ... 29

2.2.2.2. Transiente Transfektion von HEK 293-Zellen ... 33

2.3. Material und Methoden zu den P2X

-Rezeptorexperimenten... 34

2.3.1 . Kulturmedium für hHEK293-P2X3-Zellen: ... 34

2.3.2. Extrazelluläre Lösung (EC) für HEK293- und Hinterwurzelganglien- (DRG) Zellen: ... 34

2.3.3. Intrazelluläre Lösung (IC) für HEK293 und Hinterwurzelganglien -Zellen: ... 35

2.3.4 Präparationen und Kultivierungen ... 35

2.3.4.1. Präparation der DRG Zellen und ihre Kultivierung ... 35

2.3.4.2. Kultivierung von HEK293-hP2X3-Zellen... 36

2.3.5. Patch-Clamp Technik... 36

2.3.6. Aufbau und Ausstattung des Messplatzes ... 38

2.3.7. Die praktische Durchführung von Patch-Clamp-Experimenten ... 41

2.3.8. Datenanalyse und Statistik... 43

3. Ergebnisse... 45

3.1. Potenzierung der

α,ß-meATP-induzierten Ströme durch UTP. ....45

3.2. Interaktionen mit PKC Aktivatoren und Inhibitoren ... 50

3.3. Einfluss von Mutationen auf die UTP-induzierte Potenzierung der

α,ß-meATP-induzierten Ströme an mit P2X

-Rezeptoren transient

transfizierten HEK293-Zellen ... 53

3.4. Hemmung der maximalen Stromantwort von

α,ß-meATP durch

Inhibitoren der Proteinkinase C oder durch Mutationen im P2X

-Rezeptor... 58

3.5. Effekt von Mutationen des P2X

-Rezeptors auf die Kinetik der

Rezeptorantwort. ... 60

3.6. Potenzierung der

α,ß-meATP-induzierten Ströme durch UTP bei

DRG-Neuronen und Interaktionen mit PKC-Inhibitoren. ... 65

3.7. P2X

-EGFP Klonierung und Eigenschaften des

Rezeptorkonstruktes ... 68

4. Diskussion... 74

4.1. Regulation des humanen rekombinanten P2X

-Rezeptors durch

ekto-Proteinkinase C. ... 74

4.2. Sauerstoff- und Glukose-Mangel erhöhen die Expressionsrate des

P2X

-Rezeptors in der HEK 293-Zellmembran. ... 78

5. Zusammenfassung ... 81

6. Eigene Publikationen... 84

6.1. Tagungsbeiträge ... 84

6

7. Literatur ... 86

8. Abkürzungsverzeichnis ... 100

1.1. Purine und ATP

Die Purine wurden erstmalig 1884 von dem deutschen Chemiker Emil Fischer isoliert und in eine eigene chemische Familie eingeordnet. Purine sind organische, heterozyklische, aromatische Stoffe, die aus einem Pyrimidinring und einem Imidazolring bestehen (Abb.1).

Abb. 1. Chemische Grundstruktur der Purine.

Mit A, B und C wurde die Strukturformel der Purine auf drei unterschiedliche Arten dargestellt. In D ist ein dreidimensionales Modell der Purinstruktur abgebildet. Mit den blauen Kugeln wurden die Stickstoffatome markiert, mit den grauen Kugeln die Kohlenstoffatome und mit den weissen Kugeln die Wasserstoffatome.

Für die Funktion lebender Organismen spielt das Purinnukleotid Adenosintriphosphat (ATP) eine essentielle Rolle. Es ermöglicht einerseits die Energieübertragung in der Zelle, fungiert andererseits aber auch als wichtiger Neurotransmitter bzw. Kotransmitter (Hoyle und Burnstock, 1986). ATP besteht aus Adenosin, an das drei Phosphatreste gebunden sind (Abb.2).

8

Abb. 2. Chemische Grundstruktur des ATP

Im menschlichen Organismus wird ATP als ein Produkt der oxidativen Phosphorylierung in den Mitochondrien produziert (Belitser und Tsibakova, 1939). Beim Abbau eines Phosphatrestes wird Energie freigesetzt. So ist ATP der Hauptenergieträger im menschlichen Organismus (Lipmann, 1949). Außer dieser Funktion spielt ATP eine Rolle als universales Signalmolekül (Burnstock, 2001).

Neben ATP können auch andere Purine (Adenosin, ADP, AMP, GDP, GTP) und Pyrimidine (UDP, UTP) eine Signalfunktion im Organismus ausüben (Starke, 2005). Die extrazellulären Purine und Pyrimidine beeinflussen viele biologische Prozesse, wie z.B. die Kontraktilität der glatten Muskeln, die Erregungsübertragung zwischen den Nervenzellen, die exogene und endogene Sekretion, die Immunantwort, die Erregung, die Blutplättchenaggregation, den Schmerz u.a. (Ralevic und Burnstock 1998). Die Wirkung von Purinen ist zum ersten Mal von Drury und Szent-Györgyi 1929 beschrieben worden. Diese Autoren konnten zeigen, dass aus Herzmuskulatur extrahiertes Adenosin und 5’-Adenosinmonophosphat (AMP) einen biologischen Effekt haben. Wurden die extrahierten Purine einem Versuchstier injiziert, resultierten Herzstillstand, arterielle Dilatation, Erniedrigung des Blutdruckes und eine Inhibition der Darmkontraktion. Gillespie (1934) beschrieb bei Katzen und Kaninchen zwei entgegen gesetzte Effekte: Während Vasodilatation und Blutdrucksenkung infolge Adenosin- und AMP-Gabe auftraten, führte ATP zur Erhöhung des Blutdruckes. Das war der erste Anhaltspunkt für die Existenz mehrerer Purin-Rezeptoren. 1972 vermutete Burnstock eine Beteiligung von ATP bei der Erregungsübertragung zwischen Neuronen oder Neuronen und Glattmuskelzellen. 1978 postulierte er, dass spezifische, extrazellulär lokalisierte Rezeptoren für Adenosin und ATP existieren. Mit der ersten Klonierung eines ATP-spezifischen Rezeptors 1990 (s. Kennedy,

2000) nahm die diesbezügliche Forschung einen deutlichen Aufschwung. Mittlerweile wurden Purin- und Pyrimidin-Rezeptoren, die heute als P2-Rezeptoren bezeichnet werden (siehe Kapitel 1.2.), in fast allen Zellarten gefunden und deren Beteiligung an vielen physiologischen und pathologischen Prozessen nachgewiesen.

1.2. P2-Rezeptoren

P2-Rezeptoren sind auf der Oberfläche fast aller Säugetierzellen zu finden (von Kügelgen, 2005). Den Begriff „purinerge Rezeptoren“ führte Burnstock 1978 ein. Er unterteilte sie in zwei große Rezeptorfamilien, die P1- und P2-Purinorezeptoren. Die P1-Rezeptoren klassifizierte er als Rezeptoren für Adenosin. Durch ihre molekularen, biochemischen und pharmakologischen Eigenschaften unterteilte er Adenosinrezeptoren in vier Subtypen: A1-,

A2A-, A2B-, und A3-Rezeptoren. Alle P1-Rezeptoren sind alle an G-Proteine gekoppelt

(Ralevic und Burnstock, 1998). Zur P2-Rezeptorfamilie gehören die so genannten P2X-Rezeptoren, welche Liganden-aktivierte Kationenkanäle sind, und die G-Protein-gekoppelten P2Y-Rezeptoren.

1.2.1. P2Y-Rezeptorfamilie

Die P2Y-Rezeptorfamilie gehört zu den evolutionär sehr früh entstandenen Rezeptorfamilien. Dranoff et al., (2000) behaupteten, dass purinerge Signalmechanismen wahrscheinlich die phylogenetisch ältesten sind. Diese Rezeptorfamilie gehört zur Rhodopsinfamilie G-Protein-gekoppelter Rezeptoren (von Kügelgen, 2005). Bis jetzt wurden bei Säugetieren 8 verschiedene P2Y-Rezeptorsubtypen (P2Y1, 2, 4, 6, 11, 12, 13, 14)

kloniert (North und Barnard, 1997; Ralevic und Burnstock, 1998; von Kügelgen und Wetter, 2000; Jacobson et al., 2002) und funktionell als P2Y-Rezeptoren definiert.

Die P2Y-Rezeptoren besitzen die typischen Merkmale G-Protein-gekoppelter Rezeptoren, einschließlich der 7 hydrophoben transmembranären Regionen, welche durch 3 intrazelluläre und 3 extrazelluläre Schleifen verbunden sind. Der N-Terminus befindet sich extrazellulär und der C-Terminus intrazellulär (Abb. 3) (von Kügelgen, 2005).

Alle bis jetzt bekannten P2Y-Subtypen besitzen auf ihrer extrazellulären Domaine 4 Cystein-Reste, die zwei Disulfidbrücken bilden. Eine Disulfidbrücke befindet sich zwischen dem N-Terminus und der dritten extrazellulären Schleife; die zweite

10

Disulfidbrücke zwischen der ersten und der zweiten extrazellulären Schleife (Hoffmann et al., 1999; Ding et al., 2003) (Abb. 3).

Abb. 3. Struktur von P2Y-Rezeptoren.

Die 7 hydrophoben transmembranären Regionen sind rot gefärbt. Es gibt drei extrazelluläre Schleifen (EL 1-3) und vier extrazellulär lokalisierte Cysteinreste (braun), welche durch zwei Sulfidbrücken (blau) verbunden sind.

Die P2Y-Rezeptorfamilie kann aufgrund von Homologiemerkmalen innerhalb der Aminosäuresequenzen in zwei Subgruppen unterteilt werden. Zur ersten Gruppe gehören P2Y1-, P2Y2-, P2Y4-, P2Y6-, und P2Y11-Rezeptoren und zur zweiten P2Y12-, P2Y13-, und

P2Y14-Rezeptoren.

Alle klonierten P2Y-Rezeptoren der oben genannten ersten Gruppe (P2Y1-, P2Y2-, P2Y4-,

P2Y6-, und P2Y11-Rezeptoren) sind Gq-Protein gekoppelt und führen zur Aktivierung der

Phospholipase C (PLC). Die PLC hydrolysiert Phosphatidylinositol-4,5-phosphat (PIP2) zu

Diacylglycerol (DAG) und Inositol-1,4,5-trisphosphat (IP3). IP3 setzt Kalzium aus

intrazellulären Speichern frei. Zusammen mit dem freigesetzten Kalzium kann DAG zum Beispiel zur Aktivierung verschiedener Isoenzyme der Proteinkinase C (PKC) beitragen,

die ihrerseits bestimmte Proteine und Rezeptoren phosphorylieren kann (Hofmann, 2005) (Abb.4).

Abb. 4. PKC-vermittelte Prozesse:

Die Stimulation des G-Protein-gekoppelten Rezeptors (GPCR) aktiviert Phospholipase C (PLC), welche Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat (PIP2) zu Diacylglycerol (DAG) und Inositol-1,4,5-trisphosphat (IP3) hydrolisiert. IP3 stimuliert die Ca2+ Freisetzung aus dem endoplasmatischen Retikulum (ER). Das freigesetzte Ca2+ _{bindet an die PKC, der Komplex} gelangt zur Membran und reagiert mit DAG, um ein vollständiges und aktives Enzym zu bilden.

1.2.2. P2X-Rezeptorfamilie

Die P2X-Rezeptoren sind Liganden-gesteuerte Kationenkanäle, welche unselektiv permeabel für Na+, K+ und Ca2+ sind und durch extrazelluläres ATP aktiviert werden. Sie haben eine wichtige Rolle als Vermittler der schnellen Erregungsübertragung zwischen Neuronen im zentralen und peripheren Nervensystem (Abbracchio und Burnstock, 1994).

1.2.2.1. Lokalisation und Distribution

P2X-Rezeptoren haben eine relativ breite Verteilung in verschiedenen nativen Zell- und Gewebetypen. Nörenberg und Illes (2000) berichteten, dass P2X-Rezeptoren in Neuronen fast aller Gehirn- und Rückenmarkregionen zu finden sind. Sie können außerdem in vielen Retinazellarten sowie autonomen und primär-sensorischen Neuronen lokalisiert werden (Brandle et al., 1998; Jabs et al., 2000; Wheeler-Schilling et al., 2000; Dunn et al., 2001). Zahlreiche Gliazelltypen exprimieren ebenfalls P2X-Rezeptoren, z.B. Müller-Zellen der Retina (Pannicke et al., 2000; Neal et al., 1998; Liu et al., 1998) und Schwannzellen peripherer Neurone (Verkhratsky et al., 2000). Sie werden außerdem noch in verschiedenen Arten von Epithel- und Endothelzellen, im Skelettmuskel und im hämatopoetischen Gewebe exprimiert (North, 2002).

1.2.2.2. Struktur der P2X-Rezeptoren

Sieben Subtypen von P2X-Rezeptoren (P2X1 bis P2X7) wurden bis jetzt bei Säugetieren

kloniert (Buell et al., 1996). Zusätzlich wurde noch ein anderes Mitglied dieser Rezeptorfamilie identifiziert. Es wurde im Huhn nachgewiesen und P2X8-Rezeptor genannt

Abb. 5. Allgemeine Struktur einer P2X3-Rezeptor-Untereinheit.

Der Rezeptor verfügt über zwei Transmembranregionen (TM1 und TM2, grau). Cysteinreste (rot) bilden Disulfidbrücken (blau). Glycinreste sind ebenfalls gekennzeichnet (grün). Mit den sechseckigen blauen Ketten sind die Glykosylierungsstellen gekennzeichnet (nach Ralevic und Burnstock, 1998).

Die N- und C-Termini von P2X-Rezeptoren liegen intrazellulär und dienen als Zielpunkte für Proteinkinase-vermittelte Phosphorylierungsreaktionen (Burnstock, 2004). Der N-Terminus ist bei allen Subtypen ungefähr gleich groß, im Unterschied zum C-N-Terminus, dessen Länge zwischen 30 Aminosäurenresten für P2X6 bis 240 Aminosäurenresten für

P2X7 schwankt. Die P2X-Rezeptorproteine formieren zwei hydrophobe

Transmembranregionen (TM1 und TM2), die den Kanal öffnen und am Aufbau der Ionenporen beteiligt sind. Der P2X-Rezeptor besitzt außerdem noch eine extrazelluläre Schleife. Auf dieser sind 10 Cysteinreste, die paarweise Disulfidbrücken bilden, 14 Glyzinreste und 2 bis 6 Glykosylierungsstellen lokalisiert. Die Disulfidbrücken bestimmen die dreidimensionale Struktur der extrazellulären Schleife. Die extrazelluläre Schleife

14

bildet noch eine hydrophobe H5-Region nahe am Porenvorhof. Diese Region ist für eine mögliche Rezeptorregulierung durch Kationen (Magnesium, Kalzium, Zink und Kupfer-Ionen sowie Protonen) verantwortlich. Die ATP- Bindungsstellen der extrazellulären Schleife in der Nähe der TM1 und TM2 sind für die verschiedenen Subtypen unterschiedlich. Die P2X1-7 Rezeptoren haben eine 30-50% identische Aminosäuresequenz

(Burnstock, 2004). Für die Stöchiometrie der P2X-Rezeptoren wurde ein Protein aus drei Untereinheiten, die die Form eines gestreckten Trimers haben, vorgeschlagen (Khakh, 2001).

Native P2X-Rezeptoren können dabei aus gleichen (Homomere) oder aus verschiedenen Untereinheiten (Heteromere) aufgebaut sein. Die heteromeren P2X-Rezeptoren unterscheiden sich von den homomeren P2X-Rezeptoren in ihren pharmakologischen Eigenschaften.

1.2.2.3. Physiologische Eigenschaften

Universaler Agonist für die P2X-Rezeptoren ist ATP. Mehr oder weniger spezielle Agonisten sind α,β-Methylen ATP (α,ß-meATP), UTP, ADP, 2-Methylthio ATP (2MeSATP), 2',3'-(Benzoyl-4-benzoyl)-ATP (BzATP) und CTP. Die verschiedenen Agonisten besitzen eine unterschiedlich starke Wirkpotenz an den einzelnen P2X-Rezeptortypen.

Native P2X-Rezeptoren können über die Reihenfolge der Agonistenwirksamkeit, durch selektive Antagonisten und anhand ihrer Zink- und Protonen-Empfindlichkeit charakterisiert werden. Allerdings stehen subtypselektive Antagonisten von P2X-Rezeptoren immer noch nicht in ausreichendem Ausmaß zur Verfügung; Suramin und Pyridoxal-5’-phosphat-6-azophenyl-2’,4’-disulfonsäure (PPADS) sind unselektive Antagonisten.

Wie schon erwähnt, sind die P2X-Rezeptoren durchlässig für positiv geladene monovalente und bivalente Ionen. Manche Rezeptoren sind auch für größere Moleküle (wie Propidium Iodid) permeabel (z.B. P2X7; Di Virgilio, 1995).

P2X-Rezeptortypen desensibilisieren in unterschiedlichem Maße. Bei manchen Rezeptoren entwickelt sich eine vollständige Desensibilisierung innerhalb einiger Millisekunden (P2X1

P2X4). Abb. 6 zeigt schnelle und langsame Desensibilisierungen für 6 homomere

P2X-Rezeptoren.

Abb. 6. Vergleich der Desensibilisierungsraten der homomeren P2X-Rezeptoren der Ratte.

Es ist ein 10-facher Unterschied in der Zeit-Skale zwischen A und B vorhanden. Es wurde mittels eines schnellen Druckapplikationssystems 30 µM ATP für 2 s (A) oder für 60 s (B) mit Ausnahme von P2X7-Rezeptoren, wo 1 mM ATP appliziert wurde, verabreicht. Die Experimente wurden an HEK 293-Zellen durchgeführt, die 48 Stunden vor dem Experiment mit 1 µg/ml P2X-Rezeptor-cDNA transfiziert wurden (modifiziert nach North, 2002).

Die Desensibilisierung hängt von der Agonisten-Konzentration ab; sie ist bei hohen Konzentrationen stärker ausgeprägt und entwickelt sich bedeutend schneller als bei niedrigen Konzentrationen. Außerdem ist die Desensibilisierung durch die Erholungszeit, die bis zur Rückkehr der ursprünglichen Agonisten-Empfindlichkeit benötigt wird, charakterisiert. Wie schon die Desensibilisierungszeit ist auch die Erholungszeit für verschiedene P2X-Rezeptortypen sehr unterschiedlich und ebenfalls konzentrationsabhängig.

1.2.3. P2X3-Rezeptor

1.2.3.1. Lokalisation

Die Lokalisation des P2X3-Rezeptors in den sensorischen Neuronen erzeugte erhebliches

Interesse für die Rolle dieses Rezeptors im Schmerzgeschehen (Burnstock, 2000; Kowaluk und Jarvis, 2001). Der P2X3-Rezeptor wurde zum ersten Mal aus Hinterwurzelganglien

(„dorsal root ganglion“, DRG) der Ratte kloniert (Chen et al., 1995; Lewis, 1995). Die P2X3-cDNA weiterer Spezies wurde noch aus dem menschlichen Herzen (Garcia-Guzman

et al., 1997) und aus dem Zebrafisch (Boué-Grabot et al., 2000; Egan et al., 2000) isoliert. Im DRG werden P2X3-Rezeptoren in hoher Anzahl in kleinen und mittleren Neuronen,

welche in die Schmerzperzeption involviert sind, exprimiert. Die nozizeptiven Neuronen besitzen sowohl homomere P2X3-Rezeptoren als auch heteromere P2X2/3-Rezeptoren

(Lewis et al., 1995; Burgard et al., 1999). Es wurde beschrieben, dass der homomere P2X3

-Rezeptor vorwiegend in kleineren sensorischen Neuronen exprimiert wird, während der heteromere P2X2/3-Rezeptor in sensorischen Neuronen mittlerer Größe vorkommt (Ueno et

al., 1999; Cockayne et al., 2000). Außerdem gibt es Beweise für das Vorhandensein von P2X3-Rezeptoren in Rückenmarkneuronen, sympathischen und parasympathischen

Neuronen und enterischen Neuronen.

1.2.3.2. Struktur

Die Aminosäuresequenz des P2X3-Rezeptors besitzt 43% Homologie mit der des P2X1

-Rezeptors und 47% Homologie mit der des P2X2-Rezeptors (Ralevic und Burnstock,

1998). Die räumliche Struktur des P2X3-Rezeptors ist noch nicht genau bekannt, es wird

jedoch vermutet, dass er wie alle anderen P2X-Rezeptoren aus drei Untereinheiten besteht (North, 2002). Das Modell einer Untereinheit des humanen P2X3-Rezeptors ist kürzlich

Abb. 7. Geometrisch optimierte, membran-integrierte, Struktur einer Untereinheit des humanen P2X3-Rezeptors (nach Wirkner et al., 2005).

Eine Untereinheit enthält sieben konsensus Proteinkinase C–Phosphorylierungsstellen (PKC1-7; gelb), von denen fünf (PKC 2-6) extrazellulär lokalisiert sind. Die extrazelluläre Schleife enthält vier Nukleotid-Bindungsdomänen (NBD1-4; rot). Fünf ebenfalls extrazellulär lokalisierte Disulfidbrücken werden vermutet (dünne, gelbe Linien). Der potentielle Ionenfilter (weiß) wird wahrscheinlich durch die Aminosäurereste in Position 333 –341 ausgestaltet.

1.2.3.3. Physiologische Eigenschaften

Ähnlich wie beim heteromeren P2X2/3-Rezeptor reagiert der P2X3-Rezeptor mit

Einwärtsströmen auf α,ß-meATP. Die beiden synthetischen ATP-Analoga α,ß-meATP und 2-MeSATP haben eine stärkere Wirkung auf den P2X3-Rezeptor als ATP selbst (Lewis et

al., 1995; Chen et al., 1995; Garcia-Guzman et al., 1997). Diadenosinpentaphosphat (Ap5A) und Diadenosintriphosphat (Ap3A) wurden auch als wirksame P2X3-Agonisten

18

Unspezifische Antagonisten für den P2X3-Rezeptor sind Suramin, PPADS und TNP-ATP

(North et al., 2000). A-317491 ist ein wirksamer und selektiver Antagonist für P2X3- und

P2X2/3-Rezeptoren (Torben et al., 2003). Der heteromere P2X2/3-Rezeptor wurde besser

durch TNP-ATP blockiert als durch Suramin und PPADS (Burgard et al., 2000; Thomas et al., 1998; Virginio et al. 1998; Spelta et al., 2002). Di-Inosinpentaphosphat (Ip5I) blockiert viel stärker P2X3-Rezeptoren als heteromere P2X2/3-Rezeptoren, was nützlich sein kann

beim Unterscheiden zwischen diesen beiden Rezeptoren (Dowd et al., 1998; Liu et al., 2001).

Homomere P2X3- und heteromere P2X2/3-Rezeptoren werden außerdem noch durch

verschiedene Ionen gesteuert, was für das Bestimmen des Rezeptorentyps wichtig ist. Die H+-Ionen inhibieren die agonisteninduzierten Ströme am P2X3-Rezeptor und potenzieren

dieselben Ströme am heteromeren P2X2/3-Rezeptor (Liu et al., 2001; Stoop et al., 1999).

Höhere Konzentrationen an Ca2+-Ionen inhibieren den heteromeren P2X2/3-Rezeptor und

haben keinen Einfluss auf den homomeren P2X3-Rezeptor (Virginio et al., 1998).

Der homomere P2X3-Rezeptor ist selektiv durchlässig für Na+-, K+- und Ca2+-Ionen. Die

relative Permeabilität gegenüber Ca2+- im Verhältnis zu der gegenüber Na+-Ionen (PCa/PNa)

beträgt ~ 1,2 (Virginio et al., 1998). Die Kalzium-Permeabilität von P2X2/3- und P2X3

-Rezeptoren ist vergleichbar. Eine zeitabhängige Leitfähigkeitszunahme für N-methyl-D-glukamin (NMDG) wurde nur am heteromeren P2X2/3-Rezeptor beobachtet (Khakh et al.,

1998).

Die Desensibilisierungseigenschaften des schnell aktivierenden und schnell desensibilisierenden P2X3-Rezeptors sind von großer physiologischer Bedeutung, da sie

das Empfinden eines kurzandauernden, schmerzhaften Stimulus ermöglichen, ohne den Organismus durch intensive, langandauernde Schmerzen zu belasten.

Kleinere Konzentrationen (30-300 nM) von ATP induzieren Ströme, die über einige Sekunden persistieren können, bei höheren ATP Konzentrationen (≥30 µM) beobachtet man jedoch eine schnelle Desensibilisierung (Lewis et al., 1995). Im Gegensatz zum homomeren P2X3-Rezeptor desensibilisiert der heteromere P2X2/3-Rezeptor nicht (Collo et

al., 1996; Burgard et al., 1999). Insofern ähneln sich P2X2/3- und P2X2-Rezeptoren trotzt

unterschiedlicher pharmakologischer Eigenschaften. Die verzögerte Erholungszeit von P2X3 sollte bei repetitiven Agonisten-Applikationen berücksichtigt werden; der

stabile Stromantworten erhalten zu können (Wirkner et al., 2005). Die Rückkehr des P2X3

-Rezeptors aus der Desensibilisierung konnte mit einer steigenden Konzentration von extrazellulärem Kalzium deutlich beschleunigt werden. Bei 1 mM Kalzium ist die vollständige Erholungszeit 7 min und bei 10 mM Kalzium verringerte sich diese Zeit auf 3,5 min (North, 2002).

Interaktionen zwischen P2X3-Rezeptor und anderen Rezeptoren, die sich an

DRG-Neuronen befinden und dort im Schmerzgeschehen involviert sind, wurden in den letzten Jahren wiederholt beschrieben. Piper und Docherty (2000) berichteten über eine negative Interaktion zwischen dem heteromeren P2X2/3-Rezeptor und dem Capsaicin-, Hitze- und

pH-sensitiven Vanilloidrezeptor (TRPV1). Eine ähnlich geartete negative Interaktion wurde von Sokolova et al. (2001) für P2X3- und GABAA-Rezeptoren beschrieben. Eine

Wechselwirkung zwischen P2X3- und P2Y1-Rezeptoren wurde von Gerevich et al. (2005)

beobachtet. Die P2Y1-Rezeptoragonisten ADP-ß-S und 2-meSADP hemmten die

α,ß-meATP-induzierten Ströme in DRG Zellen. Dieser Effekt von α,ß-meATP wird durch intrazelluläre Applikation des G-Protein-Antagonisten GDP-ß-S aufgehoben, als Hinweis dafür, dass G-Proteine am Transduktionsmechanismus des P2Y-Rezeptors beteiligt sind.

Zur Aufklärung der Rolle des P2X3-Rezeptors an der Nozizeption wurden selektive

Rezeptorantagonisten, Antisense-Oligonukleotide und kleine interferierende RNA bzw. P2X3-Rezeptor-defiziente Mäuse verwendet.

Aus dem Hinweis, dass ATP bei Entzündungen freigesetzt wird, stellt sich die Frage, ob ATP mit anderen Faktoren der Entzündung interagiert und wie sich dies auf die DRG-Zellen auswirkt. Xu und Huang (2002) zeigten, dass die ATP-induzierten Antworten von DRG Zellen, die aus Ratten eines Entzündungsmodells entnommen wurden, zwei- bis dreimal größer sind als die ATP-induzierten Ströme von DRG Zellen, die von unbehandelten Ratten stammen. Das deutet auf eine Hochregulierung der P2X3- und

P2X2/3-Proteine hin, die durch einen Western-Blot tatsächlich nachgewiesen werden

konnte. Substanz P und Bradykinin sind potentielle Entzündungsmediatoren. Die durch diese Substanzen aktivierten Rezeptoren können eine Steigerung von ATP-induzierten Strömen in Oozyten, die P2X3- und P2X2/3-Rezeptoren exprimieren, bewirken. Ursache

war wahrscheinlich eine Phosphorylierung am N-Terminus des Rezeptors durch PKC (Paukert et al., 2001). Es ist schon seit langer Zeit bekannt, dass die Leitfähigkeit mancher ionotroper Aminosäurerezeptoren durch verschiedene Proteinkinasen moduliert wird (Moss

20

und Smart, 1996; Swope et al., 1999; Köles et al., 2001). Obwohl diese Phosphorylierungseffekte am häufigsten an der intrazellulären Seite der Rezeptoren beobachtet wurden, wurde der Teilnahme von Ektoproteinkinasen an einer Phosphorylierung der extrazellulären Rezeptorseite ebenfalls mehrmals diskutiert (Wieraszko und Ehrlich, 1994; Ehrlich und Kornecki, 1999). So könnte insbesondere intrazelluläres aber auch extrazelluläres ATP, seine klassische Funktion als Phosphatdonor ausüben.

1.2.4. P2X7-Rezeptor

1.2.4.1. Lokalisation

Die cDNA, die den Ratten-P2X7-Rezeptor kodiert, wurde zum ersten Mal aus

überdeckenden Fragmenten des oberen Halsganglions und der medialen Habenula des Gehirns hergestellt; die komplette cDNA wurde danach aus Rattenhirn isoliert (Surprenant et al., 1996). Menschliche (Rassendren et al., 1997) und Mäuse (Chessell et al., 1998) cDNA wurde aus Monozyten bzw. aus mikroglialen Zellen kloniert. Der P2X7-Rezeptor

wird darüber hinaus in humanen Müllerzellen (Pannicke et al., 2000), Astrozyten (John et al., 2001), Epithelzellen der Atemwege (Korngreen et al., 1998), azinösen Ohrenspeicheldrüsenzellen (Alzola et al., 1998; Soltoff et al., 1993), Duktuszellen der exokrinen Pankreas (Hede et al., 1999; Luo et al., 1999), Hypophysenzellen (Chung et al., 2000), humanen Hautfibroblasten (Solini et al., 1999), Osteoklasten (Gartland et al., 2001), Vena saphena-Zellen (Cario-Toumaniantz et al., 1998; Loirand et al., 1995), Glattmuskelzellen (Ugur et al., 1997; Zou et al., 2001), Makrophagen (North, 2002) und Lymphozyten (Sluyter et al., 2001) exprimiert.

1.2.4.2. Struktur

Der P2X7-Rezeptor ist strukturell den anderen P2X-Untereinheiten ähnlich, jedoch

Abb. 8. Vergleichende Struktur von P2X3- und P2X7-Rezeptoren.

Die zusätzlichen 177 für die Porenbildung essentiellen Aminosäuren sind rot gekennzeichnet. Die Disulfidbrücken sind blau markeirt.

Der C-Terminus besteht aus 240 Aminosäuren. Die letzten 177 Aminosäuren sind essentiell für die Bildung der nicht-selektiven Ionenpore (Surprenant et al., 1996).

1.2.4.3. Physiologische Eigenschaften

ATP-bedingte P2X7-Rezeptor-Stimulation führt zum Einschalten einiger Zellmechanismen,

wie Freisetzung von Interleukin-1, morphologische Änderungen in der Membranstruktur (Blasenbildung) und Aktivierung von Phospholipase D (PLD) und p38 Kinase (North, 2002).

Vier wichtige Eigenschaften unterscheiden die P2X7-Rezeptorströme von den übrigen

P2X-Rezeptoren. Diese Eigenschaften sind die folgenden: 1) die Notwendigkeit, hohe ATP Konzentrationen (>100 μM) zum Auslösen gut messbarer Ströme zu verwenden; 2)der

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Befund, dass BzATP eine 10- bis 30-mal stärkere Wirkung als ATP besitzt; 3) die Tatsache, dass der Effekt von ATP und BzATP durch Reduzierung der extrazellulären Konzentration von Ca2+ und Mg2+ verstärkt wird (Surprenant et al., 1996); 4) der Befund, dass die Ströme auffällige Änderungen in ihrer Kinetik und Amplitude nach wiederholter Applikationen desselben Agonisten aufweisen können.

Die Antagonisten können in vier verschiedene Gruppen gegliedert werden: 1) Ionen, wie Kalzium, Magnesium, Zink, Kupfer und Protonen inhibieren P2X7-Rezeptorströme. 2) Die

Ströme sind gegenüber den üblichen, unselektiven P2X-Rezeptorantagonisten Suramin und PPADS unempfindlich (Surprenant et al., 1996). Das Suraminanalogon NF279 ist wirkungsvoller als Suramin und PPADS (Klapperstuck et al., 2000). Der humane P2X7

-Rezeptor zeigt eine größere Empfindlichkeit gegenüber PPADS (Michel et al., 2000) und oxidiertem ATP als der entsprechende Rezeptor der Ratte. Der effektivste Antagonist dieser Substanzgruppe ist jedoch Brilliant Blue G, das am Ratten P2X7-Rezeptor mit einer

hohen Affinität und Wirksamkeit bindet (Jiang et al., 2000). 3). Die dritte Gruppe der P2X7-Inhibitoren enthält zwei große organische Kationen, Kalmidazolium und KN-62. 4)

Zur vierten Gruppe der P2X7-Antagonisten zählt 17ß-Estradiol.

Bei kurzdauernder Agonistenapplikation zeigt der P2X7-Rezeptorkanal eine schwache

NMDG Permeabilität, die bei längeren Applikationszeiten jedoch markant zunimmt (Surprenant et al., 1996; Virginio et al., 1999). Die Zeitkonstante der Permeabilitätssteigerung (PX/PNa) steigt von ~1 s für Dimethylamin, 4 s für Tris, bis 10 s

für NMDG an. Sogar wenn die Pore NMDG-permeabel ist, bleibt ihre Selektivität für Kationen erhalten (Virginio et al., 1999). Die BzATP Konzentrationen, die für das Öffnen des Kanals notwendig sind, entsprechen denen, die für die Porenöffnung benötigt werden. Die Konzentrations-Wirkungskurve von BzATP bzgl. der Porenöffnung, ist im Bereich von 0,3 bis 30 µM BzATP sehr steil (Virginio et al., 1999). Die Permeabilitätsmessungen wurden unter Abwesenheit von zweiwertigen Ionen durchgeführt, ohne extrazelluläres Kalzium oder Magnesium dem Inkubationsmedium hinzuzufügen. Divalente Kationen (1 mM Magnesium, 2 mM Kalzium) beeinflussen die Zuname der Permeabilität für NMDG negativ (Virginio et al., 1999). Die Permeabilität konnte auch durch genetische Veränderungen modifiziert werden. Durch eine Deletion der Aminosäurenreste 419 bis 595 wurde die Aufnahme des Fluoreszenzfarbstoffes YO-PRO-1 stark reduziert (Surprenant et al., 1996).

Die Einwärtsströme in HEK 293-Zellen, die durch ATP oder BzATP induziert wurden, zeigten keine Desensibilisierung während der mehrere Minuten andauernden Applikation (Abb. 6).

1.2.4.4. Membranporenbildung, morphologische Änderungen und Einfluss von Hypoxie auf den P2X7-Rezeptor

ATP oder BzATP induzierten erhebliche Veränderungen in mit dem P2X7-Rezeptor

transfizierten HEK 293-Zellen (Mackenzie et al., 2001; Virginio et al., 1999). Nach ~30 s kontinuierlicher BzATP (30 µM)-Applikation begann die Zellmembran große Blasen zu bilden. Nach 1-2 Minuten entwickelten sich mehr Blasen, die sich auch teilweise wieder vereinigen. Eine wichtige Frage war, ob diese Eigenschaften P2X7-spezifisch sind oder ob

sie zusätzliche Moleküle von der Gast/Mutter-Zelle benötigen.

Die Membranblasenbildung, die bei der Aktivierung des P2X7-Rezeptors auftritt, wurde bei

keinem anderen Mitglied der Familie beobachtet und scheint auf abwärts gerichtete Signaltransduktionsmechanismen hinzudeuten, die keinen Einfluss auf die Bewegung der Ionen durch die Membran haben. Punktmutationen, die selektiv den Ionenfluß und die Membranblasenbildung inhibieren, sollten in Zukunft verstärkt untersucht werden.

Folge einer P2X7-Rezeptoraktivierung kann der Zelltod sein. Die Literatur ist hier, wegen

der unterschiedlichsten methodischen Ansätze, die verwendet werden, extrem unübersichtlich. Zum Beispiel wird die Aufnahme von YO-PRO-1, als Nachweis für den Zelltod verwendet, da angenommen wird, dass über die sich ausbildenden großen Membranporen Zellbestandteile nach außen strömen und den Zelluntergang einleiten könnten. Es ist aber anzumerken, dass Zellen die den P2X7-Rezeptor exprimieren,

YO-PRO-1 wiederholt aufnehmen können und, dass die Zellen zu diesem Zeitpunkt noch lebensfähig sind (Virginio et al., 1999). Das Ausmaß der Laktatdehydrogenaseaktivität im Zellmedium kann als verlässlicherer Marker für den Zelltod verwendet werden. Der Zelltod von mit P2X7-Rezeptor transfizierten HEK 293-Zellen tritt aber erst nach minutenlanger

Applikation von BzATP auf (Mackenzie et al., 2001; Virginio et al., 1999).

Sauerstoff- und Glukosemangel verursachen in vitro und in vivo eine Überempfindlichkeit der neuronalen P2X7-Rezeptoren (Cavaliere et al., 2002; Wirkner et al., 2005) und eine

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Verstärkung der entsprechenden Rezeptorexpression (Cavaliere et al., 2004; Franke et al., 2004).

1.3. Aufgaben und Zielstellungen

Ziel dieser Arbeit war es, das Wissen über zwei der wichtigsten Rezeptoren der P2X-Rezeptorfamilie, P2X3- und P2X7-Rezeptoren, zu erweitern. Vorhergehende

Untersuchungen unserer Arbeitsgruppe zeigten, dass die Leitfähigkeit schmerzrelevanter P2X3-Rezeptoren durch niedrige Konzentrationen von UTP, welche jedoch selbst noch

nicht zur Aktivierung von P2X3-Rezeptoren führte, gesteigert werden konnte. Dieser Effekt

wurde nur dann beobachtet, wenn endogen auf HEK293-Zellen lokalisierte P2Y-Rezeptoren pharmakologisch ausgeschaltet wurden.

In der vorliegenden Arbeit sollte mit Hilfe der Patch-Clamp-Technik der Mechanismus, der dieser Interaktion zugrunde liegt, aufgeklärt werden. Es interessierte natürlich auch, ob neben UTP, andere Nukleotide ebenfalls P2X3-Rezeptor-vermittelte Ströme potenzieren

können.

Ausgehend vom Erkenntnisstand, dass die Leitfähigkeit verschiedener Rezeptoren vor allem durch intrazelluläre Phosphorylierungsreaktionen moduliert werden kann, sollten unselektive und selektive Proteinkinaseaktivatoren und -inhibitoren untersucht werden. Darüber hinaus kamen Rezeptormutanten zum Einsatz, bei denen konsensus PKC-Stellen durch Punktmutationen eliminiert wurden. Um eine mögliche physiologische Relevanz dieser im Expressionsmodell der HEK293-Zelle beobachteten Befunde zu testen, wurden auch Versuche an Hinterwurzelganglienzellen der Ratte, welche ebenfalls P2X3

-Rezeptoren exprimieren, durchgeführt.

Ergebnisse unserer Arbeitsgruppe an primären kortikalen Neuronen wiesen auf eine verstärkte Expression des endogenen P2X7-Rezeptors nach in-vitro-Ischämie hin (Wirkner

et al., 2005). Ausgehend von diesen Befunden sollte an einem Zellmodell der Einfluss ischämischer Bedingungen auf den intrazellulären Transport bzw. auf die Membranexpression des P2X7-Rezeptors sowie ausgewählter P2X7-Rezeptormutanten

aufgeklärt werden. Dazu sollte zunächst ein C-terminal mit EGFP gekoppelter P2X7

-Rezeptor kloniert und ein daraus resultierender Fusionsprotein-kodierender-Vektor (P2X7

konnte. Dieses heterologe Expressionssystem ermöglichte die Lokalisierung des P2X7

-Rezeptors innerhalb der Zelle, sowie die Verfolgung des Rezeptorprotein-Transportes („Rezeptor-Trafficking“) innerhalb der Zelle. In der vorliegenden Arbeit sollte elektrophysiologisch geklärt werden, ob die hergestellten Mutanten funktionell aktive Rezeptoren bilden und inwieweit ischämische Bedingungen die Funktionsfähigkeit dieser Rezeptoren verändern.

2. Materialen und Methoden

2.1. Chemikalien

α,ß-Methylen-adenosin-5´-triphosphat α,ß-meATP Biotrend 12-(2-Cyanoethyl)-6,7,12,13-tetrahydro-13-methyl-5-oxo-5H-indolo(2,3-a)pyrrolo(3,4-c)-carbazole Gö 6976 Calbiochem 2′-3′-O-(4-Benzoylbenzoyl)adenosin 5′-triphosphat triethylammoniumsalz BzATP Sigma 6-N,N-Diethyl-b-g-dibromomethylen-D-adenosin-5-triphosphat ARL 67156 Sigma

7-Deaza-7-carbamoyladenosinhydrat Sangivamycin Sigma

Adenosin-5´-triphosphat ATP Sigma

Agarose Gibco

Chloroform

Diacylglycerollacton DAG-Lakton Merck

Dimethylsulfoxid DMSO Calchemie

DNA Größenstandard (1kb) Sigma

DNA - Ladepuffer Sigma

Desoxynucleotidtriphosphat dNTPs Sigma

Dulbecco’s Modifiziertes Eagle Medium DMEM Sigma

Essigsäure (100%) Gibco

Ethanol (100%) Merck

Ethidiumbromid (EtBr, 10mg/ml) EtBr Merck

Ethylendiaminotetraessigsäure EDTA Sigma

Ethylenglycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N´,N´-tetraessigsäure

EGTA Sigma

Fötales Kälberserum FKS Sigma

Geneticin Seromed

Gentamycin Gibco

Glycerol (100%) Gibco

Guanosin 5´O-(2-thiodiphosphat) GDP-ß-S Sigma

Kanamycin Merck

LB Agar Gibco

L-Glutamin Gibco

N-2-hydroxyethylpiperazin-N´-ethansulfonsäure HEPES Sigma

Natriumacetat Sigma

Nichtessentielle Aminosäurelösung NEAA Sigma

Phorbol 12-myristat 13-acetat PMA Gibco

Physiologische Salzlösung nach Hank HBSS Sigma

Polyfect (4 x 1ml) Gibco

QIAGEN Plasmid Kits QIAGEN

Rinderserumalbumin BSA Sigma

Restriktionsenzyme + -puffer QIAGEN

T4 DNA Ligase BioLabs

T4 DNA Puffer Promega

Tetrodotoxin TTX Promega

Tetraethylamonium TAE Sigma

Tris-HCl Biotrend

Uridin-5´-triphosphat UTP Sigma

Q-Solution QIAGEN

pEGFP-N1 Clonetech

Ethidium Bromid EtBr Sigma

Taq Polymerase Eppendorf

Ligase Puffer Roche

Trypton Sigma

Natriumchlorid NaCl Merck

Hefeextrakt Sigma

Salzsäure HCl Merck

LB-Medium Gibco

Polymerase Puffer Eppendorf

Oligonukleotide Roche

D-Glucose Merck

Magnesiumchlorid MgCl2 Merck

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Cesiumchlorid CsCl Sigma

Cesiumhydroxid CsOH Sigma

2.2. Material und Methoden zu den P2X

-Rezeptorexperimenten

2.2.1. Material

Zelllinien

HEK293 (Human Embryonic Kidney Cells)

Oligonukleotide

X7GFP-for: 5’-CTA TAC TGC AGA ATT CAT GCC GGC CTG CTG CAG C-3’ X7GFP-rev: 5’-ATG TAG GTA CCC AGT AAG GAC TCT TGA AGC C-3’

Vektoren

pEGFPN1 (Clonetech, Heidelberg), DVektor zur Expression von Cterminal gekoppelten -EGFP Fusionsproteinen in eukaryotischen Zellen. Bei -EGFP handelt es sich um eine Variante von GFP,deren Emissionsmaximum in den längerwelligen Bereich verschoben ist und die für hellere Fluoreszenz optimiert wurde.

Geräte

Brutschrank für Zellkultur Heraeus Kelvitron, Hanau, D Brutschrank für Klonierung Heraeus Kelvitron, Hanau, D

Schüttler Gerhardt, Bonn, D

Elektrophoresekammer Amersham Pharmacia Biotech AB, USA

Geldokumentationssystem, Raytest, Straubenhardt, D

Thermomixer Eppendorf, Hamburg, D

Thermocycler, PTC 200 Biozym Diagnostik GMBH, Oldendorf, D

Photospektrometer Eppendorf, Hamburg, D

Wasserbad,GFL Burgwedel, D

Minizentrifuge Eppendorf, Hamburg, D

Magnetrührer, Heidolph MR 3002 Kelheim, D

Neubauer-Zählkammer, 0,0025mm2 Laborcenter, Nürnberg

Spannungsquelle Amersham Pharmacia Biotech AB,

USA

Vortexer: Heidolph, Kelheim D

Waagen, Mettler AT 261 Delta range Toledo, Schweiz

CO2-Gasflasche Linde AG, Höllriegelskreuth, D

Deionisierungsanlage: MilliQ Millipore, Eschborn, D

2.2.2. Methoden

2.2.2.1. Nukleinsäure-Methoden

Isolierung von Plasmid-DNA

Die Präparation von Plasmid-DNA erfolgte nach den Protokollen der Plasmid Miniprep oder Plasmid Midi Kits von QIAGEN (QIAGEN; Hilden; D). Basierend auf der alkalischen Lyse der Bakterien wird die Plasmid-DNA an einer siliziumdioxidhaltigen Membran unter Hochsalzbedingungen adsorbiert und anschließend unter Niedrigsalzbedingungen eluiert.

DNA-Sequenzierung

Alle Sequenzierreaktionen wurden durch die Firma Medigenomix (Martinsried, D) nach dem Protokoll des DNA Sequencing Kit BigDyeTM Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction von Perkin Elmer (Applied Biosystems; Foster City; U.S.A.) durchgeführt. Die Reaktionen wurden am ABI 310 Sequenziergerät analysiert.

Restriktionsanalyse

Für den Verdau von 250-500 ng Plasmid-DNA wurden 2 µl 10 x Restriktionspuffer (passend zum schneidenden Enzym), 2 µl 10 x BSA (wenn nötig für die Enzymaktivität), 0,5-1 µl Restriktionsenzym (5-10 U) und H2O in einem Endvolumen von 20 µl für zwei

30

Stunden bei der für das Enzym optimalen Temperatur inkubiert. Die Analyse der verdauten DNA erfolgte auf einem 1%igem Agarose-Gel. Für den präparativen Restriktionsverdau wurden 10-50 μg DNA und 10-100 U des Restriktionsenzyms eingesetzt.

Agarosegelelektrophorese

Lösungen und Reagenzien:

10 x DNA-Ladepuffer: Sigma, (Deisenhofen, D)

50 x TAE-Laufpuffer: 2M Tris-HCl

1M Natriumacetat

50mM EDTA

pH mit HCl auf 8,5 einstellen

Zur Größenbestimmung von DNA-Fragmenten wurden 1%ige Agarose-Gele verwendet, denen 5 µl EtBr (10 mg/ml) je 100 ml 1 x TAE zugefügt wurde. Die elektrophoretische Auftrennung der DNA-Fragmente erfolgte in horizontalen Laufkammern bei 100 V in 1 x TAE-Laufpuffer. Den Proben wurde vor dem Auftragen 1/10 des Gesamtvolumens an 10 x DNA-Ladepuffer hinzugefügt. Als Größenstandard wurde ein 1 kb bp-DNA-Leiter mitgeführt.

Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen

Die Isolierung von DNA-Fragmenten wurde nach dem Protokoll des QiaEx extraction kit (QIAGEN, Hilden, D) durchgeführt.

DNA-Fragment Ligation

Lösungen und Reagenzien: T4 DNA Ligase

Protokoll:

Folgenden Ansatz in ein Eppendorf-Gefäß pipettieren:

50 ng verdaute Vektor-DNA

x ng DNA Fragment, welches in Vektor einkloniert werden soll (molares Verhältnis von Insert:Vektor ist 5:1)

1 μl 10 x Ligase Puffer 1 μl T4 DNA Ligase

mit H2O auf ein Endvolumen von 10 μl auffüllen

Reaktion über Nacht bei 15°C inkubieren.

Herstellung von Kanamycin-Agarplatten

LB Agar Platten: 1 % Trypton

0,5 % Hefe Extrakt

0,17 M Natriumchlorid

1,5 % Agar

pH auf 7,0 mit HCl einstellen, anschließend für 30 min autoklavieren, auf ca 50 °C abkühlen lassen, 50 µg / ml Kanamycin hinzufügen und Platten unter Sterilbank gießen. Diese sind bei 4 °C ca 6 Monate haltbar.

Transformation von Plasmiden mittels Thermoschock

Lösungen und Reagenzien: Tg2-kompetente Zellen

Autoklavieren des LB-Medium LB-Medium: 1 % Trypton

0,5 % Hefe Extrakt

0,17 M Natriumchlorid

pH mit HCl auf 7,0 einstellen und für 30 min autoklavieren

Protokoll:

3 μl des Ligationsansatzes in ein Eppendorf-Gefäß überführen.

32

Inkubation der Transformationsansätze auf Eis für 30 min. LB-Medium auf 42°C vorwärmen.

Ansätze für 90 s bei 42°C inkubieren und anschließend für 3 min auf Eis stellen. Zugabe von 500 μl des vorgewärmten LB-Mediums bei RT.

Inkubation der Ansätze bei 37°C für 1 h.

Ausplattieren der Ansätze auf die Kanamycin-Agarplatten und Inkubation über Nacht bei 37°C im Brutschrank.

Einzelne Kolonien picken und 5 ml LB Medium animpfen. Bakterien über Nacht bei 37°C im Schüttler wachsen lassen.

Plasmid-DNA Isolation per Plasmid Miniprep Kit (QIAGEN, Hilden, D) und anschließende Überprüfung der Klone mittels Restriktionsanalyse.

Amplifikation von DNA mittels PCR

Lösungen und Reagenzien: Taq Polymerase (5 U/μl) 10 x Polymerase Puffer 10 x dNTPs

Q-Solution Oligonukleotide

Protokoll:

Folgenden Reaktionsansatz in ein 0,5 ml PCR-Gefäß pipettieren:

x μl DNA (100-150 ng Plasmid-DNA) 5 μl 10 x Polymerase-Puffer 10 µl Q-Solution 1,25 μl 10 x dNTPs 1,25 μl Primer 1 (10 pmol/µl) 1,25 μl Primer 2 (10pmol/µl) x μl ddH2O (auffüllen auf 49,75 μl)

0,5 μl Taq Polymerase (1 Einheit)

Schritt 1 95 °C 5 min Schritt 2 95 °C 30 sec Schritt 3 56 °C 30 sec Schritt 4 72 °C 2 min Schritt 5 72 °C 7 min Schritt 6 4 °C ∞

Schritte 1, 5 und 6 werden einmalig, Schritte 2-4 36 mal durchgeführt. Analyse der PCR-Produkte auf einem Agarose-Gel.

2.2.2.2. Transiente Transfektion von HEK 293-Zellen

Die transiente Transfektion erfolgte mit Hilfe des Polyfect Transfektionsreagenz von QIAGEN nach dem Protokoll des Herstellers.

Zellkultur

Lösungen und Reagenzien:

Zellkulturmedium: 500 ml DMEM (Dulbecco’s Minimal Essential Medium) 10 % Fötales Kälberserum

1 mM L-Glutamin

Kultivierung von HEK 293-Zellen

Die Kultivierung der Zellen erfolgte im Brutschrank bei 37°C und 10 % CO2 . Die Zellen

wurden 2 x wöchentlich bei einer Dichte von ungefähr 2 x 105 Zellen/ml gesplittet. Sie wurden mit einem Zellschaber vom Boden der Zellkulturflasche abgelöst und etwa 1/5 der Kultur in eine neue Zellkulturflasche mit frischem Zellkulturmedium überführt.

34

Kryokonservierung von Zellen

5 x 105 - 1 x 106 Zellen wurden geerntet, in 1,5 ml Einfrier-Medium resuspendiert, in Einfrierröhrchen überführt und sofort bei -70°C eingefroren. Nach einigen Tagen wurden die Zellen zur längeren Aufbewahrung in flüssigen Stickstoff überführt.

Auftauen kryokonservierter Zellen

Die Zellen wurden bei 37°C im Wasserbad aufgetaut, mit 15 ml eiskaltem Zellkulturmedium verdünnt und 5 min bei 1.200 rpm und 4°C abzentrifugiert. Nach Abkippen des Überstandes wurden die Zellen in Zellkulturmedium resuspendiert und in Zellkulturflaschen überführt.

2.3. Material und Methoden zu den P2X3-Rezeptorexperimenten

2.3.1 . Kulturmedium für hHEK293-P2X3-Zellen

Dulbecco´s Modifiziertes Eagle Medium (DMEM):

500 ml; Kat.Nr. 22320-022 Gibco BRL (Invitrogen, D), bestehend aus Natriumpyruvat (110 mg/l),D-Glucose (1000 mg/l), L-Glutamin (580 mg/l) und HEPES (5958 mg/l). 500 µl Geneticin, 5 ml NEAA (Nichtessentielle Aminosäuren) und 50 ml FKS wurden hinzugefügt.

2.3.2. Extrazelluläre Lösung (EC) für HEK293- und Hinterwurzelganglien- (DRG) Zellen

Die EC bestand aus (in mM):

NaCl, 135; KCl, 4,5; CaCl2, 2; MgCl2, 1; HEPES, 10; Glukose, 10; Einstellung des pH

Wertes auf pH=7,4 erfolgte mit NaOH

Manche Versuche sind in Mg2+ freier EC durchgeführt, bei den DRG Zellen wurde noch 0,5 µM Tetrodotoxin (TTX) hinzugefügt.

2.3.3. Intrazelluläre Lösung (IC) für HEK293 und Hinterwurzelganglien -Zellen

Die IC bestand aus (in mM):

CsCl, 140; MgCl2, 2; CaCl2, 1; HEPES, 10; und EGTA, 11. Die Einstellung des pH-Wertes

auf pH=7,4 erfolgte mit CsOH.

Für manche Versuche wurde 0,3 mM GDP-ß-S hinzugefügt.

2.3.4 Präparationen und Kultivierungen

2.3.4.1. Präparation der DRG-Zellen und ihre Kultivierung

Die DRG-Zellen wurden von 1 bis 2 Tage alten Ratten gewonnen. Zuerst wurde die Ratte dekapitiert. Dann wurden alle Organe entfernt und die Wirbelsäule eröffnet. Nach Entnahme des Rückenmarks wurden die Ganglien entnommen und in HBSS auf Eis gesammelt. Die Ganglien müssen vor der weiteren Verarbeitung noch von möglichen Bindegewebsresten gesäubert werden.

Die in HBSS befindlichen Ganglien wurden im Greiner-Röhrchen bei 1000 U/Min für 5 Minuten zentrifugiert. Danach wurde der HBSS Überstand bis auf 1ml abpipettiert. Dazu wurden anschließend 1ml Kollagenase, 1ml Dispase und 150 µl DNase gegeben. Dann erfolgte die Inkubation im Wasserbad bei 37°C für 12 Minuten. Gelegentlich sollte das Greiner-Röhrchen geschüttelt werden um die enzymatische Dissoziation anzuregen. Schließlich wurde noch 1 ml Trypsin zugegeben und die Inkubation für weitere 7 Minuten bei 37°C im Wasserbad fortgesetzt. Um die Enzymreaktion zu stoppen, wurden 2 ml Medium in die Suspension gegeben. Mit einer Glasspipette (die Pipette soll keine scharfen Kanten haben) wurde (ca 20x) trituriert. So wurden die noch erhaltenen Zellverbände gelöst. Die Suspension, die zunehmend trüber wurde, wurde durch ein steriles Zellsieb (Porengröße 70µm) filtriert und dann bei 1000 U/Min für 10 Minuten ohne Bremse zentrifugiert. Es wurde ein Pellet gebildet. Der verbleibende Überstand wurde vorsichtig entfernt. Nach Schätzung der erwarteten Zellzahl wurde das Pellet mit Medium (ca 1 ml) resuspendiert.

Die Zellzahl wurde mittels Neubauer Zählkammer bestimmt. 30 000 Zellen wurden in einer Petrischale (3,5 cm Durchmesser) ausgesät bei einer empfohlenen Tropfengröße von etwa

36

70 µl. Die verwendeten Petrischalen sind vorher mit Poly-L-Lysin beschichtet und 2 x mit HBSS und Wasser gespült worden. Die ausgesäten Zellen wurden im Brutschrank (37°C, 5-7% CO2) für 1 bis 2 Stunden inkubiert. Anschließend wurden noch 2 ml Medium

hinzugegeben. Nach 3 Tagen können an den Kulturen elektrophysiologische Messungen vorgenommen werden.

2.3.4.2. Kultivierung von HEK293-hP2X3-Zellen

Die erste humane embryonale Nierenzelllinie HEK293 (human embryonic kidney; European Collection of Cell Cultures, Porton Down, U.K.) wurde 1977 entwickelt und beschrieben (Graham et. al., 1977). Diese Zelllinie wurde auch für unsere Experimente verwendet. Uns wurde eine stabil transfizierte HEK293-Zellinie im Rahmen einer Forschungskooperation von der Grünental GmbH (Aachen, D) zur Verfügung gestellt.

Die HEK293-hP2X3-Zellen wurden einmal pro Woche gesplittet. Die Zellen wurden mit einem Zellschaber vom Boden der Zellkulturflasche abgelöst, mechanisch trituriert und etwa 1/5 der Kultur in eine neue Zellkulturflasche mit frischem Zellkulturmedium überführt. Die Einsaatdichte sollte bei 5 x 105 Zellen in 10-15 ml Medium liegen. Nach 2 bis 7 Tagen wurden die Zellen für die Messung verwendet.

2.3.5. Patch-Clamp Technik

Die Patch-Clamp Technik ist heute eine der wichtigsten elektrophysiologischen Arbeitsmethoden. Sie wurde von Erwin Neher und Bert Sakmann 1976 entwickelt. Mit Hilfe dieser Methode wurde es ermöglicht, die elektrische Aktivität von Ionenkanälen an einzelnen Zellen zu messen. Die Öffnung von Ionenkanälen und die Aktivität von Ionentransportern verändern die Leitfähigkeit der Membran, was zur Änderung des Membranpotentials führt. Zur Konstanthaltung des Membranpotentials ist in den dreißiger Jahren die Spannungsklemme (Voltage-Clamp) entwickelt worden. Ausgangspunkt der Spannungsklemme ist ein vom Verstärker erzeugter Kompensationsstrom, der im Whole-cell-Modus über die Pipette in die Zelle fließt und Änderungen des Membranpotentials der untersuchten Zelle ausgleicht.

Grundlage dieses Verfahrens ist eine mit Elektrolytlösung gefüllte Glasmikropipette, die auf der Membran einer Zelle aufgesetzt wurde (Abb. 9A). Zwischen die Glaspipette und

die Zellmembran soll eine Abdichtung, deren elektrischer Widerstand im Gigaohm-Bereich liegt, entstehen. Das erreicht man durch leichten Unterdruckaufbau. Diese Abdichtung (engl. Seal) zeigt, dass die Zelle und die Pipette elektrisch von der Umgebung isoliert sind. Die Pipettenspitze hat einen Durchmesser von 1-2 µm und im gefüllten Zustand einen Widerstand von 4-9 MΩ. Durch den Unterdruck wird die Zellmembran in diese Spitze hineingezogen, zwischen Glas und Membran bildet sich ein enger Kontakt aus, der zu einem Abdichtungswiderstand von 5-7 GΩ führt. So entsteht die Cell-attached Konfiguration (Abb. 9B). Das ist die Ausgangskonfiguration bei dieser Methode. Ein Vorteil dieser Konfiguration ist, dass intrazelluläre Mechanismen nicht beeinflusst werden. Das Ruhemembranpotential der Zelle bleibt ebenfalls unverändert. Nur in dem Membranstück unter der Pipette, dem sogenannten Patch, wird im Spannungsklemm-Modus das Membranpotential vom Verstärker kontrolliert.

Wenn man die Pipette in einer Cell-attached Konfiguration schnell von der Zelle wegzieht, kann sich ein Membranstück von der Zelle lösen und an der Pipettenspitze bleiben, ohne dass der Sealwiderstand zerstört wird. Diesen Messmodus nennt man Inside-out-Konfiguration (Abb. 9D). Diese Inside-out-Konfiguration ist gut geeignet für Einzelkanalmessung. Die innere (zytoplasmatische) Seite der Membran ist der Badlösung zugewandt.

Stärkerer Unterdruck im Cell-attached-Modus kann zum Platzen des Patches führen, wodurch man zur Whole-Cell-Konfiguration (Abb. 9C) oder Ganzzellableitung übergeht. Diese Konfiguration ist durch einen relativ niederohmigen Zugang von der Pipette zur gesamten Zelle charakterisiert. Dies ermöglicht die Gesamtheit der Ionenströme der untersuchten Zelle zu messen. Durch die Öffnung in der Zellmembran können verschiedene Substanzen von der Pipettenlösung in die Zelle diffundieren und so intrazelluläre Mechanismen beeinflussen. Das Membranpotential der gesamten Zelle kann im Spannungsklemm-Modus kontrolliert werden. Die Whole-Cell-Messkonfiguration dient als Ausgangskonfiguration für die Outside-out-Konfiguration (Abb. 9E). Dabei wird ein Stück Membran aus der Zelle herausgelöst und schließt sich an der Pipettenspitze zu einer Art Halbvesikel. So hat man an der Pipettenmündung ein Stück Zellmembran, das der Außenseite der Badlösung zugewandt ist. Diese Konfiguration ist auch sehr gut für die Untersuchung von ligandengesteuerten Ionenkanälen geeignet, weil man leicht Substanzen von der extrazellulären Seite applizieren kann.

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Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Experimente nur in der Whole-cell-Konfiguration im Voltage-clamp-Modus an Hinterwurzelganglienzellen (Dorsalwurzelganglienzellen, DRG-Zellen) der Ratte und HEK-293 Zellen durchgeführt.

Abb. 9. Schematische Durchführung eines Patch-Clamp-Experimentes durch die vier wichtigsten Konfigurationen der Patch-Clamp-Technik:

A. Annäherung der Pipette zur Membranoberfläche; B. Cell-attached; C. Whole-Cell; D. Inside-out; E. Outside-out (modifieziert nach

http://www.science-display.com/patchclamp.html)

2.3.6. Aufbau und Ausstattung des Messplatzes

Die wichtigsten Teile eines Patch-Clamp-Arbeitsplatzes sind: Mikroskop mit Kamera, Vorverstärker, Verstärker, Applikationssystem, Mikromanipulatoren, Computer. Die Patch-Clamp-Messungen werden mit einer sehr empfindlichen Technik durchgeführt. Der Kontakt zwischen Zelle und Patch-Pipette kann durch leichte Erschütterungen zerstört werden. Deswegen befinden sich das Mikroskop, die Mikromanipulatoren und der Vorverstärker auf einem schwingungsgedämpften Tisch (TMC, Peabidy, USA) (Abb.

10-1). Die Ströme, die gemessen wurden, liegen im Pikoampere-Bereich, was auch eine sehr gute Abschirmung gegen elektromagnetische Störungen mittels eines Faraday’schen Käfigs (Abb. 10-2) erfordert. Alle Metallelemente, welche sich innerhalb des Käfigs befanden, wurden mit einem zentralen Erdungsblock verbunden, um von außen eingetragenes Rauschen zu vermeiden. Auf dem schwingungsgedämpften Tisch steht ein inverses Mikroskop (Axiovert 100, Zeiss, Jena, D) (Abb. 10-3), das für Zellkulturen gut geeignet ist. Auf dem Mikroskoptisch ist eine Kammer für 35 mm Schalen (Abb. 10-4) eingebaut. Dort wurden die Zellkulturen für die elektrophysiologischen Ableitungen platziert. Zur visuellen Identifizierung und besseren Auswahl der Zellen wurde eine Kamera (Oscar Color Camera, World Precision Instruments, USA) (Abb. 10-5) montiert. Außer der normalen Belichtung verfügt das Mikroskop über eine UV-Lampe (HBO-50) (Abb. 10-6). Der Verlauf der Patch-Clamp Experimente kann über ein Oszilloskop (Oscilloscope Type HM305, Hameg GmbH, Frankfurt, D) (Abb. 10-7) beobachtet werden. Auf dem schwingungsgedämpften Tisch sind zwei motorische Mikromanipulatoren (Luigs & Neumann, Ratingen, D) (Abb. 10-8) befestigt. Die Applikationssystemspitze (Abb. 10-9), die mit der 13-fachen Spindel des Applikationssystems verbunden ist, ist am rechten Manipulator befestigt. Die lokale Applikation der Pharmaka an die Zellen erfolgt über ein rechnergestütztes schnelles Druckapplikationssystem (DAD-12, ALA Scientific Instruments Inc. Westbury, USA) (Abb. 10-10). Das Applikationssystem wurde mittels eines Laptops (Compaq; LTE Lite 4/25C, Compaq Computer Corporation, Japan) (Abb. 10-11) gesteuert. Am linken Manipulator ist der Patch-Clamp-Vorverstärker (CV 203BU HEADSTAGE, Axon Instruments) (Abb. 10-12) befestigt. Er ist mit dem Axopatch 200B (Axon Instruments, Foster City, USA) Verstärker (Abb. 10-13) verbunden. Der Verstärker ermöglicht das eingegebene Membranpotential konstant zu halten und den dazu notwendigen Kompensationsstrom zu messen. Die Potential- und Stromausgänge des Verstärkers Axopatch 200B wurden mit einem Interface (Analog-Digital-Umwandler, Digidata 1200, Axon Instruments) (Abb. 10-14), einem Laserdruckschreiber (Laserjet 5MP, Hewlett Packard) (Abb. 10-15) und dem Oszilloskop verbunden. Das Interface wandelt die Analogsignale in Digitalsignale um und ist mit dem Computer (Peacock PC+Genuintel Pentium III Processor; System: Microsoft Windows 98) (Abb. 10-16), verbunden. Die Aufnahme der digitalen Daten wurde mit dem Programm Clampex (Version 8.0.0.81, 1984-1999 Axon Instruments, New South Wales, USA) durchgeführt. Die Aufnahmen wurden mit Hilfe des Programms Clampfit (Version 8.2.0.235, 1984-2001 Axon Instruments, New South Wales, USA) analysiert.

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In den Pipettenhalter (Abb. 10-17) am Vorverstärker wurde eine mit ca. 10 µl Pipettenlösung gefüllte Glasmikropipette (3-5 MΩ) gespannt. Über silberdrahtchlorierte Bad- und Pipetten-Elektroden besteht eine elektrische Verbindung zum Vorverstärker. Die Glasmikropipetten wurden aus Borosilikatglas (GB150F-8P, Science Products GmbH, Hofheim, D) hergestellt. Sie wurden mit einem horizontalen Pipettenziehgerät (Modell P-97, Sutter Instruments, Novato, USA) (Abb. 10-18) vor der Messung frisch gezogen. Wichtig ist, dass die gefüllten Pipetten blasenfrei sind, um einen ungehinderten Stromfluss zu ermöglichen.

Abb. 10. Ausstattung eines Patch-Clamp-Messplätzes.

Damit man einen guten Seal herstellen kann, soll man eine neugezogene und saubere Pipette benutzen. Die Pipette wurde blasenfrei mit intrazellulärer Lösung aufgefüllt und in den Pipettenhalter am Vorverstärker eingespannt, so dass alles luftdicht wird. Die aufgefüllte Pipette wurde mit der Hilfe des Mikromanipulators in die Badlösung eingetaucht. Dann wurde der Nullwert für das Potential eingestellt. Die chlorierte Badelektrode wurde mittels einer Elektrolytbrücke mit der Badlösung verbunden. Der Strom soll ungehindert zwischen Pipette und Badelektrode fließen. Nach dem Abgleich beider Ströme wurde auf dem Oszilloskop ein rechteckförmiger Kommandospannungspuls beobachtet, der bei unseren Voreinstellungen etwa 10 mV betrug. Mit Hilfe des Mikromanipulators wurde die Pipettenspitze nah an die Zelloberfläche herangeführt. Eine Berührung der Membranoberfläche durch die Pipette konnte als eine geringe Erhöhung des Pipettenwiderstandes am Oszilloskop verfolgt werden. Nach der Berührung der Zelloberfläche durch die Pipette erfolgte ein leichtes Saugen an der Pipette. Dadurch wurde der Widerstand zwischen Pipette und Zellmembran immer höher und es bildete sich ein Seal. Dann wurde durch den Verstärker das gewünschte Haltepotential (-70 mV) eingestellt. Nach der Sealbildung wurde der Unterdruck entfernt und der Seal überprüft. Das auf dem Oszilloskop beobachtete Signal sollte bis auf kleine kapazitive Artefakte am Anfang und Ende des Spannungspulses fast vollständig flach sein. Diese beiden Artefakte resultieren von der Pipettenkapazität. Diese kleinen kapazitiven Artefakte wurden mittels der Pipettenkapazitäts-Kompensationsfunktion des Verstärkers abgeglichen. Jetzt befindet sich die Zelle in der Cell-Attached Konfiguration (Abb.9B). Dann wurde die Membran unter der Pipettenspitze durch stärkeres Ansaugen, oder betätigen der „Zap-Modus“-Taste (eine hochfrequente und hochamplitudige Wechselspannung) durchbrochen und die Whole-Cell-Konfiguration hergestellt. Das Bild im Oszilloskop ändert sich wie in Abb. 9C dargestellt. Die kapazitiven Artefakte werden wesentlich größer, denn statt des kleinen Stücks Membran muss jetzt bei jeder Spannungsänderung die gesamte Fläche der Zellmembran umgeladen werden. Dann wurde die Ableitung optimiert, indem der Serienwiderstand reduziert und die Kompensationen für Kapazität und Serienwiderstand aktiviert wird

Nach dem Erreichen der Whole-Cell-Konfiguration, wurde die Applikationsspitze des DAD-Systems (ALA, Scientific Instruments Inc. Westbury, USA) mit der Hilfe des zweiten Mikromanipulators in die Nähe (ungefähr 100 µm) der Zelle geführt, von welcher

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die Ableitung erfolgte; so konnten die verschiedenen Lösungen in die unmittelbare Umgebung dieser Zelle appliziert werden. Die lokale Verabreichung der Substanzen erfolgte über ein schnelles Druckapplikationssystem, welches bis zu 12 verschiedene Substanzen oder Konzentrationen nacheinander applizieren kann. Außerdem verfügt das System über ein weiteres druckunabhängiges Gefäß, über das die Zelle kontinuierlich mit extrazellulärer Lösung umspült wird. Die Austauschzeit der verwendeten Lösungen für das DAD-System wurde durch die Applikation von destilliertem Wasser an eine offene Patch-Pipette bestimmt. Der Potentialsprung von 10 auf 90 Prozent der maximalen Peakamplitude erfolgte in 15,9 ± 0,9 ms (n = 7).

Die verwendeten Applikationsschemas werden in Abbildung 11 gezeigt.

Abb. 11. Applikationsschema für die elektrophysiologischen Untersuchungen.

A. Applikationsschema für die Applikation von UTP, UDP, Uridin, GTP, ATP und PMA. Die Applikationsdauer dieser Substanzen ist mit grün gekennzeichnet. α ,ß-meATP wird in den angegebenen Abständen für jeweils 2 s appliziert (rot gekennzeichnet).

C. Applikationsschema für Konzentrations-Wirkungskurven mit α,ß-meATP. Mit rot ist die Applikation von α,ß-meATP dargestellt.

D. Applikationsschema für Konzentrations-Wirkungskurven mit BzATP. Mit rot ist die Applikation von BzATP gekennzeichnet.

2.3.8. Datenanalyse und Statistik

Die Datenaufnahme wurde mit dem Verstärker Axopatch 200B (Axon Instruments) durchgeführt und mit dem Computer und den entsprechenden Programmen (siehe oben) ausgewertet.

Die Digitalisierungsfrequenz wurde auf 5 kHz eingestellt und sie sollte nach dem Nyquist-Kriterium mindestens doppelt so hoch sein wie die höchste im Signal vorkommende Frequenz. Die hochfrequenten Signale, die in der Regel nur dem Hintergrundrauschen entsprechen, wurden mittels eines Tiefpassfilters bis zu einer Grenzfrequenz von 2 kHz eliminiert.

Die relativen Leitfähigkeiten der passierenden Ionen und ihre jeweiligen Gleichgewichtspotentiale bestimmen das Umkehrpotential eines Membranstroms. Am Umkehrpotential ist kein Nettostrom messbar. Wenn der Strom nur von einer Ionenart getragen wird, entspricht das Umkehrpotential dem Gleichgewichtspotential des entsprechenden Ions und kann anhand der Nernst Gleichung berechnet werden:

EIon = RT/zF x ln([Ion]a/[Ion]i)

EIon: Gleichgewichts-(Nernst-) Potential des jeweiligen Ions

R: allgemeine Gaskonstante z: Wertigkeit des Ions T: absolute Temperatur in Kelvin F: Faraday-Konstante ([Ion]a/[Ion]i): Ionenkonzentration außerhalb bzw. innerhalb der Zelle

Für diese Arbeit wurden die angegebenen Umkehrpotentiale empirisch aus Stromantworten ermittelt, indem derjenige Wert bestimmt wurde, bei dem der untersuchte Strom seine Orientierung änderte, also den Betrag Null hatte.

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Die Grundparameter der durch Agonisten induzierten Ströme wurden mittels der folgenden mathematischen Gleichung bestimmt:

I=Imax/[1+(EC50/Agonist)n]

Hier steht „I“ für den durch den Agonisten induzierten Gleichgewichts-Strom (Plateaustrom), „Imax“ für den maximalen Strom bei unendlicher Agonisten-Konzentration,

„n“ für den Hill-Koeffizienten und EC50 steht für jene Konzentration des Agonisten, bei der

50 % von Imax erreicht werden. Die Konzentrations-Wirkungs-Kurven wurden mit dem

Programm SigmaPlot und SigmaStat (Jandel Scientific, Erkrath, D) erstellt. Die graphische Darstellung erfolgte mit Hilfe der Programme CorelDraw (Version 11) und Microsoft Office (Microsoft, Richmond, USA).

Alle Ergebnisse werden als arithmetische Mittelwerte mit ihrem Standardfehler von „n“ Zellen vorgestellt. Mehrere Vergleiche mit einer Kontrollgruppe wurden durchgeführt mit einer einseitig gerichteten Analyse der Varianzen (one-way-ANOVA), der entweder ein nicht parametrischer Dunn’s-Test oder der parametrische Bonferroni’s t-Test folgte. Zwei Messwertreihen wurden, wenn sie normal verteilt sind und eine vergleichbare Standardabweichung hatten, mit dem parametrischen Student’s t-Test verglichen. Wo der Student’s t-Test nicht verwendet werden konnte, kam der nicht-parametrische Mann-Wilcoxon-Test zur Anwendung. Unterschiede mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit von p kleiner als 0,05 wurden als statistisch signifikant bezeichnet.

Zum Auswerten der Abfallphasen der Ströme während der Desensibilisierung von P2X3

-Rezeptoren wurde 20 s lang α,ß-meATP appliziert. Die Aufnahmen wurden mit Faktor 5 durch die pClamp 8.0 Software reduziert und die Kurvenabfallphasen wurden mittels Origin Software (OriginLab, Northampton, MA, USA) so angepaßt, dass die Zeitkonstanten (Offsetkonstanten τoff1 und τoff2 und Onsetkonstante τon(10-90) ) ausgerechnet

3.1. Potenzierung der α,ß-meATP-induzierten Ströme durch UTP

Wie schon in der Einleitung erwähnt, ist α,ß-meATP ein selektiver Agonist an P2X1,3

-Rezeptoren (Ralevic und Burnstock 1998). Zunächst wurde für α,ß-meATP eine Konzentrations-Wirkungskurve an HEK293h-P2X3-Zellen erstellt, um die

Agonistenkonzentration zu ermitteln, welche bei allen weiteren Versuchen verwendet werden sollte. Das Haltepotential betrug dabei -70 mV. Aus der in Abbildung 12 dargestellten Kurve wurden Emax=7127±516 pA, EC50=1,6 ±0,6 µM und

Hill-Koeffizient=1,5 errechnet. Davon ausgehend wählten wir für alle weiterführenden Versuche eine Konzentration von 3 µM α,ß-meATP, wobei ein Intervall von 5 min zwischen zwei Applikationen eingehalten werden musste, damit reproduzierbare Stromamplituden gemessen werden konnten.

Abb.12. Konzentrations-Wirkungskurve für α,ß-meATP.

α,ß-meATP wurde an HEK293-Zellen, welche stabil mit dem P2X3-Rezeptor transfiziert waren, appliziert. Dabei wurden aufsteigende Konzentrationen von 0,03-300 µM verwendet. Das Applikationsintervall betrug 5-7 min, (n=7).

Vorversuche zeigten, dass Superfusion von UTP in einer Konzentration von 3 µM eine Potenzierung der α,ß-meATP-induzierten Ströme in stabil transfizierten HEK293-hP2X3

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wurde jedoch nur dann beobachtet, wenn GDP-ß-S (300 µM) das üblicherweise vorhandene GTP (300 μM) in der Pipettenlösung ersetzte (Abb. 13 Aa; Ab). In Anwesenheit von GTP (300 µM) erfolgte keine Potenzierung der α,ß-meATP -induzierten Ströme durch UTP (Abb. 13 Ba; Bb).

Abb. 13. Abhängigkeit der Potenzierung der α,ß-meATP induzierten Ströme durch UTP in HEK293-hP2X3 Zellen von der verwendeten Pipettenlösung.

α,ß-meATP wurde insgesamt sechs Mal im Abstand von 5 min appliziert. Eine Ausnahme bildete die zweite und dritte Applikation, die durch ein Intervall von 10 min getrennt waren. 5 min nach der zweiten Gabe von α,ß-meATP erfolgte die Superfusion von UTP (3 µM) für insgesamt 10 min. A, Potenzierung der α,ß-meATP induzierten Ströme durch UTP in Anwesenheit von GDP-ß-S (300 µM) in der Pipettenlösung. Aa, zeigt ein repräsentatives Originalregistrat. In Ab wurden normalisierte Mittelwerte ± Standardfehler von 7 Zellen zusammengefasst. *p<0,05; statistisch signifikante Differenz zur zweiten Kontrollantwort.

B, Fehlende Potenzierung der α,ß-meATP induzierten Ströme durch UTP in Anwesenheit

von GTP (300 µM) in der Pipettenlösung. Ba zeigt ein repräsentatives Originalregistrat. In